CN109939116B - Rock2抑制剂在制备药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了ROCK2抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防胶质瘤。该药物能有效预防或治疗耐药胶质瘤，特别是耐替莫唑胺胶质瘤。

Description

ROCK2抑制剂在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及ROCK2抑制剂在制备药物中的用途。

背景技术

替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)作为临床上仅有的几个能够有效透过血脑屏障的烷化剂之一，自发现以来长期使用在胶质瘤的肿瘤化疗中。由于该药物的广泛应用，导致胶质瘤在临床上易于发生针对替莫唑胺的耐药现象。目前确定的调控胶质瘤耐替莫唑胺的机制主要有O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA-transferase,MGMT)的甲基化，基因组修复功能的亢进等，但是针对这些调控方式尚无有效的治疗方案，需要更进一步了解胶质瘤耐替莫唑胺的机制，并探索新的药物治疗方案。

法舒地尔(Fasudil)，又称为法苏地尔，是一种细胞内钙离子拮抗剂，特异性的选择性 RHO激酶抑制物，已在中国和日本上市。临床上用于治疗、预防和改善多种原因引起的血管痉挛，选择性扩张痉挛的血管，改善心、脑缺血能力；同时可以改善脑灌注，增强大脑抗缺氧能力；抑制脑神经细胞受损，促进神经元轴突生长；减轻受累脑细胞组织的炎性反应。盐酸法舒地尔主要用于蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛等引起的缺血性脑血管疾病症状的改善。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

以下无特殊说明的话，法舒地尔为式I所示化合物，替莫唑胺为式II所示化合物。

胶质瘤在临床上易于发生针对替莫唑胺的耐药现象，而目前尚无有效的治疗方案。发明人惊奇的发现，临床上常用的ROCK2抑制剂同时也是细胞内钙离子拮抗剂的法舒地尔用于胶质瘤中，能一定程度抑制其生长，而当法舒地尔与替莫唑胺联用时，又可用来治疗耐药的胶质瘤，能一定程度抑制耐药胶质瘤的生长，特别地，当法舒地尔与替莫唑胺联时，对耐替莫唑胺的胶质瘤的治疗效果更好。基于上述问题的发现，发明人首次提出了将法舒地尔用于制备药物中，并且首次提出了将法舒地尔与替莫唑胺联用的药物组合物。

在本发明的第一方面，本发明提出了ROCK2抑制剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防胶质瘤。发明人首次发现，抑制ROCK2的活性可以增敏替莫唑胺，在体内外抑制耐替莫唑胺胶质瘤的增殖。根据本发明实施例的药物能一定程度上治疗或预防胶质瘤，且对耐药胶质瘤也有一定的治疗或预防作用，特别是对于耐替莫唑胺胶质瘤的治疗或预防作用更强。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述ROCK2抑制剂包括式I所示化合物或式I所示化合物的立体异构体、互变异构体、对映异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药，

发明人首次将临床上常用的法舒地尔用于胶质瘤的治疗中，并且惊奇地发现，法舒地尔能一定程度上抑制胶质瘤的生长。根据本发明实施例的药物能一定程度上治疗或预防胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述胶质瘤为耐药胶质瘤。发明人惊喜地发现，法舒地尔对于耐药胶质瘤的治疗或预防有一定程度的效果。

根据本发明的实施例，所述耐药胶质瘤为耐替莫唑胺胶质瘤。发明人发现，法舒地尔对于耐替莫唑胺胶质瘤的治疗或预防效果优于其他耐药胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述耐替莫唑胺胶质瘤是由C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤。需要说明的是，C6为大鼠胶质瘤细胞系、U251为人胶质瘤细胞系、U87为人胶质瘤细胞系。发明人发现，法舒地尔对于C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤治疗或预防效果更优。

根据本发明的实施例，进一步包括式II所示化合物或式II所示化合物的立体异构体、互变异构体、对映异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药，

发明人首次将法舒地尔与替莫唑胺联用来用于预防或治疗胶质瘤，发明人惊奇的发现，法舒地尔与替莫唑胺联对于耐药胶质瘤也有一定程度的效果，且当胶质瘤是耐替莫唑胺的效果更佳，对于C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤治疗或预防效果最优，并且对于单独使用法舒地尔或者单独使用替莫唑胺对于耐药胶质瘤细胞的抑制效果没有采用法舒地尔与替莫唑胺联合给药能抑制耐药胶质瘤细胞的生长的效果显著。根据本发明实施例的用途，法舒地尔与替莫唑胺联用能显著抑制耐药胶质瘤，能有效地治疗胶质瘤，特别是耐药胶质瘤，尤其是耐替莫唑胺胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述式I所示化合物或式I所示化合物的立体异构体、互变异构体、对映异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药与所述式II所示化合物或式II所示化合物的立体异构体、互变异构体、对映异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药的质量比为1：(1～12)。发明人发现，在不改变替莫唑胺的药物量的情况下，下降法舒地尔的量不能有效抑制耐替莫唑胺胶质瘤的增殖，而当法舒地尔与替莫唑胺的质量比为1：(1～12)，对胶质瘤细胞的杀伤力最强。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物用于治疗胶质瘤，包括ROCK2抑制剂以及其他治疗胶质瘤的药物。发明人首次发现，抑制ROCK2的活性可以增敏替莫唑胺，在体内外抑制耐替莫唑胺胶质瘤的增殖。根据本发明实施例的药物组合物能一定程度上治疗或预防胶质瘤，且对耐药胶质瘤也有一定的治疗或预防作用，特别是对于耐替莫唑胺胶质瘤的治疗或预防作用更强。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述ROCK2抑制剂包括式I所示化合物或式I所示化合物的立体异构体、互变异构体、对映异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药，

发明人首次提出将法舒地尔与其他治疗胶质瘤的药物联用，来治疗胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述胶质瘤为耐药胶质瘤。发明人惊喜地发现，上述药物组合物对于耐药胶质瘤也有一定程度的抑制。

根据本发明的实施例，所述胶质瘤为耐替莫唑胺胶质瘤。发明人发现，上述药物组合物对于耐替莫唑胺胶质瘤的治疗或预防效果优于其他耐药胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述耐替莫唑胺胶质瘤是由C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤。发明人发现，上述药物组合物对于由C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤的治疗或预防效果最佳。

根据本发明的实施例，所述其他治疗胶质瘤的药物包括洛莫司汀、卡莫司汀、尼莫司汀、替尼泊苷、替莫唑胺，法舒地尔与上述治疗胶质瘤的药物联用，能在一定抑制耐药胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述其他治疗胶质瘤的药物为替莫唑胺。发明人首次将法舒地尔与替莫唑胺联用来用于预防或治疗胶质瘤，发明人惊奇的发现，法舒地尔与替莫唑胺联对于耐药胶质瘤也有一定程度的效果，且当胶质瘤是耐替莫唑胺的效果更佳，对于C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤治疗或预防效果最优，并且对于单独使用法舒地尔或者单独使用替莫唑胺对于耐药胶质瘤细胞的抑制没有采用法舒地尔与替莫唑胺联合给药抑制耐药胶质瘤细胞的生长的效果显著。根据本发明实施例的用途，法舒地尔与替莫唑胺联用能显著抑制耐药胶质瘤，能有效地治疗胶质瘤，特别是耐药胶质瘤，尤其是耐替莫唑胺胶质瘤。

根据本发明的实施例，所述式I所示化合物或式I所示化合物的立体异构体、互变异构体、对映异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药与所述替莫唑胺的质量比为1：(1～12)。发明人发现，下降法舒地尔的量不能有效抑制耐替莫唑胺胶质瘤的增殖，而当法舒地尔与替莫唑胺的质量比为1：(1～12)，对胶质瘤细胞的杀伤力最强。

根据本发明的实施例，进一步包括：药学上可以接受的赋形剂。

根据本发明的实施例，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。

根据本发明的实施例，所述药物组合物呈注射剂。法舒地尔盐酸盐本身制剂为注射剂，而替莫唑胺为口服药物且易于在血液中分解为药物活性成分，根据本发明实施例的药物组合物的制剂方式为注射剂。

定义和一般术语

现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另外说明，应当应用本文所使用得下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry",Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和 "March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,John Wiley& Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

本发明所使用的术语“受试对象”是指动物。典型地所述动物是哺乳动物。受试对象，例如也指灵长类动物(例如人类，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述受试对象是灵长类动物。在其他实施方案中，所述受试对象是人。

本发明说使用的术语“患者”是指人(包括成人和儿童)或者其他动物。在一些实施方案中，“患者”是指人。

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺 /反)异构体、阻转异构体，等等。

“手性”是具有与其镜像不能重叠性质的分子；而“非手性”是指与其镜像可以重叠的分子。

“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。

“非对映异构体”是指有两个或多个手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳和色谱，例如HPLC来分离。

本发明所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；andEliel，E.and Wilen， S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。

许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。一种具体的立体异构体是对映异构体，这种异构体的混合物称作对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或过程中没有立体选择性或立体特异性时，可出现这种情况。

本发明公开化合物的任何不对称原子(例如，碳等)都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称原子在(R)-或(S)- 构型方面具有至少50％对映体过量，至少60％对映体过量，至少70％对映体过量，至少80％对映体过量，至少90％对映体过量，至少95％对映体过量，或至少99％对映体过量。

依据起始物料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物，例如外消旋体和非对映异构体混合物(这取决于不对称碳原子的数量)的形式存在。光学活性的(R)-或(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。如果化合物含有一个双键，取代基可能为E或Z构型；如果化合物中含有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能有顺式或反式构型。

所得的任何立体异构体的混合物可以依据组分物理化学性质上的差异被分离成纯的或基本纯的几何异构体，对映异构体，非对映异构体，例如，通过色谱法和/或分步结晶法。

可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高效液相色谱(HPLC)。特别地，对映异构体可以通过不对称合成制备，例如，可参考Jacques,et al.,Enantiomers,Racematesand Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Principles of AsymmetricSynthesis(2^nd Ed. Robert E.Gawley,Jeffrey Aubé,Elsevier,Oxford,UK,2012)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tablesof Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of NotreDame Press,Notre Dame,IN 1972)； Chiral Separation Techniques:A PracticalApproach(Subramanian,G.Ed.,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,Weinheim,Germany,2007)。

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。酮-烯醇互变异构的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互变。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。

“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。

本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1-19.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2- 羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N⁺(C_1-4烷基)₄的盐。本发明也拟构思了任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁，等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C_1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。

本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸和氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。

如本发明所使用的术语“治疗”任何疾病或病症，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数) 或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。

可药用的酸加成盐可与无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/ 盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐 /磷酸二氢盐、聚半乳糖酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

可以由其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

可以由其衍生得到盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、磺基水杨酸等。

可药用碱加成盐可与无机碱和有机碱形成。

可以由其衍生得到盐的无机碱包括，例如铵盐和周期表的I族至XII族的金属。在某些实施方案中，该盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别适合的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。

可以由其衍生得到盐的有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括，例如，异丙胺、苄星青霉素(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺(meglumine)、哌嗪和氨丁三醇。

本发明的可药用盐可以用常规化学方法由母体化合物、碱性或酸性部分来合成。一般而言，该类盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量量的适宜碱(如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或者通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量量的适宜酸反应来进行制备。该类反应通常在水或有机溶剂或二者的混合物中进行。一般地，在适当的情况中，需要使用非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。在例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第20版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，(1985)；和“药用盐手册：性质、选择和应用(Handbook of PharmaceuticalSalts： Properties，Selection，and Use)”，Stahl and Wermuth(Wiley-VCH，Weinheim，Germany，2002) 中可找到另外一些适宜盐的列表。

另外，本发明公开的化合物，包括它们的盐，也可以以它们的水合物形式或包含其溶剂(例如乙醇、DMSO，等等)的形式得到，用于它们的结晶。本发明公开化合物可以与药学上可接受的溶剂(包括水)固有地或通过设计形成溶剂化物；因此，本发明旨在包括溶剂化的和未溶剂化的形式。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明化合物，药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂，溶媒，或它们的组合。在一些实施方案，药物组合物可以是液体，固体，半固体，凝胶或喷雾剂型。

“联合”表示在单个剂量单位形式中的固定组合或用于组合施用的部分的药盒，其中本发明公开化合物和组合伴侣可以在同一时间独立施用或者可以在一定的时间间隔内分别施用，特别是使联合合伴侣表现出合作、例如协同作用。如本文所用的术语“共同给药”或“联合给药”等意欲囊括将所选的组合伴侣施用于需要其的单个个体(例如患者)，并且意欲包括其中物质不必通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合产品”表示将一种以上活性成分混合或组合所得到的产品，并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术语“固定联合”表示活性成分如本发明公开化合物和组合伴侣以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定联合”表示活性成分如本发明公开化合物化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、共同或无特定时间限制地先后施用于患者，其中该施用在患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法，例如施用 3种或更多种活性成分。

在本文中所使用的术语“给予患者前面所述的化合物或者前面所述的药物组合物”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的式(I)所述化合物或者药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的式(I)所述化合物或者药物组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的式(I)所述化合物或者药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在胶质瘤的治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指胶质瘤尤其是耐药胶质瘤)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防胶质瘤)或病症发生；(b)抑制疾病，例如耐药胶质瘤的发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述式(I)化合物或药物组合物的给予有需要的个体。

附图说明

图1是根据本发明实施例的法舒地尔对耐替莫唑胺胶质瘤细胞增殖抑制作用；

图2是根据本发明实施例的不同浓度法舒地尔联合替莫唑胺给药对耐替莫唑胺胶质瘤细胞C6R的增殖抑制作用，其中，C6R表示单独给予替莫唑胺的抑制率；

图3是根据本发明实施例的不同浓度法舒地尔联合替莫唑胺给药对耐替莫唑胺胶质瘤细胞U251R的增殖抑制作用，其中，U251R表示单独给予替莫唑胺的抑制率；

图4是根据本发明实施例的不同浓度法舒地尔联合替莫唑胺给药对耐替莫唑胺胶质瘤细胞U87R的增殖抑制作用，其中，U87R表示单独给予替莫唑胺的抑制率；

图5是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药抑制U251R腋下移植瘤体积的变化，其中，U251R表示空白对照组的肿瘤体积的变化趋势；

图6是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对U251R腋下移植瘤瘤重量的影响；

图7是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对荷U251R肿瘤小鼠体重的影响；

图8是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对荷U251R肿瘤小鼠主要脏器重量的影响；

图9是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对颅内C6R移植肿瘤大鼠生存率的影响；

图10是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对颅内C6R移植肿瘤大鼠体重的影响；

图11是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对颅内C6R肿瘤病变占位面积的影响；

图12是根据本发明实施例的法舒地尔联合替莫唑胺给药对颅内C6R肿瘤病变占位面积的影响的量化结果；

图13是根据本发明实施例的明确ROCK2在耐替莫唑胺胶质瘤细胞中明显活化，使用小干扰RNA(siRNA)敲低ROCK2(即抑制ROCK2蛋白表达)后对耐替莫唑胺细胞中替莫唑胺的敏感度；

图14是根据本发明实施例的利用ROCK2的激动剂溶血性磷脂酸(LPA)在U251、U87、C6细胞中活化了ROCK2，此3个细胞系对替莫唑胺的敏感性的变化；以及

图15是根据本发明的实施例的给予不同浓度的法舒地尔后ROCK2的磷酸化以及ABCG2的表达的变化。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1法舒地尔联合替莫唑胺对人胶质瘤耐替莫唑胺细胞U251R和U87R、大鼠胶质瘤耐替莫唑胺细胞C6R的增殖抑制实验

1、实验材料

(1)药物

替莫唑胺原料药粉末(C₆H₆N₆O₂)，购自常州新区吉利化工有限公司，白色粉末，避光。使用二甲基亚砜(DMSO)配成20mM的母液，置于-20℃保存。临用前用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液配制成所需浓度，DMSO终浓度控制在1‰以下。

法舒地尔盐酸盐粉末(Fasudil(HA-1077)HCl，C₁₄H₁₇N₃O₂S.HCl)，购自上海上海蓝木化工有限公司，白色粉末。使用磷酸盐缓冲液(PBS)配置成100mM的母液，置于-80℃保存。临用前用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液配制成所需浓度。

(2)试剂

①DMEM培养液：取DMEM培养基粉末(美国GIBCO公司产品)一袋(13.5g) 溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO₃调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。

②胎牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。

③PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄ 2.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。

④0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mLPBS缓冲液中，过滤除菌。

⑤DMSO：美国Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo)公司产品。

⑥MTT溶液：称取MTT粉末(Bioshrp)50mg，用10mLPBS配制，0.22μm的滤膜过滤除菌。

(3)细胞株

使用中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供的大鼠胶质瘤细胞系C6、人胶质瘤细胞系U251、人胶质瘤细胞系U87构建耐替莫唑胺细胞系C6R、 U251R、U87R。根据C6、U251、U87的IC₅₀，设置IC₅₀的1/16为初始诱导耐药剂量，于细胞的对数增殖期起始点加入该浓度的TMZ，72h后观察细胞，若细胞出现大量死亡，更换新的培养基，保持TMZ浓度不变，每72h更换一次含该浓度TMZ的培养基，直至细胞汇合生长至80％密度；若在首次加TMZ 72h后没有出现细胞死亡情况，正常传代，加含初始诱导耐药剂量浓度TMZ培养基再培养72h，若出现细胞死亡，按照前述描述处理，如没有细胞死亡，加2倍初始诱导耐药剂量浓度的药物处理。经上述步骤中处理后的细胞在生长至80％密度后正常传代，传代后增加一倍剂量的TMZ；如此反复直至加药浓度升至 IC₅₀时，按照每个循环再升高10μM浓度的TMZ；当达到IC₅₀的1.5倍时，每个加药循环再升高5μM的TMZ；最后TMZ浓度加至IC₅₀的2倍时，耐TMZ结束。细胞进行耐TMZ 的性质检测。整个耐TMZ过程大致持续6-10个月。

C6、U251、U87使用含10％的胎牛血清的DMEM培养液培养；耐TMZ细胞系全部按照一传二培养，各个耐药细胞在日常培养液中均加入各自母本细胞系TMZ IC₅₀的1/2浓度作为耐TMZ特性维持的药物浓度。

2、实验仪器

(1)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。

(2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。

(3)OlympusIX51型倒置荧光显微镜：日本Olympus公司产品。

(4)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。

(5)ZW-A型微量振荡器：金坛市精达仪器制造厂。

(6)ELx800型酶联免疫检测仪，购于美国BioTeK公司。

3、药效实验

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验考察法舒地尔、替莫唑胺、法舒地尔联合替莫唑胺给药对不同耐替莫唑胺胶质瘤细胞的抑制作用和IC₅₀值。

将处于对数生长期的C6R、U251R、U87R细胞用0.25％胰酶消化、离心、重悬和计数，制成细胞悬液，以5×10⁴/mL细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μL，设3复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱培养12h左右待细胞完全贴壁。按如下方法进行加药处理：

第一组：加法舒地尔，每孔中的终浓度为1、10、50、100、200μM；

第二组：加替莫唑胺，每孔中的终浓度为125、250、500、1000、2000μM；

第三组：加替莫唑胺和低浓度法舒地尔联合给药，每孔中的替莫唑胺终浓度125、250、 500、1000、2000μM，法舒地尔终浓度为0.4μM；

第四组：加替莫唑胺和中浓度法舒地尔联合给药，每孔中的替莫唑胺终浓度125、250、 500、1000、2000μM，法舒地尔终浓度为2μM；

第五组：加替莫唑胺和高浓度法舒地尔联合给药，每孔中的替莫唑胺终浓度125、250、 500、1000、2000μM，法舒地尔终浓度为10μM。

对照组：细胞仅加入与给药组相同的空白培养基。

每孔加药后孵育48h，加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃下避光孵育4h，弃去全部上清，每孔加入100μL的DMSO后微型振荡器上振荡2～3min，待结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定吸光度值A。A值越大，代表活细胞数越多。实验重复 3次，根据A值计算药物对细胞的生长抑制率：生长抑制率＝1-A_加药组/A_对照组。

根据孙氏综合法(改进寇氏法)来计算半数抑制浓度IC₅₀(即抑制50％细胞生长所需药物浓度)。

实验结果见图1～图4和表1，与单独给予法舒地尔或替莫唑胺相比，采用法舒地尔和替莫唑胺联合给药能够显著抑制耐药细胞的增殖(p＜0.05)，法舒地尔能够显著增加耐替莫唑胺细胞对替莫唑胺的IC₅₀。说明法舒地尔通过增加耐药细胞对替莫唑胺的敏感性达到杀伤耐药细胞的功效。

表1：U251R、U87R、C6R在给予不同浓度的法舒地尔后替莫唑胺的IC₅₀

此与未治疗组相比p＜0.05标记^*，p＜0.01标记^**。

实施例2考察法舒地尔联合替莫唑胺对胶质瘤耐替莫唑胺裸鼠移植瘤的治疗作用

1、实验材料

(1)药物

替莫唑胺，使用pH＝4.0的PBS缓冲液溶解，现配现用，按照每只裸鼠25mg/kg隔日腹腔注射给药。

法舒地尔，使用pH＝4.0的PBS缓冲液溶解，现配现用，按照每只裸鼠20mg/kg隔日腹腔注射给药。

替莫唑胺和法舒地尔的给药体积均为0.01mL/g。

(2)试剂

①DMEM培养液：取DMEM培养基粉末(美国GIBCO公司产品)一袋(13.5g) 溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO₃调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。

②胎牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。

③PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄ 2.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存，配置药物时使用盐酸调pH至4.0。

④0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mL PBS缓冲液中，过滤除菌。

(3)细胞株

耐替莫唑胺细胞系U251R(构建方法同实施例1)，使用含10％的胎牛血清的DMEM培养液培养。

(4)实验动物

来源、品系：BALB/c-nu裸小鼠，由南京大学模式动物研究所提供(许可证号：SCXK(苏)2010-0001)。日龄：35-40天，体重：18-24g，性别：雌雄各半。

2、实验方法

取对数生长期的耐替莫唑胺胶质瘤细胞株U251R，在无菌条件下后制备成2×10⁷/mL 细胞悬液，取0.2mL接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤的长径和短径，待肿瘤生长至100mm³后将动物随机分组，各处理组如下：空白对照组：10 只(溶剂对照，i.p.，每日等体积pH＝4.0的PBS缓冲液)；替莫唑胺组(替莫唑胺，25mg/kg，i.p.，一日替莫唑胺，一日溶剂)10只；法舒地尔组(法舒地尔，20mg/kg，i.p.，一日法舒地尔，一日溶剂)10只；替莫唑胺联合法舒地尔给药组(替莫唑胺，25mg/kg，法舒地尔， 20mg/kg，i.p.，一日法舒地尔，一日替莫唑胺)10只。给药体积为0.01mL/g。每2-3天测 1次肿瘤直径，动态观察被试物抗肿瘤的效应。21天后，处死小鼠，手术剥取瘤块称重。

肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长径、宽径。

3、结果

法舒地尔联合替莫唑胺给药对人胶质瘤耐替莫唑胺细胞U251R裸小鼠移植瘤的治疗结果见图5～图8。如图5，与空白对照组、替莫唑胺组、法舒地尔组相比较，替莫唑胺联合法舒地尔组肿瘤体积在15天时与其他各组出现显著差异，体积较其他各组明显较小，其后每个时间点的肿瘤体积，替莫唑胺联合法舒地尔组均明显小于其他各处理组，且有统计学差异(与空白对照组相比较，*为p＜0.05，**为p小于0.01；与替莫唑胺组相比较，#为p ＜0.05，##为p小于0.01；与法舒地尔组相比较，&为p＜0.05，&&为p小于0.01)。其余各组间无统计学差异。如图6，联合给药组的肿瘤重量明显小于其他各组，且有统计学差异(与空白对照组相比较，*为p＜0.05，**为p小于0.01；与替莫唑胺组相比较，#为p＜ 0.05，##为p小于0.01；与法舒地尔组相比较，&为p＜0.05，&&为p小于0.01)。由图7 可知，各组动物体重之间没有明显差异；如图8所示，动物主要脏器重量各组之间没有明显差异，说明联合给药的毒性较小。综上可知，法舒地尔联合替莫唑胺对人胶质瘤耐替莫唑胺细胞U251R裸小鼠异种移植肿瘤具有明显的生长抑制作用。

实施例3考察法舒地尔联合替莫唑胺对胶质瘤耐替莫唑胺大鼠原位移植瘤的治疗作用

1、实验材料

(1)药物

替莫唑胺，使用pH＝4.0的PBS溶解，按照每只大鼠35mg/kg隔天腹腔给药。

法舒地尔，使用PBS溶解，按照每只大鼠30mg/kg隔天腹腔给药的。

(2)试剂

①DMEM培养液：取DMEM培养基粉末(美国GIBCO公司产品)一袋(13.5g) 溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO₃调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。

②胎牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。

③PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄ 2.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。

④0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mLPBS缓冲液中，过滤除菌。

⑤4％中性甲醛：称取4g多聚甲醛粉末，溶于60mL的超纯水中，在50℃的水浴锅中溶剂，加入NaOH助融，直至多聚甲醛完全溶解，再使用36％-38％的HCl调定pH＝7.4，再使用容量瓶定容至100mL。

(3)细胞株

耐替莫唑胺细胞系C6R(构建方法同实施例1)，使用含10％的胎牛血清的DMEM培养液培养。

(4)实验动物

来源、品系：Sprague Dawley大鼠，由南京大学模式动物研究所提供(许可证号：SCXK (苏)2010-0001)。日龄：35-40天，体重：190-210g，性别：雌雄各半。

2、实验方法

(1)分组

空白对照组：12只；

替莫唑胺组(替莫唑胺，35mg/kg，i.p.，一日替莫唑胺，一日溶剂)：12只；

法舒地尔组(法舒地尔，25mg/kg，i.p.，一日法舒地尔，一日溶剂)：12只；

替莫唑胺联合法舒地尔给药组(替莫唑胺，35mg/kg，法舒地尔，25mg/kg，i.p.，一日法舒地尔，一日替莫唑胺)：12只。

(2)造模方法

①细胞的准备：细胞离心后，计数，细胞使用预冷至4℃的PBS缓冲液，按照每10μL含有10⁶个C6R细胞的浓度混悬，冰上保存。

②SD大鼠由3％的异戊巴比妥钠(0.4～0.6mL/200g)麻醉，固定在手术台上，去除手术区域内的毛发，使用碘伏消毒手术区域，确定动物已进入深麻醉状态后，使用手术刀延颅脑中线开约1.0cm的开口，轻轻刮开脑膜，于前囟后1.0mm，中线右侧3.0mm处，用直径1.0mm的颅钻钻颅。开孔后，将进样器轻轻插入孔中，进入6mm，退出1mm，轻推10μL(10⁶个C6R细胞)，进样6min，结束后，停针2min，轻轻拔出进样针，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合伤口，术后给予保暖措施，连续3天给予大鼠1.6万单位青霉素钠肌肉注射。术后观察大鼠3天，在明确再无动物死亡后，将动物按照每组12只(雌雄各半)分组。分组后第二日开始给药。

(3)数据处理

①各组SD大鼠经过25天的治疗后，处死，剥离脑组织，去除附属结构，置入4％中性甲醛中固定。固定后的样本切片，HE染色观察肿瘤占位病变。

②利用imageJ软件测量切片中肿瘤面积，计算相对肿瘤面积。

相对肿瘤面积＝处理组/空白组。

3、结果

法舒地尔联合替莫唑胺对颅内C6R移植瘤的治疗结果见图9-图12。如图9所示，空白给药组在第7天时即出现动物死亡，而替莫唑胺组在给药5天时出现动物死亡，法舒地尔组在连续给药9天后出现动死亡，与前述三组相比较，替莫唑胺联合法舒地尔给药组出现首只动物死亡的时间明显较长，为给药后第17天；到治疗过程结束(即本实验中任意一组的生存率低于50％)，联合给药组的生存率明显高于空白对照组、替莫唑胺组、法舒地尔组，且有统计学差异(与空白对照组相比较，*为p＜0.05；与替莫唑胺组相比较，#为p＜0.05；与法舒地尔组相比较，&为p＜0.05)。如图10所示，联合给药组的动物体重在17天开始明显高于其他各组，且自17天到25天均有统计学差异(与空白对照组相比较，*为p＜0.05， **为p小于0.01；与替莫唑胺组相比较，#为p＜0.05；与法舒地尔组相比较，&为p＜0.05)，说明联合给药能缓解颅内肿瘤病变对动物生理的不良影响。如图11和图12所示，联合给药组颅内肿瘤占位面积明显小于其他各组，对占位面积进行统计后，联合给药组的面积显著小于各组，但是与空白组和法舒地尔组有统计学差异，与替莫唑胺组有差异没有统计学差异(与空白对照组相比较，**为p小于0.01；与替莫唑胺组相比较，##为p小于0.01；与法舒地尔组相比较，&&为p小于0.01)。综上所述，法舒地尔联合替莫唑胺联合给药对 C6R颅内移植瘤具有明显的生长抑制作用。

实施例4抑制ROCK2活性可在耐替莫唑胺细胞中增敏替莫唑胺

1、实验材料

(1)药物

法舒地尔，使用PBS溶解配置为浓度为100mM的母液，使用时。

(2)试剂

①DMEM培养液：取DMEM培养基粉末(美国GIBCO公司产品)一袋(13.5g) 溶于1000mL灭菌三蒸水中，用NaHCO₃调pH值至7.3～7.4，圆筒式过滤器过滤除菌，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。

②胎牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。

③PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄ 2.0g，溶于1000mL三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。

④0.25％胰酶：称取胰酶0.25g，溶于100mLPBS缓冲液中，过滤除菌。

⑤蛋白抗体与其他试剂：Anti-ROCK2，Abcam公司，规格：40μL，货号：ab125025；Anti-p-ROCK2(Tyr 722)，Abcam公司，规格100μL，货号：ab182648；High-sig ECL WesternBlotting Substrate，上海天能生物科技有限公司，规格：500mL，货号：180-5001；Biostep^TMPrestained Protein Marker，上海天能生物科技有限公司，规格：200μL，货号：180-6003；siRNA-control，Santa Cruz Biotechnology公司，规格：10μM，货号：sc-37007；siRNA-ROCK2，人源序列：GCAgACAAgAAACgAAAUUUg，大鼠源序列：GUCUAUUAAUACUCGUCUA，由上海生工合成；anti-ABCG2，来自Bioworld，规格100μL，货号：BS3482；PVDF膜， Immobilon-P，Millipore，货号：IPVH00010。

(3)细胞株

耐替莫唑胺细胞系U251R、U87R、C6R(构建方法同实施例1)，使用含10％的胎牛血清的DMEM培养液培养。

2、实验方法

(1)总蛋白提取

细胞蛋白提取：按需要处理后的细胞，PBS洗涤2次。用细胞刮刀刮取细胞，500g离心10min，加入适量含有1％PMSF的RIPA裂解液，混悬细胞，于冰上裂解1.5h，13000 g，4℃离心30min，吸取上清液，使用Nano-100测定蛋白含量；其后使用RIPA裂解液将蛋白统一成相同浓度，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，100℃变性8min，迅速置于冰上冷却， western blot使用前离心。

(2)Western Blot实验

①按照目标蛋白的分子量配置不同浓度的SDS凝胶，电泳条件为浓缩胶恒压75V，分离胶恒压135V，电泳时间约为2小时。

②电泳结束后，按照所需的蛋白分子量裁剪合适的分离胶胶块，使用半干或者全湿转膜法转膜。

③半干转膜法：裁出合适的分离胶，按照从负极到正极滤纸-胶-膜-滤纸的顺序铺好转膜“三明治”结构，小心赶去气泡，按照膜面积(cm²)乘以系数1.2(mA)计算电流，恒流转膜60～90min。全湿转膜法：裁出合适的分离胶，按照从负极到正极滤纸-胶-膜-滤纸的顺序铺好转膜“三明治”结构，夹紧架子，置入充满转膜液的转膜槽中，将转膜槽置入有冰袋的桶内或4℃冰柜内，恒流300mA转膜2.5～4h。

④待转膜完成后，PVDF膜使用含有3％小牛血清白蛋白(bovine serium albumin，BSA)，4℃摇床2h封闭。其后，弃封闭液，PVDF膜用PBST清洗3次，每次10min。加入合适浓度的一抗，4℃摇床上孵育过夜。

⑤隔天回收一抗，使用PBST清洗，每次10min，共3次。加入用PBST稀释好二抗， 4℃恒温摇床孵育2h。孵育结束后弃二抗，使用PBST在脱色摇床上清洗条带，每次10min，共3次；再使用新鲜配置的ECL发光液滴加于待检的PVDF膜上，在凝胶成像分析系统中扫膜成像，并分析western blot结果。

(3)数据统计和分析

细胞实验平行操作，重复三次，所有数据均采用mean±SD表示，使用SPSS19.0软件进行统计学分析。两组之间使用配对t检验；多组之间通One-way ANOVA检验。小样本或非正态分布数据使用non-parametric Mann-Whitney U-test。P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。

3、结果

抑制ROCK2可以增敏耐替莫唑胺细胞对替莫唑胺的敏感度，结果如图13-15。如图13 所示，发明人发现在耐替莫唑胺胶质瘤细胞中ROCK2的表达和活化(活化形式为磷酸化)均出现了明显的上升(A)；而在使用了小干扰RNA(siRNA)敲低ROCK2蛋白的表达之后，耐替莫唑胺细胞对替莫唑胺的敏感性出现明显的上升(B和C，与耐替莫唑胺细胞空白相比较，*为p＜0.05，**为p小于0.01)。如图14所示，发明人使用了ROCK2的激动剂溶血性磷脂酸(LPA)刺激U251、U87、C6细胞，发现LPA能够显著增加ROCK2的磷酸化(A)，并且U251、U87、C6在LPA刺激下，对替莫唑胺的敏感性出现了明显下降(B，与空白相比较，*为p＜0.05，**为p小于0.01)。如图15所示，在给予不同浓度的法舒地尔以后，ROCK2的磷酸化随给药剂量的增加出现了明显的下降，而肿瘤耐药重要的靶标之一ABCG2的表达也出现了明显的下降。综上所述，抑制ROCK2的活性可以在耐替莫唑胺细胞中增敏替莫唑胺，并且下调ABCG2的表达。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.法舒地尔或其药学上可接受的盐和替莫唑胺或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防胶质瘤；

所述法舒地尔或其药学上可接受的盐与所述替莫唑胺或其药学上可接受的盐的质量比为1：（1~12）；

其中，所述胶质瘤为耐替莫唑胺胶质瘤。

2.根据权利要求1所述的用途，所述耐替莫唑胺胶质瘤是由C6、U251、U87构建的耐替莫唑胺胶质瘤。

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