CN109929909A - 一种检测乳糖酶活性的方法、试剂盒及速测卡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测乳糖酶活性的方法、试剂盒及速测卡，包括以下步骤：将5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基‑β‑D‑吡喃半乳糖苷以及促进剂混合；再加入酶检测液，进行显色反应。根据显色反应的颜色变化，从而确定检测液乳糖酶的活性。本发明制备的乳糖酶活性速测方法以及速测卡操作简便，检测时间短，可以适用于生产用乳糖酶产品的质量验证、食品原料乳糖酶含量快速测定等领域。
Description
技术领域
本发明涉及乳糖酶活性检测领域，特别涉及一种检测乳糖酶活性的方法、试剂盒及速测卡。
背景技术
乳糖酶即β-半乳糖苷酶，水解酶的一种，乳糖酶能够将乳糖水解转化成细胞可吸收的葡萄糖和半乳糖。当人体缺乏乳糖酶时，食品中的乳糖无法被水解成可吸收的营养，同时会导致乳糖不耐受，出现腹痛、胀气、腹泻等临床症状。乳制品是钙、高质量蛋白质等营养物质的重要来源，而缺乏乳糖酶的人群由于乳糖不耐受症而不能摄入含有乳糖的乳制品。
牛奶等乳品原料经益生菌发酵可降低乳糖含量，但也会带来口感的改变，食品工业上通过加入乳糖酶降低乳糖，广泛应用在果蔬、乳清处理排放等领域；也有如片剂、胶囊制剂、液体制剂等口服乳糖酶制剂，在饮用纯牛奶前服用乳糖酶制品可较大幅度改善乳糖不耐受症症状。市面上乳糖酶制品繁多，质量参差不齐。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷是一种显色剂，被酶裂解后会产生半乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚，5-溴-4-氯-3-羟基吲哚二聚化并氧化成5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝，颜色从无色转为蓝色。常用在蓝白斑的克隆筛选上，但未见用于乳糖酶的检测。该显色剂难溶于有机溶剂，在室温和冷藏条件下迅速降解，不稳定，且乳糖酶分解该显色剂产生的颜色变化用时长，例如鉴定微生物时需要温育6-8h，且在一定温度下显色剂本身易分解也会影响反应的进行。目前国内没有针对乳糖酶活性检测的国家标准，大多参照美国食药法典(FCC V)进行改进化用，如赵华梅的“乳糖酶制剂活力测定方法的研究”中有记载。
人们用于检测乳糖酶活性的方法有高效液相色谱等直接测定法、还原糖间接测定法，又或者是邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷法，将邻硝基苯酚-β半乳糖苷作为底物进行水解测试，借助邻硝基苯酚的标准曲线进行分析，普遍问题是显色剂不稳定、需要多种化学试剂、仪器精度要求高和操作步骤繁琐等，特别是无法实现乳糖酶活性的快速检测。
针对现有问题，本发明致力于开发一种操作简便，对仪器要求不高的乳糖酶活性检测方法、试剂盒及速测卡，对于检测领域中具有非常重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种乳糖酶活性检测方法、试剂盒以及半定量速测卡。
发明人将5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷作为底物，进行乳糖酶活性的检测，但发现显色剂溶解易降解、没有与酶充分接触、水中的溶解性低以及酶活单位要求高的问题，无法应用到乳糖酶活性的快速检测中，因此提供一种快速检测乳糖酶活性的方法。
本发明的速测卡适用范围广，可快速、简便地应用于食品原料中乳糖酶含量测定、乳糖酶的酶活测定及酶制剂产品验收等领域。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测乳糖酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和促进剂添加到检测液；
(2)检测液中添加待测的酶液，根据反应的颜色变化，判断待测酶液中乳酸酶的活性。
进一步的，检测液还包括稳定剂、乳化剂的至少一种。
进一步的，步骤(1)所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种；优选的，所述的促进剂在检测液中的终浓度为10-100mmol/L。
进一步的，所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精中的至少一种；优选的，稳定剂在检测液中的质量百分数为0.01％-0.5％。
进一步的，所述的乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮；优选的，乳化剂的质量百分数为0.01％-1％。
进一步的，该速测卡包含底板、显色底物片和上盖膜；所述的显色底物片固定5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、促进剂，所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种。
进一步的，所述显色底物片还固定有稳定剂、乳化剂的至少一种；所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。
一种检测乳糖酶活性的试剂盒，包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、促进剂，所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种。
进一步的，还包括稳定剂和乳化剂的至少一种。
进一步的，所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精；所述的乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。
附图说明
图1为本发明速测卡的显色实验结果，其中滴加的酶液浓度分别为200、200、20和0U/ml。
图2为本发明制备的乳糖酶活性速测卡，其中滴加的酶液浓度分别为100、10和1U/ml。
具体实施方式
一种检测乳糖酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和促进剂添加到检测液；
(2)检测液中添加待测的酶液，根据反应的颜色变化，判断待测酶液中乳酸酶的活性。
优选的，检测液还包括稳定剂、乳化剂的至少一种。
优选的，步骤(1)所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种；所述的促进剂在检测液中的终浓度为10-100mmol/L。
优选的，所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精中的至少一种；优选的，稳定剂在检测液中的质量百分数为0.01％-0.5％。
优选的，所述的乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮；优选的，乳化剂的质量百分数为0.01％-1％。
一种检测乳糖酶活性的半定量速测卡，该速测卡包含底板、显色底物片和上盖膜；所述的显色底物片固定5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、促进剂，所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种。
优选的，所述显色底物片还固定有稳定剂、乳化剂的至少一种；所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。
一种检测乳糖酶活性的试剂盒，包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、促进剂，所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种。
优选的，还包括稳定剂和乳化剂的至少一种。
优选的，所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精；所述的乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷水溶性较差，提高溶解性，本发明先将5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷溶于N,N-二甲基甲酰胺，方便后续的实验。
本发明的有益效果是：
本发明通过使用促进剂，使得5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷可以被乳糖酶快速水解，并可根据反应后的显色情况确定乳糖酶的酶活，可以制备乳糖酶活性速测卡。
通过进一步使用稳定剂，可以提高产品保存的稳定性，制备速测卡更方便。当5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷使用其他方法可以稳定保存且临时配制使用检测液时，可以省略使用稳定剂。
通过进一步使用乳化剂，可以进一步提高显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的分散情况，分散更为均匀，有利于更快、更好地获得检测结果。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术。以下实施例中，如未特别说明，百分含量指质量百分含量。
实施例1
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、0.08％聚乙烯吡咯烷酮、10mmol/L硫酸锌、25mmol/L磷酸二氢钾的混合液，烘干，制备成显色底物片，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例2
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.08％聚乙烯吡咯烷酮、100mmol/L硫酸锌、25mmol/L磷酸二氢钾的混合液，烘干，并被覆有热敏胶的OPP膜上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例3
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、0.08％聚乙烯吡咯烷酮的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例4
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、10mmol/L硫酸锌、50mmol/L磷酸二氢钾的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例5
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、10mmol/L硫酸锌、75mmol/L磷酸二氢钾、0.1％聚乙烯吡咯烷酮的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例6
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.01mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、100mmol/L硫酸锌、50mmol/L磷酸二氢钾、0.4％聚乙烯吡咯烷酮的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例7
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、0.01％聚乙烯吡咯烷酮、10mmol/L硫酸锌、25mmol/L磷酸二氢钾的混合液，烘干，制备成显色底物片，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
实施例8
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、0.01％β-环糊精、0.05％葡聚糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mmol/L硫酸锌、25mmol/L磷酸二氢钾的混合液，烘干，制备成显色底物片，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
对比例1
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
对比例2
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、聚乙烯吡咯烷酮的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
对比例3
将直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附溶于N,N-二甲基甲酰胺的0.05mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、10mmol/L硫酸锌、25mmol/L磷酸二氢钾的混合液，烘干，并用上盖膜覆盖，装配成乳糖酶速测卡。
乳糖酶活性速测卡的使用过程如下：
1.标准曲线及色卡建立
方法：根据购进乳糖酶产品标注的酶活单位将乳糖酶用pH6.5的PB-EDTA缓冲液配成每毫升200单位的酶溶液，并进行十倍稀释，取本实施例1制备的乳糖酶速测卡分别滴加各酶梯度稀释液50微升，同时滴加蒸馏水为空白对照。反应3min后即可获得酶活色卡；也可以取本实施例1制备的乳糖酶速测卡分别滴加各酶梯度稀释液50微升，使用光线仪器进行吸光值测定，绘制标准曲线，建立酶活测定标准。
结果：取本发明制备的乳糖酶速测卡，滴加各酶梯度稀释液，同时蒸馏水为空白对照，绘制了标准曲线，建立酶活测定标准，其结果如表1和图1所示。
表1添加各酶液后速测卡显示的颜色
注：表中颜色深浅程度为：深蓝色>蓝色>天蓝色>淡蓝色>无色
在表1中可知，滴加系列浓度乳糖酶液后，实施例1-4的速测卡颜色呈一定梯度变化，3min时实施例1显色变化明显；当酶液浓度为2U/ml时，实施例1的速测卡颜色为淡蓝色(+)，而对比例2、3的速测卡为无色(-)或者淡蓝色(+)，说明缺乏了乳化剂或者促进剂使得反应速率下降，降低了速测卡的灵敏度。后续试验中延长反应时间到25min以上时，实施例3、4显色程度才逐渐接近实施例1的速测卡3min时的显色程度，反应时间大大延长。而对比例1仅使用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的速测卡，反应后的颜色变化不如本发明实施例的颜色变化。
2.乳糖酶速测卡稳定加速试验
方法：将实施例1、2所制备的乳糖酶速测卡放置于36℃培养箱中，于1d、7d、15d、30d记录乳糖酶速测卡的颜色并滴加蒸馏水进行检测。
表2高温放置一定天数的乳糖酶速测卡测试结果
| 时间(d) | 1 | 7 | 15 | 30 |
| 实施例1 | 无色 | 无色 | 无色 | 淡蓝色 |
| 实施例2 | 无色 | 淡蓝色 | 淡蓝色 | 蓝色 |
| 对比例1 | 淡蓝色 | 淡蓝色 | 蓝色 | 蓝色 |
注：表中颜色深浅程度为：蓝色>淡蓝色>无色
表3高温放置的乳糖酶速测卡滴加蒸馏水测试结果
| 时间(d) | 1 | 7 | 15 | 30 |
| 实施例1 | 无色 | 无色 | 无色 | 淡蓝色 |
| 实施例2 | 无色 | 淡蓝色 | 天蓝色 | 蓝色 |
| 对比例1 | 淡蓝色 | 天蓝色 | 蓝色 | 蓝色 |
注：表中颜色深浅程度为：蓝色>天蓝色>淡蓝色>无色
结果：由表2和表3可知，未加入稳定剂的乳糖酶速测卡，放置一定时间后显色剂自动降解，降解后的乳糖酶速测卡即失去检测判定的作用；同时放置于室温的实施例2乳糖酶速测卡在放置40d后也出现淡蓝色，而实施例1乳糖酶速测卡的显色正常，说明显色剂制作成乳糖酶速测卡后容易缺乏稳定性，而本发明制备的乳糖酶速测卡稳定。
3.各种添加助剂的对比试验
方法：根据购进乳糖酶产品标注的酶活单位将乳糖酶用pH6.5的PB-EDTA缓冲液配成每毫升20单位的酶溶液，取实施例1、3、4制备的速测卡分别滴加各酶梯度稀释液50微升，同时滴加蒸馏水为空白对照。反应3min、6min、10min后记录显色情况，其结果如表4所示：
表4乳糖酶速测卡滴加蒸馏水测试结果
注：表中颜色深浅程度为：深蓝色>蓝色>淡蓝色>无色
结果：由表4可知，缺乏乳化剂的实施例4中，因为显色剂与酶接触不好因此反应较慢，6min才显示颜色。缺乏促进剂的实施3在室温下反应时反应效果较差。对比例1均没有乳化剂和促进剂，直接滴加酶液10min内不变色，滴加酶液16min才开始出现淡蓝色。实施例1制备的乳糖酶速测卡反应及时而且显色正常。
综上所述，本发明制备的乳糖酶活性的检测速测卡(见图2)，添加有乳化剂、促进剂以及稳定剂的速测卡，显色时间更长、显色更稳定以及显色更及时。
Claims (10)
1.一种检测乳糖酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和促进剂添加到检测液；
(2)检测液中添加待测的酶液，根据反应的颜色变化，判断待测酶液中乳酸酶的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测液还包括稳定剂、乳化剂的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种；优选的，所述的促进剂在检测液中的终浓度为10-100mmol/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精中的至少一种；优选的，稳定剂在检测液中的质量百分数为0.01％-0.5％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮；优选的，乳化剂的质量百分数为0.01％-1％。
6.一种检测乳糖酶活性的半定量速测卡，其特征在于，该速测卡包含底板、显色底物片和上盖膜；所述的显色底物片固定5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、促进剂，所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种。
7.根据权利要求6所述的乳糖酶活性半定量速测卡，其特征在于，所述显色底物片还固定有稳定剂、乳化剂的至少一种；所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。
8.一种检测乳糖酶活性的试剂盒，其特征在于，包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、促进剂，所述的促进剂为硫酸锌和磷酸二氢钾的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括稳定剂和乳化剂的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的稳定剂为葡聚糖和β-环糊精；所述的乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 510663 Building 213, No. 2 E, No. 1 Heng Street, No. 1 Heng Street, No. 2, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant after: GUANGZHOU YUEFENG BIOLOGICAL CONTROL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 510670 Building 404, A5, No. 3 Scientific Research Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant before: GUANGZHOU YUEFENG BIOLOGICAL CONTROL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221101 Address after: Room 304, building 5, No. 3, Kexue Road, Huangpu District, Guangzhou, Guangdong 510663 Patentee after: Guangzhou Xinyuan Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 510663 213, building e, No. 2, Yiheng Road, Yiheng street, tiantougang Second Road, Xintang District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee before: GUANGZHOU YUEFENG BIOLOGICAL CONTROL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |