CN109928979B

CN109928979B - 吲哚酮类衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN109928979B
Application number: CN201811463649.1A
Authority: CN
Inventors: 朱加望; 蔡家强; 李桂英; 游泽金; 吴勇勇; 韩润丰; 葛勇; 王利春; 王晶翼
Original assignee: Sichuan Kelun Biotech Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sichuan Kelun Biotech Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN109928979A

Abstract

本发明涉及式(A)所示化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，还涉及含有该化合物的药物组合物。该化合物可用于治疗癌症或免疫系统疾病。

Description

吲哚酮类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及吲哚酮类衍生物及其制备方法和用途，还涉及含有该吲哚酮类衍生物的药物组合物。该吲哚酮类衍生物可用于治疗癌症或免疫系统疾病。

背景技术

癌症是严重危害人类生活质量和生命健康的一类重大疾病。肿瘤免疫治疗因其有效、安全、低不良反应等特点，成为肿瘤治疗有前途的新疗法，其通过调动或恢复宿主的天然防御机制获得抗肿瘤效应。

BET(Bromodomains and extra-terminal)蛋白属于BRD(Bromodomain)家族，是识别并结合乙酰化赖氨酸的关键蛋白分子。BET蛋白家族主要包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。BET蛋白含有两个串联保守的溴结构域(Bromodomain)BD1和BD2以及一个ET结构域(Extraterminal domain)。BD1/2可以用来识别染色质上的乙酰化赖氨酸，启动染色质复合物的招募和转录活性。BRD4蛋白通过招募正转录延伸因子P-TEFb(positive tran-scription elongation factor b)在RNA聚合酶II启始的转录中起重要作用，进而调控细胞周期、细胞增殖和致癌、炎症反应和氧化应激等过程。BRD4在中线癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、卵巢癌等实体瘤中过表达，也是白血病发病的重要蛋白。

目前有多个BRD4抑制剂处于临床研究阶段，适应症主要为肿瘤，但尚无BRD4抑制剂上市。需要进一步开发高效低毒的新型结构的BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)抑制剂。

发明内容

本发明的一方面提供式(A)所示化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，

其中，R¹选自氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、5-12元杂芳基、3-12元杂环基、(C_1-6亚烷基)-(3-12元杂环基)、(C_1-6亚烷基)-(5-12元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵和-CONR^4aR^4b，其中C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、5-12元杂芳基、3-12元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-12环烷基、5-12元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代；

R²各自独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、-NR^4aR^4b、5-12元杂芳基、3-12元杂环基、(C_1-6亚烷基)-(3-12元杂环基)、(C_1-6亚烷基)-(5-12元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵或-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b和-NR^4aSO₂R⁵，其中C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、-NR^4aR^4b、5-12元杂芳基、3-12元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-10环烷基、5-6元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代；

r为选自0、1、2、3、4、5中的任意整数；当r大于1时，每个R²相同或不同；

R³各自独立地选自选自氢、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、卤素和C_1-3卤代烷基；

q为选自0、1、2、3；当q大于1时，每个R³相同或不同；

X，Y，Z，M各自独立地选自-NR^4a-，-C(O)-，-C(R^4aR^4b)-，-O-，-S(O)-，-S(O₂)-和-S-；

m，n，p各自独立地选自0或1，且m、n、p之和大于或等于1；

环A为5-10元杂芳基或C_6-12芳基；

环B为5-6元杂芳基，所述杂芳基可被一个或多个选自卤素、甲基、氰基的取代基在任意位置取代；

R^4a、R^4b各自独立地选自氢、C_1-3烷基、羟基-C_1-3烷基、氨基-C_1-3烷基、甲基氨基-C_1-3烷基、二甲基氨基-C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、C_6-12芳基、5-12元杂芳基、5-6元杂环基、C_5-6环烷基；当同一结构式中包含多个R^4a时，多个R^4a相同或不同；当同一结构式中包含多个R^4b时，多个R^4b相同或不同；

R⁵选自氢、羟基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_6-12芳基、5-12元杂芳基、5-6元杂环基、C_5-6环烷基。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的另一方面提供一种制备本发明的药物组合物的方法，所述方法包括将本发明的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药与一种或多种药学上可接受的载体组合。

本发明的另一方面提供一种药物制剂，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，或者本发明的药物组合物。

本发明的另一方面提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、本发明的药物组合物或本发明的药物制剂在制备用于预防或治疗BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病中的用途，优选地，所述疾病为癌症或免疫系统疾病。

本发明的另一方面提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药或者本发明的药物组合物，其用于治疗BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病。优选地，所述疾病为癌症(例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、中线癌、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、卵巢癌、白血病)或免疫系统疾病。优选地，所述药物为通过口服、静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内或经皮途径给药的药物，

本发明的另一方面提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药或者本发明的药物组合物在制备作为BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)抑制剂的药物中的用途。

定义

除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本文中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。

如本文中所使用，术语“亚烷基”表示饱和二价烃基，优选表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的饱和二价烃基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。

如本文中所使用，术语“烷基”定义为直链或支链的饱和脂肪族烃基。在一些实施方案中，烷基具有1至12个，例如1至6个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C_1-6烷基”指具有1至6个碳原子的直链或支链的基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基或正己基)，其可任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基如卤素取代(此时该基团被称作“卤代烷基”，例如CF₃、C₂F₅、CHF₂、CH₂F、CH₂CF₃、CH₂Cl或-CH₂CH₂CF₃等)。

如本文中所使用，术语“环烷基”指饱和或不饱和的非芳族单环或多环(诸如双环)烃环(例如单环，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基，或双环，包括螺环、稠合或桥连系统(诸如双环[1.1.1]戊基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或双环[5.2.0]壬基、十氢化萘基等)，其可任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基取代。所述环烷基具有3至15个，例如3至6个碳原子。例如，术语“C_3-6环烷基”指具有3至6个成环碳原子的饱和或不饱和的非芳族单环或多环(诸如双环)烃环(例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基)，其可任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基取代，例如甲基取代的环丙基。

如本文中所使用，术语“芳基”指具有共轭π电子系统的全碳单环或稠合环多环芳族基团。在一些实施方案中，芳基具有6至14个，例如6至10个碳原子。例如，如本文中所使用，术语“C_6-14芳基”意指含有6至14个碳原子的芳族基团，诸如苯基或萘基。芳基可任选地被一个或多个(诸如1至3个)适合的取代基(例如卤素、-OH、-CN、-NO₂、C_1-6烷基等)取代。

如本文中所使用，术语“杂芳基”指单环或多环芳族环系，例如其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，且其包含至少一个可以相同或不同的杂原子(例如氧、氮或硫)，并且，另外在每一种情况下可为苯并稠合的。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基等，以及它们的苯并衍生物；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物。

如本文中所使用，术语“卤代”或“卤素”基团定义为包括F、Cl、Br或I。

如本文中所使用，术语“烷氧基”意指通过氧原子连接至母体分子部分的如上文所定义的烷基。C_1-6烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。

如本文中所使用，术语“杂环基”指饱和或不饱和的单环或多环基团，例如其在环中具有2、3、4、5、6、7、8或9个碳原子和一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)选自C(＝O)、O、S、S(＝O)、S(＝O)₂和NR(其中R表示适合的取代基)的含杂原子的基团，例如但不限于环氧乙烷基、氮丙啶基、氮杂环丁基(azetidinyl)、氧杂环丁基(oxetanyl)、四氢呋喃基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、咪唑烷基、吡唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基(dithianyl)、硫吗啉基、哌嗪基、三噻烷基(trithianyl)等。

术语“取代”指所指定的原子上的一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)氢被从所指出的基团的选择代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物。取代基和/或变量的组合仅仅当这种组合形成稳定的化合物时才是允许的。

如果取代基被描述为“任选地被…取代”，则取代基可(1)未被取代或(2)被取代。如果取代基的碳被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则碳上的一个或多个氢(至存在的任何氢的程度)可单独和/或一起被独立地选择的任选的取代基替代。如果取代基的氮被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则氮上的一个或多个氢(至存在的任何氢的程度)可各自被独立地选择的任选的取代基替代。

如果取代基被描述为“独立地选自”一组，则各取代基独立于另一者被选择。因此，各取代基可与另一(其他)取代基相同或不同。

如本文中所使用，术语“一个或多个”意指在合理条件下的1个或超过1个，例如2个、3个、4个、5个或10个。

除非指明，否则如本文中所使用，取代基的连接点可来自取代基的任意适宜位置。

当取代基的键显示为穿过环中连接两个原子的键时，则这样的取代基可键连至该可取代的环中的任一成环原子。

本发明还包括所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其与本发明的化合物相同，除了一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于在自然界中占优势的原子质量或质量数的原子替代。适合包含入本发明的化合物中的同位素的实例包括(但不限于)氢的同位素(例如²H、³H)；碳的同位素(例如¹¹C、¹³C及¹⁴C)；氯的同位素(例如³⁶Cl)；氟的同位素(例如¹⁸F)；碘的同位素(例如¹²³I及¹²⁵I)；氮的同位素(例如¹³N及¹⁵N)；氧的同位素(例如¹⁵O、¹⁷O及¹⁸O)；磷的同位素(例如³²P)；及硫的同位素(例如³⁵S)。某些同位素标记的本发明的化合物(例如掺入放射性同位素的那些)可用于药物和/或底物组织分布研究(例如分析)中。放射性同位素氚(即³H)及碳-14(即¹⁴C)因易于掺入且容易检测而特别可用于该目的。用正电子发射同位素(例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O及¹³N)进行取代可在正电子发射断层显像术(PET)研究中用于检验底物受体占据情况。被同位素标记的本发明的化合物可通过与描述于随附路线和/或实施例及制备中的那些类似的方法通过使用适当的被同位素标记的试剂代替之前采用的非标记的试剂来制备。本发明的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶溶剂可被同位素取代的那些，例如，D₂O、丙酮-d₆或DMSO-d₆。

术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)不对称中心的化合物中，其可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。类似地，本发明的化合物可以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合物(通常称作互变异构体)存在。互变异构体的代表性实例包括酮-烯醇互变异构体、苯酚-酮互变异构体、亚硝基-肟互变异构体、亚胺-烯胺互变异构体等。例如，二氢嘧啶基团在溶液中可以下列互变异构形式平衡存在。要理解，本申请的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的异构体或其混合物。

本文中可使用实线(-)、实楔形

或虚楔形

描绘本发明的化合物的碳-碳键。使用实线以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，包括该碳原子处的所有可能的立体异构体(例如，特定的对映异构体、外消旋混合物等)。使用实或虚楔形以描绘键连至不对称碳原子的键欲表明，存在所示的立体异构体。当存在于外消旋混合物中时，使用实及虚楔形以定义相对立体化学，而非绝对立体化学。除非另外指明，否则本发明的化合物意欲可以立体异构体(其包括顺式及反式异构体、光学异构体(例如R及S对映异构体)、非对映异构体、几何异构体、旋转异构体、构象异构体、阻转异构体及其混合物)的形式存在。本发明的化合物可表现一种以上类型的异构现象，且由其混合物(例如外消旋混合物及非对映异构体对)组成。

本发明涵盖本发明的化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。

还应当理解，本发明的某些化合物可以游离形式存在用于治疗，或适当时，以其药学上可接受的衍生物形式存在。在本发明中，药学上可接受的衍生物包括但不限于：药学上可接受的盐、溶剂合物、代谢物或前药，在将它们向需要其的患者给药后，能够直接或间接提供本发明的化合物或其代谢物或残余物。因此，当在本文中提及“本发明的化合物”时，也意在涵盖化合物的上述各种衍生物形式。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。

适合的酸加成盐由形成药学可接受盐的酸来形成。实例包括乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐及其它类似的盐。

适合的碱加成盐由形成药学可接受盐的碱来形成。实例包括铝盐、精氨酸盐、胆碱盐、二乙胺盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐及其它类似的盐。

适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。用于制备本发明的化合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。

本发明的化合物可以溶剂合物(优选水合物)的形式存在，其中本发明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。

在本发明的范围内还包括本发明的化合物的代谢物，即在给药本发明的化合物时体内形成的物质。这样的产物可由例如被给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物的代谢物，包括通过使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的时间的方法制得的化合物。

本发明在其范围内进一步包括本发明的化合物的前药，其为自身可具有较小药理学活性或无药理学活性的本发明的化合物的某些衍生物当被给药至身体中或其上时可通过例如水解裂解转化成具有期望活性的本发明的化合物。通常这样的前药会是所述化合物的官能团衍生物，其易于在体内转化成期望的治疗活性化合物。关于前药的使用的其他信息可参见“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，第14卷，ACS Symposium Series(T.Higuchi及V.Stella)及“Bioreversible Carriers in Drug Design,”PergamonPress,1987(E.B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association)。本发明的前药可例如通过用本领域技术人员已知作为“前-部分(pro-moiety)(例如“Design ofProdrugs”，H.Bundgaard(Elsevier,1985)中所述)”的某些部分替代本发明的化合物中存在的适当官能团来制备。

本发明还涵盖含有保护基的本发明的化合物。在制备本发明的化合物的任何过程中，保护在任何有关分子上的敏感基团或反应基团可能是必需的和/或期望的，由此形成本发明的化合物的化学保护的形式。这可以通过常规的保护基实现，例如，在ProtectiveGroups in Organic Chemistry,ed.J.F.W.McOmie,Plenum Press,1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,1991中所述的那些保护基，这些参考文献通过援引加入本文。使用本领域已知的方法，在适当的后续阶段可以移除保护基。

本文中术语“约”是指在所述数值的±10％范围内，优选±5％范围内，更优选±2％范围内。

本文中所使用的化合物名称与化学结构式不一致时，以化学结构式为准。

化合物

本发明提供式(A)所示化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，

q为选自0、1、2、3；当q大于1时，每个R³相同或不同；

m，n，p各自独立地选自0或1，且m、n、p之和大于或等于1；

环A为5-10元杂芳基或C_6-12芳基；

R⁵选自氢、羟基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_6-12芳基、5-12元杂芳基、5-6元杂环基、C_5-6元环烷基。

在本发明的某些实施方案中，环B为吡唑-4-基、噻唑-5-基或异恶唑-4-基，所述吡唑-4-基、噻唑-5-基或异恶唑-4-基可任选地被一个或多个选自卤素、甲基、氰基的取代基在任意位置取代。

在本发明的某些实施方案中，环B为异恶唑-4-基，所述异恶唑-4-基可任选地被一个或多个选自卤素、甲基的取代基在任意位置取代。

在本发明的某些实施方案中，环B为

在本发明的某些实施方案中，本发明所述的化合物具有以下式(I)所示的结构：

其中：R¹、R²、r、R³、q、X、Y、Z、M、m、n、p、A的定义如本文所述。

在本发明的某些实施方案中，R^4a、R^4b各自独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙基氧基、异丙基氧基、氨基乙基、(甲基氨基)乙基、(二甲基氨基)乙基、羟乙基。

在本发明的某些实施方案中，环A选自以下基团：

其中，位置1与Z连接，位置2与M连接，R^4a的定义如本文所述，

在本发明的某些实施方案中，环A为

其中，位置1与Z连接，位置2与M连接。

在本发明的某些实施方案中，M为-O-或-CH₂-，p为0或1。

在本发明的某些实施方案中，M为-CH₂-，p为0或1。

在本发明的某些实施方案中，R¹选自氢、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基、(C_1-3亚烷基)-(3-6元杂环基)、(C_1-3亚烷基)-(5-6元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵和-CONR^4aR^4b，其中C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-6环烷基、3-6元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代，其中R^4a、R^4b及R⁵的定义如本文所述。

在本发明的某些实施方案中，R¹选自氢、卤素、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙基氧基、异丙基氧基、氨基乙基、(甲基氨基)乙基、(二甲基氨基)乙基、氨基羰基、1H-吡咯-3-基、吗啉-4-基羰基、-CH₂CH₂-COOH、1H-吡唑-4-基、1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基。

在本发明的某些实施方案中，R¹选自氢、(二甲基氨基)乙基、氨基羰基、1H-吡咯-3-基、吗啉-4-基羰基、-CH₂CH₂-COOH、1H-吡唑-4-基、1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基。

在本发明的某些实施方案中，R²选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、-NR^4aR^4b、5-6元杂芳基、3-6元杂环基、-(C_1-3亚烷基)-(3-6元杂环基)、-(C_1-3亚烷基)-(5-6元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵或-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵，其中C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、-NR^4aR^4b、5-6元杂芳基、3-6元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-6环烷基、5-6元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代，其中R^4a、R^4b及R⁵的定义如本文所述。

在本发明的某些实施方案中，R²选自氢、卤素、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙基氧基、异丙基氧基、氨基乙基、羟基乙基、(甲基氨基)乙基、氨基羰基、1H-吡咯-3-基、吗啉-4-基羰基、-CH₂CH₂-COOH、1H-吡唑-4-基、1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基、(二甲基氨基)乙基、三氟乙基、-COOH、2-羟基-2-甲基-丙基、2-羟丙基、2-甲氧基-乙氧基、-S(O)CH₃、-S(O₂)CH₃、-CH₂S(O)CH₃、-CH₂S(O₂)CH₃、4-甲基哌嗪-1-基、4-甲基哌嗪-1-基-乙基。

在本发明的某些实施方案中，R²选自氢、氟、羟基乙基、(二甲基氨基)乙基、三氟乙基、-COOH、2-羟基-2-甲基-丙基、氨基羰基、2-羟丙基、-CH₂CH₂-COOH、2-甲氧基-乙氧基、-S(O)CH₃、-S(O₂)CH₃、-CH₂S(O)CH₃、-CH₂S(O₂)CH₃、吗啉-4-基羰基、1H-吡唑-4-基、4-甲基哌嗪-1-基、4-甲基哌嗪-1-基-乙基。

在本发明的某些实施方案中，r为0或1。

在本发明的某些实施方案中，R³为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、正丙基氧基、异丙基氧基、氟、氯、溴、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氟代乙基、二氟代乙基或三氟代乙基。

在本发明的某些实施方案中，R³为氢或氟。

在本发明的某些实施方案中，q为选自0或1。

在本发明的某些实施方案中，其中，

选自以下结构：

其中*表示X与分子其他部分连接的位置，**表示Z与分子其他部分连接的位置，R^4a的定义如本文所述，

上述结构中的亚甲基可任选被一个或两个各自独立地选自卤素、羟基、C_1-3烷基、C_1-3卤代烷基的取代基取代。

在本发明的某些实施方案中，

选自以下结构：

其中R^4a为氢、羟乙基或(二甲基氨基)乙基。

在本发明的某些实施方案中，本发明所述的化合物的结构如式II-a、II-b、II-c或II-d所示：

其中，X，Y，Z，M，R¹，R²，R³，r，环A以及环B如本发明所述。

在本发明的某些实施方案中，本发明所述的化合物的结构如式III-a、III-b、III-c或III-d所示：

其中，X，Y，Z，M，R¹，R²以及环B如本发明所述。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的化合物具有以下式(I)所示的结构：

其中，R¹可选自氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、5-12元杂芳基、3-12元杂环基、(C_1-6亚烷基)-(3-12元杂环基)、(C_1-6亚烷基)-(5-12元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵或-CONR^4aR^4b，其中C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、5-12元杂芳基、3-12元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-12环烷基、5-12元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代；

R²各自独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、-NR^4aR^4b、5-12元杂芳基、3-12元杂环基、-(C_1-6亚烷基)-(3-12元杂环基)、-(C_1-6亚烷基)-(5-12元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵或-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCO0R^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵，其中C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、-NR^4aR^4b、5-12元杂芳基、3-12元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-10环烷基、5-6元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代；当R²为多个时，多个R²相同或不同；

R³各自独立地选自氢、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、卤素、或C_1-3卤代烷基；当R³为多个时，多个R³相同或不同；

R^4a、R^4b各自独立地选自氢、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、C_6-12芳基、5-12元杂芳基、5-6元杂环基、C_5-6环烷基；当R^4a为多个时，多个R^4a相同或不同；当R^4b为多个时，多个R^4b相同或不同；

R⁵选自氢、羟基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_6-12芳基、5-12元杂芳基、5-6元杂环基、C_5-6元环烷基；

m，n，p各自独立地选自0或1，且m、n、p之和大于或等于1；q独立地选自1-3中的任意整数，r独立地选自1-5中的任意整数；

环A为5-10元杂芳基或C_6-12芳基；

X，Y，Z，M独立地选自NR^4a，C，O，或S，当所述X，Y，Z，M中的一个或多个为C时，所述C可任选被一个或两个各自独立地选自羟基、＝O、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、卤素的取代基取代；当所述X，Y，Z，M中的一个或多个为S时，所述S可任选被1-2个＝O取代。

根据本发明的某些实施方案，环A为5-6元杂芳基、苯基、或萘基。

根据本发明的某些实施方案，环A选自以下基团：

其中，位置1与Z连接，位置2与M连接；

R^4a如上文定义。

根据本发明的某些实施方案，R¹选自氢、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基、-(C_1-3亚烷基)-(3-6元杂环基)、-(C_1-3亚烷基)-(5-6元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵或-CONR^4aR^4b，其中C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-6环烷基、3-6元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代；

优选地，R¹选自氢、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基、-(C_1-3亚烷基)-(3-6元杂环基)、-(C_1-3亚烷基)-(5-6元杂芳基)、-COOH、-COO(C_1-3烷基)、-CO(C_1-3烷基)、-CO(C_1-3卤代烷基)、-CO(3-6元杂环基)、-CO(5-6元杂芳基)、-CON(C_1-3烷基)₂、-CONH(C_1-3烷基)、-CONH₂、-SO(C_1-3烷基)、-SO₂(C_1-3烷基)，其中C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自F、Cl、Br、I、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、C_3-6环烷基、3-6元杂环基、-N(C_1-3烷基)₂、-NH(C_1-3烷基)、-NH₂、-COOH、-COO(C_1-3烷基)、-CO(C_1-3烷基)、-CON(C_1-3烷基)₂、-CONH(C_1-3烷基)、-CONH₂、-SO(C_1-3烷基)、-SO₂(C_1-3烷基)的取代基所取代；

其中R^4a、R^4b的定义如上文所述。

根据本发明的某些实施方案，R²选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、-NR^4aR^4b、5-6元杂芳基、3-6元杂环基、-(C_1-3亚烷基)-(3-6元杂环基)、-(C_1-3亚烷基)-(5-6元杂芳基)、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵或-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵，其中C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、-NR^4aR^4b、5-6元杂芳基、3-6元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、-NR^4aR^4b、C_3-6环烷基、5-6元杂环基、-COOR^4a、-COR⁵、-SOR⁵、-SO₂R⁵、-CONR^4aR^4b、-OCOR⁵、-OCONR^4aR^4b、-NR^4aCOR⁵、-NR^4aCOOR^4a、-NR^4aCONR^4aR^4b、-NR^4aSO₂R⁵的取代基所取代；

优选地，R²选自氢、F、Cl、Br、I、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、-N(C_1-3烷基)₂、-NH(C_1-3烷基)、-NH₂、5-6元杂芳基、3-6元杂环基、-(C_1-3亚烷基)-(3-6元杂环基)、-(C_1-3亚烷基)-(5-6元杂芳基)、-COOH、-COO(C_1-3烷基)、-CO(C_1-3烷基)、-CO(C_1-3卤代烷基)、-CO(3-6元杂环基)、-CO(5-6元杂芳基)、-CON(C_1-3烷基)₂、-CONH(C_1-3烷基)、-CONH₂、-SO(C_1-3烷基)、-SO₂(C_1-3烷基)，其中C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、5-6元杂芳基、3-6元杂环基可任选被一个或多个各自独立地选自F、Cl、Br、I、羟基、氰基、硝基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、C_3-6环烷基、3-6元杂环基、-N(C_1-3烷基)₂、-NH(C_1-3烷基)、-NH₂、-COOH、-COO(C_1-3烷基)、-CO(C_1-3烷基)、-CON(C_1-3烷基)₂、-CONH(C_1-3烷基)、-CONH₂、-SO(C_1-3烷基)、-SO₂(C_1-3烷基)的取代基所取代；

其中R^4a、R^4b的定义如上文所述。

根据本发明的某些实施方案，

选自以下结构，其中*表示X与分子其他部分连接的位置，**表示Z与分子其他部分连接的位置：

上述结构中的亚甲基可任选被一个或两个各自独立地选自卤素、羟基、C_1-3烷基、C_1-3卤代烷基的取代基取代，优选地，所述亚甲基可任选被一个或两个各自独立地选自F、Cl、CF₃、羟基、甲基的取代基取代；

其中R^4a如上文定义。

根据本发明的某些实施方案，所述化合物的结构如式IV-a、IV-b、IV-c、或IV-d所示：

其中，X，Y，Z，M，R¹，R²，R³，r，及环A如上文定义。

根据本发明的某些实施方案，所述化合物的结构如式V-a、V-b、V-c、V-d所示：

其中，X，Y，Z，M，R₁，R₂如上文定义。

在部分实施方案中，M选自化学键、O或CH₂，所述CH₂可任选被一个或两个各自独立地选自羟基、＝O、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、卤素的取代基取代；优选地，M选自化学键、O或CH₂。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的化合物选自：

制备方法

在某些实施方案中，本发明的化合物通过以下合成方式获得：

步骤一：化合物1-1在强碱作用下进行生成芳基碳负离子，再与PMB保护的5-溴靛红(化合物1-2)发生加成反应生成三级醇(化合物1-3)。该反应所用强碱包括但不限于tBuLi、iBuLi、nBuLi，优选地采用nBuLi；反应温度为-78℃至25℃，优选地采用-78℃；溶剂包括但不限于乙醚、THF、二氧六环，优选地采用THF；

步骤二：化合物1-3在缩合剂作用下发生Mitsunobu成环反应得到化合物1-4；所述缩合剂包括但不限于PPh₃/DEAD、PPh₃/DIAD，优选为PPh₃/DEAD；溶剂选自THF、DMF、DCM、CH₃CN、或二氧六环，优选为THF；反应温度为0℃-80℃，优选温度为25℃。

步骤三：化合物1-4与化合物1-5经Suzuki偶联反应得到化合物1-6；优选地，所述反应在催化剂和/或碱的存在下进行，所用催化剂选自Pd(PPh₃)₄、PdCl₂(dppf)，优选为PdCl₂(dppf)；所用碱选自K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、或NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂选自DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、或二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O或/和二氧六环/H₂O；

步骤四：化合物1-6在酸作用下脱保护基得到化合物1-7。所述酸选自TFA、HOAc、HCl、甲酸、甲磺酸、三氟甲磺酸，优选为TFA；反应温度为25-150℃，优选温度为100-130℃；

步骤五：化合物1-7发生偶联反应生成化合物1-8。优选地，所述反应在催化剂、配体和碱的存在下进行，所用催化剂选自CuCl、CuBr、CuI、CuCl₂，优选为CuI；所用配体为N,N’-二甲基乙二胺、1,10-邻菲咯啉、trans-N、N’-二甲基环己二胺、trans-环己二胺、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺，优选为(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺；所用碱为K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂为DMSO、DMF、CH₃CN、二氧六环，优选为二氧六环。

步骤一：化合物2-1与化合物2-2在强碱作用下经加成反应生成化合物2-3。该反应所用强碱包括但不限于tBuLi、iBuLi、nBuLi，优选地采用nBuLi；反应温度为-78℃至25℃，优选地采用-78℃；溶剂包括但不限于乙醚、THF、二氧六环，优选地采用THF；

步骤二：化合物2-3与化合物2-4经过偶联反应得到化合物2-5；优选地，所述反应在催化剂催化和碱的条件下进行，所述催化剂选自Pd(PPh₃)₄、PdCl₂(dppf)，优选为PdCl₂(dppf)；所用碱为K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂为DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O和二氧六环/H₂O，进一步优选为二氧六环/H₂O；

步骤三：化合物2-5与化合物2-6在酸作用下经缩合反应得到化合物2-7。所用酸包括但不限于甲磺酸、对甲苯磺酸、TFA、三氟甲磺酸、HCl，优选为对甲苯磺酸；所用溶剂为苯、甲苯、二甲苯、二氧六环，优选为甲苯；反应温度为80-130℃，优选温度为100-120℃。

步骤一：化合物3-1经傅-克反应生成化合物3-2，优选地，所述反应在取代苯酚和/或Lewis酸的存在下进行；所用Lewis酸为Sc(OTf)₃、AlCl₃、FeCl₃、SnCl₄、BF₃·Et₂O、ZnCl₂，优选为Sc(OTf)₃；溶剂为MeOH、DCM、DMF、CH₃CN、二氧六环、THF、DCE，优选为DCE；反应温度为-20-80℃，优选温度为0℃；

步骤二：化合物3-2经环合反应生成化合物3-3。优选地，所述反应在缩合剂的存在下进行；所用缩合剂包括但不限于PPh₃/DEAD或PPh₃/DIAD，优选采用PPh₃/DIAD；溶剂选自THF、DMF、DCM、CH₃CN、或二氧六环，优选为THF；反应温度为0℃-80℃，优选温度为0℃；

步骤三：化合物3-3与化合物3-4经偶联反应得到化合物3-5。优选地，所述反应在催化剂和碱的存在下进行；所用催化剂选自Pd(PPh₃)₄、PdCl₂(dppf)，优选为PdCl₂(dppf)；所用碱为K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂为DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O和二氧六环/H₂O，进一步优选为二氧六环/H₂O；

步骤四：化合物3-5经脱保护基反应得到化合物3-6。所述反应在酸性试剂的存在下进行，所用酸性试剂选自TFA、HOAc、HCl、甲酸、甲磺酸、和三氟甲磺酸，优选为TFA；反应温度为25-150℃，优选温度为100-130℃。

步骤一：化合物1-4经氧化反应得到化合物4-1。所用氧化剂组合选自FeCl₃/TBHP、NHPI/Co(OAc)₂/O₂、H₂O₂，优选为FeCl₃/TBHP；所用溶剂为DCM、DCE、DMF、THF、吡啶、二氧六环，优选为吡啶；反应温度为25-100℃，优选温度为90-100℃；

步骤二：化合物4-1经过偶联反应得到化合物4-2。优选地，所述反应在催化剂和碱的存在下进行；所用催化剂选自Pd(PPh₃)₄或PdCl₂(dppf)，优选为PdCl₂(dppf)；所用碱选自K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、或NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂选自DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、或二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O或二氧六环/H₂O，进一步优选为二氧六环/H₂O；

步骤三：化合物4-2经过脱保护基反应得到化合物4-3。所述反应在酸的存在下进行，所用酸为TFA、HOAc、HCl、甲酸、甲磺酸、三氟甲磺酸，优选为TFA；反应温度为25-150℃，优选温度为100-130℃。

步骤四：化合物4-3经还原反应生成化合物4-4，优选地，所述反应在NaBH₄催化下进行；所用溶剂为MeOH、EtOH、THF，优选为MeOH；反应温度为-20℃-80℃，优选为0℃。

步骤一：化合物5-1与水合肼反应生成化合物5-2。所用溶剂选自MeOH、EtOH、或THF，优选为MeOH；反应温度为0℃-100℃，优选为80℃；

步骤二：化合物5-2与化合物5-3经过成环反应生成化合物5-4。优选地，所述反应在催化剂的催化下进行，所用催化剂优选为Rh催化剂；氧化剂选自DDQ、MnO₂、或CAN，优选为MnO₂；所用溶剂选自MeOH、THF、DMF、DMSO、NMP、CH₃CN、或二氧六环，优选为THF；反应温度为25℃-120℃，优选为60-80℃；

步骤三：化合物5-4经过脱保护基反应得到化合物5-5。所述反应在酸的存在下进行，所用酸为TFA、HOAc、HCl、甲酸、甲磺酸、三氟甲磺酸，优选为TFA；反应温度为25-150℃，优选温度为100-130℃。

步骤一：化合物6-1与化合物6-2发生格氏加成得到化合物6-3。所用溶剂选自THF、Et₂O、或二氧六环，优选为THF；反应温度为-78℃-25℃，优选为-78-0℃；

步骤二：化合物6-3经过环化反应得到化合物6-4，优选地，所述反应在酸作用下进行，所用酸选自TFA、HOAc、HCl、甲酸、或BF₃·Et₂O，优选为BF₃·Et₂O；反应温度为25-120℃，优选温度为60-80℃；

步骤三：化合物6-4经过偶联反应得到化合物6-5。优选地，所述反应在催化剂和碱的存在下进行，所用催化剂选自Pd(PPh₃)₄或PdCl₂(dppf)，优选为PdCl₂(dppf)；所用碱选自K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、或NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂选自DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、或二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O或二氧六环/H₂O，进一步优选为二氧六环/H₂O。

步骤一：化合物6-1与化合物7-1发生环化得到化合物7-2。优选地，所述反应在金属试剂的存在下进行，所用金属试剂选自In、Zn、Fe、或Cu，优选为In；溶剂选自DMSO、DMF、CH₃CN、二氧六环，或THF，优选为DMF；反应温度为25-120℃，优选温度为25-40℃；

步骤二：化合物7-2经过偶联反应得到化合物7-3。优选地，所述反应在碱的存在下进行，所用碱选自K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂选自DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、或二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O或二氧六环/H₂O，进一步优选为二氧六环/H₂O。

步骤一：化合物8-1进行Boc保护反应生成化合物8-2。优选地，所述反应在碱的存在下进行，所述碱选自Et₃N、DIPEA、Na₂CO₃、K₂CO₃、或Cs₂CO₃，优选为Na₂CO₃；溶剂选自DMSO、DMF、CH₃CN、二氧六环、或THF，优选为THF；反应温度为25-100℃，优选温度为60-80℃；

步骤二：化合物8-2与化合物8-3经过两次烷基化反应生成化合物8-4。优选地，所述反应在碱的存在下进行，所述碱选自tBuOK、NaOH、NaH、或吡啶，优选为NaH；溶剂选自DMSO、DMF、CH₃CN、二氧六环、或THF，优选为DMF；反应温度为0-80℃，优选温度为0-25℃；

步骤三：化合物8-4经过脱Boc保护基反应生成化合物8-5。优选地，所述反应在酸的存在下进行，所述酸为HCl或TFA；溶剂选自DCM、二氧六环、或CH₃CN，优选为DCM或二氧六环；反应温度为-20-40℃，优选温度为0-25℃；

步骤四：化合物8-5经过偶联反应生成化合物8-6。优选地，所述反应在碱性条件下进行，所用碱选自K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、或NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂选自DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、或二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O或二氧六环/H₂O，进一步优选为二氧六环/H₂O。

在部分技术方案中，本发明的化合物通过以下合成方式获得：

步骤一：化合物9-1与化合物9-2或9-3经Suzuki偶联反应得到化合物9-4。优选地，所述反应在催化剂和/或碱的存在下进行，所用催化剂选自Pd(PPh₃)₄、PdCl₂(dppf)，优选为PdCl₂(dppf)；所用碱选自K₂CO₃、Cs₂CO₃、K₃PO₄、Na₂CO₃、或NaHCO₃，优选为K₂CO₃；反应温度为25-120℃，优选温度为80-100℃；溶剂选自DMSO/H₂O、DMF/H₂O、CH₃CN/H₂O、或二氧六环/H₂O，优选为DMF/H₂O或/和二氧六环/H₂O；

步骤二：化合物9-4在酸作用下脱保护基得到化合物9-5。所述酸选自TFA、HOAc、HCl、甲酸、甲磺酸、三氟甲磺酸，优选为TFA；反应温度为25-150℃，优选温度为100-130℃。

药物组合物和药物制剂

本发明还提供一种药物组合物，其包含预防或治疗有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)中所述。

本发明的药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或者通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。

对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂等。

本发明的化合物在药物组合物中的含量或用量可以是约0.01mg至约1000mg，适合地是0.1-500mg，优选0.5-300mg，更优选1-150mg。

本发明的另一目的在于提供一种制备本发明的药物组合物的方法，所述方法包括将本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药与一种或多种药学上可接受的载体组合。

本发明的另一目的在于提供一种药物制剂，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者它们的混合物，或者本发明的药物组合物

治疗方法和用途

本发明还提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病的药物中的用途，所述BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病为癌症或免疫系统疾病。

本发明还提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药或者本发明的药物组合物在制备作为BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)抑制剂的药物中的用途。

本发明还提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者本发明的药物组合物，其用于预防或治疗BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病的药物中的用途，所述BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病为癌症或免疫系统疾病。

本发明还提供本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药、或者本发明的药物组合物，其用于抑制细胞中的BRD蛋白活性，特别是BRD4蛋白的活性。

本发明还提供预防或治疗BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病的方法，所述方法包括向需要其的个体给药有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，或者本发明的药物组合物，所述BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)相关疾病为癌症或免疫系统疾病。

本发明还提供抑制细胞中BRD蛋白(特别是BRD4蛋白)活性的方法，所述方法包括给予细胞有效量的本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药，或者本发明的药物组合物。

本发明的化合物或其药学可接受的盐、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、代谢物或前药可以与其他抗肿瘤剂联合用药，来治疗癌症。所述其他抗肿瘤剂是指具有治疗癌症及其相关病症活性的物质。

本发明所述的癌症包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、中线癌、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、卵巢癌、白血病。

所述“联合用药”包括同时、顺序、交替地使用两种或更多种药物，特别地包括将两种或更多种药物制成存在于一个或多个剂量单位中，获得适宜联合用药的药物产品，并将所述药物产品向需要联合用药的哺乳动物给药。

如本文中所使用的术语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一或多种症状的化合物的量。

可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整。

所给药的本发明的化合物的量会取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。

除非另外说明，否则如本文中所使用，术语“治疗”意指逆转、减轻、抑制这样的术语所应用的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状的进展，或预防这样的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状。

如本文所使用的“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。

具体实施方式

实施例

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。

本文中的缩写具有以下含义：

以下实施例中记载的化合物的结构通过¹H NMR或MS来确证。反应的监测采用薄层色谱法(TLC)或LCMS。¹H NMR的测定仪器为Bruker 400MHz核磁共振仪(型号AVACE III HD400MHz)，测定溶剂为CD₃OD、CDCl₃或DMSO-d₆，内标物质为TMS，全部δ值用ppm值表示。质谱(MS)的测定仪器为Aglient 1260Infinity/Aglient 6120Quadrupole。微波反应使用BiotageInitiator微波反应器进行。柱色谱法一般使用青岛海洋200～300目硅胶为载体。薄层色谱采用为硅胶GF 254为固定相。在以下实施例中，如无特殊说明，反应的温度为室温(15-30℃)。

本申请中所使用的试剂购自Acros Organics、Aldrich Chemical Company或特伯化学等公司。

实施例1：5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-3'-H-螺[吲哚-3,1'-异苯并呋喃]-2-酮(化合物30)的制备

第一步：化合物30b的制备

化合物30a(1.0g,5.4mmol)溶于20mL MeOH中，冰浴下加入NaBH₄(1.0g,5.6mmol)，室温反应2h，反应液经EA萃取、浓缩后，硅胶柱层析分离纯化得化合物30b(1g)。

第二步：化合物30e的制备

将化合物30d(9.04g,40mmol)溶于90mL DMF，0℃下分批加入NaH(2.4g,60mmol)，室温搅拌30min，滴加入化合物30c，于室温反应2h，经硅胶柱层析纯化得化合物30e(7.2g)。

第三步：化合物30f的制备

将化合物30b(0.54g,2.9mmol)溶于10mL THF中，-78℃下滴加入n-BuLi(2.3mL,5.8mmol)，于-78℃下搅拌30min，再将化合物30e(1.0g,2.9mmol)的THF溶液滴加入反应体系，于-78℃下反应30min，再自然升至室温反应1h，经硅胶柱层析纯化得化合物30f(0.65g)。

第四步：化合物30g的制备

将化合物30f(0.65g,1.43mmol)、PPh₃(0.56g,2.2mmol)溶于10mL THF中，N₂保护，于-10℃下滴加DEAD(0.75g,4.3mmol)，于室温反应1h，经硅胶柱层析纯化得化合物30g(0.4g)。

第五步：化合物30i的制备

将化合物30g(200mg,0.46mmol)，化合物30h(123mg,0.55mmol)，K₂CO₃(190mg,1.38mmol)，PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂(38mg,0.046mmol)溶于10mL二氧六环和4mL水中，N₂保护，于95℃下反应过夜，经硅胶柱层析得到化合物30i(90mg)。

第六步：化合物30的制备

将化合物30i(90mg,0.20mmol)溶于3mL TFA中，于微波条件下加热至130℃反应3h，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得到化合物30(30mg)。MS m/z(ESI):333(M+1).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：7.91(s,1H),7.42-7.37(m,2H),7.28-7.23(m,1H),7.19-7.15(m,1H),7.02-6.97(m,2H),6.93-6.89(m,1H),5.64(d,J＝12.0Hz,1H),5.44(d,J＝12.0Hz,1H),2.32(s,3H),2.18(s,3H).

实施例2：5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)螺[吲哚-3,1'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物31)的制备

第一步：化合物31c的制备

将化合物31b(1.28g,6.36mmol)溶于10mL THF中，-78℃下滴加入n-BuLi(5.1mL,12.7mmol)，于-78℃下搅拌30min，再将化合物31a(2.0g,5.78mmol)的THF溶液滴加入反应体系，于-78℃下反应30min，再自然升至室温反应1h，经硅胶柱层析分离纯化得化合物31c(1.5g)。

第二步：化合物31d的制备

将化合物31c、PPh₃(1.26g,4.81mmol)溶于10mLTHF中，N₂保护，于-10℃下滴加DEAD(0.838g,4.81mmol)，于室温反应1h，经硅胶柱层析分离纯化得化合物31d(1.3g)。

第三步：化合物31f的制备

将化合物31d(250mg,0.56mmol)，化合物31e(150mg,0.672mmol)，K₂CO₃(194mg,1.4mmol)，PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂(46mg,0.056mmol)溶于10mL二氧六环和4mL水中，N₂保护，于95℃下反应过夜，经硅胶柱层析分离纯化得化合物31f(130mg)。

第四步：化合物31的制备

将化合物31f(130mg,0.28mmol)溶于3mL TFA中，于100℃反应60h，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得化合物31(40mg)。MS m/z(ESI):347(M+1).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：8.16(s,1H),7.23(d,J＝4.4Hz,2H),7.17-7.14(m,1H),7.11-7.08(m,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.97(s,1H),6.68(d,J＝7.6Hz,1H),4.89-4.83(m,1H),4.20-4.15(m,1H),3.24-3.16(m,1H),2.97-2.91(m,1H),2.30(s,3H),2.17(s,3H).

实施例3：5'-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2,2-二甲基螺[[d][1,3]苯并二噁英-4,3'-二氢吲哚]-2'-酮(化合物32)的制备

第一步：化合物32c的制备

将化合物32b(5.51g，32mmol)溶于30mL THF，N₂保护，-75℃下，将n-BuLi滴加入到体系中，1h后，再将32a(6.0g，26mmol)溶于50mL THF并滴加入反应体系，自然升至室温后反应过夜，经硅胶柱层析得到化合物32c(1.72)。

第二步：化合物32e的制备

将化合物32c(1.72g，5.41mmol)、32d(1.45g，6.49mmol)、K₂CO₃(1.86g，13.52mmol)和Pd(dppf)Cl₂(396mg，0.54mmol)溶于40mL二氧六环和8mL水中，N₂保护，于100℃反应过夜，经硅胶柱层析得到化合物32e(500mg)。

第三步：化合物32的制备

将化合物32e(172mg,0.51mmol)、32f(4mL)和对甲基苯磺酸(50mg)溶于6mL甲苯，于120℃分水反应过夜，经制备硅胶板分离纯化得到化合物32(10mg)。MS m/z(ESI):377(M+1)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.73(s,1H),7.37-7.21(m,2H),7.08-6.96(m,3H),6.91(t,J＝7.6Hz,1H),6.63(d,J＝7.7Hz,1H),2.30(s,3H),2.13(s,3H),1.61(d,J＝9.7Hz,6H).

实施例4：5'-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2H-螺[苯并呋喃-3,3'-吲哚]-2'-酮(化合物33)的制备

第一步：化合物33b的制备

将Cs₂CO₃(3.7g,11.4mmol)加入到三甲基碘化亚砜(2.5g,11.4mmol)的CH₃CN溶液中，50℃下反应50min。再将化合物33a(2.0g,5.7mmol)的CH₃CN溶液缓慢滴加入反应体系，5min后过滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析分离纯化得化合物33b(1.6g)。第二步：化合物33c的制备

0℃下，将Sc(CF₃SO₃)₃(42mg,0.1mmol)加入到C₆H₅OH(480mg,5.1mmol)及化合物33b(600mg,1.7mmol)的DCE溶液中，0℃下反应4h。反应液浓缩后经硅胶柱层析分离纯化得化合物33c(250mg)。

第三步：化合物33d的制备

0℃下，将DIAD(145mg,0.7mmol)的THF溶液滴加入化合物33c(250mg,0.6mmol)和PPh₃(188mg,0.7mmol)的THF溶液中，0℃下反应4h。反应液经硅胶柱层析分离纯化得化合物33d(160mg)。

第四步：化合物33f的制备

将化合物33d(60mg，0.2mmol)、化合物33e(44mg,0.2mmol)、Pd(dppf)Cl₂(2mg,0.002mmol)和K₂CO₃(38mg,0.3mmol)溶于二氧六环/水(2mL/0.2mL)的混合溶液，N₂保护，于90℃下反应16h。反应液过滤，滤液浓缩后经制备型TLC分离纯化得化合物33f(40mg)。

第五步：化合物33的制备

将化合物33f(40mg,0.1mmol)溶于1mL TFA中，于微波条件下加热至130℃反应7h，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得到化合物33(10mg)。MS m/z(ESI):347(M+1).¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.72(s,1H),7.27(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.33(ddd,J＝8.1,7.4,1.5Hz,1H),7.13(d,J＝1.5Hz,1H),7.04(d,J＝8.0Hz,1H),6.96(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(td,J＝7.4,0.9Hz,1H),6.76(dd,J＝7.5,1.1Hz,1H),4.85(d,J＝9.3Hz,1H),4.76(d,J＝9.3Hz,1H),2.31(s,3H),2.14(s,3H).

实施例5：5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-5'-氟-3'-H-螺[吲哚-3,1'-异苯并呋喃]-2-酮(化合物34)的制备

第一步：化合物34b的制备

化合物34a(1.0g,5.0mmol)溶于20mLMeOH中，然后在冰浴下加入NaBH₄(1.0g,5.6mmol)，反应2h，反应液经EA萃取浓缩后，经硅胶柱层析分离纯化得化合物34b(1g)。第二步：化合物34d的制备

将化合物34b(0.59g,2.9mmol)溶于10mL THF中，-78℃下滴加入n-BuLi(2.3mL,5.8mmol)，于-78℃下搅拌30min，再将化合物34c(1.0g,2.9mmol)的THF溶液滴加入反应体系，于-78℃下反应30min，再自然升至室温反应1h，经硅胶柱层析纯化得化合物34d(0.68g)。

第三步：化合物34e的制备

将化合物34d(0.67g,1.43mmol)、PPh₃(0.56g,2.2mmol)溶于10mL THF中，N₂保护，于-10℃下滴加DEAD(0.75g,4.3mmol)，于室温反应1h，经硅胶柱层析纯化得化合物34e(0.38g)。

第四步：化合物34g的制备

将化合物34e(208mg,0.46mmol)，化合物34f(123mg,0.55mmol)，K₂CO₃(190mg,1.38mmol)，PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂(38mg,0.046mmol)溶于10mL二氧六环和4mL水中，N₂保护，于95℃下反应过夜，经硅胶柱层析得到化合物34g(80mg)。

第五步：化合物34的制备

将化合物34g(80mg,0.17mmol)溶于3mL TFA中，于微波条件下加热至130℃反应3h，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得到化合物34(25mg)。MS m/z(ESI):351(M+1).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：8.38(s,1H),7.20-7.16(m,1H),7.10-7.06(m,1H),7.02-6.98(m,2H),6.98-6.93(m,1H),6.88-6.84(m,1H),6.60(d,J＝12.4Hz,1H),5.39(d,1H,J＝12.4Hz),2.33(s,3H),2.19(s,3H).

实施例6：5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-1-(1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基)-3'-H-螺[吲哚-3,1'-异苯并呋喃]-2-酮(化合物35)的制备

第一步：化合物35b的制备

将化合物35a(300mg,1.55mmol)和K₂CO₃(428mg,3.10mmol)溶于20mL CH₃CN中，然后加入2,2,2-三氟乙基三氟甲烷磺酸酯(538mg,2.32mmol)，氮气保护，于90℃反应过夜，经硅胶柱层析分离纯化得化合物35b。

第二步：化合物35的制备

将化合物35b(20mg,0.06mmol)、化合物35h(20mg,0.07mmol)、K₂CO₃(21mg,0.15mmol)、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(7mg,0.048mmol)和CuI(3mg,0.012mmol)溶于3mL二氧六环中，N₂保护，于90℃反应过夜，过滤，滤液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得化合物35。MS m/z(ESI):481(M+1).¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ：8.26(s,1H),7.95(d,J＝0.4Hz,1H),7.38-7.47(m,3H),7.28-7.31(m,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.13(d,J＝1.2Hz,1H),6.95(d,J＝7.6Hz,1H),5.44-5.57(m,2H),5.01-5.08(m,2H),2.32(s,3H),2.17(s,3H).

实施例7：5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-1-(1H-吡唑-4-基)-3'-H-螺[吲哚-3,1'-异苯并呋喃]-2-酮(化合物36)的制备

第一步：化合物36b的制备

将化合物36a(1000mg,5.15mmol)和Et₃N(1040mg,10.3mmol)溶于20mL DMF中，然后加入TrtCl(1720mg,6.18mmol)，室温反应过夜，经硅胶柱层析分离纯化得化合物36b。

第二步：化合物36d的制备

将化合物36b(79mg,0.181mmol)、化合物36c(50mg,0.151mmol)、K₂CO₃(52mg,0.378mmol)、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基-1,2-环己二胺(17mg,0.121mmol)和CuI(6mg,0.03mmol)溶于5mL二氧六环中，氮气保护，于90℃搅拌过夜，过滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析分离纯化得化合物36d。

第三步：化合物36的制备

将化合物36d(20mg,0.03mmol)溶于3mL甲醇中，然后加入1mL冰乙酸，75℃搅拌反应3h，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得化合物36。MS m/z(ESI):399(M+1).¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ：8.10(s,1H),7.89(s,1H),7.36-7.48(m,3H),7.28-7.32(m,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,1H),7.12(d,J＝1.6Hz,1H),6.96(d,J＝8.0Hz,1H),5.45-5.57(m,2H),2.32(s,3H),2.17(s,3H).

实施例8:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)螺[吲哚-3-1'-异苯并二氢吡喃]-2,4'-二酮(化合物37)的制备

第一步：化合物37b的制备

将化合物37a(700mg,1.56mmol)溶于5mL的Py中，然后加入FeCl₃(5mg)和TBHP(0.652mL,4.68mmol)，于90℃下反应6h，经硅胶柱层析分离纯化得化合物37b(50mg)。

第二步：化合物37d的制备

将化合物37b(50mg,0.108mmol)，化合物37c(36mg,0.161mmol)，K₂CO₃(38mg,0.27mmol)，PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂溶于5mL二氧六环和1mL的水中，于85℃下反应5h，经制备型TLC分离得到化合物37d(43mg)。

第三步：化合物37的制备

将化合物37d(43mg,0.0896mmol)溶于2mL的TFA中，，于微波条件下加热至130℃反应6h，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得到化合物37(14mg)。MS m/z(ESI):361(M+1).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：8.21-8.19(m,1H),7.84(br,1H),7.54-7.51(m,2H),7.28(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.13(d,J＝1.6Hz,1H),7.08(d,J＝8.0Hz,1H),6.78-6.76(m,1H),5.35(d,J＝17.6Hz,1H),4.53(d,J＝17.6Hz,1H),2.37(s,3H),2.24(s,3H).

实施例9:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-4'-羟基螺[吲哚-3-1'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物38)的制备

将化合物38a(3mg,0.008mmol)溶于1mL甲醇中，然后加入NaBH₄(1mg,0.026mmol)，于室温下反应30min，反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得到化合物38(2mg)。MS m/z(ESI):363(M+1).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：8.01(s,1H),7.58(d,J＝7.2Hz,1H),7.38(t,J＝7.6Hz,1H),7.25-7.21(m,2H),7.05(s,1H),7.04(d,J＝8.0Hz,1H),6.64(d,J＝7.6Hz,1H),4.8(t,J＝2.8Hz,1H),4.52(dd,J＝11.2,3.6Hz,1H),4.18(dd,J＝11.2,2.4Hz,1H),2.34(s,3H),2.20(s,3H).

实施例10:5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)螺[二氢吲哚-3,1'-二氢异吲哚]-2,3'-酮(化合物39)的制备

第一步：化合物39b的制备

将化合物39a(150mg，0.41mmol)和BocNPPh₃(172mg，0.46mmol)溶于3mL二氧六环溶液，于95℃反应过夜，经制备型TLC分离纯化得到化合物39b(130mg)。第二步：化合物39c的制备

将化合物39b(130mg)溶于3mL甲醇，再加入水合肼(260mg)，于80℃反应2h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩，得到粗品化合物39c(110mg)。

第三步：化合物39e的制备

将化合物39d(200mg)、Et₃N(300mg)溶于5mL THF，再滴加入三甲基乙酰氯(200mg)，室温反应3h，将反应体系倒入水中淬灭，用EA萃取，无水硫酸干燥，过滤后，浓缩得到粗品化合物39e(340mg)。

第四步：化合物39f的制备

将粗品化合物39c(110mg)、粗品化合物39e(100mg)、MnO₂(60mg)和[CP*RhCl]₂(15mg)溶于4mL THF，于65℃反应4h，反应液通过制备型TLC分离纯化得到化合物39f(38mg)。

第五步：化合物39的制备

将化合物39f(38mg)溶于2mL TFA，于微波条件下加热至130℃反应8h。反应液浓缩后经制备型高效液相色谱法分离纯化得到化合物39(12mg)，MS m/z(ESI):346(M+1)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：11.00(s,1H),9.07(s,1H),7.86-7.70(m,1H),7.61-7.50(m,2H),7.34(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H),7.18-7.05(m,2H),6.96(d,J＝1.8Hz,1H),2.27(s,3H),2.10(s,3H).

实施例11：5'-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2,3-二氢螺[茚-1,3'-吲哚啉]-2'-酮(化合物40)的制备

第一步：化合物40c的制备

-78℃下，将化合物40b(4.4mL，4.4mmol)的THF溶液加入到化合物40a(500mg,2.2mmol)的THF(5mL)溶液中，-78℃反应2h。反应液经硅胶柱层析得到化合物40b(200mg)。

第二步：化合物40d的制备

室温下将三氟化硼乙醚溶液(100mg,0.7mmol)加入到化合物40c(150mg,0.5mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，60℃反应16h，用饱和碳酸钠调节反应体系Ph>8，经制备型TLC分离纯化得到化合物40d(100mg)。

第三步：化合物40的合成

将化合物40d(60mg,0.2mmol)、化合物40e(67mg，0.3mmol)、Pd(dppf)Cl₂(2mg,0.002mmol)和K₂CO₃(38mg，0.3mmol)溶于2mL二氧六环和0.2mL水中，N₂保护，于90℃下反应16h。过滤，滤液浓缩后经制备型高效液相色谱分离得化合物40(5mg)。MS m/z(ESI):331(M+1).¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:10.56(s,1H),7.37(d,J＝7.5Hz,1H),7.23(td,J＝8.3,1.4Hz,2H),7.10(t,J＝7.4Hz,1H),7.05-6.93(m,2H),6.66(d,J＝7.5Hz,1H),3.30-3.13(m,2H),2.60-2.52(m,1H),2.44-2.40(m,1H),2.31(s,3H),2.13(s,3H).

实施例12：5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)螺[二氢吲哚-3,3'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物41)的制备

第一步：化合物41a的制备

将5-溴靛红(900mg,4.0mol)、1,2-二(溴甲基)苯(2.1g,8.0mol)、铟(0.92g,8.0mol)以及NaI(2.40g,16.0mol)置于50mL单口瓶中，加入15mL DMF，于30℃反应过夜。LC-MS检测反应完全后过滤，滤液用水洗涤，EtOAc萃取，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱层析分离得化合物41a(450mg)。MS m/z(ESI):331(M+1)。

步骤二：化合物41的制备

室温下，将化合物41a(450mg，1.37mmol)、化合物41b(915mg，4.1mmol)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(112mg，0.137mmol)和碳酸钾(556mg，4.1mmol)加入到1,4-二氧六环/H₂O(10:1(v/v),11mL)中，氮气保护下于80℃，反应16小时，LC-MS检测反应完成后降至室温，过滤，滤液用水洗涤，EtOAc萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析分离得化合物41(110mg)。MS m/z(ESI):347(M+1)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：8.27(s,1H)，7.24–7.33(m,2H),7.11–7.19(m,3H),6.98(m,1H),6.52(s,1H),5.23(d,J＝16,1H),5.00(d,J＝16,1H),3.48(d,J＝16,1H),2.88(d,J＝16Hz,1H),2.21(s,3H),2.06(s,3H).

实施例13:(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-3'，4'-二氢-2'H-螺[二氢吲哚-3,1'-萘]-2-酮(化合物42)的制备

第一步：化合物42b的制备

将镁屑(500mg,20.8mmol)，和少量碘置于一50mL三口烧瓶中，加入无水THF 20mL，再加入少量1-溴-3-苯基丙烷，置于油浴中加热至微沸引发反应，逐滴滴加1-溴-3-苯基丙烷(共2mL)，滴毕，回流反应2h，得化合物42b，不经处理直接投入下一步反应。

第二步：化合物42c的制备

将5-溴靛红(1g,4.4mmol)溶解于20mL无水THF中，冷却至-40℃,向其中逐滴滴加前一步化合物42b的THF溶液，滴毕后逐渐升至室温，反应过夜。饱和NH₄Cl溶液淬灭后乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱硅胶柱层析分离纯化得化合物42c(0.4g)。第三步：化合物42d的制备

将化合物42c(400mg,1.22mmol)溶解于10mL无水DCM中，加入三氟化硼乙醚(494mg,3.4mmol)，回流过夜。反应结束后加入饱和NaHCO₃溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取并用无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离纯化得化合物42d(0.27g)。

第四步：化合物42的制备

将化合物42d(275mg,0.84mmol)溶解于10mL 1,4-二氧六环和水的混合溶剂中(V/V＝10/1)，依次加入碳酸钾(348mg,2.5mmol)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(69mg,0.08mmol)和3,5-二甲基异恶唑-4-硼酸频哪醇酯(562mg,2.5mmol)，80℃反应过夜。反应液用乙酸乙酯萃取并用无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离纯化得化合物42(0.12g)。MS m/z(ESI):345(M+1)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：7.25–7.08(m,3H),7.06–6.95(m,3H),6.52–6.40(m,1H),3.00–2.83(m,2H),2.30(s,3H),2.27–2.20(m,1H),2.12(s,3H),2.09–2.03(m,1H),2.00–1.90(m,2H).

实施例14：5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-3'，4'-二氢-1'H-螺[二氢吲哚-3,2'-萘]-2-酮(化合物43)的制备

第一步：化合物43b的制备

将化合物43a(5g,23.7mmol)溶解于150mL THF中，依次加入碳酸钠(25g,23.5mmol)和二碳酸二叔丁酯(12.8g,58.6mmol)，60℃下反应12h，反应结束后过滤，滤夜经硅胶柱层析分离得化合物43b(3.1g)。

第二步：化合物43d的制备

将43b(500mg,1.6mmol)溶解于10mL无水DMF中，冰浴下缓慢加入NaH(160mg,4mmol)，30min后加入化合物43c(386.2mg,1.4mmol)，反应12h后加入饱和NH₄Cl溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离纯化得化合物43d(100mg)。

第三步：化合物43e的制备

将化合物43d(100mg,0.3mmol)溶解于1mL二氯甲烷中，加入TFA 1mL，室温反应2h后加入饱和NaHCO₃溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得化合物43e(70mg)。

第四步：化合物43的制备

将化合物43e(70mg,0.21mmol)溶解于5mL 1,4-二氧六环和水的混合溶剂中(V/V＝10/1)，依次加入K₂CO₃(89mg,0.64mmol)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(18mg,0.02mmol)和3,5-二甲基异恶唑-4-硼酸频哪醇酯(72mg,0.32mmol)，80℃反应过夜。反应结束后乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离纯化得化合物43(20mg)。MS m/z(ESI):343(M+1)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：10.60(s,1H),7.26–7.18(m,3H),7.13–7.09(m,2H),6.98(d,J＝8.0Hz,1H),6.55(d,J＝1.7Hz,1H),3.19–3.04(m,2H),3.03–2.92(m,1H),2.73(d,J＝15.3Hz,1H),2.18(s,3H),2.14–2.06(m,1H),1.98(s,3H),1.85–1.79(m,1H).ESI-MS(m/z):343.2[M+H]⁺

实施例15：5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-6'-氟螺[二氢吲哚-3,1'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物44)的制备

第一步：化合物44b的制备

氮气保护下将化合物44a(500.00mg,2.27mmol)溶解于10mL THF中，冷却至-78℃，缓慢加入n-BuLi(2.60mL,5.23mmol)，于-78℃搅拌30min后将化合物31a(785.00mg,2.27mmol)的THF溶液滴加入反应体系，于-78℃下反应30min，再自然升至室温反应1h，经硅胶柱层析分离纯化得化合物44b(500.00mg)。

第二步：化合物44c的制备

氮气保护下将化合物44b(500.00mg，1.03mmol)、PPh₃(296.00mg,1.20mmol)溶解于10mL THF中，冷却至-10℃，滴加DEAD(208.80mg,1.20mmol)的THF溶液(2mL)，于室温反应1h，经硅胶柱层析分离纯化得化合物44c(300.0mg)。

第三步：化合物44e的制备

氮气保护下将化合物44c(70mg,0.15mmol)、化合物44d(43mg,0.19mmol)、K₂CO₃(42mg,0.3mmol)和PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂(12mg,0.015mmol)置于反应瓶中，加入二氧六环(2mL)和水(0.5mL)，加热至95℃下反应过夜，反应结束后冷却至室温，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化得化合物44e(50mg)。

第四步：化合物44的制备

将化合物44e(50mg,0.10mmol)溶于3mL TFA中，于100℃反应60h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩并经制备型高效液相色谱分离纯化得化合物44(15mg)。MS m/z(ESI):365.1(M+1).¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),7.30(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.14(dd,J＝9.7,2.6Hz,1H),7.05(dd,J＝13.1,4.8Hz,2H),6.95(td,J＝8.7,2.7Hz,1H),6.61(dd,J＝8.7,5.6Hz,1H),4.53(ddd,J＝12.2,8.5,4.0Hz,1H),4.14–4.02(m,1H),3.12–2.98(m,1H),2.89(dt,J＝16.6,4.1Hz,1H),2.29(s,3H),2.12(s,3H).

实施例16：5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-7'-氟螺[二氢吲哚-3,1'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物45)的制备

第一步：化合物45b的制备

将化合物45a(5.0g，21.46mmol)溶解于THF(100mL)中，在冰浴下搅拌均匀，分批次加入LiAlH₄(1.5g，39.47mmol)，室温搅拌15h，TLC检测(展开剂PE/EA＝1:1)待原料完全转化。反应结束后加水淬灭反应，随后加入15％的NaOH水溶液，用EA萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩至干，经硅胶柱层析分离纯化(PE:EA＝3:2)得到化合物45b(2.7g)。

第二步：化合物45d的制备

将化合物45b(300mg,1.37mmol)溶解于干燥的THF(10mL)中，-78℃下滴加入n-BuLi(1.37mL,3.42mmol)，保持-78℃下反应30min，再将化合物45c(523mg,1.51mmol)的THF溶液滴加入反应体系中，于-78℃下反应30min后自然升至室温反应1h。反应结束后加水淬灭反应，用EA萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩至干，经硅胶柱层析分离纯化(PE:EA＝7:3)得到化合物45d(204mg)。

第三步：化合物45e的制备

氮气保护下将化合物45d(204mg,0.42mmol)和PPh₃(166mg,0.63mmol)溶解于THF中，于-10℃下滴加DEAD(128mg,0.63mmol)，室温反应1h后减压蒸除溶剂，经制备型TLC分离纯化(PE:EA＝3:1)得到化合物45e(84mg)。

第四步：化合物45g的制备

氮气保护下将化合物45e(84mg，0.17mmol)、化合物45f(46mg,0.20mmol)、K₂CO₃(59mg,0.43mmol),和PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂(14mg,0.02mmol)置于反应瓶中，加入二氧六环(10mL)和水(4mL)，加热至100℃下反应4h。反应结束后将反应体系倒入水中，用EA萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩至干，经制备型TLC分离纯化(PE:EA＝5:1)分离纯化得化合物45g(62mg)。

第五步：化合物45的制备

将化合物45g(62mg)溶解于3mL TFA中，于微波条件下加热至130℃反应5h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩至干并经制备型高效液相色谱分离纯化得化合物45(30mg)。MSm/z(ESI):365.1(M+1).

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：10.72(s,1H),7.36-7.31(m,2H),7.13-7.03(m,3H),6.36(dd,J＝9.5,2.7Hz,1H),4.56-4.50(m,1H),4.14-4.08(m,1H),3.05-2.98(m,1H),2.90-2.84(m,1H),2.30(s,3H),2.12(s,3H).

实施例17：5-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)螺[二氢吲哚-3,1'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物46)的制备

第一步：化合物46b的制备

氮气保护下将化合物31d(100mg,0.22mmol)、化合物46a(107mg,0.33mmol)、K₂CO₃(60mg,0.44mmol)和PdCl₂(dppf).CH₂Cl₂(9mg,0.011mmol)置于反应瓶中，加入二氧六环(5mL)和水(0.5mL)，加热至95℃反应过夜，反应结束后冷却至室温，经硅胶柱层析分离纯化得化合物46b(90mg)。

第二步：化合物46的制备

将化合物46b(90mg,0.16mmol)溶解于3mL TFA中，加热至100℃反应8h，反应结束后，冷却至室温，减压浓缩后经制备型高效液相色谱分离纯化得化合物46(25mg)。MS m/z(ESI):346.1(M+1).¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.20(s,1H),10.55(s,1H),7.27–7.16(m,3H),7.12–7.07(m,1H),6.97(d,J＝8.0Hz,1H),6.88(d,J＝1.6Hz,1H),6.57(d,J＝7.6Hz,1H),4.56(ddd,J＝12.4,8.6,4.0Hz,1H),4.09(dt,J＝11.1,4.8Hz,1H),3.09–2.98(m,1H),2.87(dt,J＝16.4,4.1Hz,1H),2.07(s,6H).

实施例18：5-(4-甲基噻唑-5-基)螺[二氢吲哚-3,1'-异苯并二氢吡喃]-2-酮(化合物47)的制备

第一步：化合物47b的制备

将化合物47a(400mg，4.04mmol)溶解于10mL冰醋酸中，于0℃下加入溴素(176mg，4.44mmol)，TLC监测至原料完全转化，反应结束后用饱和亚硫酸钠溶液淬灭反应，EtOAc萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离得化合物47b(200mg)。MS m/z(ESI):179(M+1)。

第二步：化合物47c的制备

氮气保护下将化合物47b(300mg,1.69mmol)、B₂pin₂(861mg，3.39mmol)、Pd(dppf)Cl₂(30mg,0.04mmol)和KOAc(332mg，3.39mmol)置于反应瓶中，加入20mL乙二醇二甲醚，加热至80℃反应8h。反应结束后冷却至室温，过滤并将滤液用水洗涤，EtOAc萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离得化合物47c(400mg)。MSm/z(ESI):226(M+1)。

第三步：化合物47d的制备

氮气保护下将化合物37a(90mg,0.2mmol)、化合物47c(68mg，0.3mmol)、Pd(dppf)Cl₂(2mg,0.002mmol)和K₂CO₃(38mg，0.3mmol)置于反应瓶中，加入二氧六环(2mL)和水(0.2mL)，加热至90℃反应16h。反应结束后冷却至室温，过滤并将滤液用水洗涤，EtOAc萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离得化合物47d(20mg)。MS m/z(ESI):469(M+1)。

第四步：化合物47的制备

将化合物47d(20mg)溶解于于2mL TFA，于微波条件下加热至130℃反应8h。反应结束后冷却至室温，减压浓缩至干，经制备型高效液相色谱分离纯化得到化合物47(6mg)，MSm/z(ESI):349.1(M+1)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ：8.81(s,1H),7.42-7.44(m,1H),7.20-7.23(m,2H),7.06-7.10(m,3H),7.63-7.65(m,1H),4.69-4.89(m,1H),4.13-4.16(m,1H),3.13-3.19(m,1H),2.90-2.95(m,1H),2.38(s,3H).

药理学测试

试验例1：BRD结合实验(BRD binding assay)

蛋白：BRD2(BD2)-GST tag、BRD3(BD2)-GST tag、BRD4(BD2)-GST tag、BRDT(BD1)-GST tag，分别购自于Cisbio。

底物：Lys(5,8,12,16)Ac]H4(1-21)-biotin，购自于Cisbio。

试剂盒：Epigeneous Binding Domain Kit B(Cisbio)，含结合域稀释缓冲液(Binding domain diluent buffer)，以及SA-acceptor、Anti GST-donor Ab。

实验：：

将待测化合物以不同浓度溶解于结合域稀释缓冲液中。在384孔板中加入不同浓度的本发明化合物和BRD蛋白(BRD2(BD2)/BRD3(BD2)/BRD4(BD2)/BRDT(BD1))，混匀，在室温下孵育10分钟后加入底物(Lys(5,8,12,16)Ac]H4(1-21)-biotin)，和不同浓度的SA-acceptor和Anti GST-donor Ab室温孵育3小时。将384孔板放入酶标仪中，在HTRF模式下，选择激发光波长为337nm，发射光波分别长为665nm和620nm来读取荧光值。基于337nm/665nm和337nm/620nm的荧光比值，采用SigmaPlot或GraphPad Prism5软件拟合本发明化合物抑制BRD的半数浓度(IC₅₀)。结果见表1-表4。

表1：BRD2(BD2)结合IC₅₀

化合物	IC<sub>50</sub>(nM)
		化合物30	14.98
化合物31	28.34
		化合物32	54.14
化合物33	11.69
		化合物34	18.97
化合物36	16.75
		化合物37	10.18
化合物38	8.11
		化合物39	25.96
化合物40	7.16
		化合物42	29.50
化合物44	8.59

表2：BRD3(BD2)结合IC₅₀

化合物	IC<sub>50</sub>(nM)
		化合物30	9.77
化合物31	11.42
		化合物32	17.89
化合物33	14.41
		化合物34	16.06
化合物36	10～30
		化合物37	约10
化合物38	约10
		化合物39	27.14
化合物40	约10
		化合物42	10～30
化合物44	10～30

表3：BRD4(BD2)结合IC₅₀

化合物	IC<sub>50</sub>(nM)
		化合物30	5.80
化合物31	2.27
		化合物32	20.09
化合物33	14.06
		化合物34	23.42
化合物36	26.15
		化合物37	11.04
化合物38	5.92
		化合物39	16.38
化合物40	6.58
		化合物42	11.86
化合物44	10.48

表4：BRDT(BD1)结合IC₅₀

化合物	IC<sub>50</sub>(nM)
		化合物31	45.52
化合物38	30～100
		化合物42	77.26
化合物44	约42.7

从表1～表4的数据可以看出，本发明化合物对多种BRD蛋白(特别是BRD4)有明显的抑制作用。

试验例2：细胞增殖抑制试验

细胞：人黑色素瘤SK-MEL-2(南京科佰)；人非小细胞肺癌A549(ATCC)。

试剂盒：CellTiter

Luminescent Cell Viability Assay(Promega)。

实验：

分别将SK-MEL-2(完全培养基：含10％胎牛血清的EMEM)和A549细胞(完全培养基：10％胎牛血清的F12K)在37℃，5％CO₂条件下进行培养。向96孔板中铺入适量细胞，培养箱中过夜培养后，移除培养基，加入含有本发明化合物的完全培养基，37℃孵育3天。第四天向每孔中加入检测试剂CellTiter Glo，化学发光检测各孔的相对发光单位(RLU)。用SigmaPlot或GraphPad软件计算得到本发明化合物分别对SK-MEL-2和A549细胞的增殖抑制IC₅₀值。

本发明化合物30对人黑色素瘤SK-MEL-2细胞增殖抑制的IC₅₀值为96.6μM；本发明化合物31、44、45、46和47对人非小细胞肺癌A549细胞增殖抑制的IC₅₀值分别为1.54μM、1.96μM、1.03μM、11.3μM、7.6μM。由此可见，以上述化合物为代表的本发明化合物对人黑色素瘤SK-MEL-2细胞及人非小细胞肺癌A549细胞均有一定抑制作用。