CN109907855A - 一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统及制备方法，该制备系统包括垫球、套筒、砝码和塑料薄膜，所述塑料薄膜设置在所述套筒内的底部，所述垫球设置在所述套筒内且与所述塑料薄膜相连，所述砝码设置在所述套筒内且在所述垫球的上方；本发明上述系统能够实现对脑损伤动物模型的制备，且制备得到的动物模型具有稳定性好、重复性好和存活时间较长；该系统通过塑料薄膜的设置，能够避免垫球直接作用于脑组织穿透硬脑膜，使脑组织受过重损伤和脑水肿，还能够利于垫球的取出。
Description
技术领域
本发明实施例涉及动物模型制备技术领域，具体涉及一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统及制备方法。
背景技术
颅脑损伤是一种常见外伤，可单独存在，也可与其他损伤复合存在。其分类根据颅脑解剖部位分为头皮损伤、颅骨损伤与脑损伤，三者可合并存在。头皮损伤包括头皮血肿、头皮裂伤、头皮撕脱伤。颅骨骨折包括颅盖骨线状骨折、颅底骨折、凹陷性骨折。脑损伤包括脑震荡、弥漫性轴索损伤、脑挫裂伤、脑干损伤。
目前，颅脑损伤占全身创伤死残率的第1位，而在1-34岁的青少年中，车祸是第1死因。随着现代化交通的发展，车祸将有增无减，因此对颅脑创伤的各种研究具有重要意义，而探寻更实用更先进的动物模型制作方式尤为重要；然而，现有动物模型的制作方式制备的颅脑损伤动物模型存活时间短、稳定性较差，且采用自由落体脑损伤装置进行脑损伤动物模型制备过程中垫球不易取出、易对周围脑组织损伤较重，出血多。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统，以解决现有技术中制备的脑损伤动物模型存活时间短、制作不稳定以及垫球不易取出的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面提供一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统，所述系统包括垫球、套筒、砝码和塑料薄膜，所述塑料薄膜设置在所述套筒内的底部，所述垫球设置在所述套筒内且与所述塑料薄膜相连，所述砝码设置在所述套筒内且在所述垫球的上方。
本发明上述系统能够实现对脑损伤动物模型的制备，且制备得到的动物模型具有稳定性好、重复性好和存活时间较长；该系统通过塑料薄膜的设置，能够避免垫球直接作用于脑组织穿透硬脑膜，使脑组织受过重损伤和脑水肿，还能够利于垫球的取出；此外，通过将垫球设置为圆形，使的损伤处损伤程度层次分明，利于观察造模结果。
进一步地，所述垫球直径为1.8-2.2mm。
进一步地，所述套筒内径为1.6-1.8cm。
进一步地，所述砝码为球状，其质量为12-16g，直径为1.4-1.5cm。
进一步地，所述塑料薄膜材质为聚乙烯；厚度为0.9-1dmm。本发明通过上述参数的限定，能够更好的模拟脑损伤发生机制，并提高制备的动物模型的稳定性和重复性。
根据本发明实施例的第二方面提供一种大鼠脑损伤动物模型的制备方法，所述制备方法采用上述系统进行制备，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将大鼠进行麻醉、固定、消毒，随后在大鼠颅骨上开设骨窗；
(b)在骨窗位置覆盖塑料薄膜，并将垫球置于塑料薄膜上且正对骨窗；
(c)将套筒垂直置于骨窗上方，再将砝码置入套筒内自由下落撞击垫球中心，直至垫球陷入脑组织1.2-1.8mm；
(d)将垫球和塑料薄膜取出脑组织、消毒、缝合头皮，即得所述大鼠脑损伤动物模型。
本发明上述方法通过在颅骨上开设骨窗，使的外力直接作用于硬脑膜外面，避免不同动物头皮及颅骨机械力学不同导致相同打击负荷造成的致伤力传导到脑组织的大小和分布差异，减少实验动物个体差异的影响。
进一步地，所述大鼠固定方式为俯卧位固定。
进一步地，所述骨窗的直径大小为3.5-4.5mm。
进一步地，所述骨窗开设方法为：沿正中失状线切开大鼠头皮，在右侧顶部、前囟后2mm、中线旁2mm处开设骨窗。
进一步地，所述塑料薄膜大小能够覆盖所述骨窗。
进一步地，所述麻醉采用的麻醉剂为10％的水合氯醛；麻醉方式为腹腔注射。
本发明通过上述参数的限定，能够更好的模拟人类受伤机制，并能够提高造模的稳定性和重复性，提高造模的存活时间。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明上述系统能够实现对脑损伤动物模型的制备，且制备得到的动物模型具有稳定性好、重复性好和存活时间较长；该系统通过塑料薄膜的设置，能够避免垫球直接作用于脑组织穿透硬脑膜，使脑组织受过重损伤和脑水肿，还能够利于垫球的取出。
(2)本发明通过将垫球设置为圆形，使的损伤处损伤程度层次分明，利于观察造模结果。
(3)本发明通过在颅骨上开设骨窗，使的外力直接作用于硬脑膜外面，避免不同动物头皮及颅骨机械力学不同导致相同打击负荷造成的致伤力传导到脑组织的大小和分布差异，减少实验动物个体差异的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例1或2提供的大鼠脑损伤动物模型的制备系统的剖面示意图；
图2为本发明实验例2提供的试验组切片HE染色图；
图3为本发明实验例2提供的对照组切片HE染色图；
图4为本发明实验例2提供的试验组免疫组化染色图；
图5为本发明实验例2提供的对照组免疫组化染色图；
图6为本发明实验例2提供的阳性对照组免疫组化染色图；
图7为本发明实验例2提供的阴性对照组免疫组化染色图；
图8为本发明实验例2提供的试验组TUNEL细胞凋亡荧光检测图；
图9为本发明实验例2提供的对照组TUNEL细胞凋亡荧光检测图；
图10为本发明实验例2提供的阳性对照组TUNEL细胞凋亡荧光检测图；
图11为本发明实验例2提供的阴性对照组TUNEL细胞凋亡荧光检测图。
图中：
1-垫球；2-套筒；3-砝码；4-塑料薄膜。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统，如图1所示，该制备系统包括垫球1、套筒2、砝码3和塑料薄膜4，塑料薄膜4设置在套筒2内的底部，垫球1设置在套筒2内且与塑料薄膜4相连，砝码3设置在套筒2内且在垫球1的上方；
其中，垫球1直径为2.2mm；套筒2内径为1.6cm；砝码3为球状且质量为12g，直径为1.4cm；塑料薄膜4材质为聚乙烯；厚度为0.9dmm。
实施例2
本实施例为一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统，如图1所示，该制备系统包括垫球1、套筒2、砝码3和塑料薄膜4，塑料薄膜4设置在套筒2内的底部，垫球1设置在套筒2内且与塑料薄膜4相连，砝码3设置在套筒2内且在垫球1的上方；
其中，垫球1直径为2mm；套筒2内径为1.7cm；砝码3为球状且质量为14g，直径为1.5cm；塑料薄膜4材质为聚乙烯；厚度为1dmm。
实施例3
本实施例为一种大鼠脑损伤动物模型的制备方法，该制备方法采用实施例1的制备系统进行制备，上述制备方法包括如下步骤：
(a)通过腹腔注射方式采用10％的水合氯醛对大鼠进行麻醉，再将大鼠进行俯卧位固定、消毒，随后沿正中失状线切开大鼠头皮，在右侧顶部、前囟后2mm、中线旁2mm处开设直径大小为4.5mm的骨窗；
(b)在骨窗位置覆盖塑料薄膜，并将垫球置于塑料薄膜上且正对骨窗；
(c)将套筒垂直置于骨窗上方，再将砝码置入套筒内自由下落撞击垫球中心，直至垫球陷入脑组织1.8mm；
(d)将垫球和塑料薄膜取出脑组织、消毒、缝合头皮，即得大鼠脑损伤动物模型。
实施例4
本实施例为一种大鼠脑损伤动物模型的制备方法，该制备方法采用实施例2的制备系统进行制备，上述制备方法包括如下步骤：
(a)通过腹腔注射方式采用10％的水合氯醛对大鼠进行麻醉，再将大鼠进行俯卧位固定、消毒，随后沿正中失状线切开大鼠头皮，在右侧顶部、前囟后2mm、中线旁2mm处开设直径大小为4mm的骨窗；
(b)在骨窗位置覆盖塑料薄膜，并将垫球置于塑料薄膜上且正对骨窗；
(c)将套筒垂直置于骨窗上方，再将砝码置入套筒内自由下落撞击垫球中心，直至垫球陷入脑组织1.5mm；
(d)将垫球和塑料薄膜取出脑组织、消毒、缝合头皮，即得大鼠脑损伤动物模型。
对照例1
本对照例为一种大鼠脑损伤动物模型的制备方法，该制备方法为Feeney自由落体法造模，具体制备方法参见Feeney DM,Boyeson Mg,Lim RT,etal,Responses tocorticalinjury；I Methodology and local e ffects of contusions in therat.BrainRes.2017.21；67-77。
实验例1
选取Wistar雄性大鼠40只(购自鲁抗生物制药公司)，体重280-340g；随机分为两组，试验组通过实施例4的制备方法进行造模，对照组通过对照例1的制备方法进行造模。
对造模后的小鼠在相同调价下进行饲养，待饲养四天后统计各组大鼠存活情况，统计结果如表1所示：
表1
| 组别 | 存活(只) | 死亡(只) | 成功率(％) |
| 试验组 | 18 | 2 | 90 |
| 对照组 | 5 | 15 | 20 |
由表1可知，本发明的大鼠脑损伤动物模型制备方法存能够显著提高成活率，且能够提高大鼠的存活时间。
实验例2
选取Wistar雄性大鼠40只(购自鲁抗生物制药公司)，体重280-340g；随机分为两组，试验组通过实施例4的制备方法进行造模，对照组通过对照例1的制备方法进行造模。
将上述两组大鼠均于造模后第5天，选取各组存活大鼠进行深度麻醉，迅速暴露脑，术中可用生理盐水冲洗脑表面血块，在脑不离体情况下，脑组织行厚度为2mm冠状横切取材，而且使所取标本含有挫伤灶及对侧脑组织，取材后立即投入以PBS新鲜配制的4％中性甲醛固定24小时，用于HE染色、免疫组化与TUNEL检测；
选取上述固定后的两组样品分别进行HE染色，HE染色后的试验组切片如图2所示，对照组切片如图3所示；
由图2、图3可知，两组切片均可见挫伤坏死灶，但对照组挫伤坏死灶及灶周脑组织结构杂乱无章，挫伤坏死灶内有大量细胞核碎片聚集，灶周内有大量核细胞密集，核大小较均一，其间杂有染色质浓缩边集及突出细胞的凋亡小体；然而试验组未损伤区及对侧脑组织无异常。
选取上述固定后的两组样品分别进行免疫组化检测：
按武汉博士德生物工程有限公司即用型SABC免疫组化染色试剂盒操作步骤进行，最后为DAB染色，以细胞质出现明显棕黄色为阳性；每只鼠取6张切片，每张切片随机选取脑挫裂伤灶各5个40×10倍的光镜视野，将所购阳性片作为阳性对照，将PBS替换一抗的切片作为阴性对照；其中试验组、对照组、阳性对照组和阴性对照组的切片光镜图分别如图4-图7所示；
由图4-图7可知：Bcl-2阳性染色细胞主要表现为细胞质呈棕黄色；虽两组均可见Bcl-2阳性细胞，但对照组Bcl-2阳性细胞分布杂乱无章。
选取上述固定后的两组样品分别进行TUNEL细胞凋亡检测：
参照武汉博士德生物工程有限公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明，经常规脱蜡与水合后，以浓度40ug/ml蛋白酶K室温反应10min消化，TdT酶混合液液37℃下孵育60min，90％甘油封片；所有切片使用Olympus荧光显微镜分别在20×10和40×10倍视野下观察与摄影；为显示实验的客观性和准确性，将用DNaseI处理的切片作为阳性对照，以不加TdT酶进行染色的切片作为阴性对照；
其中试验组、对照组、阳性对照组和阴性对照组的切片的荧光显微镜观察结果如图8-图11所示；
由图8-图11可知：TUNEL阳性染色细胞主要表现为细胞核呈黄绿色荧光；在未加TdT酶的阴性对照染色切片中未见阳性细胞，在经DNaseI处理的阳性对照切片中几乎所有细胞均呈明亮的黄绿色荧光；在各组切片中，阳性细胞均主要分布于灶周4mm范围内，余部及对侧脑组织几乎无阳性细胞发现；虽两组均可见阳性细胞，但对照组阳性细胞分布杂乱无章，垫球所致损伤与取出垫球时所致损伤难以分辨。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统，其特征在于，包括垫球、套筒、砝码和塑料薄膜，所述塑料薄膜设置在所述套筒内的底部，所述垫球设置在所述套筒内且与所述塑料薄膜相连，所述砝码设置在所述套筒内且在所述垫球的上方。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述垫球直径为1.8-2.2mm。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述套筒内径为1.6-1.8cm。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述砝码为球状，其质量为12-16g，直径为1.4-1.5mm。
5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述塑料薄膜材质为聚乙烯；厚度为0.9-1dmm。
6.一种大鼠脑损伤动物模型的制备方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述的系统进行制备，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将大鼠进行麻醉、固定、消毒，随后在大鼠颅骨上开设骨窗；
(b)在骨窗位置覆盖塑料薄膜，并将垫球置于塑料薄膜上且正对骨窗；
(c)将套筒垂直置于骨窗上方，再将砝码置入套筒内自由下落撞击垫球中心，直至垫球陷入脑组织1.2-1.8mm；
(d)将垫球和塑料薄膜取出脑组织、消毒、缝合头皮，即得所述大鼠脑损伤动物模型。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述大鼠固定方式为俯卧位固定。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述骨窗的直径大小为3.5-4.5mm。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述骨窗开设方法为：沿正中失状线切开大鼠头皮，在右侧顶部、前囟后2mm、中线旁2mm处开设骨窗。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述麻醉采用的麻醉剂为10％的水合氯醛；麻醉方式为腹腔注射。
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| CN201910305216.1A Pending CN109907855A (zh) | 2019-04-16 | 2019-04-16 | 一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统及制备方法 |
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|---|---|
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003289750A (ja) * | 2002-04-05 | 2003-10-14 | Imex Japan Kk | 簡易脳神経障害実験モデル作製器及び脳神経障害実験モデルの作製方法、記憶測定用迷路装置並びに抗脳神経障害薬及び抗記憶障害薬の薬効評価方法 |
| CN202376254U (zh) * | 2011-12-22 | 2012-08-15 | 重庆警官职业学院 | 原发性脑干损伤撞击机 |
| US20140107523A1 (en) * | 2012-10-12 | 2014-04-17 | University Of Rochester | Model for traumatic brain injury |
| CN210697887U (zh) * | 2019-04-16 | 2020-06-09 | 肖以磊 | 一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统 |
-
2019
- 2019-04-16 CN CN201910305216.1A patent/CN109907855A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003289750A (ja) * | 2002-04-05 | 2003-10-14 | Imex Japan Kk | 簡易脳神経障害実験モデル作製器及び脳神経障害実験モデルの作製方法、記憶測定用迷路装置並びに抗脳神経障害薬及び抗記憶障害薬の薬効評価方法 |
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| CN210697887U (zh) * | 2019-04-16 | 2020-06-09 | 肖以磊 | 一种大鼠脑损伤动物模型的制备系统 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李梅等: "大鼠弥漫性脑损伤中血管内皮生长因子表达变化的实验研究", 法律与医学杂志, vol. 9, no. 02, pages 96 - 98 * |
| 王宇等: "低强度激光血管照射治疗脑损伤的实验研究", 《激光生物学报》, vol. 8, no. 2, pages 145 - 151 * |
| 王清华等: "大鼠不同程度脑损伤模型的建立", 《创伤外科杂志》, vol. 2, no. 1, pages 42 - 44 * |
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