CN109906090A - 用于T1-MRI的新型脂质体钆(Gd)造影剂“NMRX” - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于脂质‑顺磁金属离子螯合物的新化学实体。该化合物的脂质部分嵌入脂质体的膜中。本发明的化合物特别用作磁共振成像的顺磁造影剂。出人意料地发现，脂质体造影剂在施用到妊娠对象时基本上不会穿过胎盘屏障进入胎儿的脉管系统。这些新型化合物可用于诊断妊娠和非妊娠对象的病症和疾病。本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物和这些化合物的用途。

Description

用于T1-MRI的新型脂质体钆(Gd)造影剂“NMRX”

说明书

本申请要求2016年9月16日提交的美国临时专利申请序列号62/395836的优先权权益，其通过引用整体并入本文。

技术领域

以下涉及医学领域、妇产科学领域、医学成像领域和相关领域。

发明背景

胎盘和脐带对于胎儿的正常生长以及营养物质和气体的输送至关重要。与胎盘功能异常有关的几种情况包括胎儿生长异常、死产、先兆子痫和早产(Haws等人,BMCPregnancy and Childbirth 9增刊1,S5(2009)；和Smith,G.C.和Fretts,R.C.Lancet 370(9600):1715-1725(2007))。目前包括超声断层扫描(UST)技术和胎儿心率监测在内的体内胎儿监护方法已证明了对不良妊娠结局具有低敏感性和高假阳性率(Grivell等人,TheCochrane Database of Systematic Reviews,1:CD007113(2009))。

如今，胎盘的成像面临许多限制。胎儿辐射暴露问题使得不能进行核成像和CT。因此，超声和磁共振(MR)是目前仅有的可行选择。Herzca等人(美国专利申请公开第20110288399号)公开了一种用于检测胎盘钙化的方法。该方法包括使用超短回波时间(UTE)脉冲序列获取胎盘的至少一个磁共振图像；处理所述至少一个磁共振图像以产生表明胎盘钙化的信息。已经将磁共振成像(MRI)和近红外光谱(NIRS)以实验的方式用于评估氧合作用，但是，这些方法存在局限性(Kakogawa等人,American Journal ofPerinatology,27(6):463-468(2010)；Kakogawa等人,American Journal ofPerinatology,24(3):161-166(2007)；Elsayes等人,Radiographics:a reviewpublication of the Radiological Society of North America,Inc.29(5):371-1391(2009))。

这些技术无法提供关于胎盘组织发育、血流流向和组织完整性和功能的可靠信息，这些信息对胎盘发育以及例如先兆子痫和宫内生长受限(IUGR)等病症的发展具有重要意义(Tache等人,Stem Cells and Development(2013)；Kakogawa等人,American Journalof Perinatology,27(1):25-29(2010))。

已知胎盘发育和功能异常导致妊娠的许多主要异常病理学，包括自发性早产、胎儿生长受限和先兆子痫，并且在过去的五十年中发生率显著增加。例如，侵入性胎盘及其相关病症(植入性胎盘、穿透性胎盘)增加了8倍，从20世纪70年代的每4000个分娩中存在1例增加到过去十年中每500个分娩中存在1例。特征是胎盘侵入子宫壁的程度越来越高，目前在已知危险因素的情况下，这些病症通过超声来诊断或特殊病例借由MRI来诊断。然而，检测的灵敏度总体上<80％，并且虽然特异性通常很高(>90％)，但仍然有很大一部分病例未检测到，而仅在分娩时才发现。标准治疗是强制性剖腹产手术，其后通常进行子宫切除术。如果未被发现，胎盘则不能与产后子宫分离，从而导致大量产科出血。即使有计划的剖腹产，ACOG报告显示，高达90％的侵入性胎盘患者需要大量输血，且母体死亡率高达7％。间接的组织学发现强烈地预测母亲在随后的妊娠中会发生相同的病症。

安全地表征侵入性胎盘、胎盘穿透性以及胎盘在体内分子分布的方法长期来看可以极大地增强我们研究和治疗胎盘功能障碍的能力。造影剂是明显的选择，但是由于担心胎儿暴露于造影剂，T1-MR中采用Gd造影剂通常是不适合的。已经尝试了用于T2-MRI的氧化铁纳米颗粒，但它也穿透了胎盘屏障。缺乏可接受的MRI造影剂极大地限制了胎盘MR成像可以实现的效果。Di Bona,K.R.等人Surface charge and dosage dependent potentialdevelopmental toxicity and biodistribution of iron oxide nanoparticles inpregnant CD-1mice.Reprod.Toxicol.50,36–42(2014)；和Kulvietis,V.等人Transportof nanoparticles through the placental barrier.Tohoku J.Exp.Med.225,225–234(2011).

因此，本领域需要评估体内胎盘发育和功能的改善方法。特别地，需要成本效益好的造影剂，其可用于当前的磁共振成像方法，以实时评估发育中的胎盘和脐带。本发明满足了本领域长期以来的需要和期望。

发明内容

在各种实施方案中，本发明提供了顺磁纳米颗粒，例如脂质体造影剂，其在妊娠对象的诊断成像研究中具有有益特性。造影剂用于表征胎盘的方法，包括用于研究正常胎盘和胎盘异常病理情况下胎盘灌注与分子谱的方法。由于担心胎儿暴露于造影剂，造影增强的MRI和MR分子成像的广泛效用尚未被用于此类应用。本发明的生物相容的、基本上无毒的造影剂减轻了这些顾虑。

本发明的示例性造影剂包括在螯合剂(例如，大环螯合剂)和顺磁金属离子例如Gd(III)之间形成的顺磁金属螯合物。顺磁金属螯合物通过与螯合剂缀合的脂质部分掺入脂质体膜中。当施用到妊娠对象时，本发明的造影剂主要保持限制在母体脉管系统内；造影剂不会很大程度地通过胎盘进入胎儿的脉管系统。这是首次可以获得妊娠对象的造影增强图像，并使用该方式评估胎盘的发育和活力，同时不存在造影剂分散到胎儿脉管系统中的显著风险。

本发明的造影剂分布并保持限制在母体脉管系统内的能力主要是由于含有顺磁金属离子螯合物的脂质体。脂质体是囊泡结构，通常由包围水性核心的两亲性分子例如磷脂的双层膜构成。各种类型脂质体的直径和形态在本领域中是已知的。(D.Drummond等人,J.Pharm.Sci.,(2008)97(11):4696-4740,PMID10581328)。

试剂提供卓越的血池造影，可实现微小血管和血管渗漏的可视化。示例性试剂能够容易地检测到小至约100供卓直径的血管。因此，NMRX使得能够在整个妊娠期间对子宫脉管系统进行详细研究。

从下面的详细描述中，本发明的其他实施方案、目的和优点将显而易见。

附图说明

图1、示例性NMRX纳米颗粒呈现出稳定的脂质体纳米颗粒中的钆，该脂质体纳米颗粒具有非常低的穿过胎盘膜的穿透性，从而最小化或消除对胎儿的毒性。

图2、本发明的示例性脂质-螯合物缀合物的合成途径。

图3A、用新型PEG-Gd缀合物配制的纳米颗粒显示出优于现有构建体的弛豫率。

图3B、用新型PEG-Gd缀合物配制的纳米颗粒显示出优于现有构建体的弛豫率。

图4、体外试验未显示出统计学上显著量的NMRX携带的Gd穿过胎盘膜从母体侧到胎儿侧。

图5A至图5E、通过MRI进行的体内试验表明，NMRX易于进入胎盘，但不会穿过到胎儿。

图6、组织分析未证实统计学上显著量的NMRX Gd到达胎儿组织。

图7、脂质体-Gd在造影后T1加权和T2加权图像中引起信号强度变化。在T1w-GRE图像中，在胎盘中观察到由于T1缩短引起的信号增强。

图8A、T1w-GRE扫描的定量图像分析显示，与造影前图像(每对中的左侧条形图)相比，造影后图像(每对中的右侧条形图)中胎盘内的信噪比(SNR)显著更高(p<0.05)。在造影前和造影后图像中，在羊水区室内未观察到SNR的显著差异。NEX＝1

图8B、T1w-GRE扫描的定量图像分析显示，与造影前图像(每对中的左侧条形图)相比，造影后图像(每对中的右侧条形图)中胎盘内的信噪比(SNR)显著更高(p<0.05)。在造影前和造影后图像中，在羊水区室内未观察到SNR的显著差异。NEX＝4

图8C、T2w-FSE扫描的定量图像分析显示，与造影后图像(每对中的右侧条形图)相比，造影前图像(每对中的左侧条形图)中胎盘内的信噪比(SNR)显著更高(p<0.05)。在造影前和造影后图像中，在羊水区室内未观察到SNR的显著差异。在T2w图像中，无法分辨胎盘后空间。NEX＝1

图8D、T2w-FSE扫描的定量图像分析显示，与造影后图像(每对中的右侧条形图)相比，造影前图像(每对中的左侧条形图)中胎盘内的信噪比(SNR)显著更高(p<0.05)。在造影前和造影后图像中，在羊水区室内未观察到SNR的显著差异。在T2w图像中，无法分辨胎盘后空间。NEX＝4

图9A、将与图8A中相同的数据绘制为对比度噪声比。对比度定义为类别轴中指定的区域之间的信号差异。

图9B、将与图8B中相同的数据绘制为对比度噪声比。对比度定义为类别轴中指定的区域之间的信号差异。

图9C、来自图8C和图8D中的胎盘和羊水之间的CNR数据，单次扫描为NEX＝1，多次扫描平均为NEX＝4。在T2w图像中，胎盘后空间无法可视化。

图10A至图10F、脂质体-Gd增强MRI和脂质体-碘增强CT图像中胎盘特征的可视化。妊娠大鼠胎盘的正交3-主视图，脂质体-Gd造影后T1加权MR图像(A、B、C)和脂质体-碘增强CT图像(D、E、F)，展示了胎盘后空间(*)和中央管(圆)的可视化。比例尺表示为5mm。造影后图像中的高CNR值解释为改善的目标特征的可视化。在T1w图像中，与造影前图像相比，造影后图像中胎盘边缘更好地可视化。

图11、在MRI和CT图像上所确定的胎盘体积(cm³)的比较。在MRI和CT图像上分割总共20个胎盘并将它们包括在分析中。

图12、来自MRI的和来自CT的胎盘血容量占比(FBV)的比较。每个点代表单个胎盘。在分析中包括总共20个胎盘。

图13、来自MRI的和来自ICP-MS钆测定的血容量占比的比较。每个点代表妊娠动物的平均FBV值。对于每个动物，在MRI-FBV分析中包括10个胎盘，并且在ICP-FBV分析中包括5个胎盘。

图14、注射有脂质体-Gd的动物的胎盘和胎儿中的钆浓度的ICP-MS分析。在注射脂质体-Gd后72小时进行Gd分析。虚线表示ICP-MS的0.318纳摩尔/克组织检出限。对于每只动物，分析中包括五个胎盘和五个胎儿。分析中包括7只动物。误差线表示平均值的标准差。

图15、小鼠胎盘的结构。成熟胎盘(E14.5)由三层组成：迷路(Labyrinth)、海绵滋养层和母体蜕膜。血绒毛膜(hemochorionic)胎盘的内部区室(迷路)包含使营养物质从母体血液进入胎儿血液的绒毛。

图16、向胎盘中加入常规造影剂(钆贝酸二葡甲胺)期间的动态信号增强。在130秒时，携带母体血液到胎盘的动脉、中央动脉管和胎盘迷路全部增强。在随后的点，胎盘脉管系统的细节通过胎盘周边的增强而变得模糊。胎盘迷路(星号)显示出早期增强，随后是周边(圆圈)显示出增强。随着从循环中清除造影剂，两个区域都会衰减。两个增强区中的瞬态信号如图所示。

图17、向胎盘中加入脂质体造影剂期间的动态信号增强。在18秒时，造影剂加入前，没有可见的增强。在185秒时，进入胎盘、迷路和周边的管均增强。随着增强逐渐衰减，即使在最后收集的时间点(1221秒，注射后约20分钟)，迷路甚至似乎仍保持对比度。

图18、在常规造影剂、脂质体造影剂和空白(盐水)造影剂注射后，胎儿中的典型信号强度。(a)注射显示胎儿区室中的摄入；(b)脂质体Gd未显示出可见的摄入，与(c)中所示的盐水空白注射无法区分。

图19A至图19B、使用RR模型获得的药代动力学(PK)参数。转移率基于假设脊柱旁参考组织的K转移＝0.2和K胎盘排出＝0.1。RR模型分析以两种方式进行：(1)通过使用来自整个胎盘的信号作为单个区室(在图中显示为白色条形图)和(2)仅使用中央迷路作为早期增强信号区室(黑色条形图)。从母体动脉到胎盘血管腔的转移率是K转移(如A中所示)，胎盘血管区室输出的排出率是K胎盘排出(如B中所示)。使用检验零假设H0：比较值相等的概率p来标记两种试剂测量值之间的差异的统计学显著性。符号***表示p<0.001。对于每种试剂，在整个胎盘和单独的迷路中计算的PK参数没有统计学上的显著差异。误差线表示平均值的标准误差。

图20A至图20B、在注射有(A；n＝8)和脂质体Gd(B；n＝6)的动物的胎盘和胎儿中使用ICP-MS进行钆测定。在两个时间点(注射后45分钟和90分钟，脂质体Gd注射后45分钟和72小时)呈现Gd浓度。检出限为0.318纳摩尔/克组织，用水平线表示。误差线表示平均值的标准误差。注意，纵坐标以对数标度绘制，以确保注射脂质体Gd后的其他非常低的胎儿浓度的可见度。在脂质体Gd注射后45分钟时间点的两个胎儿样品产生高于检出限的Gd测量值，然而，不可能排除在切除期间少量胎盘组织污染胎儿组织的可能性。所有其他脂质体Gd样品均低于检出限。注射后的所有样品均高于检出限。

图21A至图21C、胎盘后空间的MR图像。DCE-MRI图像显示胎盘(P)和子宫肌层壁(箭头)的无造影图像(A)，使用临床批准的常规造影剂钆特酸葡胺获得的峰值增强的造影后图像(B)，和使用脂质体-Gd获得的造影后图像(C)。注意，胎盘后空间(*)仅在脂质体-Gd增强图像上可见。

图22、在MRI和CT成像中对妊娠大鼠子宫胎盘脉管系统进行体积渲染3D成像。冠状体积渲染图像显示了在(左)造影增强MRI和(右)造影增强CT成像中的胎盘和相关的子宫胎盘血管。在造影增强的MRI体积渲染图像(箭头)中看到可见于胎盘周围的低增强边缘的胎盘后空间。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的示例性组合物、实施方案和方法，其构成发明人目前已知的实施本发明的最佳方式。应该理解的是，所公开的实施方案仅是本发明的示例，本发明可以以各种形式和替代形式实施。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制，而仅作为本发明任何方面的代表性基础和/或作为教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。

引言

在例如磁共振成像(MRI)的诊断医学成像领域中，仍然需要具有新颖和有用性质的生物相容的、基本上无毒的造影剂。特别感兴趣的是基于顺磁金属离子螯合物的造影剂，其具有改善的药代动力学和毒性特征。该关注对基于镧系元素离子的造影剂例如基于Gd(III)的造影剂尤其相关和及时，该造影剂已被证明在一些对象体内是有毒。由于这些多功能、具有诊断价值的试剂的潜在毒性，它们尚未扩展到用于妊娠对象的成像。因此，通过造影增强MRI可获得的高诊断率对于妊娠对象是不可用的。如本文所公开的，本发明减轻了与在妊娠对象的成像研究中使用MR造影剂相关的困难。

定义

在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定实施方案，因为这些实施方案可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且术语不旨在是限制性的。本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在提供数值范围的情况下，应当理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确指出，否则为下限单位的十分之一)以及该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包含在本发明内，受限于规定范围内的任何明确排除的界限。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除所包括的一个或两个限值的范围也包括在本发明中。本文给出的一些范围的数值之前是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字提供文字支持，且为接近或近似该术语之后数字的数字。在确定数字是否接近或近似具体记载的数字时，接近或近似未记载的数字可以是在其出现的上下文中提供具体记载的数字的实质等同的数字。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体和单独地提到每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。此外，每篇引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的主题。任何出版物的引用是为了在申请日之前公开，并且不应被解释为承认本文所述的发明无权由于在先发明而先于这些出版物。此外，提供的出版日期可能与可能需要单独确认的实际出版日期不同。

注意权利要求可撰写为排除任何可选的要素。因此，这种陈述旨在用作与权利要求要素的陈述或“否定”限制的使用有关的如“单独”、“仅”等等的专有术语的在先基础。在阅读本公开后对本领域的技术人员显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方案具有独立的组分和特征，其可以容易地与任何其他几个实施方案中的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。任何列举的方法都可以按所列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。虽然在本发明的实践或测试中还可以使用与本文所描述的任何方法和材料相似或等同的方法，但是本文描述了有代表性的说明的方法和材料。

以下定义广泛适用于下文所述的本发明的每个实施方案。除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的分析化学和有机合成中的命名法和实验室程序是本领域公知和常用的那些。使用标准技术或其变型来进行化学合成和化学分析。

除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分，是指直链烃基或支链烃基、或环状烃基或其组合，其是完全饱和的并且可包括具有指定碳原子数(即C₁-C₁₀表示1个至10个碳原子)的单价基团、二价基团、三价基团和四价基团。饱和烃基的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、其同系物和同分异构体例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的基团。如本文所用，术语“烷基”是指烷基部分，其可以是适合于满足化合价要求的单价、二价或多价类型。

除非另有说明，否则术语“烯基”本身或作为另一取代基的一部分，是指具有一个或多于一个碳-碳双键的直链烷基或支链烷基、或环状烷基或其组合。烯基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、异戊烯-2-基、丁二烯-2-基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯-3-基、以及更高级的同系物和同分异构体。

除非另有说明，否则术语“炔基”本身或作为另一取代基的一部分，是指具有一个或多于一个碳-碳三键的直链烷基或支链烷基、或环状烷基或其组合。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基、以及更高级的同系物和同分异构体。

术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自烷基部分的二价基团，例如但不限于-CH₂CH₂CH₂CH₂-。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1个至24个碳原子，本发明中优选具有10个或少于10个碳原子的那些基团。对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，任选地，连接基团的取向不是由所写的连接基团的式的方向所表示。例如，式-C(O)₂R'-表示-C(O)₂R'-和任选地-R'C(O)₂-。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，通常具有八个、七个、六个、五个或少于五个碳原子。

术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫代”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。

除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合是指由所述数目的碳原子和至少一个选自B、O、N、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链或环状烷基，其中杂原子可任选地被氧化，氮原子可任选被季铵化。杂原子可以位于杂烷基的任何内部位置或位于末端，例如烷基与分子其余部分连接的位置。“杂烷基”基团的实例包括但不限于-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-Si(CH₃)₃、和-CH₂-CH＝N-OCH₃。两个或多于两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指二价杂烷基，例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于杂亚烷基，杂原子也可占据末端中的任一端或两端(例如亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。示例性的杂烷基部分被一个或多于一个环结构中断，例如其中环连接杂芳基部分的碳或杂原子所形成的杂环烷基或杂芳基环。

除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

在一些实施方案中，烷基、烯基、炔基、亚烷基、杂亚烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫代、杂烷基、环烷基和杂环烷基中的任何基团任选地被例如一个或多于一个在本文中称为“烷基取代基”的基团取代。

除非另有说明，术语“卤代”或“卤原子”本身或作为另一取代基的一部分是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。另外，诸如“卤代烷基”的术语是指包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C₁-C₄)烷基”是指包括但不限于三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有说明，否则术语“芳基”是指多不饱和芳族取代基，其可以是稠合在一起的单环或多环(优选1个至3个环)。术语“杂芳基”是指含有1个至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。在一些实施方案中，芳基和杂芳基中的任何基团任选地被例如一个或多于一个在本文中称为“芳基取代基”的基团取代。

术语“芳基烷基”包括其中芳基与烷基连接的那些基团(例如，苄基、苯乙基等)。

烷基和杂烷基的取代基以及通常称为亚烷基、杂亚烷基、烯基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团通常称为“烷基取代基”，它们可以是选自但不限于以下的各种基团中的一个或多于一个：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤原子、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO₂R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)₂R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R”、-NRSO₂R'、-CN和-NO₂，数目为0至(2m'+1)，其中m'是这些基团中碳原子的总数。R'、R”、R”'和R””各自优选独立地指氢、经取代的或未经取代的杂烷基、经取代的或未经取代的芳基例如被1个至3个卤原子取代的芳基、经取代的或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，独立地选择每个R基团作为各个R'、R”、R”'和R””基团。当R'和R”与同一氮原子连接时，它们可与氮原子结合形成5-元环、6-元环或7元环。例如，-NR'R”意指包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据以上对取代基的讨论，本领域技术人员将理解，术语“经取代的烷基”包括具有与氢以外的基团键合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如，-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

类似于所描述的烷基取代基，芳基和杂芳基的取代基一般称为“芳基取代基”。示例性取代基选自烷基取代基和其他取代基，例如：卤原子、-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO₂R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)₂R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R”、-NRSO₂R'、-CN和-NO₂、-R'、-N₃、-CH(Ph)₂、氟代(C₁-C₄)烷氧基和氟代(C₁-C₄)烷基，数目为0至芳环体系上的开放化合价的总数；其中R'、R”、R”'和R””优选独立地选自氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基、和经取代或未经取代的杂芳基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，独立地选择各个R基团作为各个R'、R”、R”'和R””基团。

芳基环或杂芳基环上的两个取代基与它们所连接的原子一起可任选地连接以形成与芳基环或杂芳基环稠合的环(例如环烷基环或杂环烷基环)。

芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-T-C(O)-(CRR')_q-U-的取代基替代，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR'-或单键，q是0至3的整数。或者，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-A-(CH₂)_r-B-的取代基替代，其中A和B独立地为-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR'-或单键，r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选地被双键替代。或者，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-(CRR')_s-X-(CR”R”')_d-的取代基替代，其中s和d独立地是0至3的整数，X是-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR'-。取代基R、R'、R”和R”'优选独立地选自氢或经取代或未经取代的(C₁-C₁₆)烷基。

如本文所用，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

符号“R”是表示取代基的一般缩写，所述取代基选自H、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、和经取代或未经取代的杂环基。R还可以指烷基取代基和芳基取代基。

所示的垂直于键的符号表示所示的部分与分子其余部分连接的点。

本文所述的化合物可具有一个或多于一个不对称中心或平面。含有不对称取代原子的本发明化合物可以分离为旋光性形式或外消旋形式。本领域众所周知如何制备旋光性形式，例如通过外消旋形式(外消旋体)的拆分，通过不对称合成，或通过从旋光性原料合成。外消旋体的拆分可以通过例如常规方法完成，例如在拆分剂存在下进行结晶，或使用例如手性HPLC柱的色谱法。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，并且所有这些稳定的同分异构体都在本发明中被考虑。描述了本发明化合物的顺式和反式几何异构体，并且可以将其分离为同分异构体的混合物或分离为分开的同分异构体形式。除非特别指出特定的立体化学或异构形式，否则考虑结构的所有手性形式(对映异构和非对映异构)和外消旋形式以及所有几何异构形式。

本文使用的外消旋、双部分消旋(ambiscalemic)和部分消旋(scalemic)或对映体纯化合物的图示来自Maehr,J.Chem.Ed.,62:114-120(1985)：实心楔形和虚线楔形用于表示手性元素的绝对构型；波浪线表示否认它所代表的键可能产生的任何立体化学含义；实粗线和虚粗线是表示所显示的相对构型但不表示任何绝对的立体化学的几何描述符；楔形轮廓和点线或虚线表示不确定绝对构型的对映体纯化合物。

术语“带电基团”是指带负电荷或带正电荷的基团。负电荷或正电荷可以具有选自1、2、3或高于3的整数或者是分数的电荷数。示例性的带电基团包括例如-OPO₃ ^2-、-OPO₂ ^-、-P⁺Ph₃、-N⁺R'R”R”'、-S⁺R和-C(O)O^-。应当理解的是，带电基团附带相反电荷的反离子，无论这些反离子是否在本文提供的式中明确表示。

本文所述的化合物可具有一个或多于一个带电基团。例如，化合物可以是两性离子的，但总体上可以是中性的。其他实施方案可具有一个或多于一个带电基团，这取决于pH和其他因素。在这些实施方案中，化合物可以与合适的反离子缔合。本领域众所周知如何制备盐或交换反离子。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量的合适的碱(例如Na⁺、Ca⁺⁺、Mg⁺⁺、或K⁺的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量的合适的酸反应来制备。这些反应通常在水或有机溶剂中进行，或在两者的混合物中进行。例如，可以通过离子交换技术如离子交换色谱法改变反离子。除非特别指出反离子或盐，否则意指所有两性离子、盐和反离子。

如本文所用，术语“生物相容性”是指物体、材料或组合物基本上无毒且无免疫原性。更广泛地说，生物相容性是指材料在特定情况下执行适当的宿主反应的能力。因此，生物相容性代表了身体组织与材料相互作用的程度以及这种相互作用如何满足特定植入目的和部位的设计预期的整体表现[参见，Von Recum,A.F.等人,"Introduction:Biomaterials and Biocompatibility.",在:Handbook of Biomaterials Evaluation:Scientific,Technical and Clinical Testing of Implant Materials.von Recum,A.F.,编辑；Taylor和Francis,1999:第1页至第8页]。因此，生物相容性是一种相对而非绝对的概念，其在很大程度上取决于对材料的最终预期。

如本文所用，术语“基本上无毒”是指表面或材料是基本上非溶血性的，并且基本上是指表面、材料或组合物不会从释放的材料中浸出足够量的本文所述的成像剂或其它组合物以在宿主中产生毒性反应。

如本文所用，术语“诊断有效量”是指有效诊断对象的疾病或病症的本发明组合物的量。

术语“MRI”在本文中用作“磁共振成像”的缩写。术语“MRI”和“磁共振成像”在以下公开内容中可互换使用。术语“MRI磁环境”和“MRI环境”用于指由MRI磁体产生的强磁场，MRI磁体是MRI系统的部件。当对患者身体进行MRI成像时，MRI磁环境通常包含患者身体的全部或部分。此外，预期在本专利的有效期内，将开发许多用于磁共振成像的相关技术，并且术语“MRI”和“磁共振成像”的范围旨在先验地包括所有这些新技术。

如本文所使用的，术语“约”指+/-10％。

本文所用的术语“螯合剂”是指与化合价大于一的金属离子结合的任何有机或无机化合物。“螯合剂”包括但不限于大环有机螯合剂，例如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)和1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(TETA)。参见，例如，Kaden,TA.Host Guest Complex Chemistry III,Topics in Current Chemistry丛书的121卷第157页至第179页(2005)。该定义还包括开链螯合剂，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、三亚乙基四胺二盐酸盐(TRIEN)、乙二醇-双(季-氨基乙基)醚-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、二亚乙基三胺-五乙酸(DPTA)、和三亚乙基四胺六乙酸(TTG)、去铁胺、二巯基丙醇、依地酸钙二钠、柠檬酸锌、青霉胺二巯基琥珀酸和依替膦酸盐，或任何其他螯合二价和三价离子的螯合剂，其在施用到哺乳动物对象例如怀孕对象时是生物相容的。螯合物任选为盐的形式，例如药学上可接受的盐。

如本文所用，术语“连接体”或“连接基团”涉及与螯合基团连接的部分，其连接至嵌入脂质体膜内的脂质部分，并且具有至少一个能够共价结合(或键合到)与脂质膜相互作用的脂质部分的官能团。当连接体或螯合剂具有多个这样的官能团时，它们可以是相同的或不同的。当螯合部分是大环时，连接体部分可以连接到任何环原子上。例如，当螯合部分是多氮杂大环时，侧基可以连接到环碳原子或环氮原子上。当侧基连接到环氮原子上时，该化合物可称为N-取代的多氮杂大环。示例性的连接体是亚烷基、烯基和炔基以及包括一个或多于一个杂原子的这些基团，使得基团是杂亚烷基、杂烯基和杂炔基。连接体也可以是通过例如磷脂部分和PEG部分上的互补官能团的反应所形成的键或部分。

术语“盐”包括用相对无毒的酸或碱制备的化合物的盐，这取决于本文所述化合物上存在的特定取代基。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过使中性形式的这些化合物与足量的所需碱接触而获得碱加成盐，该所需碱是纯的或在合适的惰性溶剂中。碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐、或镁盐、或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过使中性形式的这些化合物与足量的所需酸接触而获得酸加成盐，该所需酸是纯的或在合适的惰性溶剂中。酸加成盐的实例包括衍生自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸等的那些，以及衍生自相对无毒的有机酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸例如精氨酸等的盐，以及有机酸例如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见，例如，Berge等人,Journal ofPharmaceutical Science,66:1-19(1977))。本发明的一些特定化合物含有碱性和酸性官能团，使得化合物可以转化成碱加成盐或酸加成盐。还包括盐的水合物。

如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应等并且具有合理的收益/风险比的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是众所周知的。例如，P.H.Stahl等人在"Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use"(Wiley VCH,Zunch,Switzerland:2002)中详细描述的药学上可接受的盐。盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。此外，可用以下试剂使碱性含氮基团季铵化，这样的试剂例如为低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，例如二甲基硫酸盐、二乙基硫酸盐、二丁基硫酸盐和二戊基硫酸盐；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物，如苄基溴和苯乙基溴等。由此获得水溶性或油溶性或可分散的产物。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的无机酸以及诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。

短语“药物制剂”是指本领域通常接受的用于将诊断化合物递送至哺乳动物如人的化合物和介质的制剂。因此，这种介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本文所用的短语“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已经被美国食品和药物管理局批准的可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

如本文所用，术语“疾病”、“病症”和“病况”可以互换使用或者可以是不同的，因为特定疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此尚未找出病因)，因此，它尚未被认为是一种疾病，而仅是一种已被临床医生确定了一组或多或少特定症状的不良状况或综合症。

示例性实施方案

在本发明的示例性实施方案中，提供了与基于小分子的常规造影剂相比，基于纳米颗粒的生物相容的、基本上无毒的造影剂(“NMRX”)。本发明的纳米颗粒的非穿透性是意想不到的并且新颖的。低穿透性使得仅极少量的造影剂穿过胎盘屏障进入胎循环。示例性纳米颗粒造影剂如图1所示。

在各种实施方案中，本发明提供了根据式I的化合物：

R¹-L¹-X¹-(CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂)-X²-L²-R² (I)

其中R¹是磷脂；L¹和L²是独立地选自键、经取代的烷基或未经取代的烷基、和经取代的杂烷基或未经取代的杂烷基的连接体；X¹和X²独立地选自O和NH；n是5至500的整数；且R²是顺磁金属离子螯合物，其包括络合了顺磁金属离子的大环配体，所述螯合物的热力学稳定常数(logK_GdL)为至少约20，例如至少约22，例如至少约24。

可以使用任何有用的顺磁金属离子螯合物。在示例性的实施方案中，本发明的化合物包括的大环配体是四氮杂大环。与Gd(III)络合的示例性大环配体包括：

根据式I，在本发明的示例性化合物中，磷脂是：

其中m和m'独立地选自4至24的整数。m和m'的示例性值包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22的整数。

L¹是根据式I的化合物中将磷脂与PEG部分连接的示例性连接体部分。如本领域技术人员所理解的，L¹是具有任何适当且合适结构的连接体。L¹的示例性部分包括：

其中o和p独立地选自整数0、1和2。

在根据式I的示例性化合物中，R¹-L¹是：

与L¹类似，在根据式I的示例性化合物中，L²部分是具有任何合适且适当结构的连接体。L²的示例性类型包括：

其中x和y独立地选自整数0、1和2。

在示例性实施方案中，L²-R²是：

本发明的造影剂的顺磁金属螯合物-脂质组分易于使用本领域标准方法和可用的试剂和前体制备。图2：示例性造影剂基于与顺磁离子络合以形成高度稳定的螯合物的大环螯合剂。这种高度稳定的利用大大减少了作为Gd造影剂副作用的肾源性系统性纤维化和脑沉积的问题。

脂质体

在各种实施方案中，本发明提供了用于MRI研究(例如妊娠对象的T1-MRI)的新型脂质体顺磁造影剂，从而基本上使Gd保留在母体侧，而不穿透胎盘屏障，因此保护胎儿免受造影剂和由此产生的任何潜在毒性的影响。在各种实施方案中，使足够量的顺磁造影剂保留在母体侧，以避免或显著减少关于胎儿暴露于造影剂的临床问题。在各种实施方案中，不超过约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或不超过约1％的施用到妊娠对象的剂量穿过胎盘进入胎儿的脉管系统。

示例性脂质体包括式I的脂质-顺磁螯合物缀合物作为脂质体的第一脂质组分。在各种实施方案中，脂质体还包括脂质体膜的第二脂质组分。

除了包括本发明的缀合了螯合剂的脂质作为组分之外，本发明的脂质体的膜组分没有特别限制。可用于本发明的示例性脂质体膜可以由多种形成囊泡的脂质形成，通常包括二脂肪族链脂质例如磷脂、甘油二酯、二脂肪族糖脂，单一脂质例如鞘磷脂和鞘糖脂，胆固醇及其衍生物，以及它们的组合。如本文所定义，磷脂是具有由长链烷基链形成的疏水基团和含有磷酸部分的亲水基团的两亲性试剂。磷脂基团包括磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸及其混合物。示例性磷脂选自1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、蛋黄磷脂酰胆碱(EYPC)或氢化蛋黄磷脂酰胆碱(HEPC)、固醇改性脂质(SML)、阳离子脂质和反两性脂质。

在各种实施方案中，第二脂质组分选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-mPEG(DSPE-mPEG)及其组合。

本发明的脂质体的组分不限于上述组分，可以加入其他组分。这些组分的实例包括描述于FEBS Lett.,223,42(1987)；Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85,6949(1988)等的胆固醇、胆固醇酯、鞘磷脂、单唾液酸(monosial)神经节苷脂GM1衍生物；描述于Chem.Lett.,2145(1989)；Biochim.Biophys.Acta,1148,77(1992)等的葡萄糖醛酸衍生物；描述于Biochim.Biophys.Acta,1029,91(1990)；FEBS Lett.,268,235(1990)等的聚乙二醇衍生物。然而，组分不限于这些实例。

本发明的示例性实施方案提供了基于一种本领域公认的脂质体(隐形脂质体(Stealth liposome))的造影剂。对隐形脂质体的药代动力学、器官分布和安全性已有充分了解。这些脂质体通常包括掺入脂质体脂质膜中的至少一种PEG化脂质。已经在各种啮齿动物物种和灌注的人胎盘中证明了根据本发明的隐形脂质体不穿透胎盘屏障，从而防止胎儿暴露，从而改善了妊娠对象的造影增强MRI研究中的胎儿安全性。

本发明的示例性脂质体包含：

(i)根据权利要求1的约1％至约15％的脂质；

(ii)约50％至约60％的基质脂质，其选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)及其组合；

(iii)约10％至约40％的胆固醇；和

(iv)约1％至约5％的2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-mPEG(DSPE-mPEG)。

本发明的脂质体MRI造影剂在低场强(1T至3T)下显示出显著高的弛豫率(图3A和图3B)。在本发明的示例性脂质体中，顺磁螯合物具有在约1特斯拉(T)至约3特斯拉下的T1弛豫率，其为未掺入所述脂质体的相同顺磁螯合物的至少约4倍至约8倍。

本发明的示例性含Gd脂质体显示出超高的弛豫率并且不显著穿透胎盘屏障(图4、图5和图6)。脂质和水性有效负载都不能穿透胎盘屏障。在各种实施方案中，这种非穿透性在离体人灌注胎盘和体内啮齿动物胎盘中得到证实。

如本申请中包括的实施例所示，脂质体和脂质体的顺磁螯合物组分在母体循环中的实质限制可在妊娠小鼠、妊娠大鼠以及来自正常和异常妊娠的灌注人胎盘中得到证明。

在各种实施方案中，除了基于Gd的造影剂之外，将一种或多于一种试剂掺入脂质体中。例如，在一个示例性实施方案中，将用于除MRI之外的方式的造影剂包括在脂质体中，例如用于荧光成像或近红外荧光成像的试剂。在一个示例性实施方案中，脂质体还包含用于CT的碘化化合物。本发明的示例性脂质体制剂还包含用于在图像引导下进行药物递送的治疗分子。

术语脂质体在本文中根据其通常含义使用，指的是由包封内部水性介质的双层磷脂或任何类似的两亲性脂质构成的微观脂质囊泡。本发明的脂质体可以是单层囊泡例如小单层囊泡(SUV)和大单层囊泡(LUV)，和多层囊泡(MLV)，通常尺寸为30nm至200nm。对本发明的脂质体膜结构没有特别限制。术语脂质体膜是指将内部水性介质与外部水性介质分隔开的磷脂双层。

本发明造影剂的脂质体可通过本领域已知的任何方法制备。制备方法的实例在上文中提及的参考文献中作为脂质体的一般性综述进行描述，以及在Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9,467(1980),"Liopsomes"(M.J.Ostro编辑,MARCELL DEKKER,INC.)等中描述。具体实例包括但不限于超声法、乙醇注入法、弗氏压碎器法、醚注入法、胆酸法、钙熔融法、冻融法、反相蒸发法等。本发明的脂质体的大小可以是通过上述方法可获得的任何大小。脂质体的结构没有特别限制，可以是单层或多层结构。

根据本发明，脂质体可以通过现在已知的或随后开发用于制备脂质体的任何技术制备。例如，脂质体可以通过用于制备多层脂质囊泡(MLV)的常规技术形成，即，将一种或多于一种所选的脂质沉积在合适容器的内壁上，将脂质溶解在氯仿中然后蒸发氯仿，然后，将待包封的水溶液加入容器中，使水溶液水化脂质，并旋转或涡旋所得的脂质悬浮液。该过程产生包含所需脂质体的混合物。或者，用于产生大单层脂质囊泡(LUV)的技术，例如反相蒸发、输注方法和洗涤剂稀释，可用于产生脂质体。用于产生脂质囊泡的这些和其他方法的综述可以在Liposome Technology,卷I,Gregory Gregoriadis编辑,CRC Press,Boca Raton,Fla.,(1984)的文本中找到，其通过引用并入本文。例如，含脂质的颗粒可以是甾体脂质囊泡、稳定的多层脂质囊泡(SPLV)、单相囊泡(MPV)或脂质基质载体(LMC)的形式。在MLV的情况下，如果需要，可以对脂质体进行多次(五次或多于五次)冻融循环，以增强其捕获体积和捕获效率并提供更均匀的溶质的层间分布。

在制备脂质体之后，任选地确定脂质体尺寸以实现所需的尺寸范围和相对窄的脂质体尺寸分布。约20纳米至约200纳米的尺寸范围使得脂质体悬浮液能够通过常规过滤器(通常为0.22微米或0.4微米过滤器)过滤来灭菌。如果脂质体的尺寸已经减小到约20纳米至约200纳米，则过滤灭菌方法可以在高通量的基础上进行。有几种技术可用于将脂质体的大小调整到所需的大小。通过浴超声法或探针超声法对脂质体悬浮液进行的超声处理导致逐渐的尺寸减小，直至得到尺寸小于约50纳米的小单层囊泡。均质化是另一种依靠剪切能量将大脂质体分解成较小脂质体的方法。在典型的均质化程序中，多层囊泡通过标准乳液均化器再循环，直到得到选定的脂质体尺寸，通常为约50纳米至约500纳米。在两种方法中，可以通过常规激光束粒度测定来监测粒度分布。通过小孔聚碳酸酯膜或非对称陶瓷膜挤出脂质体也是将脂质体尺寸减小到相对明确的尺寸分布的有效方法。通常，使悬浮液循环通过膜一次或多于一次，直至达到所需的脂质体尺寸分布。脂质体可以通过连续的小孔膜挤出，以实现脂质体尺寸的逐渐减少。或者，可以使用微流体技术制备尺寸受控的脂质体，其中在尺寸小于300微米，优选宽度小于150微米，高度小于50微米的微通道中，将有机溶剂如乙醇或乙醇-非质子溶剂混合物中的脂质与水性介质快速混合，使得有机溶剂/水的比例小于30％。然后通过透析从脂质体中除去有机溶剂。其他有用的控制尺寸的方法如超声处理、溶剂蒸发或反相蒸发是本领域技术人员已知的。

如本文所提及的，内部水性介质通常是在其中进行脂质体制备并且在形成脂质体时最初被包封的原始介质。然而，还设想了实施方案，其中脂质体在制备后脱水，例如以用于存储。脂质体任选地使用标准冷冻干燥设备或等效装置在减压下脱水。在各种实施方案中，脂质体及其周围介质在在液氮中冷冻，然后脱水并置于减压下。为了确保脂质体在脱水过程中存活而不损失其大部分内部内容物，任选地使用一种或多于一种保护性糖与脂质囊泡膜相互作用并在除去系统中的水时保持它们完整。可以使用多种糖，包括诸如海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖和葡聚糖的这些糖。通常，已经发现二糖比单糖效果更佳，其中二糖海藻糖和蔗糖是最有效的。也可以使用其他更复杂的糖。例如，已发现包括链霉素和二氢链霉素在内的氨基糖苷类在脱水过程中保护脂质体。通常，包含一种或多于一种糖作为脂质囊泡的内部介质或外部介质的部分。最优选地，糖包含在内部介质和外部介质两者中，使得它们可以与脂质体膜的内表面和外表面相互作用。通过将糖添加到缓冲液中来实现包含在内部介质中，所述缓冲液在脂质体形成过程中被包封在脂质囊泡中。在这些实施方案中，在有效加载过程中使用的外部介质还应优选地包括一种或多于一种保护性糖。

如本领域技术人员通常所知，聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物已被广泛用于改善脂质体包封的功能化合物的循环时间，以避免或减少功能化合物从脂质体组合物中过早渗漏并且避免身体的免疫系统检测到脂质体。因此，在本发明的示例性实施方案中，脂质体是PEG化脂质体。PEG化可以通过将PEG化脂质掺入脂质体中来实现。根据本发明的合适的PEG衍生的脂质包括DSPE-PEG的缀合物，其中PEG的分子量为2000克/摩尔至5000克/摩尔。其他合适的PEG衍生的脂质是具有C₈-尾或C₁₆-尾的与神经酰胺缀合的mPEG，其中mPEG的分子量为750道尔顿至5000道尔顿。其他合适的配体是与甘油磷脂缀合的mPEG或官能化PEG，甘油磷脂例如为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)等。PEG化脂质体的形成是本领域技术人员通常已知的技术。

在各种实施方案中，脂质体经DSPE-PEG-GSH缀合物(最多5摩尔％)和/或DSPE-mPEG缀合物(其中PEG的分子量通常为750道尔顿至5000道尔顿，例如2000道尔顿)PEG化。本发明的示例性PEG化脂质体的磷脂组合物可包含约1摩尔％至约20摩尔％，例如约1摩尔％至约5摩尔％的PEG-脂质缀合物。

此外，在一些实施方案中，脂质体表面上的一个或多于一个部分使脂质体特异性靶向特定细胞类型、组织等。先前已经描述了使用多种靶向部分(例如，配体、受体和单克隆抗体)靶向脂质体。这种靶向的合适实例是本领域已知的。靶向机制通常要求靶向剂以使得靶部分可与靶标如细胞表面受体相互作用的方式定位在脂质体的表面上。在一个示例性实施方案中，脂质体被制造为包括在形成膜时结合到膜中的连接体部分。示例性连接体部分具有亲脂部分，其牢固地嵌入并锚定在膜中。示例性连接体部分还包括亲水部分，其在化学上可用于脂质体的水性表面上。选择亲水部分使得它在化学上适合与随后加入的靶向剂形成稳定的化学键。将靶向部分掺入脂质体膜中的技术通常是本领域已知的。

示例性制剂

在一个示例性实施方案中，本发明提供了包含本发明的脂质组分的脂质体制剂。脂质体包括第二组分，该第二组分选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-mPEG(DSPE-mPEG)及其组合。

本发明的示例性脂质体包含：(i)约1％至约15％的根据式1的顺磁螯合物脂质；(ii)约50％至约60％的基质脂质，其选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)及其组合；(iii)约10％至约40％的胆固醇；和(iv)约1％至约5％的2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-mPEG(DSPE-mPEG)。

本发明的脂质体选自冻干脂质体和其中所述脂质体悬浮在药学上可接受的稀释剂中的制剂。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了钆大环的脂质体制剂，其中大环在其所施用的对象中的体内T_1/2为约12小时至约48小时，例如约18小时至约24小时。

在一个示例性实施方案中，本发明的脂质体的直径为约90nm至约140nm。

本发明的药物制剂

对于静脉内注射、皮肤注射或皮下注射、或在疼痛部位的注射，本发明的脂质体是肠胃外可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗载体如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

用于经口给药的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可包括固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

在各种实施方案中，顺磁螯合物将作为药学上可接受的盐存在于脂质体中。这是指螯合剂包括未被带正电荷的金属如Gd(III)-DOTA“中和”的一个或多于一个负电荷，反离子是“药学上可接受的”。

本发明的方法

本发明还提供了从妊娠对象成像或以其他方式获取MR数据的方法，因为本发明的造影剂对胎儿没有毒性，而其他造影剂由于可能对胎儿有毒性而具有黑箱警告(black boxwarning)。在各种实施方案中，所述方法可用作胎盘病症例如IUGR、先兆子痫和GDM的诊断方法。本发明还提供了使用本发明的造影剂用于非妊娠对象的类似方法。

本发明的造影剂还有利于对非妊娠对象进行成像，从而减少作为基于Gd的造影剂的副作用的肾源性系统性纤维化和脑沉积的问题。因此，本发明还提供了对非妊娠对象进行成像的方法。

本发明的示例性方法包括向对象施用诊断有效量的本发明的试剂，然后从对象获得一个或多于一个MR数据集。数据集至少部分获自已被递送了本发明的造影剂的对象中的感兴趣区域(ROI)。在示例性实施方案中，ROI包括胎盘。在各种实施方案中，ROI包括胎盘和胎儿，并且从所获得的数据集中明显看出施用到妊娠对象的造影剂剂量的小于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、或小于约10％进入胎儿的脉管系统。

MR图像形成的要素

一些原子核具有非零自旋，从而产生净磁矩。在大多数MR成像实验中，水质子(氢原子)的核磁矩提供信号。将待成像的样品置于强静磁场中，该静磁场诱导样品轻微磁化，在所施加的场的方向上具有净磁矩，其中能量(角动量)与所施加的场成比例。为了编码空间信息，以沿着一个或多于一个正交轴的倾斜度施加其他场。空间中的每个位置都由该位置的自旋能量或相位唯一编码。使射频场脉冲穿过样品，并且所吸收的能量使净核磁化重新定向到新方向(通常施加脉冲以使磁化倾斜90度)。受到这种扰动之后，各个过程的净能量损失使净磁化恢复到其初始平衡取向。从该过程形成图像对许多因素具有复杂的依赖性。

在典型的实验中，人们修改成像参数以减少许多这些因素的影响。在最典型的MRI实验中，信号强度主要来源于质子浓度和弛豫时间。弛豫时间表征净磁化回归平衡。正是空间区域之间的信号强度的差异提供了对比。质子浓度在软组织和骨骼之间可以有很大的变化，从而提供鲜明的对比。然而，软组织之间质子密度的差异更加细微，并且对比更可能源于弛豫时间的组织依赖性差异，这在很大程度上取决于局部环境。

造影增强

尽管本文通过参考基于Gd的造影剂举例说明了本发明，但本领域技术人员将理解，本发明不限于此并且对在成像实验中对组织造影的一系列化合物具有广泛的适用性。本发明特别但非唯一地适用于作为与MRI结合使用的顺磁造影剂的组分。

需要区分磁性相似但组织学上不同的组织或器官，这是造影增强剂发展的主要推动力。它们由于信号在它们存在时增加从而提高了所在组织与周围组织之间的对比而被称为造影剂。现在所有临床MR检查的超过30％使用造影剂。然而，目前的临床MRI试剂对细胞或器官中的生化事件不敏感，但是，这些生化事件总是活跃的，它们增强其所在任何地方的信号。区分组织依赖于造影剂在组织之间的差异分布，而这并非经常发生。对组织之间的微环境差异有响应的造影剂使得可以基于生化事件进行区分，从而将MRI的潜在应用扩展到简单解剖学之外。

顺磁元素如镧系元素可形成有效的造影剂。顺磁离子中的不成对电子与周围的水质子直接相互作用，从而大大减少了它们的弛豫时间。弛豫时间的这种变化转化为增强的信号。造影剂的效果通常报告为水质子的弛豫速率或弛豫率，其与弛豫时间成反比并且反映了系统中所有起作用的弛豫机制的总体贡献。水靠近顺磁离子对于该效果(第一层配位)是重要的。

具有和不具有造影增强的MRI图像形成的原理和实践是本领域技术人员公知的，并且在Aime等人,JMRI 16:394-406(2002)；Caravan等人,Chem.Rev.99:2293-2352(1999),和Gadian,NMR and its Applications to Living Systems,第二版,Oxford SciencePublications(1995)中更详细地讨论，其全部公开内容出于所有目的通过引用整体并入。

本发明的方法包括在体内或体外施用足量的本发明的脂质体，并获得妊娠对象或实验系统的一个或多于一个造影增强的MRI图像。本发明的方法还包括在体内或体外测试中测定本发明化合物的活性以表征本发明的化合物。

本发明还包括用于诊断和表征影响妊娠对象的疾病的严重程度以及对该疾病进行分期的方法。本发明的方法包括向对象施用诊断有效量的本发明的脂质体，并在施用后获取对象的一个或多于一个图像。本发明的脂质体可以配制成药物制剂，以用于体内施用于妊娠对象。除一种或多于一种本发明化合物外，这些制剂还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。这样的物质应无毒，并且不应干扰活性化合物的功能。载体或其他物质的确切性质可取决于给药途径，例如，经口、静脉内、皮肤或皮下、鼻腔、肌内、腹膜内途径。

施用的实际量、施用的速率和时间过程将取决于化合物的性质以及待成像的目标区域。造影剂的处方，例如关于造影剂种类、剂量等的决定，属于放射科医师和其他医疗服务提供者所知的普通技术范围内，并且通常考虑待成像的病症、个体患者的病况、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。上述技术和方案的实例可在Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编辑),1980中找到。

提供以下实施例以说明但不限制本发明。

实施例

实施例1

材料和方法

脂质体Gd造影剂

按照前述方法制备脂质体Gd造影剂。简而言之，将1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、Gd-DTPA双(硬脂酰胺)(Gd-DTPA-BSA)、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(-聚(乙二醇))-2000](mPEG2000-DSPE)以30:25:40:5的摩尔比溶解在乙醇中。将乙醇脂质溶液用150mM盐水/10mM组氨酸水化，以达到75mM的脂质浓度。将溶液在60℃下搅拌30分钟，然后在Lipex Thermoline挤出机上依次挤出，以使脂质体的尺寸为约120nm。将所得溶液用150mM盐水/10mM组氨酸透析。通过动态光散射(DLS)测定的最终制剂中的平均脂质体尺寸为约120nm。使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICPOES)定量的脂质体制剂中的钆和磷脂(磷当量)浓度分别为16mM和25mM。

对于体内研究，通过尾静脉以0.2毫摩尔Gd/千克的剂量静脉内施用脂质体-Gd。

动物模型

所有动物研究均按照贝勒医学院机构动物护理和使用委员会(theInstitutional Animal Care and Use Committee of the Baylor College ofMedicine)批准的方案进行。

在该研究中使用十五只妊娠的Sprague Dawley大鼠(8周龄至9周龄；在妊娠前体重约175g至199g)。将常规Gd造影剂用于这些动物中的六只，并且将脂质体-Gd用于这些动物中的九只。妊娠的第一天(指定为0.5)是检测到阴道交配栓的时间。在妊娠的第18.5天进行成像。

磁共振成像(MRI)

在1T永久性MRI扫描仪(M2系统，Aspect Technologies，Israel)上进行成像。将60mm体线圈用于发射和接收RF信号。

使用3％异氟醚使动物镇静，将其安置在MRI动物床上，然后使用鼻罩装置维持递送1％至1.5％的异氟醚。通过在MRI动物床中循环热水来维持体温。使用置于动物腹部区域下方的气动控制压力垫监测呼吸频率。

在使用常规Gd造影剂的研究中，使用钆特酸葡甲胺(Gd-DOTA，)进行动态造影增强MRI(DCE-MRI)，以评估胎盘后空间的可视化。使用具有以下扫描参数的T1w 2D梯度回波序列(GRE)进行DCE-MRI：TE＝3.5毫秒，TR＝15毫秒，FA＝25，切片厚度＝0.8mm或1.6mm，NEX＝12；时间分辨率＝47秒。获得四个非造影的基线图像，然后推注静脉内施用钆特酸葡甲胺(0.15毫摩尔Gd/千克)。在施用钆特酸葡胺后，造影后成像持续长达20分钟。为了直接比较两种造影剂之间的图像质量，至少在三小时后施用脂质体-Gd造影剂(0.15毫摩尔Gd/千克)，使得能够清除钆特酸葡甲胺。使用相同的DCE-MRI方案获得脂质体-Gd造影后图像。

在使用脂质体-Gd的研究中，对所有九只动物都进行了造影前和造影后扫描。使用3D梯度回波序列(GRE)获取T1加权扫描。在轴向面和冠状面上获得扫描。T1w-GRE序列的扫描参数为：回波时间(TE)＝3.5毫秒，重复时间(TR)＝20毫秒，翻转角＝70，切片厚度＝1.0mm，视野＝64mm，切片数量＝32，矩阵＝180×180，面内分辨率＝356×356μm²，扫描时间约2分钟。

使用快速自旋回波(FSE)序列在冠状面中获取T2w扫描。T2w-FSE扫描的扫描参数为：回波时间(TE)＝80毫秒，重复时间(TR)＝7952毫秒，切片厚度＝1.5mm，视野＝60mm，切片数＝38，矩阵＝256×250，面内分辨率＝234×240μm²，激发数＝2，扫描时间约7分钟。

使用高分辨率T1w-GRE序列进行造影后扫描的冠状面采集。扫描参数为：回波时间(TE)＝4.2毫秒，重复时间(TR)＝20毫秒，翻转角＝50，切片厚度＝0.8mm，视野＝80mm，切片数＝120，矩阵＝300×300，面内分辨率＝266×266μm²，扫描时间约12分钟。

针对每种扫描方案获取四次单独扫描。在Matlab中将来自各个扫描的DICOM(医学数字成像和通信[标准])图像平均化，以定量和定性地比较单次扫描与平均扫描的图像质量。在平均之前检查各个扫描的运动伪影。

计算机断层扫描(CT)成像

在小动物微CT系统(Siemens Inveon)上进行成像。使用3％异氟醚使动物镇静，将其安置在MRI动物床上，然后使用鼻罩装置维持递送1％至1.5％的异氟醚。使用置于动物腹部区域下方的气动控制压力垫监测呼吸频率。

在施用脂质体碘化血池造影剂(550毫克碘/kg)后进行造影增强CT血管造影。脂质体碘化造影剂表现出与其MR对应物相似的药代动力学，并且已广泛用于啮齿动物脉管成像。

组织Gd浓度的元素分析

由于脂质体-Gd的长血液循环寿命(t_1/2约18小时)并为Gd可能转运至胎儿留出额外的时间，在施用造影剂后3天对动物实施安乐死。在成像结束时对两只经过MRI和CT成像的动物进行安乐死。解剖动物，取出胎盘和胎儿并单独转移到聚碳酸酯小瓶中，在-80℃保存。收集母体血液样品并离心收集血浆，然后将其储存在-80℃。如前所述通过使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测量Gd浓度来处理和分析血浆、胎盘和胎儿。针对每只妊娠动物，分析五个胎儿和五个胎盘。

图像分析

在Osirix(版本5.8.5，64位，Pixmeo，Bernex，Switzerland)中进行图像的定性和定量分析。

审查图像

由经过培训的母胎放射科医师(约10年的经验)审查造影前扫描和造影后扫描。审查中包括T1加权GRE图像和T2加权FSE图像。针对胎盘边缘、胎盘后空间和胎盘内血管(中央管)的可视化进行了单个(四次扫描的最佳)T1w-GRE图像和平均T1w-GRE图像的审查。对于使用常规GD造影剂获得的DCE-MRI图像，遵循相同的程序。针对胎盘边缘和羊水之间的造影可视化进行了单个(四次扫描的最佳)T2w-FSE图像和平均T2w-FSE图像的审查。T1w和T2w图像中目标特征的可见度由放射科医师以3分制进行评分：0＝不可见，1＝部分可见，2＝清晰可见。数据表示为得分的平均值和标准差。

定量分析

在造影前和造影后脂质体-Gd扫描中，确定单次扫描和平均扫描的信噪比(SNR)和对比度噪声比(CNR)。分析中包括T1w-GRE和T2w-FSE图像。测定T1w-GRE图像中胎盘、胎盘后空间和羊水的SNR。测定T1w-GRE图像中胎盘和胎盘后空间以及胎盘和羊水之间的CNR。测定T2w-FSE图像中胎盘和羊水的SNR。在T2w-FSE图像中看不到胎盘后空间。测定T2w-FSE图像中胎盘和羊水之间的CNR。

胎盘血容量占比的测定

脂质体-Gd的血管内特性使得能够指导测量血容量占比(FBV)。在母体血液和胎盘中使用ICP-MS测定的脂质体-Gd浓度用于测定胎盘FBV。使用妊娠动物的37.1％血细胞比容值将血浆Gd浓度转换为母体Gd浓度。计算胎盘FBV为母体血液中脂质体-Gd与胎盘中脂质体-Gd的比。

胎盘FBV也由MRI和CT数据集确定。在MRI和CT图像中手动分割胎盘。每只动物分割出至少十份胎盘。测定每个胎盘的分割胎盘体积和平均信号强度。对于三个不同的图像在下腔静脉中绘制目标区域以确定血液中的平均信号强度。计算MRI衍生的FBV为胎盘体积中的平均信号强度与母体血液中的平均信号强度的比。类似地，测定CT图像中的胎盘体积、平均胎盘和母体血液信号强度。

统计分析

使用威尔科克森秩和检验进行造影前和造影后图像中的SNR和CNR值的统计分析。使用卡方检验进行放射科医师得分的统计分析。认为P值<0.05表示具有统计学显著性的差异。当比较使用两种不同方法测定的参数值(胎盘体积和胎盘血容量占比)时，计算皮尔逊系数。

结果

在造影后T1加权和T2加权图像中脂质体-Gd引起信号强度变化(图7)。在T1w-GRE图像中，在胎盘中观察到由于T1缩短引起的信号增强。整个胎盘的信号增强是均匀的，因为在施用脂质体-Gd几分钟后获得造影后图像，此时药剂均匀地分布在母体循环系统中。在T2w-FSE图像中，在胎盘中观察到由于T2缩短导致的信号减弱。与T1w图像类似，T2w图像中整个胎盘的信号强度变化均匀。在造影后T1w图像中，胎盘后空间清晰可见。由于降低了噪声水平，多次扫描平均图像改善了特征的可视化。

使用常规Gd剂的多相动态造影增强MRI图像显示胎盘朝向子宫肌膜的逆行不清晰。然而，在20分钟的造影后采集期间使用常规造影剂采集的图像中，显示出不存在胎盘后空间的一致且可再现的可视化(图21)。脂质体-Gd血池造影剂证明了胎盘的清晰可视化。更重要的是，血池剂能够使胎盘后空间可视化(图21)。

造影后图像中的高CNR值解释为改善的目标特征的可视化(图10)。在T1w图像上，与造影前图像相比，造影后图像(常规Gd和脂质体-Gd)的胎盘边缘显著更佳地可视化(p<0.001)。由于造影后图像的高SNR值，胎盘边缘在单次采集和平均采集的脂质体-Gd图像上都清晰可见。胎盘后空间仅在用脂质体-Gd获取的造影后T1w图像中清晰可见。单次采集和平均采集的脂质体-Gd图像中的胎盘后空间的可见度得分无显著差异(p＝0.38)。血管中的高SNR使得造影后T1w脂质体-Gd图像上的中央管可视化。单次采集图像和平均采集图像中的中央管(仅在造影后脂质体-Gd图像中可见)的可见度得分无显著差异(p＝0.28)。在T2w图像上，与造影前图像相比，胎盘边缘和羊水区室之间的对比度在造影后脂质体-Gd图像中更高(表1-2)。单次采集图像和平均采集造影后T2w脂质体-Gd图像被评定为对胎盘边缘描绘是等效的。

使用脂质体-Gd获得的T1w-GRE扫描的定量图像分析显示，与造影前图像(6.9±1.8)相比，造影后图像(28.0±4.7)中胎盘内的信噪比(SNR)显著更高(p<0.05)(图8A)。在造影前和造影后图像中，在羊水区室内未观察到SNR的显著差异。在造影后图像中清楚地区别出胎盘后空间，因此能够确定SNR。与单次扫描相比，在多次扫描平均图像中，SNR值增加约2倍。造影后图像中的高SNR值解释为胎盘和胎盘后空间之间(9.7±6.6)以及胎盘和羊水区室之间(18.0±10.7)改善的CNR。

在T2w-FSE扫描中，与造影前图像(10.9±2.8)相比，在造影后图像(17.1±3.7)中胎盘内的SNR显著下降(图8C和图8D)。在造影前和造影后T2w图像中，在羊水区室内未观察到SNR的显著差异。与T1w图像类似，与单次扫描图像相比，在多次扫描平均图像中获得的SNR增加了约2倍。与造影前图像(5.7±1.4)相比，胎盘和羊水区室之间的CNR在造影后图像(10.3±4.6)中显著更高。对于造影前(9.4±4.7)和造影后图像(21.5±8.3)，多次扫描平均图像的CNR值增加了约2倍。

脂质体-Gd的均匀不透明化使得能够获得胎盘的高分辨率3D图像。高分辨率MR成像(0.035mm³体素)清楚地显示了胎盘特征，这些特征在高分辨率CT血管造影(0.00034mm³体素)中也是可见的，包括胎盘后空间和中央管(图10)。在MRI图像中看到的像素化是由于放大了图像并使用了非各向同性体素的多平面重建。母体脉管系统和胎盘的均匀不透明化促进了子宫胎盘脉管系统的三维可视化(图22)。

施用脂质体-Gd后72小时母体血液和胎儿单位中钆的元素分析表明，平均胎儿Gd浓度低于检出限(图中的水平虚线)，比母体血液Gd浓度低约500倍(图14)。

胎盘中的均匀信号增强有助于MR图像上胎盘体积的分割和计算(图11)。还在高分辨率CT图像(35μm各向同性空间分辨率)上确定胎盘体积。在MRI和CT上确定的胎盘体积聚集在45度线周围，这表明在两种成像模式上进行的测量之间具有良好的相关性。

脂质体-Gd的血管内特性有助于确定胎盘血容量占比(FBV)。在每个胎盘基础上测定接受MRI和CT成像的妊娠动物的胎盘FBV值。MRI衍生的FBV值和CT衍生的FBV值聚集在45度线周围，这表明在两种成像模式上进行的测量之间具有良好的相关性(图11)。然后将MRI衍生的FBV值与基于动物的Gd元素分析(ICP-MS)衍生的FBV值进行比较。

表

表1-1：在造影前图像和脂质体-Gd造影增强图像中T1加权GRE扫描的胎盘特征的可视化。胎儿放射科医师以0至2的等级对特征的可见度进行评分，0指定为不可见，1指定为部分可见，2指定为清晰可见。得分报告为平均值和标准差。使用T1w-GRE序列获得图像。

表1-2：在造影前图像和脂质体-Gd造影增强图像中T2加权扫描的胎盘边缘和羊水区室之间的造影可视化。胎儿放射科医师以0至2的等级对特征的可见度进行评分，0指定为不可见，1指定为部分可见，2指定为清晰可见。得分报告为平均值和标准差。使用T2w-FSE序列获得图像。

实施例2

造影增强MRI非常适合评估结构和灌注动力学，因此允许对组织和血管结构进行详细表征。然而，不鼓励在人类孕妇体内使用造影剂，因为胎盘-胎儿膜对于大多数造影剂来说是可透过的，从而引起胎儿的潜在暴露。该技术已在动物模型中得到证实。

我们测试了两种试剂。(1)钆贝酸二葡甲胺其为一种临床使用的钆螯合物，具有相对短的循环半衰期和几乎完全的肾排出。与许多Gd螯合物一样，该试剂不显著结合血清蛋白，具有有限的通过血管内皮的穿透性，并且它的分布体积大致等于总细胞外水。钆诱导的毒性主要来自从螯合物中解离的游离Gd，并且在相对较小程度上来自完整螯合物的肾毒性。钆贝酸盐是最稳定的螯合物之一，并且已被证明在天然人血清中不会比其他两种众所周知的低风险试剂钆磷维塞三钠和钆喷酸二葡甲胺释放出更多的游离Gd。然而，在这三种试剂中，两种线性螯合物钆贝酸盐和钆喷酸盐具有相对低的白蛋白结合。人血清白蛋白具有显著的通过胎盘膜的穿透性，因此如果它能够结合Gd螯合物，则可以将Gd转运穿过屏障。因此，我们选择钆贝酸二葡甲胺作为常规试剂进行测试。(2)一种新型脂质体造影剂，其在内部包封钆贝酸二葡甲胺，并在双层中掺入脂质-Gd-螯合物缀合物。由于它们的大尺寸(直径100nm至150nm，分子量约2×10⁵kD)，脂质体通过完整的血管内皮时表现出非常有限的扩散。本研究中使用的基于脂质体的Gd试剂保留在血池中，半衰期为18小时至24小时。它们通过网状内皮系统从血液中排出，并被肝脏和脾清除。

我们假设：(1)与常规试剂相比，基于纳米颗粒的造影剂会表现出降低的胎盘屏障穿透性，(2)基于纳米颗粒的造影剂至少能与常规试剂一样显示出胎盘解剖学，且对胎儿无毒性。

在妊娠小鼠模型中评估脂质体钆(Gd)纳米颗粒造影剂的经胎盘穿透性。使用3D扰相梯度回波方法在9.4T下使用以下两种造影剂对妊娠的Balb/c小鼠在妊娠16.5(±1)天进行成像：临床批准的Gd螯合物(钆贝酸二葡甲胺)和新型实验脂质体Gd试剂。动态造影增强(DCE)方案用于捕获造影剂在胎盘中的进入和分布的动态、以及从循环中清除的动态。临床放射科医师盲法评估了两组图像。使用参考区域模型测量胎盘流量和生理参数；体积转移常数(K转移)，流出速率常数(K胎盘排出)。使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测量切除的胎盘和胎儿的Gd含量。妊娠小鼠的MRI图像以及胎盘组织和胎儿组织的ICP-MS分析显示，脂质体Gd试剂具有不可检测的低胎盘穿透性，而临床试剂(Multihance)大量地透过胎盘屏障。两种造影剂之间的图像解释和诊断质量相当。

结果：

小鼠DCE-MRI研究

9.4T下测量的的弛豫率(r1)为3.99±0.52(秒·mM)^-1，脂质体Gd的弛豫率为2.50±0.29(秒·mM)^-1。在体内，造影前弛豫时间(T₁(0))为800毫秒至1100毫秒。可见的胎盘数量为每只动物2个到5个不等。胎儿-胎盘囊、胎盘和胎儿在T₁加权的造影后图像上是可区分的。由于受限的视场(FOV)或与运动相关的模糊，母体动脉和胎儿左心室不可见。在测试的25只小鼠中，14只小鼠接受并且图像产生52个可分析的胎盘。9只小鼠接受脂质体Gd，并且图像产生36个可分析的胎盘。2只小鼠接受盐水安慰剂，并且图像产生4个可分析的胎盘。

图15显示了胎盘循环图，以及迷路区和蜕膜区的位置，如本分析中所用。联合的迷路区和蜕膜区被视为整个胎盘。在使用钆贝酸二葡甲胺造影的典型DCE-MRI中，当推注进入胎盘时，可以通过造影增强胎盘的可见性。迷路区首先接收造影剂，然后逐渐填充胎盘的其余部分，然后随着试剂从母体循环中清除而强度逐渐衰减。同时，当试剂过滤进入胎儿区室时，可以看到胎囊中的强度略微增加。

在渐进时间点的信号增强是造影剂循环的结果，如图16所示。在130秒的时间点可以看到进入胎盘迷路的中央动脉管。在每个胎盘中，可以看到两个流动区域(胎盘迷路和母体蜕膜或周边区域)，如左下方突出显示。胎盘迷路首先填充，并在邻近的蜕膜达到强度峰值之前达到峰值增强。图17显示当使用脂质体Gd造影剂时相同的瞬时填充顺序。虽然钆贝酸二葡甲胺在胎盘迷路填充和母体蜕膜填充之间显示出明显的延迟，但使用脂质体造影剂时没有发现这种延迟。

表2-1显示了放射科医师的盲法客观印象，他们解读每种造影剂在峰值强度的图像，并评估每个胎盘的可视化清晰度。盲法审查者审查了用常规Gd(Multihance)处理的14只小鼠中可见的所有52个胎盘，和用脂质体Gd处理的9只小鼠中可见的所有36个胎盘。χ²检验产生了2x10^-8的概率，两个得分分布是不同的，这表明两种造影剂使得图像具有相同的诊断质量。

在所研究的每只小鼠中，观察到采用钆贝酸二葡甲胺时在胎儿区室中摄入造影剂，而采用脂质体Gd，即使在暴露72小时后，在胎儿区室中也未观察到摄入。图18显示出注射两种造影剂中的每一种和注射对照盐水后的代表性胎儿信号。使用附录A中的方法通过图像数据计算绝对Gd浓度。使用等式A4和A5根据MRI数据估计的造影剂浓度表示在表2-2中。

每个造影剂的K^转移和K^胎盘排出值(考虑迷路区或整个胎盘作为目标组织)在图19中示出。这些值不随胎盘内目标ROI的位置显著变化，但反映了两种造影剂的非常不同的值。

针对注射后45分钟、90分钟和72小时收集的组织样品进行ICP-MS的钆测定。该分析的结果如图20所示。并且当使用钆贝酸二葡甲胺时，胎盘和胎儿浓度在45分钟时彼此在一个数量级内，而在90分钟时彼此相差2倍。当使用脂质体试剂时，胎儿浓度低于仪器的检出限(图中的水平线)，并且比胎盘浓度低至少2个至3个数量级。来自脂质体Gd注射的胎儿Gd浓度实际上在两个时间点上与阴性对照(盐水处理的)对照小鼠无法区分(数据未显示)。

讨论：

小鼠的短妊娠期使得小鼠成为研究在整个妊娠期的胎盘异常病理学的有吸引力的模型。本研究中小鼠的孕龄为E16.5±1天，对应于人类妊娠晚期的早期部分。人类胎盘和小鼠胎盘都是血绒毛膜的。存在结构差异，例如母体-胎儿交换区在小鼠中是迷路，而在人类中是绒毛状的。然而，认为这些结构差异不影响子宫胎盘和胎儿胎盘血之间的整体交换机制。

胎盘是交换器官，因此希望选择性地、容易地穿过胎盘屏障运输物质。与使用常规Gd螯合物时胎儿Gd水平与胎盘Gd水平实际上相等(在一个数量级内)的情况相比，我们观察到当使用脂质体Gd时胎儿Gd水平比胎盘Gd水平低约3个数量级，(图20)与具有低得多的穿过胎盘中母体-胎儿屏障的扩散速率的脂质体颗粒一致。可以合理地排除脂质体穿过胎盘屏障的主动运输，因为脂质体上的PEG层有效地防止与表面的任何特异性结合。在没有主动运输机制的情况下，扩散或对流过程是分子或颗粒可以通过胎盘屏障转运的唯一剩余机制。不存在穿过完整胎盘屏障的对流，因此扩散成为唯一的机制。脂质体比自由分子大3个数量级，因此它们一定扩散得更慢，即使在大体积基质中也是如此。在胎盘屏障的受限几何形状中，这种扩散速率的差异可能更大。

我们观察到在每个胎盘内具有不同时间增强模式的两个区域，这与早期增强的中心迷路区和晚期增强的交界区和周边区一致，如Remus等人先前所述。母体血液通过聚焦于中央动脉管的穿透动脉进入胎盘(图15)并流入周边区域(迷路窦状隙，其靠近胎盘胎儿侧的绒毛膜板)。然后，流动方向反转，使它远离绒毛膜表面并朝向交界区移动。虽然这两个区域不代表解剖学上不同的区域，但是它们可以基于动态信号增强模式来分割。以这种方式使血液通过中央动脉管输送到胎盘迷路，并通过广泛的静脉循环返回，如DCE-MRI图像中所示(图16和图17)。

清晰描绘子宫壁的胎盘边缘是诊断侵入性胎盘及其相关病症(植入性胎盘、穿透性胎盘)的重要部分。这种描绘是当今的一项重大挑战，因为很难使将胎盘与母体子宫壁分开的薄组织边界变得可见。目前的做法是利用超声波作为第一种可视化方法，并且在不清楚的情况下参考MRI。没有用于MRI的造影剂以消除胎儿对钆的潜在暴露。使用该方法检测胎盘异常的灵敏度适中，为80％至85％。在无造影的情况下，T1加权成像导致胎盘边缘不清楚。在没有外源性造影剂的情况下进行常规T2加权成像的益处尚不清楚。已经注意到使用MRI诊断侵入性胎盘的这些困难，观察到不可能将绒毛膜绒毛与基蜕膜区分开。然而，通过外源造影剂，观察到明显的区分。高级MR技术，例如动脉自旋标记(ASL)和扩散加权成像(DWI)，可以利用组织和血液之间的内源性造影来克服这些局限性。ASL方法提供有关区域流动的信息，但不区分循环的母体和胎儿侧，而DWI通过测量体素内非相干运动来提供关于质子的局部扩散系数的信息。然而，这两种技术的信噪比(SNR)和时间分辨率明显差于造影增强MR。我们观察到脂质体Gd试剂似乎没有进入胎儿区室，这表明对胎儿的风险降低。它们的使用可以使胎盘边界以增加的对比度可视化，并且可以更确信地确定胎盘侵入的程度。

造影增强MRI中的SNR是造影剂的弛豫率和场强的函数，并且随着这两个参数而增加。然而，在该工作中使用的脂质体造影剂在低场强下显示出显著更高的弛豫率，这与相较于溶液中的Gd螯合物更慢的脂质体试剂的转动相关时间一致。因此，虽然目前的工作是使用小型动物高场9.4T磁体进行的，但是预期当使用临床相关的1.5T场强时会获得相同或更高的图像质量。

除了简单的边缘描绘，动态造影增强可以提供有关胎盘中造影剂净输送的直接信息。前述工作使用低分子常规造影剂和三室模型(SAAM II)来测量经胎盘穿透性和胎盘灌注。然而，在所观察的视场中难以观察到附近的动脉，并且不能提供准确的血管输入函数。因此，我们选择了参考区域(RR)模型方法，该方法不依赖于对动脉或血管输入函数的了解。

RR模型中的K^转移值反映了血管造影剂对目标组织的填充(灌注)，而K^胎盘排出值表示造影剂的消除。我们观察到脂质体造影剂的K^转移值略高于钆贝酸二葡甲胺的K^转移值，而脂质体造影剂的K^胎盘排出值显著低于钆贝酸二葡甲胺的K^胎盘排出值。低分子量钆贝酸二葡甲胺很容易通过胎盘屏障扩散，因此降低造影剂在胎盘本身的有效量，使K^转移值较低。类似地，与由于网状内皮系统摄入和胆汁消除而被相当缓慢地清除的脂质体Gd的K^胎盘排出值相比，通过肾过滤更快地清除低分子量螯合物得到更高的K^胎盘排出值。

结论：

我们首次证明了脂质体Gd颗粒不会穿透胎盘屏障。这可能有助于表征难以通过非造影MRI观察胎盘绒毛向子宫肌层(子宫内壁)附着的情况下的胎盘功能障碍。已经建立了造影剂的灌注动力学，并且在脂质体Gd的情况下，其不被穿过胎盘屏障的转运和清除动力学破坏，因此更好地反映了实际的胎盘灌注动力学。因此，改变灌注的病症可以潜在地通过该技术表征。脂质体Gd螯合物可以在未来用作研究胎盘结构和胎盘异常如侵入性胎盘中的边界检测的有用试剂。然而，在用于人类之前，必须明确建立脂质体Gd的母体和胎儿安全性。

材料和方法：

造影剂

使用从制造商处得到的(Bracco Diagnostics Inc.，新泽西州，USA)。脂质体Gd试剂(NMRX：延长寿命的纳米MR)按照文献中描述的方法内部制备。简言之，将所有脂质(二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG-DSPE)和Gd-DTPA-双硬脂酰胺(Gd-DTPA-BSA)以30:40:5:25的摩尔比和40mM的最终摩尔浓度(水合后)溶于乙醇中，在含有500mg Gd/ml钆贝酸二葡甲胺的Tris盐水缓冲液中水合1小时，使得乙醇占总体积的10％。然后将自组装脂质体在Lipex 10ml挤出机(Northern Lipids，Vancouver，BC，加拿大)中通过400nm、200nm和100nm的核孔(Nucleopore)径迹蚀刻膜挤出7次至10次，在使用500kDa截止MicroKros模块(SpectrumLaboratories，CA)的渗滤中通过10体积交换除去过量乙醇和未包封的钆贝酸二葡甲胺。通过动态光散射测量的平均粒径为约120nm。通过在悬浮于PBS中的100kDa透析袋中温育(在37℃下)在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2)和重构的牛血浆(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，USA)中以1:5稀释的颗粒悬浮液来测试Gd从颗粒中的释放。在开始温育后1小时、2小时、24小时、29小时、48小时和52小时对外部缓冲液进行取样，并在Varian 810 ICP-MS系统上通过ICP-MS分析总Gd含量。以这种方式测试3批纳米颗粒造影剂，并且每个时间点一式三份进行取样和分析。

动物模型

所有动物研究均在贝勒医学院机构动物福利委员会批准的方案下进行。本文报道的研究符合NC3RS ARRIVE指南。

在该研究中使用25只雌性Balb/c小鼠(7周龄至9周龄；妊娠前平均体重26克)。将动物与相同的品系雄性交配。将检测到阴道交配栓的那天指定为第0.5天。在第16.5±1天对妊娠小鼠进行成像。在收集MRI数据后立即处死小鼠(按照机构安乐死方案)(两只接受脂质体Gd试剂的小鼠除外，并且维持存活72小时，以便为Gd可能转运到胎儿留出额外的时间，然后处死)。解剖小鼠并取出胎盘和胎儿并单独转移到2ml聚碳酸酯小瓶中以在-81℃下储存。使用ICP-MS分析这些胎盘和胎儿以直接测量Gd浓度。

用4％异氟醚/空气麻醉动物并将其仰卧转移至动物成像支架。将28号导管置于尾静脉中。转移到成像仪器后，通过鼻罩连续施用异氟醚(2％)。将压敏枕头放在腹部并用胶带固定以监测呼吸。将具有成像探针的动物室维持在约30℃至33℃。将磁体室维持在25℃至27℃。通过调节气流和异氟醚浓度，使心率保持稳定在50次每分钟至60次每分钟。在14只小鼠中用进行MR成像。脂质体Gd用于9只小鼠。给两只小鼠注射盐水作为对照用于比较。将造影剂稀释至20mM并制备0.08毫摩尔/千克(通常约100μL)的剂量用于该研究。造影剂由同一操作者手动注射(3年小动物操作经验)并且在每只小鼠中以相同的速率注射。

DCE-MRI研究

虽然脂质体造影剂的清除缓慢，但可以快速清除，并且图像采集的时间安排至关重要。因此，我们选择使用DCE-MRI技术来收集一系列图像，从中可以选择最佳时间点。DCE-MRI实验在水平孔9.4T Bruker Avance III，20cm孔Biospec光谱仪(Karlsruhe，德国，其具有能够产生梯度(1000mT/m)的微成像探针)上进行。在体内研究之前，使用附录A中描述的可变翻转角技术测量两种试剂的弛豫率。类似地，使用与附录A中描述的相同的脉冲序列测量胎盘和胎儿的基线弛豫率T₁(0)。

对于DCE-MRI研究，获得没有造影增强的基线图像，随后在造影剂到达目标组织期间和之后获得随时间推移的一系列图像。在175次测量中使用具有16度固定翻转角的3D扰相梯度回波(SPGRE)脉冲序列。其他参数如附录A中所述。单次测量的时间为9.25秒。进入实验两分钟后，注入造影剂。总扫描时间为26分52秒。使用所获取的信号产生时间-强度曲线，并且信号逐个像素地转换成注入的试剂的浓度。

ICP-MS

将来自胎盘或幼崽的湿组织用手术刀切成约3mm的碎片。然后将已知质量的切碎的组织溶解在2ml至4ml浓硝酸(14N)中并在100℃下加热直至组织完全溶解。(通常，在室温下约30分钟至45分钟且在100℃下约3分钟就足够了)。用10ml去离子水稀释酸溶液，导致一些有机物质沉淀。将该物质以3000g离心5分钟至10分钟，并将上清液用于分析。然后制备10⁶范围内的系列稀释液，并加入在2％硝酸中的十亿分之10(ppb)铋(Bi)作为内标。在Varian 810 ICP-MS系统上进行ICP-MS分析，使用制造商推荐的Gd测定方案。对空白组织的加标回收研究产生线性响应，在0ppb至900ppb范围内回收>90％，在0ppb至50ppb范围内响应>96％。

数据分析：

图像解释：

由于Multihance造影剂从循环中相对快速的清除，图像强度在注射后约11秒至15秒达到峰值。放射科医师比较Multihance和脂质体-Gd的图像，以评估其质量和外观。选择表示所达到的最大强度的视场中的每个胎盘的图像用于解读。由于从循环中非常缓慢的清除，用脂质体试剂收集的图像具有恒定的强度，因此随机选择来自该系列的图像。将图像去识别化，使得所使用的造影剂不被暴露，将它们的顺序随机化，并呈现给盲法解读者(专门从事母胎成像的儿科放射科医师)。解读者对每个图像进行了5分制评分(0：胎盘不可见，直至4：清晰可见和描绘出边缘，与主要血管可比)。然后对评分的图像进行非盲化，并且将采用每种造影剂获得的图像得分的离散分布制成表格。使用卡方检验来检验零假设H0：分布不等同。

DCE分析

将MRI数据转移至离线工作站，并使用AMIRA V5.6软件(FEI VisualizationSciences Group，Hillsboro，俄勒冈州)将每个胎盘和胎儿区室分割为单独的目标区域(ROI)。将分割的区域转移到Matlab(Matlab 7.6.0，MathWorks，Natick，MA，USA)以创建逐像素的T₁(0)图和T₁(t)图，如附录A中所述。从信号增强模式可视地识别两个胎盘区：以早期流动增强为特征的迷路区和以中心迷路增强达到峰值后开始的晚期流动增强为特征的周边区域(母体蜕膜)。这两个区域共同构成了整个胎盘。

DCE评估有两种情况：(1)假设胎盘迷路单独作为目标组织，和(2)假设整个胎盘作为目标组织。使用参考区域(RR)模型来估计目标组织的转移速率常数K^转移和K^胎盘排出(详见附录B)。对于这两种情况，使用椎旁肌中的参考区域，其中假设K^转移值＝0.2毫升/分钟/毫升组织，K^胎盘排出＝0.1毫升/分钟/毫升组织。

实施例3

病态黏附胎盘(MAP)是一种破坏性病症，其特征在于胎盘侵入子宫壁。MAP发病率在过去30年中增加了近10倍。虽然这种增加在很大程度上与剖腹产的增加同时发生，但在一项基于多中心人群的研究中，超过一半的病例是从未生育过的女性，或者没有剖腹产史的人群，这表明自发性MAP(在没有已知的风险因素的情况下)是一个重要的事件。在不确定的病例中进行MAP诊断仍然具有挑战性，即便进行超声检查然后进行MRI检查也仍具挑战：仅约一半的MAP病例在分娩前即被怀疑。MAP导致大量失血(25％的病例)、子宫切除(70％的病例)和ICU入院(30％的病例)，远远高于非MAP人群的发病率。

虽然超声是用于检测MAP的第一线成像模式，但是由于观察者间可靠性具有相当大的变化，灵敏度和特异性是存在缺陷的，因此，通常在妊娠中期和妊娠晚期增加MRI的使用。钆(Gd)造影剂增强了MRI对MAP的诊断准确性。然而，对胎儿暴露于Gd的担忧已经使它在美国不被使用，而在世界其他地方，它也被谨慎使用。然而，Gd试剂的不良事件发生率非常低，为0.1％至0.3％。最近的一项前瞻性研究汇总了8年期间和超过130000次对人类施用Gd造影剂(两种性别、所有年龄、且包括妊娠女性)的数据，没有对适应症作出说明。该研究还包括学术和社区医院。该研究中的不良事件被指定为“任何报告的客观或主观体征”，而无论是否与临床相关。即使存在这一极其广泛的标准，报告的AE率也很小：0.18％。少于0.01％被归类为“严重”，其余被认为是“轻微”。绝大多数是一些形式的过敏反应，并且很容易用苯海拉明或在少量病例中使用类固醇进行治疗。

在妊娠女性中，安全性考虑适用于母亲和胎儿。虽然没有关于妊娠女性Gd安全性的前瞻性研究，但已有一些回顾性研究和一些动物研究。在啮齿动物和非人类灵长类动物中，Gd暴露于母亲或后代中没有明显的影响。在人类中，对临床数据的回顾性分析显示对母亲没有不良影响，且当Gd暴露发生在妊娠早期时对婴儿没有影响。然而，当Gd暴露发生在妊娠中期或妊娠晚期时，后代患风湿病或炎性病症的风险增加。Fraum等人,JMRI 2017。另一项研究(Ray等人,JAMA 316:952-61(2016))专注于妊娠早期，并显示出即使经历这一时期的Gd暴露，也表现出增加的患风湿病或炎性病症的风险。因此，消除胎儿暴露是提高妊娠期Gd试剂安全性的一种方法。与似乎易于通过胎盘屏障扩散的常规Gd螯合物不同，该实施例证明了本文公开的脂质体Gd造影剂的实施方案显示出不易通过胎盘屏障扩散。

方法

用于灌注胎盘研究的荧光脂质体：对于实验胎盘的母体和胎儿区室的灌注，使用Krebs溶液(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO)。溶液含有D-葡萄糖(2.07g/L)、NaCl(6.95g/L)、KCl(0.35g/L)、MgSO₄(0.144g/L)、KH₂PO₄(0.163g/L)、NaHCO₃(2.1g/L)、EDTA(9.7mg/L)、CaCl₂·2^.H₂O(0.37g/L)、2000-U/l肝素(Sagent Pharmaceuticals；Schaumburg，IL)和50mg/l庆大霉素(Sigma-Aldrich；圣路易斯，MO)。将40000分子量的葡聚糖(SpectrumChemical；New Brunswick，NJ)分别以30g/L和7.5g/L的浓度溶解于胎儿溶液和母体溶液中，以在灌注的胎盘组织中维持适当的胶体-渗透平衡。在整个实验过程中，这些缓冲液用于灌注胎盘的母体侧和胎儿侧。在整个实验过程中，胎儿灌注溶液用95％N₂/5％CO₂气体混合物平衡，而母体溶液用95％O₂/5％CO₂平衡。作为脂质体造影剂的替代物，使用带有罗丹明的脂质体(Bhavane等人,Circ.Cardiovasc.Imaging Jan 24,2013)。使用1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(mPEG-DSPE)和Lissamine罗丹明B 1,2-双十六烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙基铵盐(罗丹明-DHPE)(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)以DPPC:CHOL:mPEG-DSPE:罗丹明-DHPE＝61.9:35:3:0.1的摩尔比制备脂质体。

胎盘小叶选择和插管：选择妊娠分类为正常、或表现为妊娠糖尿病(GDM)或子宫内生长受限(IUGR)的女性进行该研究。在分娩前，所有患者均签署了机构审查委员会批准的同意书。该程序紧随先前发布的方案。Bednov等人Placenta Aug.31,2015。胎盘组织获自剖腹产后足月分娩的女性。在该研究中使用来自每种病况的三个胎盘(正常、GDM、IUGR)。分娩后，立即将胎盘运送到位于分娩室的专用胎盘灌注室，在那里进行进一步处理。对每个胎盘样品进行称重并将其置于室温下装有生理盐水溶液的托盘中。去除绒毛膜和羊膜。然后选择来自胎盘周边的胎盘小叶进行插管，该胎盘子叶没有血肿、梗死、近期出血或组织破坏的现象并且包含单对动脉和静脉血管。

对绒毛膜板的“动脉-静脉”对进行插管。在插管后立即将几毫升含有肝素的缓冲溶液注射到插管的动脉中以扩张部分凹陷的血管分支并用于抗凝。在将缓冲液注入其相应的动脉后，通过来自插管静脉的回流确认插管是否适当。

胎盘灌注：将胎盘的插管的动脉和静脉连接到数字蠕动泵(Welch Vacuum，型号3200C，Welch；Niles，IL)，初始流速为1.5毫升/分钟。然后将插管的胎盘小叶安装到金属压缩环的钉上并夹紧到带有蝶形螺母的丙烯酸圆筒上。除去周围多余的胎盘组织。然后将安装的组合件(母体表面朝上)放入填充有盐水的双壁热稳定灌注室(Specialty Glass，Inc.，休斯敦，德克萨斯州)中。胎儿和母体循环系统以及水加热灌注室中的温度设定为37℃。

通过在30分钟期间内测量收集的胎儿灌注溶液体积来检查母体和胎儿区室之间的胎盘渗漏。认为渗漏低于10％/小时是可接受的。然后通过将四个均匀分布的金属插管插入母体表面，穿过基片进入蜕膜表面下2mm至4mm的胎盘绒毛间空间，来建立母体灌注。灌注液通过蜕膜板中的几个静脉开口离开绒毛间空间，并通过回流泵系统连续排出。

通过用95％O₂/5％CO₂气体混合物对母体灌注溶液进行通气并用95％N₂/5％CO₂对胎儿灌注缓冲液进行通气来建立灌注的胎盘小叶中的常氧条件。

然后将脂质体造影剂注入灌注器官的母体循环侧。在以下时间点收集母体和胎儿再循环流体的样品：1分钟、2分钟、4分钟、8分钟、12分钟、16分钟、32分钟、40分钟、60分钟。使用荧光(Ex/Em：540nm/625nm)光谱测定样品的罗丹明含量，重复三次测定。在12分钟至60分钟(在启始瞬态获得平衡后)收集的样品用于估计每个样品中的总脂质含量。将相对于预注射值的胎盘屏障每侧注射后的平均脂质浓度用作脂质体通过胎盘屏障的穿透性的指标。

结果：

母体回路中的脂质体-脂质浓度平均为约300μM至500μM，这与引入回路中的浓度一致。胎儿回路中的浓度低500倍至1000倍。值得注意的是，妊娠异常(妊娠糖尿病和胎儿生长受限)似乎不影响脂质体试剂的胎盘穿透性，无法区分试剂的母体和胎儿浓度与正常胎盘中的相应水平。

聚乙二醇包被的脂质体具有长的循环特性，并且可以起到血池试剂的作用，这形成了已经在许多动物模型中测试过的临床上使用的脂质体多柔比星以及几种成像试剂的基础。然而，与胎盘成像的潜在用途相关的是，这些试剂可能穿透人类胎盘屏障，特别是在当胎儿Gd暴露与风湿病和免疫病症风险增加相关的妊娠晚期时。然而，针对代表正常、GDM和生长受限妊娠的胎盘，本发明人进行的实验表明这些脂质体颗粒不穿透胎盘屏障。如通过保持连接到脂质体的脂质双层的荧光示踪剂(脂质-罗丹明)所测量的，灌注胎盘的胎儿回路中的脂质体浓度比母体回路中的浓度低3个数量级，这与在大鼠的胎儿和母体血液中测量的水平相一致。

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Claims (30)

1.一种根据式I的化合物：

R¹-L¹-X¹-(CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂)-X²-L²-R² (I)

其中

R¹是磷脂；

L¹和L²是独立地选自键、经取代的烷基或未经取代的烷基、和经取代的杂烷基或未经取代的杂烷基的连接体；

X¹和X²独立地选自O和NH；

n是5至500的整数；和

R²是顺磁金属离子螯合物，其包含络合了顺磁金属离子的大环配体，所述螯合物的热力学稳定常数(logK_GdL)为至少约20。

2.根据权利要求2所述的化合物，其中所述大环配体为四氮杂大环。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述大环配体的式选自：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述磷脂为：

其中

m和m'独立地选自4至24的整数。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中m＝m'并且是选自10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22的整数。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中L¹为：

其中

o和p独立地选自整数0、1和2。

7.根据权利要求4所述的化合物，其中R¹-L¹为：

8.根据权利要求2所述的化合物，其中L²为：

其中

x和y独立地选自整数0、1和2。

9.根据权利要求6所述的化合物，其中L²-R²为：

10.一种脂质体，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的化合物作为脂质体膜的第一脂质组分。

11.根据权利要求10所述的脂质体，其中所述脂质体还包含脂质体膜的第二脂质组分。

12.根据权利要求11所述的脂质体，其中所述第二组分选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-mPEG(DSPE-mPEG)及其组合。

13.根据权利要求12所述的脂质体，其中所述脂质体包含：

(i)约1％至约15％的根据权利要求1的脂质；

(ii)约50％至约60％的基质脂质，其选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)及其组合；

(iii)约10％至约40％的胆固醇；和

(iv)约1％至约5％的2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-mPEG(DSPE-mPEG)。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的脂质体，其中所述顺磁螯合物的T1弛豫率为约1特斯拉至约3特斯拉，其为相同顺磁螯合物未掺入所述脂质体时的至少约4倍至约8倍。

15.一种药物制剂，其包含根据权利要求10所述的脂质体和所述脂质体在其中悬浮的药学上可接受的载体。

16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述制剂是单位剂型制剂，其包含足以对体重约70kg的成年患者进行造影增强磁共振成像研究的量的所述脂质体。

17.一种获取对象的造影增强磁共振图像的方法，所述方法包括：

(a)向所述患者施用足以增强待获取所述图像的组织的造影的量的根据权利要求10所述的药物制剂；和

(b)获取所述对象的所述磁共振图像。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述对象是具有至少一个胎儿的妊娠雌性，每个所述胎儿的循环系统通过胎盘与所述雌性的循环系统分开。

19.根据权利要求18所述的方法，其中少于约5％的脂质体穿过胎盘并被递送至胎儿的循环系统。

20.一种获取妊娠雌性对象的造影增强磁共振图像的方法，所述方法包括：

(a)向所述患者施用脂质体，其中所述脂质体的膜包含含有与顺磁金属离子络合的螯合剂的化合物；和

(b)获取所述对象的磁共振图像，其中胎盘后空间在所述对象的磁共振图像中是可视的。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述化合物还包含磷脂。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述顺磁金属离子是Gd⁺³。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述脂质体包封造影剂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述造影剂包括钆贝酸二葡甲胺、钆喷酸二葡甲胺或钆磷维塞三钠。

26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述脂质体的直径为100nm至150nm。

27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述脂质体的分子量为1.8×10⁵kD至2.2×10⁵kD。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述脂质体包含在药物组合物中，并且其中所述药物组合物中的少于约5％的脂质体穿过胎盘并被递送到胎儿的循环系统。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述药物组合物中的少于约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、或约0.1％的脂质体穿过胎盘并被递送到胎儿的循环系统。

30.根据权利要求20至29中任一项所述的方法，其中胎儿的循环系统中脂质体浓度是妊娠雌性的循环系统中脂质体浓度的至多约1/100、约1/300或约1/500。