CN109900729A - 用于带电粒子显微镜等冷冻样品的改良型制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备（例如用于在带电粒子显微镜中进行研究的）冷冻样品的方法，由此使用冷冻剂对所述样品进行快速冷却，所述方法包括以下步骤：提供两个用于输送冷冻流体的导管，所述导管中的每个导管通向管接口中，所述管接口布置成隔着中间间隙彼此相对；将样品放入所述间隙中；通过所述导管泵送冷冻流体，以便同时从所述管接口冲排，从而从相对两侧将样品突然浸没在冷冻流体中，其中从所述管接口中的第一管接口施加的冷冻流体的冲排不同于从所述管接口中的第二管接口施加的冷冻流体的冲排，例如，二者的持续时间不同。

Description

用于带电粒子显微镜等冷冻样品的改良型制备
技术领域
本发明涉及一种制备冷冻样品的方法，由此使用冷冻剂对样品进行快速冷却，所述方法包括以下步骤：
- 提供两个用于输送冷冻流体的导管，每个导管通向管接口中，所述管接口布置成隔着中间间隙彼此相对；
- 将样品放入所述间隙中；
- 通过所述导管泵送冷冻流体，以便同时从所述管接口冲排，从而从相对两侧将所述样品突然浸没在所述冷冻流体中。
此外，本发明涉及一种用于执行这种方法的装置。
本发明还涉及这种样品在带电粒子显微镜中的使用，包括：
- 样品架，其用于保持样品；
- 冷却设备，其用于至少在样品位于样品架上时将其保持在冷冻温度；
- 源，其用于产生带电粒子束；
- 照明器，其用于引导所述束来照射样品；
- 检测器，其用于检测响应于所述照射而从样品散发的辐射通量。
背景技术
术语“冷冻剂”应解释为指冷冻温度（即，-150℃或以下）下的液体。这种冷冻剂的示例包括液态乙烷、液态丙烷、液态氧及其混合物。
带电粒子显微镜法，特别是电子显微镜法的形式，是一种众所周知且日益重要的微观物体成像技术。从历史上看，电子显微镜的基本类已经演变成许多众所周知的装置种类，例如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和扫描透射电子显微镜（STEM），以及各种子类，诸如所谓的“双射束”工具（例如，FIB-SEM），该工具另外采用“机加工”聚焦离子束（FIB），例如允许进行诸如离子束研磨或离子束诱导沉积（IBID）等支持性活动。更具体地说：
- 在SEM中，通过扫描电子束照射样品，例如以二次电子、背散射电子、X射线和光致发光（红外、可见和/或紫外光子）的形式沉淀来自样品的“辅助”辐射的散发；然后检测这种散发辐射通量的一个或多个分量并用于图像累积目的。
- 在TEM中，选择用来照射样品的电子束具有足够高的能量以穿透样品（为此，该样品通常将比SEM样品更薄）；然后，可以使用从样品散发的透射电子的通量来产生图像。当这种TEM以扫描模式操作（因此变成STEM）时，所讨论的图像将在照射电子束的扫描运动期间累积。
作为使用电子作为照射束的备选方案，还可以使用其他种类的带电粒子进行带电粒子显微镜法。在这方面，短语“带电粒子”应该广义地解释为包含，举例来说，电子、正离子（例如，Ga或He离子）、负离子、质子和正电子。关于非基于电子的带电粒子显微镜法，例如，可以从以下来源收集一些进一步的信息：
https://en.wikipedia.org/wiki/Focused_ion_beam
http://en.wikipedia.org/wiki/Scanning_Helium_Ion_Microscope。
- W.H.Escovitz, T.R.Fox和R.Levi-Setti，《具有场离子源的扫描透射离子显微 镜（Scanning Transmission Ion Microscope with a Field Ion Source）》，《美国国家科学院学报（Proc.Nat. Acad.Sci.USA），72(5)，第1826-1828页（1975年）。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22472444。
应当注意的是，除了成像和执行（局部）表面改性（例如，研磨、蚀刻、沉积等）之外，带电粒子显微镜还可以具有其他功能，诸如执行光谱检查、检查衍射图等。
在所有情况下，带电粒子显微镜（CPM）将至少包括以下组件：
- 辐射源，诸如肖特基电子源或离子枪。
- 照明器，其用于操纵来自源的“原始”辐射束，并且对其执行某些操作，诸如聚焦、减轻像差、裁剪（带孔）、滤波等。它通常包括一个或多个（带电粒子）透镜，并且还可以包括其他类型的（粒子）光学组件。如果需要，照明器可以设有偏转系统，所述偏转系统可以被调用以使其输出束在正在研究的样品上执行扫描运动。
- 样品架，在其上可以保持和定位（例如倾斜、旋转）被研究的样品。如果需要，可以移动该样品架，以便实现射束关于样品的扫描运动。一般而言，这种样品架将连接到定位系统，诸如机械台。样品架可以包括将样品保持在给定（热或冷）温度范围内的器件；在本发明的具体背景下，它通常包括将样品保持在冷冻温度下的器件。
- 检测器（用于检测从被照射的样品散发的辐射），其在本质上可以是单一式或复合/分布式，并且可以采取许多不同的形式，这取决于被测辐射。示例包括光电二极管、CMOS检测器、CCD检测器、光伏电池、X射线检测器（诸如硅漂移检测器和硅（锂）检测器）等。一般而言，CPM可以包括几种不同类型的检测器，可以在不同情况下调用对其的选择。
在透射型显微镜（例如(S)TEM）的情况下，CPM还将包括：
- 成像系统，其基本上采集透射通过样本（平面）的带电粒子并将其引导（聚焦）至分析装置上，诸如检测/成像设备、光谱装置（诸如EELS模块；EELS=电子能量损失能谱仪）等。与上面提到的照明器一样，成像系统还可以执行其他功能，诸如减轻像差、裁剪、滤波等，并且通常包括一个或多个带电粒子透镜和/或其他类型的粒子光学组件。
在下文中，本发明将通过示例的方式时常在电子显微镜学的特定背景中阐述。然而，这种简化仅用于清楚/说明目的，不应解释为限制。
与其在CPM中的检查相比，需要在水性液体（诸如水、电解质、细胞液、血浆等）的主体内储存和研究的生物样本（诸如细胞、细胞组分、单细胞生物体等）可能会遇到重大挑战，原因如下：
- 引入CPM（准）真空环境的水性液体将开始脱气/沸腾，从而趋于降解样本；
- 为防止这种情况，可以在将样品（样本+水性液体）引入所述真空之前首先将其冻结；
- 然而，为了防止因形成（尖锐的）冰晶而导致样本损坏，这种冻结一般必须非常迅速地进行，目的在于实现样品玻璃化（凝固成玻璃状非晶相）而不会发生显著的冰结晶。
为了促进这种玻璃化，并且还为了允许在透射型CPM（诸如TEM）中研究样品，样品应该相对较薄（片状），但是仍然应该能够通过其边缘进行支撑（使得所采用的支撑器件不会对射束穿透产生显著影响）。为此，使用的通常由栅格状支架（诸如所谓的TEM Autogrid®）制成，在其上横跨穿孔膜（诸如所谓的“多孔碳膜”），所述膜的穿孔（通过表面张力效应）可以保持少量的样品。例如，参见图1。
如以上开头段落中所述的方法从US 2017/0169991 A1中获知，该方法具有与本申请相同的发明人/受让人，并且通过引用并入本文。尽管与在其日期之前的现有技术相比，所述文献中提出的技术实现了显著的改进，但发明人仍然试图对其进一步改进。这一努力的结果即为本发明主题。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过玻璃化制备冷冻样品的改良方法。特别地，本发明的目的是，与现有技术相比，这种方法应该产生更加一致的结果。具体地，本发明的目的是新方法应该减少样品在玻璃化过程中发生的（部分）损坏。
这些和其他目的是通过以上开头段落中提出的方法实现的，所述方法的特征如权利要求1中所限定。根据所述方法，在给定的时间间隔之后减少从所述管接口中的第一管接口施加的冷冻流体的冲排，使得来自所述管接口中的所述第一管接口的冷冻流体的冲排不同于从所述管接口中的第二管接口施加的冷冻流体的冲排。
这一新型技术与US 2017/0169991 A1中的技术的不同之处在于，它在样品后侧（面向所述管接口中的一个）和前侧（面向所述管接口中的另一个）的冷却方面会特意产生不对称/差异。在本发明中，来自每个管接口的冷冻剂的冲排可以在例如冷冻剂类型、相位、温度、流动横截面、流速、冲排持续时间等中的一个或多个方面不同。这种有意的差异来自发明人对设置在栅格安装式穿孔膜上的水性样品的玻璃化的研究，由此发明人观察到，当使用US 2017/0169991 A1中的技术时，膜的一些单元格/方格（在某些情况下）容易脱离栅格：例如，参见图2。更彻底地观察这种现象，发明人观察到，这样的单元格/方格看起来是从以特定方向性/非等距性，即，沿着从后侧（膜面向栅格的一侧）到前侧（膜背向栅格的一侧）的方向，从膜的剩余部分切断/脱离。经过大量研究后，本发明人得出的结论是，在膜的一侧（后侧）而非另一侧（前侧）存在栅格会产生本质上不同的条件，这些条件通常需要单独定制/优化后侧和前侧玻璃化。更具体地说，发明人得出的结论是，在后侧和前侧都施加相同的冲排，有可能过度冲排后侧，其中从该侧损坏/破损的风险增加。因此，发明人设计了这样的实验，其中例如，通过改变冲排压力、改变冲排分布（使用不同的管接口）、改变后侧相对于前侧的冲排持续时间和/或释放后侧的空间以便从中抽空冷冻剂并因此与前侧相比降低压力，使后侧接受的冲排与前侧相比“不太有力”。这产生的结果令人鼓舞，大大减少了单元格/方格损坏/脱离的发生。
一种解释前一段中阐述的现象的方法源于认识到，膜的一侧（后侧）存在栅格会相对于膜的另一侧（前侧）而产生不同的流动行为（和相关的热效应）。实质上，栅格“划分”膜后侧的空间，阻碍冷冻剂横向流动（沿着膜），并且往往引起伴随的湍流效应。在某种程度上，栅格往往“聚焦”/集中（在栅格单元格内）与后侧冲排相关的机械力/热效应——如果不采取缓解措施，可能会局部淹没膜。
完整起见，应当认识到，从管接口冲排的冷冻流体可以是液体或（干）气体/蒸气，并且在每个管接口可以是相同的或不同的；一般而言，液体往往优于气相流体，尤其是因为液体的热容量更大，并且可以相对容易地进行储存和泵送。还应注意的是，如果需要，管接口可以包含筛网（滤网）或其他形式的流动路径细分，例如，以便实现层流和/或特定的流动模式；如上所提及的，两个管接口的栅格不必相同。
在一个实施例中，减小包括在所述给定时间间隔之后终止来自该所述第一管接口的冲排的步骤。因此，一侧与相对侧相比冷却的时间更长。
在根据本发明的设置中，冷冻流体可以例如使用一个或多个（电）泵泵送通过所采用的导管；这些可以根据需要打开/关闭，和/或可以使用阀门系统随意打开/关闭导管中的流动。根据本发明（的一个实施例），这种设置允许例如导管之一中的流速和/或流动持续时间与另一个导管中的流速和/或流动持续时间不同。然而，在备选实施例中，使用的是“手动泵送”设置，其中：
- 所述导管布置在柱塞中，由此每个导管在柱塞的下侧上具有入口孔，并且所述间隙在柱塞的顶侧设置成凹槽。
- 冷冻流体浴槽设置在所述柱塞下方；
- 使用工具将所述样品插入所述凹槽中，所述工具在所述柱塞上施加向下的压力，从而使所述柱塞至少部分地浸入，并使所述浴槽中的冷冻流体流入所述入口孔并通过所述管接口排出。
这种设置有效地利用了类似于活塞中使用的流体驱替机构（由此[在具有溢流导管的情况下]柱塞起到了活塞头的作用，并且冷冻浴槽包含在活塞管中）。它类似于前述US2017/0169991 A1中描述的设置，但是根据本发明进行了修改，以便能够从每个管接口产生不同的冷冻流体冲排。实现此目的的一种方式是在给定的时间间隔之后，使用挡板关闭连接到所述第一管接口的所述导管中的第一导管。执行这种延迟遮挡的便捷方式是使用这样的构造，其中当柱塞浸入所述浴槽中时，连接到所述第一导管的所述孔中的第一孔与设置在所述浴槽表面下方选定距离d处的盖子（遮蔽物；切断构件）接合，所述盖子然后与柱塞共同移动，以便使所述第一孔保持关闭。例如，在图3A至3C中描绘了这种情况。如果柱塞以垂直速度v浸入，则可以选择d，以便在开始冲排/压下柱塞之后，在给定时间t=d/v（(例如，在10至100毫秒（ms）的范围内，举例来说，诸如40至60毫秒）接合挡板。挡板本身例如可以是：
- 实施为本质上在所使用的冷冻剂浴槽中可上浮，和/或举例来说，例如通过使用弹簧机构使其向上偏置而人为地“上浮”。以这种方式，当柱塞（在其向上/返回“行程”）从其脱离时，挡板将向上复原/松弛（到默认/初始位置）。
- 附接到将其运动限制在垂直路径上的导轨/轨道。
- 使用可调节挡块缩减超过一定水平（深度d）的上升。
在前一段中所描述的实施例中，应当注意的是：
- 所讨论的“工具”可以例如是镊子或钳子，其可以用来夹住试样边缘。这种工具例如可以包含诸如突起、结节或局部增大之类的特征，该特征与柱塞顶部（或其上的某个结构）接合，以便将工具的插入（凹槽的）运动转变成柱塞的（向下）共同运动。
- 柱塞最初可以（浅浅地）浮在冷冻剂浴槽中，或者另选地，可以悬挂在浴槽上方。
- 尽管图3A至3C的说明描绘了样品平面垂直定向并且冷冻流体从管接口水平冲排的情况，但并非必须如此。相反，例如可以构建一种设置，其中样品平面水平定向，管接口布置在其上方和下方，并且冷冻流体从管接口进行垂直冲排。在两种情况下，需要两个导管的（累积）长度基本相等，以便在柱塞适当地浸入时确保从两个管接口基本上同步地放出冷冻流体。
- 柱塞可以由各种材料制成，只要其（例如，在脆性方面）适用于冷冻温度。示例包括，举例来说，不锈钢、钛和（某些）陶瓷。
对于具有相对定位的主表面的基本上为平面的样品，诸如如以上所述的栅格/膜，或者例如薄片/圆片——以下考虑因素提供了在应用本发明时的（非约束性）指导：
- 可以将终端/极端/周向周边与每个管接口相关联。这通常将是循环的，尽管并非必须如此。
- 在理想情况下，这些周边将以公共轴为中心。
- 该公共轴将以（近似）法角/直角与（平面型）样品的平面相交。在理想情况下，公共轴也将穿过样品的几何中心/质心/重心。
- 在名义上，将样品定位成使其与管接口等距（或者，在样品包括横跨在栅格上的膜的情况下，使得膜与管接口等距）。如果样品/膜更靠近特定的管接口，则仍然可以通过例如以下方式确保同时开始冲排样品的前侧和后侧：
- 稍微延迟将冷冻剂泵送到与该特定管接口相连的导管中；和/或
- 将连接到该特定管接口的导管实施为略长于连接到另一个管接口的导管。
关于插入样品的冷冻剂浴槽，所用的冷冻剂有各种可能的选择。例如，各种从业者报告使用液态乙烷/丙烷混合物。在本发明的一个具体实施例中，浴槽中的冷冻剂包括温度范围为-160℃至-183℃的液态乙烷（不含大量其他成分）。当通过插入冷却使样品玻璃化时，往往可以坚持“越冷越好”的准则。然而，在低于约-183℃的温度下，发明人已经观察到液态乙烷可能趋于变得如此粘稠，以至于可能例如通过粘附到样品架而阻碍插入过程。因此通常优选高于这个水平（例如，-175℃）的温度。
为了实现令人满意的样品玻璃化，将其暴露于来自本发明的管接口的冷冻流体时，应当相对突然地进行——因此使用术语“冲排”。如果对来自管接口的冷冻流体的暴露比较平缓/长时间，则存在样品将（至少部分地）冻结成结晶形式而不是非晶固化（这在本发明的背景下是合需要的）的风险。本发明的冲排的时间和持续时间可以根据各种因素，诸如样品的（栅格/膜的）厚度、所用冷冻流体的温度、管接口产生的压力/流动模式等进行调节/优化。作为非约束性示例，来自第二管接口的不间断冲排可以具有，举例来说，5至200毫秒范围内的标称持续时间；在样品包括栅格上的多孔膜的情况下，稍长的持续时间一般将有助于确保除了在多孔膜中产生水性薄膜的玻璃化之外，从栅格（以及任何相关的支撑构件）中将残余热量去除到令人满意的程度，以防由于栅格热泄漏而导致膜的不必要的“再加热”。在发生玻璃化后，水性膜的温度将优选保持低于约-145℃，以防形成不必要的结晶冰。所属领域技术人员将能够选择符合与本发明的给定实施例有关的设置和参数的冲排持续时间。
尽管以上已经参考栅格安装式样品阐述了本发明，但是不应该将其解释为限于这样的样品。原则上，本发明可以用于任何样品，其中在第一侧和相对设置的第二侧之间存在不对称/区别。例如：
- 一侧可以包括厚基板，而另一侧可以包括薄叠片/薄膜；
- 一侧可以包括非晶材料，而另一侧可以为晶体状；
- 一侧可以包括具有第一比热容的材料，而另一侧可以包括具有基本不同的热容量的材料，
等等。这种差异可以证明本发明的应用是合理的，由此将第一侧冲排配置成与第二侧冲排不同。
附图说明
现在将基于示例性实施例和所附示意图对本发明进行更详细的阐述，其中：
图1示出了玻璃化过程中使用的常见样品结构（的一个具体实施例）。
图2显示了应用现有技术玻璃化程序可能导致的样品损坏。
图3A至3C呈现了根据本发明的装置（用于实施本发明的方法）的实施例的各方面的纵向剖视图。
图4呈现了带电粒子显微镜的纵向剖视图，该显微镜适用于本发明。
在附图中，在相关情况下，可以使用对应的附图标记表示对应的部件。应当注意的是，一般而言，附图未按比例绘制。
具体实施方式
背景示例
图1呈现了可以与本发明结合使用的样品S的特定实施例的各个方面的详细（放大）视图。这种特定类型的样品S包括通常被称为“栅格”或“自动栅格”G的物件。它包括金属丝（举例来说，例如含有Cu或Ni）圆形环21a，环的直径通常为约3 mm，并且金属丝的直径通常为约20至100 μm。附接在环21a内的是直线金属丝部分21b，其（在这种情况下）布置成形成正交的栅格图案，从而限定出矩阵状的（基本上正方形的）孔（开口/孔洞/窗）23的阵列。图1的中间部分显示了沿着直径B-B'截取的附图的上部的横向剖视图。它显示出栅格G具有基本上平面（板状）的形式，相对的第一“面”（S1）和第二（S2）“面”基本上彼此平行。如此处所示，膜25跨在第一面S1上（并且任选地，例如，使用粘合剂或通过熔融粘合固定到金属丝21b）。该膜25可以，例如，包括碳质材料，诸如尼龙或石墨烯，并且通常具有范围从约0.3 nm到数百nm的厚度（沿着Y方向）。膜25包含分布的穿孔27，其在附图底部的详细视图中清楚可见。这些穿孔27的直径（平行于XZ平面）通常约在1.2至3.5 μm的范围内（例如，~2 μm）。栅格G在本质上充当膜25的支撑物，并且膜25又用作穿孔27的支撑结构（因此它有时被称为“多孔碳支架”）。在穿孔27内，将以水性液体薄膜29（包括悬浮在其中的一个或多个研究样本）的形式，提供并支撑最终“样本”，所述水性液体薄膜29横跨每个给定穿孔27，（尤其）借助表面张力效应保持在适当位置。应当注意的是，如图1所示的结构（栅格G+穿孔膜25、27）和如以上所描述的结构可在市场上买到，例如，从诸如美国加利福尼亚州雷丁市的Ted Pella公司等公司买到。也可以例如从德国耶拿Quantifoil Micro Tools公司等公司，购买（各种）预先制造的多孔碳膜（对应于多孔膜25、27）。尤其在本发明的上下文中，所示结构可被视为具有“后侧”Sb和“前侧”Sf。
可以使用技术文献中充分描述的和所属领域技术人员已知的方法，在膜25的各种穿孔27中提供水性液体膜29。在一种这样的已知方法中，将一张吸墨纸（未示出）压在膜25的外表面/下表面上，然后使用所讨论的水性液体润湿，随后除去（例如，剥离）膜25，使（大部分）孔27被赋予水性液体的（微型）膜29，所述膜通过表面张力效应跨越在孔中。例如，Marc Adrian等人在《微米（Micron）》第29（2-3）期（爱思唯尔科学有限公司（ElsevierScience Limited），1998年，第145至160页）的文章《冷冻负染色（Cryo-negative Staining）》中描述了这种类型的方法，这里不再进一步关注。还可以参考US 9,772,265（具有与本申请相同的发明人/受让人，并且通过引用并入本文）中提出的备选方法。
现在转到图2，其显示了在使用前述US 2017/0169991 A1中所述的方法进行玻璃化之后，诸如图1中所示类型的特定样品（对样品的后侧和前侧施加相同的冲排）。深色/斑驳的方格/单元格未损坏或者仅有些损坏（玻璃化程序成功），而白色的方格/单元格对应于（或多或少）发生膜破裂/分层的位置。在当前情况下，可以看到约50％的方格/单元格是次佳的。如上所述，对样品进行更仔细的检查（在当前附图中不明显）表明，受损的方格/单元格已经脱离，方向主要从后侧到前侧。
实施例1
图3A至3C示出了根据本发明的方法和装置的实施例的各方面。从图3A开始，这示出了用于输送冷冻流体的一对导管31a、31b。这些导管31a、31b中的每一个都具有两个极端孔，这些孔（分别）为：
- （下）入口孔37a、37b，冷冻流体可以通过其进入导管31a、31b；
- （上）管接口（出口孔）33a、33b，冷冻流体可以通过其从导管31a、31b中排出。这些管接口33a、33b隔着中间间隙35彼此相对。
应当注意的是：
- 方便起见，各种组件31a、31b、33a、33b、35、37a、37b在这里描绘成驻留在主体P中，主体P可以用作将它们保持在适当位置的矩阵/结构；例如，主体P可以是金属、陶瓷或环氧树脂的插塞/块，其中，举例来说，这些各种组件通过铸造、模制、机加工或3D打印形成。然而，这并不一定如此，并且各种组件可以相反地为（准）独立结构。
- 孔37a、37b、33a、33b在此处描绘成喇叭形，但并不一定如此。
- 间隙35被描绘成具有一致的宽度，但是另选地，例如，可以是锥形的。在理想情况下，它应该相对较窄（在Y方向上），以便改善初始冲排同步和对称性。
- 如此处所示，筛网/滤网/起泡构件39a、39b提供在相应的管接口33a、33b中，设置成紧靠样品S的（标称）插入位置；这就形成了靠近样品S的“壁”，从而降低了可能的冲排延迟，并减少了在样品S两侧冲排时的任何初始不对称/不相似性，但仍远离样品S以防止冷冻剂的“桥接”。
图3A中还描绘了工具T（诸如镊子、钳子、老虎钳、夹子，、机器臂等），其可用于例如通过沿着边缘将其夹住来夹紧和操纵样品S。该工具T可用于将样品S定位在间隙35中和管接口33a、33b之间。
如上已经阐述的，一种向入口孔37a、37b供应冷冻流体的方式是使用合适的管道/管线将其简单地连接到（电动）冷冻剂泵（和相关联的冷冻剂储箱）；然后可以将冷冻剂泵送通过导管31a、31b，并从管接口33a、33b中泵出，以便用冷冻流体冲排/喷淋间隙35（中的样品S）。然而，在当前实施例中，相反地，使用（手动）活塞动作来使冷冻流体移动通过导管31a、31b。为此，主体P被实施为柱塞，其具有下侧Pu（入口孔37a、37b位于其中）和顶侧Pt（通过其可以进入间隙35）。然后，该柱塞P可以，例如，（部分地）插入/浸入冷冻剂7的容器（管，器皿）5中；当柱塞的下侧Pu在表面9下方移动时，冷冻剂7将（逐渐地）被迫通过入口孔37a、37b，通过导管31a、31b并从管接口33a、33b流出（参见图3A至3B至3C的进展，这说明了这个动作的一部分）。请注意，在图3A中，在插入工具T/开始插入程序之前，例如，作为前一次插入迭代的预虹吸和/或毛细管作用的结果，导管31a、31b已经用冷冻剂7灌注/预先填充。以这种方式，确保了冷冻剂供应紧邻样品S的插入位置等待，准备几乎瞬间喷出，从而降低从样品S两侧进行不同步冲排的风险。在这方面，应当注意的是，筛网39a、39b有助于将灌注的冷冻剂的这个“头部”保持在导管31a、31b内的适当位置。
为了产生所需的插入运动，所描绘的设置使用工具T向柱塞P施加向下的力——尽管这并不一定如此，并且相反地，可以通过其他方式向下推动柱塞P。如图3B和3C所示，工具T具有突起/凸耳T'，其与柱塞P的顶侧Pt的交互区域/部件P'接合，允许工具T上的向下的力将向下的动量传递到柱塞P：参见图3B、3C中的说明性向下箭头T"。此外，可以利用突起T'（如果需要）来确保样品S插入到间隙35中的最佳深度（在理想情况下，在管接口33a、33b之间基本对称），并且还可以用于来提供样品S在间隙35中的正确的横向定位（再次，在理想情况下，样品（的玻璃状膜）与管接口33a、33b等距离）。
在诸如此处所描述的设置的非限制性示例中，以下说明性（和近似）值可以适用：
- 样品S包括直径为3 mm和厚度为0.4 mm的平面栅格。
- 管接口33a、33b的直径：3至4 mm。
- 导管31a、31b的直径：2.5 mm。
- 管接口31a、31b的分离/间隙35的宽度：1 mm。
- 来自管接口31a、31b的流速：~5至15 m/s。
技术人员将能够根据给定情况的要求定制其自己的值。
在本发明的具体上下文中，所描绘的装置已经配置成使得从（左）管接口33a施加的冷冻流体的冲排与从（右）管接口33b施加的冷冻流体的冲排不同——更具体地，使来自管接口33a的冲排的持续时间短于来自管接口33b的冲排的持续时间。为此，在经过给定的时间间隔之后，使用遮挡机构（41、43、45）来关闭（左）导管31a（其连接到所述（左）管接口33a）。更具体地，该遮挡机构包括：
- 盖子（覆盖物/切断装置）41，其设置在冷冻剂浴槽表面9下方选定的标称距离d处。
- 轨道/导轨43，其允许并引导盖子41进行基本上平行于Z轴的运动。为此，盖子43可以包括孔43'（或者其他合适的结构，例如，诸如扣钩或流道），其与轨道43协作以允许二者进行相对运动。
- 可调节挡块（举例来说，诸如螺钉锁定式滑动套环），其防止盖子41向上的运动超过（在深度d处）某一点。
如上所述，盖子41可以在冷冻剂7中自然上浮（例如，因为盖子是中空的）和/或可以使用例如弹簧、活塞或磁性布置向上偏置。以这种方式，盖子41可以在与柱塞P接合时向下共同移动，但是当柱塞P从其脱离时将向上返回/松弛。特别参考个别附图：
- 在图3B中，尚未发生这种接合。柱塞P向下移动通过冷冻剂7，将（更多）冷冻剂强制性地引入导管31a、31b中。如图3A所示，通过填充管接口31a、31b之间的空间的阴影区域，相关联的压力头致使冷冻剂从两个管接口31a、31b进行冲排。
- 在图3C中，柱塞P与盖子41接合，并且柱塞P和盖子41向下共同移动（参见箭头47）。由于其尺寸/定位，盖子41仅与左入口孔37a接合，将其阻挡/盖住并且防止冷冻剂流入其中；另一方面，右入口孔37b不会以这种方式受到阻碍。因此，来自左管接口33a的冷冻剂的冲排停止，而来自右管接口33b的冲排继续。请注意，阴影区域（冲排）现在仅来自右管接口33b。
如上所述，所属领域技术人员可以选择d和/或柱塞P的向下速度，以便在开始冲排之后，以预选的时间间隔使从左管接口33a的冲排终止。该时间间隔可以是，例如，10至200毫秒。
实施例2
图4是CPM的实施例的高度示意图，该CPM可以用来检查根据本发明制备的样品；更具体地，它示出了透射型显微镜M的实施例，在这种情况下，透射型显微镜M是TEM/STEM（但是，在本发明的上下文中，它可以只是有效地是例如，基于离子的显微镜）。在该图中，在真空外壳V内，电子源2（例如，诸如肖特基发射器）产生横穿电子光学照明器4的电子束C，用于将其引导/聚焦到样本S的选定部分（例如，其可以（局部地）变薄/平面化）。该照明器4具有电子光学轴，并且一般将包括各种静电/磁性透镜、（扫描）偏转器D、校正器（诸如象散校正装置）等；通常还可以包括聚光镜系统（整个项目4有时称为“聚光镜系统”）。
样本S固持在样本架H上，样本架H可以通过定位系统/台A以多个自由度定位；例如，样本架H可以包括可以（尤其）在XY平面中移动的指状物（参见笛卡尔坐标系；通常，还可能进行平行于Z和（至少）关于X/Y倾斜的运动）。这种移动允许样本S的不同部件被沿轴C'（在Z方向上）行进的电子束照射/成像/检查（和/或作为射束扫描的备选方案，允许进行扫描运动）。冷却装置H'与样本架H紧密热接触，并且能够将后者保持在冷冻温度，例如，使用一桶冷冻冷却剂来达到并保持所需的低温。
沿着轴C'行进的（聚焦的）电子束C将与样本S相互作用，使得从样本S散发出各种类型的“受激”辐射，包括（例如）二次电子、背散射电子、X射线和光辐射（阴极发光）。如果需要，可以借助分析设备6检测这些辐射类型中的一种或多种，举例来说，分析设备6可以是例如组合式闪烁器/光电倍增管或EDX（能量色散X射线光谱仪）模块；在这种情况下，可以使用与SEM中基本相同的原理来构建图像。然而，另选地或补充地，可以研究横穿（穿过）样本S，从其中发出（散发）并继续沿着轴C'传播（实质上，尽管一般具有一些偏转/散射）的电子。这种透射电子通量进入成像系统（组合物镜/投影透镜）8，该系统一般包括各种静电/磁性透镜、偏转器、校正器（诸如，象散校正装置）等。在正常（非扫描）TEM模式中，该成像系统8可以将透射的电子通量聚焦到荧光屏10上，如果需要，该荧光屏10可以缩回/收回（如箭头10'示意性所示），以便使其远离轴C'的路径。样本S（的一部分）的图像（或衍射图）将由成像系统8在屏幕10上形成，并且这可以通过位于外壳V的壁的适当部分中的观察口12来观察。屏幕10的缩回机构可以，例如，在本质上是机械的和/或电的，此处未示出。
作为在屏幕10上查看图像的备选方案，相反地，可以利用从成像系统8发出的电子通量的焦深通常非常大（例如，约1 m）的事实。因此，可以在屏幕10的下游使用各种其他类型的分析装置，诸如：
- TEM相机14。在相机14处，电子通量可以形成静态图像（或衍射图），其可以由控制器E处理并且显示在显示设备（未示出）上，例如，诸如平板显示器。当不需要时，相机14可以缩回/收回（如箭头14'示意性地所示），以使其远离轴C'。
- STEM成像仪（相机）16。来自成像器16的输出可以记录为射束C在样本S上的（X,Y）扫描位置的函数，并且可以构造图像，该图像是来自成像器16的作为X, Y的函数的输出的“图”。与相机14中特征性地存在的像素矩阵相反，成像器16可以例如包括直径为例如20mm的单个像素。此外，成像器16一般具有比相机14（例如，每秒102张图像）更高的采集速率（例如，每秒106个点）。再次，当不需要时，可以缩回/收回成像器16（如箭头16'示意性地所示），以使其远离轴线C'（尽管例如在甜甜圈状环形暗场成像器16情况下，这种缩回不是必需的；在这种成像器中，当未使用成像器时，中心孔将允许射束通过。
- 作为使用相机14或成像器16成像的备选方案，还可以调用光谱装置18，其可以是例如EELS模块（EELS=电子能量损失光谱仪）。
应当注意的是，项目14、16和18的顺序/位置不严格，并且可以想到许多可能的变化。例如，光谱装置18还可以集成到成像系统8中。
请注意，控制器（计算机处理器）E经由控制线（总线）E'连接到各种图示的组件。该控制器E可以提供各种功能，诸如同步动作、提供设定点、处理信号、执行计算，以及在显示设备（未示出）上显示消息/信息。不用说，（示意性地描绘的）控制器E可以（部分地）位于外壳V的内部或外部，并且可以根据需要具有单一或复合结构。所属领域技术人员将理解的是，外壳V的内部不必保持在严格的真空状态；例如，在所谓的“环境TEM/STEM”中，在外壳V内有意地引入/维持给定气体的背景气氛。所属领域技术人员还将理解的是，在实践中，限制外壳V的体积以使其在可能的情况下紧密地包围轴C'可能是有利的，采取小管的形式（例 如，直径约1 cm），使所采用的电子束从其穿过，但是加宽以容纳诸如源2、样本架H、屏幕10、相机14、成像器16、光谱装置18等结构。
例如，图4中所示的样本S可以是已经经历根据本发明的玻璃化程序的样品。由于冷却装置H'，这种样本当在CPM M中时（并且在运输/储存时），可以保持在冷冻温度。为此，例如，可以采用诸如以下实施例：
- 冷却装置H'包括杜瓦瓶/烧瓶，其与样本架H紧密地热连接（例如，经由铜杆和/或编织物），并且可以填充有冷冻剂。
- 复合结构H+H'可以插入CPM M中或从CPM M中移除，由此可以通过定位系统A的接收器部分将其固定/夹紧。
例如，参考美国专利申请US 2012/0112064 A1中讨论的设置，以及类似的这种设置。

Claims (14)

1.一种制备冷冻样品的方法，由此使用冷冻剂对所述样品进行快速冷却，所述方法包括以下步骤：
提供两个用于输送冷冻流体的导管，所述导管中的每个导管通向管接口中，所述管接口布置成隔着中间间隙彼此相对；
将所述样品放入所述间隙中；
通过所述导管泵送冷冻流体，以便同时从所述管接口冲排，从而从相对两侧将所述样品突然浸没在所述冷冻流体中，
其特征在于，在给定的时间间隔之后减少从所述管接口中的第一管接口施加的冷冻流体的冲排，使得来自所述管接口中的所述第一管接口的所述冷冻流体的冲排不同于从所述管接口中的第二管接口施加的冷冻流体的冲排。
2.根据权利要求1所述的方法，其中与从所述第二管接口施加的冷冻流体的冲排的持续时间相比，从所述第一管接口施加的冷冻流体的冲排的持续时间更短。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中来自两个管接口的冲排基本上同时开始。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中来自所述第一管接口的冲排在所述给定时间间隔之后终止。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用挡板来减少从所述管接口中的所述第一管接口施加的冷冻流体的冲排。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中：
所述导管布置在柱塞中，由此每个导管在所述柱塞的下侧上具有入口孔，并且所述间隙在所述柱塞的顶侧设置成凹槽；
冷冻流体浴槽设置在所述柱塞下方；
使用工具将所述样品插入所述凹槽中，所述工具在所述柱塞上施加向下的压力，从而使所述柱塞至少部分地浸入，并使所述浴槽中的冷冻流体流入所述入口孔并通过所述管接口排出。
7.根据权利要求5和6所述的方法，其中当所述柱塞浸入所述浴槽中时，连接到所述第一导管的所述孔中的第一孔与设置在所述浴槽表面下方选定距离处的盖子接合，所述盖子然后与所述柱塞共同移动，以使所述第一孔保持关闭。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中：
所述样品基本上是平面的，具有相对定位的主表面；
将所述样品布置在所述间隙中，使得所述主表面面向所述管接口。
9.根据权利要求8所述的方法，其中：
所述样品包括带有穿孔膜的平面栅格，由此将所述膜的后侧放置在所述栅格的面上；
所述样品定位在所述管接口之间，使得所述后侧面向所述第一管接口。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述冷冻流体包括温度在-160℃至-183℃范围内的液态乙烷。
11.一种用于制备冷冻样品的装置，由此使用冷冻剂对所述样品进行快速冷却，所述装置包括：
一对用于输送冷冻流体的导管，所述导管中的每个导管通向管接口中，所述管接口布置成隔着中间间隙彼此相对，所述样品可以布置在所述间隙中；
泵送机构，其用于通过所述导管泵送冷冻流体，以便同时从所述管接口冲排，并且从相对两侧将所述样品突然浸没在所述冷冻流体中，
所述装置配置成使得可以减少从所述管接口中的第一管接口施加的冷冻流体的冲排，使得在给定的时间间隔之后从所述管接口中的第一管接口施加的冷冻流体的冲排不同于从所述管接口中的第二管接口施加的冷冻流体的冲排。
12.根据权利要求11所述的装置，其中：
所述导管布置在柱塞中，由此每个导管在所述柱塞的下侧上具有入口孔，并且所述间隙在所述柱塞的顶侧设置成凹槽，
所述冷冻流体可以设置在所述柱塞下方的浴槽中，
所述凹槽配置成接合工具，所述工具将样品插入所述凹槽并且同时在所述柱塞上施加向下的压力，以便至少部分地将所述柱塞浸入所述浴槽，并使冷冻流体流入所述入口孔并通过所述管接口排出。
13.根据权利要求12所述的装置，其包括挡板，所述挡板布置成当所述柱塞达到所述浴槽中的给定深度时，封闭连接到所述第一管接口的所述导管中的第一导管。
14.使用根据权利要求1至9中任一项所述的方法制备的样品在带电粒子显微镜中的使用，其包括：
样品架，其用于保持所述样品；
冷却设备，其用于至少在所述样品在所述样品架上时将其保持在冷冻温度；
源，其用于产生带电粒子束；
照明器，其用于引导所述束来照射所述样品；
检测器，其用于检测响应于所述照射而从所述样品散发的辐射通量。
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