CN109897841B - 一种以杂多糖为碳源生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了本发明涉及一种以杂多糖为碳源生产内切β‑1,3‑葡聚糖酶的方法，属于发酵工程技术领域。本发明采用高果糖浆废液杂多糖代替葡萄糖利用毕赤酵母工程菌PGAP9K‑BGN13.1生产内切β‑1,3‑葡聚糖酶，为高果糖浆废液杂多糖提供了其在生物工程领域的价值，与葡萄糖做碳源相比，本发明的所述杂多糖做碳源发酵效果在相差无几的同时，发酵成本显著降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种以杂多糖为碳源生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
高果糖浆作为一种新型甜味剂具有低热量、低生产成本及工艺简便等优点，每年都有巨大的产量。高果糖浆是以淀粉为原料，由生物工程技术生产而来。其主要步骤有液化、糖化、离子交换、浓缩、异构化及果葡分离等。经过最后一步果葡分离后，高果糖浆作为产品包装售卖，剩余的废液杂多糖中含有大量的葡萄糖、果糖及少量的寡糖。但废液价格十分低廉且售卖领域十分有限。
β-1,3-葡聚寡糖是一类重要的生理活性物质，其应用范围近年来逐渐扩大，如β-1,3-葡聚寡糖可以通过刺激宿主免疫功能，激活巨噬细胞、中性粒细胞和天然杀伤细胞而具有抗菌抗肿瘤活性。目前制备β-1,3-葡聚寡糖的主要方法是水解β-1,3-葡聚多糖。使用专一性内切酶水解多糖制备相应寡糖优势明显。内切β-1,3-葡聚糖酶能够沿分子链随机切割β-1,3-糖苷键，产生DP 2-10的寡糖。该类酶来源广泛，存在于植物、真菌以及细菌中。除此之外，内切β-1,3-葡聚糖酶在细胞融合和转化、原生质体制备、食品加工、药物筛选、饲料加工和发酵工业生产方面也有着巨大的潜在应用。
发明内容
本发明使用高果糖浆废液杂多糖代替葡萄糖作为毕赤酵母工程菌PGAP9K-BGN13.1生产内切β-1,3-葡聚糖酶的碳源，以降低发酵成本。
本发明的第一个目的是提供一种生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法，以杂多糖或含有杂多糖的组合物为碳源，以毕赤酵母为发酵微生物，生产内切β-1,3-葡聚糖酶。
在本发明的一种实施方式中，所述含有杂多糖的组合物为高果糖浆废液。
在本发明的一种实施方式中，所述高果糖浆废液含有聚合度2-17的线性葡聚糖，单糖部分包括葡萄糖和果糖；其中总糖含量为902.3g/L±50g/L，葡萄糖含量为480g/L±30g/L，果糖含量为292g/L±20g/L，麦芽糖含量为103.6g/L±10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、K2SO4、MgSO4、(NH4)2SO4、柠檬酸、CaSO4和PTM1。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基中，酵母粉的浓度为10g/L，蛋白胨的浓度为20g/L，KH2PO4的浓度为14.3g/L，K2SO4的浓度为4.77g/L，MgSO4的浓度为5.7g/L，(NH4)2SO4的浓度为5g/L，柠檬酸的浓度为1.92g/L，CaSO4的浓度为0.1g/L，PTM1的浓度为4.8mL/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程还进行补料。
在本发明的一种实施方式中，补料的培养基含有：杂多糖、酵母粉、蛋白胨。
在本发明的一种实施方式中，补料的培养基中，杂多糖浓度为20-60g/L。
在本发明的一种实施方式中，补料的培养基中，杂多糖浓度为500g/L，酵母粉浓度为10g/L，蛋白胨浓度为20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵包括以下步骤：
1)使用固体培养基对毕赤酵母进行活化，得到活化后的单菌落；
2)使用种子培养基对步骤1)得到的单菌落进行摇瓶培养，得到处于对数生长期(OD600值在2-3)的菌悬液；
3)在7L发酵罐中装入3.4L所述发酵培养基，接入发酵罐控制系统，平衡各种控制参数至少2h；
4)将步骤2)所得菌种悬浮液接入发酵罐中进行发酵培养，一定时间后，流加补料培养基，培养时间为接种后120h；
5)步骤4)完成后，取发酵上清液即可获得内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤1)中固体培养基为YPD固体培养基；活化时间为2-3天，活化次数为2次。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤2)中种子培养基为YPD液体培养基，摇瓶培养时间为16-20h，转速为220r/min，温度为30℃。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3)中，所述控制参数分别为：pH，DO，转速，温度，通气量。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3)中，所述控制参数值分别为：pH 7.0,DO≥30，转速200-800r/min,温度30℃，通气量2-6。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤3)中，所述pH通过流加30％的H3PO4及40％的NH4OH进行调控。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤4)中，所述接种菌种悬浮液为接种OD600在2-3的对数生长期菌株600mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤4)中所述一定时间是发酵培养基中葡萄糖消耗完毕后2h。
在本发明的一种实施方式中，所述补料培养基的流加速度为3mL/L/h。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母PGAP9K-BGN13.1的构建方法记载于2019年1月公开的《土壤杆菌-毕赤酵母耦合培养直接生产热凝胶低聚糖》论文中。
本发明还要求保护所述方法在细胞融合和转化、原生质体制备、食品加工、药物筛选、饲料加工和发酵工业生产等方面的应用。
本发明的有益效果：生物发酵过程绝大多数的碳源都是葡萄糖，且每批发酵葡萄糖的用量很大，导致发酵过程中碳源成本高昂。本发明采用高果糖浆废液杂多糖代替葡萄糖利用毕赤酵母工程菌PGAP9K-BGN13.1生产内切β-1,3-葡聚糖酶，为高果糖浆废液杂多糖提供了其在生物工程领域的价值，与葡萄糖做碳源相比，本发明的所述杂多糖做碳源发酵效果在相差无几的同时，碳源成本降低了40倍。
具体实施方式
在本发明中，不做特别说明的情况下，杂多糖指代高果糖浆废液，其成分为：聚合度2-17的线性单糖；单糖包括葡萄糖和果糖，其中总糖含量为902.3g/L，葡萄糖含量为480g/L，果糖含量为292g/L，麦芽糖含量为103.6g/L。
生物量测定方法：使用分光光度计在600nm下测定吸光度(OD600)值，根据曲线DCW＝0.34OD600计算细胞干重。
酶活测定方法：本研究中内切β-1,3-葡聚糖酶活力定义为：以热凝胶为底物，水解反应1分钟生成1μg寡糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
反应体系5mL，包含1.5mL 2％(w/v)热凝胶悬浮液，2.5mL醋酸钠缓冲液(0.025mol·L-1，PH 6.0)，1mL毕赤酵母发酵液上清，反应液置于50℃水浴2.5h反应结束后沸水浴加热10min终止反应。随后，水解液中寡糖含量采用TLC板法测定。
实施例1
培养基配方：
发酵初始培养基：杂多糖40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO4 14.3g/L，K2SO4 4.77g/L，MgSO4 5.7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，柠檬酸1.92g/L，CaSO4 0.1g/L，PTM1 4.8mL/L
杂多糖流加培养基：杂多糖500g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
1)使用YPD固体培养基对工程菌毕赤酵母PGAP9K-BGN13.1进行活化，活化时间2-3天，活化次数2次，得到活化后的单菌落；
2)使用种子培养基YPD液体培养基对步骤1)得到的单菌落进行摇瓶培养16-20h,转速为220r/min，温度为30℃，得到处于对数生长期(OD600＝3)的菌悬液；
3)在7L发酵罐中装入3.4L本发明所述杂多糖发酵初始培养基，接入发酵罐控制系统，平衡各种控制参数至少2h，各参数指标为pH 7.0,为保证DO≥30，转速调节范围为200-800r/min，温度30℃，通气量调节范围为2-6；
4)将步骤2)所得菌种悬浮液接入发酵罐中进行发酵培养，待葡萄糖消耗完毕2h后，接入所述杂多糖流加培养基，流加速度为3mL/L/h,培养时间为120h；
5)步骤4)完成后，生物量达到80.29g/L，取发酵上清液即可获得内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液。
对比例1
发酵初始培养基：
葡萄糖40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO4 14.3g/L，K2SO4 4.77g/L，MgSO45.7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，柠檬酸1.92g/L，CaSO4 0.1g/L，PTM1 4.8mL/L
葡萄糖流加培养基：葡萄糖500g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
对比例2
发酵初始培养基：
本发明所述杂多糖60g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨40g/L，KH2PO4 14.3g/L，K2SO44.77g/L，MgSO4 5.7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，柠檬酸1.92g/L，CaSO4 0.1g/L，PTM1 4.8mL/L
杂多糖流加培养基：杂多糖500g/L。
对比例3
发酵初始培养基：
葡萄糖40g/L，酵母粉20g/L，蛋白胨40g/L，KH2PO4 42.9g/L，K2SO4 14.3g/L，MgSO45.7g/L，(NH4)2SO4 5g/L，柠檬酸1.92g/L，CaSO4 0.6g/L，PTM1 4.8mL/L。
葡萄糖流加培养基：葡萄糖500g/L。
表1
注：葡萄糖价格40元/kg；杂多糖价格1元/kg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法，其特征在于，以高果糖浆废液为碳源，以毕赤酵母为发酵微生物，生产内切β-1,3-葡聚糖酶；
所述高果糖浆废液含有聚合度2~17的线性葡聚糖，单糖部分包括葡萄糖和果糖；其中总糖含量为902.3g/L±50g/L，葡萄糖含量为480g/L±30g/L，果糖含量为292g/L±20g/L，麦芽糖含量为103.6g/L±10g/L；
发酵用的培养基中含有酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、K2SO4、MgSO4、（NH4）2SO4、柠檬酸、CaSO4和PTM1；
发酵过程还进行补料；补料的培养基含有：高果糖浆废液、酵母粉、蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，补料的培养基中，高果糖浆废液浓度为20-60g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，应用毕赤酵母PGAP9K-BGN13.1进行发酵。
4.权利要求1~3任一所述的方法在细胞融合和转化、原生质体制备、食品加工、药物筛选、饲料加工和发酵工业生产方面的应用。
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