CN109832288B - 一种细胞分裂素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞分裂素提取技术领域，特别涉及一种细胞分裂素的制备方法。包括如下步骤：S1、用提取液浸提植物的根或茎的粉末，得到浸提液；S2、将浸提液离心，收集上清液，同时将残渣继续浸提，离心，将两次上清液合并，得到离心液；S3、将离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。本发明的纯化方法操作简单，成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高，纯度高达97％。
Description
技术领域
本发明属于细胞分裂素提取技术领域，特别涉及一种细胞分裂素的制备方法。
背景技术
细胞分裂素(cytokinin)活性物质包括两类：一是嘌呤型的细胞分裂素(CTK)，其结构均为腺嘌呤在N6位置上取代衍生物，如玉米素(ZT)、激动素(KT)等；另一类是苯基脲型的衍生物类细胞分裂素，如N，N'-二苯基脲(DPU)等。天然的细胞分裂素存在于茎尖、根尖、未成熟的种子、萌发中的种子和生长的果实中，其作用是促进细胞分裂，细胞体扩大，使芽分化，解除顶端优势，促进侧芽生长，抑制衰老等，对种子和芽有打破休眠、促使萌发的作用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从植物根茎中提取玉米素的方法。
为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：
一种细胞分裂素的制备方法，所述细胞分裂素为玉米素，包括如下步骤：
S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-25℃～-20℃下浸提10h～12h，得到浸提液；
所述提取液为甲醇溶液，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
S2、将浸提液在10000r/min～15000r/min，4℃下离心8min～12min，收集上清液置于离心管并保存于-25℃～-20℃下，残渣再用提取液于-25℃～-20℃提取5h～8h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；
S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。
进一步的，S1中所述植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL～1.2g/mL。
进一步的，所述S3的具体步骤为：
用1ml 100％甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
进一步的，S4中每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物。
进一步的，S5上清液过硅胶柱为称取适量200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
进一步的，S5中设定为15mL为一个馏分收集。
进一步的，S5中的斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。
本发明中的植物为杧果、水稻、油菜、拟南芥、番茄或烟叶等植物。
将减压蒸馏得到的玉米素用色谱级甲醇溶解，用HPLC技术检测。
其中，所述HPLC技术的具体参数如下：
色谱柱：Agilent SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，上海安捷伦科技有限公司)；
流动相A：超纯水；
流动相B：(色谱纯)；
紫外检测波长：245nm
流速：0.3mL/min；
柱温：35℃；
流动相洗脱梯度见表1；
表1液相色谱线性梯度洗脱程序
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的纯化方法操作简单，成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高，纯度高达97％。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种细胞分裂素的制备方法，包括如下步骤：
S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-25℃下浸提10h，得到浸提液；植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL，所述植物为杧果。
提取液为甲醇溶液，甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
S2、将浸提液在10000r/min，4℃下离心12min，收集上清液置于新管并保存于-25℃下，残渣再用提取液于-25℃提取5h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
具体步骤为：
用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物；
S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素；
具体步骤为
称取200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
且设定为15mL为一个馏分收集，斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。
然后将得到的玉米素用色谱级甲醇溶解，用HPLC技术检测，结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11min，在相同条件下，本申请的某一组分出峰时间为24.873min，和玉米素标准品的出峰保留时间相近，于是判断该组分为玉米素。
且经过测定本发明的玉米素的含量为96.7％.
实施例2
一种细胞分裂素的制备方法，所述细胞分裂素为玉米素，包括如下步骤：
S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-20℃下浸提12h，得到浸提液；植物的根或茎的质量与提取液的体积比为1.2g/mL，所述置物为水稻；
提取液为甲醇溶液，甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
S2、将浸提液在15000r/min，4℃下离心8min，收集上清液置于离心管并保存于-20℃下，残渣再用提取液于-20℃提取8h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
具体步骤为：
用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物；
S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。
S5上清液过硅胶柱为称取200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
且设定为15mL为一个馏分收集，斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。
将减压蒸馏得到的玉米素用色谱级甲醇溶解，用HPLC技术检测，结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11min，在相同条件下，本申请的某一组分出峰时间为25.015min，和玉米素标准品的出峰保留时间相近，于是判断该组分为玉米素。
且经过测定本发明的玉米素的含量为96.9％。
实施例3
一种细胞分裂素的制备方法，细胞分裂素为玉米素，包括如下步骤：
S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-22℃下浸提11h，得到浸提液；
所述提取液为甲醇溶液，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1；植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.9g/mL，所述植物为烟叶。
S2、将浸提液在12000r/min，4℃下离心10min，收集上清液置于离心并保存于-22℃下，残渣再用提取液于-22℃提取7h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
具体步骤为：
用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物；
S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素。
具体步骤为称取200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
且设定为15mL为一个馏分收集，斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。
然后将得到的玉米素用色谱级甲醇溶解，用HPLC技术检测，结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11min，在相同条件下，本申请的某一组分出峰时间为24.908min，和玉米素标准品的出峰保留时间相近，于是判断该组分为玉米素。
且经过测定本发明的玉米素的含量为97％。
综上所述，本发明的纯化方法操作简单，成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高，纯度高达97％。
以上公开的仅为本发明的较佳实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种细胞分裂素的制备方法，所述细胞分裂素为玉米素，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取植物的根或茎，用液氮冷冻后，研磨成粉末，再向粉末中加入提取液，-25℃～-20℃下浸提10h～12h，得到浸提液；
所述植物为杧果、水稻、烟叶；
所述提取液为甲醇的水溶液，所述甲醇的水溶液中甲醇与水的体积比为4:1；
S2、将浸提液在10000r/min～15000r/min，4℃下离心8min～12min，收集上清液置于离心管并保存于-25℃～-20℃下，残渣再用提取液于-25℃～-20℃提取5h～8h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
S3、将上述离心液过固相萃取柱，收集滤液后，减压蒸馏至无溶剂蒸出为止，得到浓缩物；
S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合，分液后，取上清液；
S5、上清液过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯，进行梯度洗脱，设定等体积为一个馏分收集，检测并合并相同斑点的馏分后，减压蒸馏，干燥得到玉米素；
S5上清液过硅胶柱为称取200目～300目细硅胶装入到玻璃柱中，使硅胶自由沉降，将S4中的上清液上样到细硅胶柱中；
且按照二氯甲烷：乙酸乙酯的体积比为13:1；9:1；7:1；6:1；2:1进行梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S1中所述植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL～1.2g/mL。
3.如权利要求1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，所述S3的具体步骤为：所述固相萃取柱为C18固相萃取柱；
用1ml 甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，收集滤液。
4.如权利要求1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S4中每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物。
5.如权利要求1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S5中设定为15mL为一个馏分收集。
6.如权利要求1所述的细胞分裂素的制备方法，其特征在于，S5中的斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。
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| 高效液相色谱法测定玉米内源激素方法的改进研究;未晓巍等;《玉米科学》;20130615;第21卷(第3期);第145页 * |
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