CN109832229A

CN109832229A - 一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置及使用方法

Info

Publication number: CN109832229A
Application number: CN201910153274.7A
Authority: CN
Inventors: 武海斌; 武海波; 宫庆涛; 孙瑞红; 王传增; 刘婷婷; 公义; 董放
Original assignee: Shandong Institute of Pomology
Current assignee: Shandong Institute of Pomology
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-06-04

Abstract

本发明的一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置及使用方法，包括圆形透明的载玻板，载玻板的边缘设置有向上凸起的围坝，载玻板底部中心标出有圆形的线虫释放区，线虫释放区外侧的载玻板底部依次标出有若干圆形且与线虫释放区同心的区域线，载玻板底部还标出有两条交错线，载玻板顶部表面边缘均匀设置有四个寄主固定瓶，寄主固定瓶侧壁上开有若干小孔。它提高了检测准确度，减少了检测时间，减轻了多次过筛对线虫的伤害。

Description

一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置及使用方法

技术领域

本发明涉及一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置及使用方法。

背景技术

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes，EPNs)是一类专门寄生昆虫的线虫，通过3龄感染期幼虫对害虫身体的自然开口或节间膜侵入的方式进入寄主体内，并释放携带的共生细菌，使其在害虫体内繁殖，产生毒素，最终导致害虫死亡。因EPNs具有寄主范围广泛，主动寻找寄主，对非靶标生物安全，对环境无副作用，能与许多农药、肥料混用等优点，已广泛应用于防治蛴螬、地老虎、桃小食心虫、天牛等多种农林地下害虫。

然而，与化学杀虫剂相比，昆虫病原线虫杀虫效果缓慢且不稳定。研究表明，其杀虫效果受到生物因素(昆虫病原线虫品系和剂量、不同品系昆虫病原线虫混合、寄主虫态及龄期等)、环境因素(温度、湿度、杀虫剂等)以及施用方法(喷施、大水漫灌等)等因素的影响。而线虫品系自身对寄主觅食能力的差异将直接决定其杀虫效果。昆虫病原线虫觅食行为过程可分为远距离的扩散、近距离的定向和最终的募集三个主要阶段，而昆虫病原线虫觅食寄主的过程主要靠来自寄主本身或其它物质的化学刺激。其中远距离扩散能力的强弱则是成功用线虫防治害虫的关键。

当前在研究远距离扩散能力时主要采用土壤沙柱法。具体步骤为：采用自制PCV圆柱，圆柱内填入灭菌的沙土。将圆柱平分为几段并标号，将线虫放在圆柱的一段，寄主放在圆柱的另一端。处理不同时间后，调查线虫在圆柱内的扩散情况。此种方法需要对不同段内的线虫进行清洗，而清洗的过程则是十分繁琐，需要将土壤进行100、200、400和600目的筛网冲洗，最后才能得到需要的线虫。且在筛选过程中，很多线虫在过筛中死亡或被沙土破碎，在统计结果时造成很多的误差，况且筛选过程，费时费力，极大地限制开展线虫远距离扩散能力的研究。

因此，准确、快速地检测昆虫病原线虫的远距离扩散能力是试验研究和线虫应用及技术指导中急需解决的问题，有必要研发一种新的昆虫病原线虫远距离扩散能力检测装置及其使用方法，从而提高检测准确度，减少检测时间，减轻多次过筛对线虫的伤害。

发明内容

为解决以上技术上的不足，本发明提供了一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置及使用方法，它提高了检测准确度，减少了检测时间，减轻了多次过筛对线虫的伤害。

本发明是通过以下措施实现的：

本发明的一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置，包括圆形透明的载玻板，所述载玻板的边缘设置有向上凸起的围坝，载玻板底部中心标出有圆形的线虫释放区，所述线虫释放区外侧的载玻板底部依次标出有若干圆形且与线虫释放区同心的区域线，载玻板底部还标出有两条十字交叉且交叉点在载玻板中心的交错线，载玻板顶部表面边缘均匀设置有四个寄主固定瓶，并且四个寄主固定瓶以两条交错线为对称轴两两对称，所述寄主固定瓶侧壁上开有若干小孔。

上述载波板采用圆形的透明塑料板，直径为32cm，厚度为1mm，线虫释放区直径为1cm，区域线为圆形实线，自内到外划分为4个区域，每个区域长4cm，区域范围为0-4cm、4-8cm、8-12cm和12-16cm。

上述相邻的两条区域线之间标出有3条圆形同心的区分线，所述区分线采用短虚线。

上述寄主固定瓶为圆柱形，寄主固定瓶顶部设置有瓶盖，寄主固定瓶侧壁上均匀开有100个小孔，所述小孔的直径为1mm。

本发明的一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置的使用方法，包括以下步骤：

(1)首先将配好的50mL的琼脂液加入圆形载波板内，其厚度为2.0mm，待其琼脂液凝固备用；

(2)待琼脂液凝固后，在4个寄主固定瓶内分别放入寄主昆虫，并盖住寄主固定瓶的瓶口；

(3)用移液器将线虫在容器中充分混合均匀2～3次后，吸取50μL的线虫悬浮液，加入到载波板的线虫释放区；

(3)然后将装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗，处理24h后，将检测装置放置-20℃冰箱内3min，用来固定线虫，并于体式显微镜下观察不同区域线内的线虫数量；

(4)计算此不同线虫运动到各个区域的百分率，各个区域内的线虫百分率＝每个区域的线虫数量/线虫释放区的总数量×100％；

(5)利用统计分析软件，分析不同区域内线虫百分率的差异性。

琼脂液由琼脂、K₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄和水组成，琼脂液中琼脂质量浓度为1.6％，K₂SO₄浓度为5mmol/L，CaCl₂浓度为1mmol/L，MgSO₄浓度为1mmol/L。上述琼脂液配方试剂均为分析纯试剂，各生物制剂公司均有售。

本发明的有益效果是：1、本发明装置结果简单，对线虫的远距离扩散能力研究装置包括载玻板，围坝，寄主固定瓶和检测区。通过先将配好的琼脂液加入圆形载波板内，待琼脂液凝固后，在4个寄主固定瓶内分别放置加入相同数量的寄主昆虫。后将昆虫病原线虫悬浮液充分混合均匀后，加入到载波板的线虫释放区。处理不同时间后，在体式显微镜下观察不同区域线内的线虫数量，统计线虫运动到各个区域的百分率。采用该装置及其方法检测，与常规PCV管土壤检测均差异不显著，表明此装置及方法具备研究线虫远距离扩散能力研究的技术要求。且本发明专利及其方法花费时间比常规PCV管土壤检测缩短了5.06～6.22倍，其线虫总回收率达到了97.25～98.75％，比采用常规PCV管土壤检测提高了31.27～41.14倍。本发明专利及方法在显著提高线虫回收率、显著降低试验时间基础上降低了试验误差，更有利于评估线虫的远距离扩散能力评估。2、本发明装置和方法可以取代常规PCV管土壤检测方法，解决了常规PCV管土壤检测反复冲洗过不同目的筛网，且在筛选过程中线虫死亡或被沙土破碎的问题，提高了线虫回收率，减少了试验时间、降低了试验误差，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为昆虫病原线虫远距离扩散能力检测装置载玻板结构示意图。

图2为昆虫病原线虫远距离扩散能力检测装置检测区结构示意图。

图3为寄主固定瓶结构示意图。

图4为昆虫病原线虫远距离扩散能力检测装置整体示意图。

其中，1、载玻板；2、围坝；3、线虫释放区；4、寄主固定瓶；5、区域线；6、区分线；7、交错线；8、参照区；9、昆虫病原线虫；10、小孔；11、瓶盖；12、瓶底。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细的描述：

实施例1：

如图1、2、3、4所示，一种检测昆虫病原线虫9远距离扩散能力的装置，包括载玻板1，围坝2，寄主固定瓶4、线虫释放区3和检测区。在载玻板1的背面用不同颜色的圆线设置寄主固定区、线虫释放区3以及检测区。载玻板1为圆形聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸树酯、聚苯乙烯等类型塑料材料制作，其直径为15～30cm其好处在于在载玻板1背面所有寄主固定区、线虫释放区3及检测区上标记的圆线及其颜色，能够在不同区域看清。圆形载玻板1直径为15～40cm，厚度为1～2mm，此设计可以满足线虫对不同距离的扩散能力研究，此厚度可看清载玻板1背面的不同区域内的圆形线。围坝2的高度为0.3～0.5cm，厚度与载玻板1的材料及厚度一致。围坝2底部与载玻板1正面为一体结构，在进行线虫检测时，防止线虫移动到载玻板1外。寄主固定瓶4为在紧靠载玻板1边沿、且彼此间距相等的4个圆柱瓶，同时圆柱瓶底12部与载玻板1粘结在一起，为一体结构。圆柱瓶高度为0.5～1.0cm，直径为1.0～3.0cm，其高度和直径可以满足盛放不同大小的寄主昆虫，其制作材料与载玻板1相同。4个圆柱瓶均带有盖子，其直径大小为正好盖住圆柱瓶为宜，防止寄主昆虫的移动。在距离圆柱瓶底12部3.0～4.0mm处，直至上部瓶盖11处的所有区域均匀穿孔50～150个直径1～3mm的小孔10，用于寄主昆虫自身气味的释放和呼吸，小孔10的大小可根据寄主昆虫的大小而定，小孔10的数目可根据整个圆柱瓶的大小确定，其目的是即可以保证寄主昆虫正常呼吸和自身气味的释放，又不能使寄主昆虫爬出圆柱瓶外。

寄主昆虫可以为韭蛆、桔小实蝇幼虫等小型昆虫，也可以为小地老虎、蛴螬及桃小食心虫等大型昆虫。线虫释放区3为圆形载玻板1的中心区域，其直接为0.5～1.5cm，可根据扩散距离的不同而加入线虫悬浮液的量制作不同型号。线虫释放区3标记线为带有颜色的长虚线，其目的是便于观察线虫是否移动出线虫释放区3。颜色为黑色、红色、绿色或蓝色中的一种。此设计的目的是由于昆虫病原线虫9为乳白色，便于在显微镜下观察与计数。检测区包括区域线5、区分线6和交错线7。区域线5和区分线6为同心圆线，交错线7为相互垂直的直线。区域线5为距离圆形载玻板1中心区域的圆形实线，其圆形实线的数量及间距可以根据要划分的区域个数界定，一般可划分2～5个区域，且区域间的距离原则上相等。不同区域的圆形实线可应用不同的颜色。区分线6为在区域线5之间辨别区域的圆形短虚线，此目的是便于线虫检测时作为参照物，易于在显微镜下观察。圆形短虚线的数量及间距可以根据区域距离界定，一般可画1～3个圆形短虚线，且距离相等。圆形短虚线可固定为一种颜色，其颜色均不同于圆形实线的颜色。交错线7为相互垂直的直线，在载玻板1背面标记为A、B、C和D共4个参照区8，此目的同样是显微镜检测时的参照物，防止计数时出现重复计数。在常规使用范围内的线虫浓度，本发明的远距离扩散装置都能检测。

利用上述昆虫病原线虫9远距离扩散能力检测装置研究昆虫病原线虫9对寄主的扩散能力的方法，包括步骤如下：

(1)首先将配好的50mL的琼脂液(琼脂质量浓度为1.6％，K2SO4浓度为5mmol/L，CaCl2浓度为1mmol/L，MgSO4浓度为1mmol/L)加入圆形载波板内，其厚度为2.0～2.5mm，低于圆柱瓶底12部小孔10，防止琼脂液堵塞小孔10。

(2)待琼脂液凝固后，在4个寄主固定瓶4内分别放置加入相同数量的寄主昆虫。寄主昆虫的数量根据寄主昆虫的大小确定。

(3)将不同昆虫病原线虫9悬浮液在不同容器中充分混合均匀后，用移液器各自吸取50μL的线虫悬浮液(大约350条左右)，加入到载波板的线虫释放区3。

(4)处理后的检测装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗。处理不同时间后，将检测装置放置-20℃冰箱内3min，用来固定线虫，并于体式显微镜下观察不同区域线5内的线虫数量，计算此不同线虫运动到各个区域的百分率。

(5)利用统计分析软件，检验不同线虫品系对相同寄主昆虫，或相同线虫品系对不同寄主昆虫的扩散能力的差异。

本发明的计数装置适用于所有线虫品系，包括斯氏线虫属和异小杆线虫属的所用线虫品系，昆虫病原线虫9品系包括在室内高致病力品系的筛选、繁殖方法、保存方法，田间应用杀虫范围以及致病机理等所有研究中所出现的线虫品系。步骤(1)中，所用的琼脂液配方试剂均为分析纯试剂，各生物制剂公司均有售。步骤(2)中，寄主昆虫的数量根据寄主昆虫的大小确定。如大蜡螟等大型昆虫幼虫可加入3～4头，韭蛆等小型昆虫幼虫可放入10～15头。步骤(3)中，应用的昆虫病原线虫9通过体式显微镜镜检，其存活率均应为95％以上，转移采用移液器吸取线虫悬浮液转移载玻板1线虫释放区3上，在吸取线虫之前，用移液器对线虫悬浮液应充分混合2～3次。步骤(4)中温湿度条件可以根据不同的研究目的自由选择。步骤(5)中，统计分析软件为SPSS、DPS等软件。

实施例2

同实施例1所述一种昆虫病原线虫9远距离扩散能力检测装置，不同之处在于，

载玻板1的直径为15cm，可研究线虫扩散到周边7.5cm范围内百分比。

实施例3

载玻板1的直径为24cm，可研究线虫扩散到周边20cm范围内百分比。

实施例4

载玻板1的直径为40cm，可研究线虫扩散到周边20cm范围内百分比。

室内试验验证

实施例5

利用实施例1中昆虫病原线虫9远距离扩散能力检测装置对昆虫病原线虫9扩散能力进行检测的方法，方法如下：

(1)以小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All(All)为例，选择载玻板1直径为32cm的装置，利用此检测装置研究此线虫对韭蛆3龄幼虫和韭菜根扩散到周边16cm的能力。

(2)首先将配好的50mL的琼脂液(琼脂质量浓度为1.6％，K2SO4浓度为5mmol/L，CaCl2浓度为1mmol/L，MgSO4浓度为1mmol/L)加入圆形载波板内，其厚度为2.0mm，待其琼脂液凝固备用。

(3)待琼脂液凝固后，在4个寄主固定瓶4内分别放置加入10头韭蛆3龄幼虫，并加入0.3cm长的韭菜根5根。并用固定瓶上的瓶盖11盖住，防止韭蛆爬出固定瓶。

(3)用移液器将小卷蛾斯氏线虫All在容器中充分混合均匀2～3次后，吸取50μL的线虫悬浮液(大约400条)，加入到载波板的线虫释放区3。

(4)处理后的检测装置置于温度22±1℃、相对湿度60％±10％的培养箱内，光周期为24h全暗。处理24h后，将检测装置放置-20℃冰箱内3min，用来固定线虫，并于体式显微镜下观察不同区域线5内的线虫数量，对线虫的镜检计数均采用同一人，此目的是防止不同人镜检造成的试验误差。

(5)计算此不同线虫运动到各个区域的百分率。各个区域内的线虫百分率＝每个区域的线虫数量/线虫释放区3的总数量×100％

(6)利用统计分析软件，分析不同区域内线虫百分率的差异性。

实施例6

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法。不同之处在于，采用线虫品系不同，选用芫菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae SF-SN(SF-SN)为例。

实施例7

选用与实施例1相同的装置，采用与实施例5相同的方法。不同之处在于，采用线虫品系不同，选用嗜菌异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora H06(H06)为例。

对比例1

选用与实施例5相同的线虫品系，在同等浓度条件下。不同之处在于，采用常规自制的PCV管土壤检测法。具体步骤为：

(1)将5个高为5cm、直径5cm的PCV塑料筒连接，构成0-4cm、4-8cm、8-12cm和12-16cm共4个层次的PCV圆柱，从一头向另一头标号，依次为1-4号。

(2)柱内装满消毒细沙，细沙在装入圆柱前做拌水处理。从沙柱表面一端加入线虫悬浮液(大约10000条)，另一端放置韭蛆3龄幼虫10头和0.3cm长的韭菜根5根。用塑料布扎紧两端水平置于与实施例5相同的温湿度条件下，3d后取出圆筒，分别用过200目、400目和600目筛网后，在体视显微镜下统计线虫的数量。对线虫的过筛、镜检均采用同一人，此目的是防止不同人操作造成的试验误差。

(3)计算线虫扩散到各层中的百分率。线虫百分率的计算方法＝每个区域的线虫数量/过筛后得到的线虫总数量×100％

(4)统计方法同实施例5

对比例2

选用与实施例6相同的线虫品系，不同之处在于选用与对比例1相同的PCV管土壤检测法。

对比例3

选用与实施例7相同的线虫品系，不同之处在于选用与对比例1相同的PCV管土壤检测法。

试验例

此试验共设7个处理，分别使用本发明装置检测和常规PCV管土壤检测(实施例5组、实施例6组、实施例7组和对比例1组、对比例2组、对比例3组)。步骤分别采用实施例5组、实施例6组、实施例7组和对比例1组、对比例2组、对比例3组所述的方法，每个处理重复4次，记录每个重复镜检时所花费时间，记录可用于统计分析的线虫数量，并计算其回收百分比，具体条件步骤及结果见表1。

表1处理方法及实验结果对比

由表1可以看出，采用本发明装置及其方法实施例5、实施例6和实施例7与采用常规PCV管土壤检测装置的对比例1、对比例2和对比例3，通过方差分析表明，不同扩散距离范围内，使用本发明专利装置与常规PCV管土壤检测均差异不显著，表明此发明专利装置及其使用方法具备研究线虫远距离扩散能力研究的技术要求。采用本发明专利及其方法花费时间显著低于采用常规PCV管土壤检测，其花费时间缩短了5.06～6.22倍，且采用本发明装置的线虫总回收率显著高于采用常规PCV管土壤检测，达到了97.25～98.75％，比采用常规PCV管土壤检测提高了31.27～41.14倍，在提高线虫总收率基础上有利于达到更准确的远距离扩散能力评估。总之，采用本发明装置及其方法能够满足线虫远距离扩散能力的研究，且具有显著提高线虫回收率、显著降低试验时间，降低试验误差的水平。

以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。

Claims

1.一种检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置，其特征在于：包括圆形透明的载玻板，所述载玻板的边缘设置有向上凸起的围坝，载玻板底部中心标出有圆形的线虫释放区，所述线虫释放区外侧的载玻板底部依次标出有若干圆形且与线虫释放区同心的区域线，载玻板底部还标出有两条十字交叉且交叉点在载玻板中心的交错线，载玻板顶部表面边缘均匀设置有四个寄主固定瓶，并且四个寄主固定瓶以两条交错线为对称轴两两对称，所述寄主固定瓶侧壁上开有若干小孔。

2.根据权利要求1所述检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置，其特征在于：所述载波板采用圆形的透明塑料板，直径为32cm，厚度为1mm，线虫释放区直径为1cm，区域线为圆形实线，自内到外划分为4个区域，每个区域长4cm，区域范围为0-4cm、4-8cm、8-12cm和12-16cm。

3.根据权利要求1所述检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置，其特征在于：相邻的两条区域线之间标出有3条圆形同心的区分线，所述区分线采用短虚线。

4.根据权利要求1所述检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置，其特征在于：所述寄主固定瓶为圆柱形，寄主固定瓶顶部设置有瓶盖，寄主固定瓶侧壁上均匀开有100个小孔，所述小孔的直径为1mm。

5.一种如权利要求1所述检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述检测昆虫病原线虫远距离扩散能力的装置的使用方法，其特张在于：琼脂液由琼脂、K₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄和水组成，琼脂液中琼脂质量浓度为1.6％，K₂SO₄浓度为5mmol/L，CaCl₂浓度为1mmol/L，MgSO₄浓度为1mmol/L。