CN109825505A - 一种抑制circ_0006493表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制人circ_0006493环状RNA表达的核苷酸及其应用，其特征是：所述的核苷酸特异性结合于人circ_0006493环状RNA，所述核苷酸的序列由ACAUUCAGGAACUUGAAUAACAU GG序列或者互补序列中的18‑25个连续核苷酸序列组成，特别是其包含序列：AGGAACUUGAAUAACAU GG和AACAUUCAGGAACUUGAAUAA。本发明抑制人circ_0006493环状RNA，能够有效抑制A549和MBA‑MD‑231细胞中circ_0006493环状RNA表达，与抗肿瘤药物联合可以增加其抑制其生长和增殖，从而有效治疗多种肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于医学材料技术和药物领域，具体地本发明涉及一种环状RNAs核苷酸，尤其是涉及人环状RNAs核苷酸。该核苷酸可与circ_0006493互补，从而抑制人 circ_0006493的表达，与其他抗肿瘤药物其起到抗肿瘤的作用。
背景技术
CircRNAs是一种普遍的其分子呈封闭环状结构的RNA，可由外显子或内含子、非编码RNA等环化形成。ADAR1、QKI和DHX9等参与了circRNAs形成过程的调控。 CircRNAs通过多种方式发挥作用，研究表明circRNAs含有miRNA应答元件可以竞争性结合miRNA，通过影响miRNA方式调节基因表达的；有的circRNAs可与小核糖核蛋白相互作用，调控基因的转录；部分circRNAs可以调节pre-mRNA的剪接，改变mRNA含量，从而影响蛋白质的产量。在细胞的生长、增值、分化、周期调控和应激等多个过程中 circRNAs均起重要作用，其表达变化与神经系统疾病、糖尿病、冠心病以及多种癌症的发生、发展、和预后密切相关。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源RNA从而沉默靶基因，从而实现干扰靶基因的功能。
近年，尽管临床上肿瘤的联合疗法得到普及，但是联合疗法对肿瘤患者的5年生存率提高不大，中晚期患者生存率更低，约为20％。部分化疗药物副作用大限制了药物的运用。因此，寻找更安全有效的靶向性联合疗法是提高肿瘤患者生存的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够特异高效地抑制circ_0006493表达的siRNA及其应用。
本发明的目的是这样实现的，包括合成核苷酸的序列由ACAUUCAGGAACUUGAAUAACAUGG(SEQ ID NO.1)序列中的18-25个连续核苷酸序列组成或者互补序列中的18-25个连续核苷酸序列组成。特别是其包含序列： AGGAACUUGAAUAACAUGG(SEQID NO.2)和AACAUUCAGGAACUUGAAUAA(SEQ ID NO.3)。核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。核苷酸进一步被核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物特别是三价无机砷。制备治疗癌症药物中的应用。癌症包括：肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道癌、口腔癌、贲门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中耳癌、骨癌、睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。本课题受云南省运用基础研究计划-面上项目2017FB123支持。
本发明(优点)：发明的核苷酸具有很好的circ_0006493抑制效果，作用于特异性的靶位点，特异性强、毒性低、副作用小和修饰半衰期长，可以与多种抗肿瘤药物合用。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施方式：
实施例1
本实施例中的沉默RNA序列为：AGGAACUUGAAUAACAUGGdTdT(SEQ ID NO.2),以及互补序列CCAUGUUAUUCAAGUUCCUdTdT(SEQ ID NO.4)。所有的序列都是从5端到3 端,其中dTdT是不足19核苷酸加上去了TT尾巴,由上海吉玛制药技术有限公司合成， CIRC_0006493的RNA序列信息存在于UCSC数据库中。本课题受云南省运用基础研究计划-面上项目2017FB123支持。
对照合成
首先，由上海吉玛制药技术有限公司合成核苷酸，合成包含其互补序列的双链RNA序列，对照组使用吉玛制药技术有限公司的A06001序列为 UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQID NO.5)以及互补的 ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQ ID NO.6)作为阴性对照。
细胞培养：将A549或者MBA-MD-231细胞在含有10％胎牛血清的1640培养基中培养，胎牛血清购自cellmax公司，1640培养基来自于Hyclone，于37℃，5％CO2条件下培养。收集生长状态良好的细胞，离心计数，以5000个每孔铺于96孔板内200000个接种于六孔板内，37℃，5％CO2培养。
RNA转染：
采用碧云天公司Lipo8000TM转染试剂，按照操作说明进行操作，A549使用六孔板转染时候，六孔板中SIRNA量为每孔20ul，转染试剂为15ul,培养基为2ml，MBA-MD-231使用六孔板转染时候，六孔板中SIRNA量为每孔10ul，转染试剂为7.5ul,培养基为2ml，96小时检测沉默效果,其结果见表1。
表1.circ_0006493沉默效果
| 沉默效果 | 对照组 | 沉默组1 | 沉默组1 |
| A549 | 1.02±0.07 | 0.23±0.01 | 0.25±0.05 |
| MBA-MD-231 | 1.04±0.09 | 0.21±0.03 | 0.19±0.03 |
表1为本发明SIRNA沉默的效果表1，对照组使用的是阴性对照片段，沉默组1为实施例1沉默核苷酸片段的结果；沉默组2为实施例2沉默核苷酸片段的的结果，数据使用2^-ΔΔCt表示。
A549使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.5ul，转染试剂为0.5ul培养基为0.1ml，MBA-MD-231使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.25ul，转染试剂为0.25ul培养基为0.1ml，二者转染后24小时加入亚砷酸钠A549加入30uM(微摩尔每升),MBA-MD-231 5uM，其中一排不加入亚砷酸钠，再培养48小时后MTS检测细胞活力,其结果见表2。
表2.circ_0006493沉默后加入砷后活力(％)
| 活力％ | 未加砷组 | 对照组 | 实验组1 | 实验组2 |
| A549 | 100±4.53 | 83±3.52 | 65±5.31 | 63±4.65 |
| MBA-MD-231 | 101±5.62 | 84±3.77 | 63±3.11 | 61±3.54 |
表2为本发明MTT的结果表2；未加入砷组：不加入亚砷酸钠，对照组：为使用阴性对照片段后加入亚砷酸钠的结果，定为100％，实验组1实施例1沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果，实验组2实施例2沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果。
MTS检测采用Promega公司CellTiterAQueous One Solution CellProliferation Assay，an说明书的方法进行操作计算。
检测沉默效果采用荧光定量PCR，PCR的条件是1、95度2-10分，2、95度10秒， 3、60度10秒，4、72度15秒，PCR试剂采用罗氏或者康为世纪的，引物序列如下：TCTCTACATCTGCCTCTCCGT(SEQ ID NO.7)和TGGAACATTCAGGAACTTGAATAA(SEQ ID NO.8)采用2^ΔΔCt表示表达量。
实施例2
本实施例中的RNA序列为：AACAUUCAGGAACUUGAAUAA(SEQ ID NO.3),以及互补序列UUAUUCAAGUUCCUGAAUGUU(SEQ ID NO.9)。细胞培养和转染等试验方法同实施例 1，仅使用的沉默RNA序列不同。沉默效果，其结果见表1,MTT其结果见表2。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学
<120> 一种抑制circ_0006493表达的siRNA及其应用
<130>
<140>
<141>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
acauucagga acuugaauaa caugg 25
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggaacuuga auaacaugg 19
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacauucagg aacuugaaua a 21
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccauguuauu caaguuccu 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tctctacatc tgcctctccg t 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggaacattc aggaacttga ataa 24
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
uuauucaagu uccugaaugu u 21
Claims (9)
1.一种抑制circ_0006493环状RNA表达的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸的序列由ACAUUCAGGAACUUGAAUAACAUGG序列或者互补序列中的18-25个连续核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于其序列为AGGAACUUGAAUAACAUGG或者AACAUUCAGGAACUUGAAUAA，及其互补序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。
4.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述核苷酸进一步被核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。
5.根据权利要求4所述的核苷酸，其特征在于所述修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。
6.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求 1-5 任一项所述的核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物。
7.根据权利要求6所述药物组合物，其特征在于其他抗肿瘤治疗药物为三价无机砷。
8.权利要求 7所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
9.权利要求 8 所述的应用，其中所述癌症包括 ：肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道 癌、口腔癌、贲门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中耳癌、骨癌、 睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。
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