CN109825503A - 一种抑制circ_0005050表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制人circ_0005050环状RNA表达的核苷酸及其应用，其特征是：所述的核苷酸特异性结合于人circ_0005050环状RNA，所述核苷酸的序列由AAACGUAUGAACCUUAUUUAUCAU序列或者互补序列中的18‑24个连续核苷酸序列组成，特别是其包含序列：AAACGUAUGAACCUUAUUU和CGUAUGAACCUUAUUUAUCAU。本发明抑制人circ_0005050环状RNA，能够有效抑制A549和MBA‑MD‑231细胞中circ_0005050环状RNA表达，与抗肿瘤药物联合可以增加其抑制其生长和增殖，从而有效治疗多种肿瘤。

Description

一种抑制circ_0005050表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于医学材料技术和药物领域 ，具体地本发明涉及一种环状RNAs核苷酸，尤其是涉及人环状RNAs核苷酸。该核苷酸可与circ_0005050互补，从而抑制人circ_0005050的表达，与其他抗肿瘤药物其起到抗肿瘤的作用。

背景技术

CircRNAs是一种普遍的其分子呈封闭环状结构的RNA，可由外显子或内含子、非编码RNA等环化形成。ADAR1、QKI和DHX9等参与了circRNAs形成过程的调控。CircRNAs通过多种方式发挥作用，研究表明circRNAs含有miRNA应答元件可以竞争性结合miRNA，通过影响miRNA方式调节基因表达的；有的circRNAs可与小核糖核蛋白相互作用，调控基因的转录；部分circRNAs可以调节pre-mRNA的剪接，改变mRNA含量，从而影响蛋白质的产量。在细胞的生长、增值、分化、周期调控和应激等多个过程中circRNAs均起重要作用，其表达变化与神经系统疾病、糖尿病、冠心病以及多种癌症的发生、发展、和预后密切相关。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源RNA从而沉默靶基因，从而实现干扰靶基因的功能。

近年，尽管临床上肿瘤的联合疗法得到普及，但是联合疗法对肿瘤患者的5年生存率提高不大，中晚期患者生存率更低，约为20％。部分化疗药物副作用大限制了药物的运用。因此，寻找更安全有效的靶向性联合疗法是提高肿瘤患者生存的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够特异高效地抑制circ_0005050表达的siRNA及其应用。

本发明的目的是这样实现的，包括合成核苷酸的序列由AAACGUAUGAACCUUAUUUAUCAU (SEQ ID NO.1)序列中的18-24个连续核苷酸序列组成或者互补序列中的18-24个连续核苷酸序列组成。特别是其包含序列：AAACGUAUGAACCUUAUUU (SEQID NO.2)和CGUAUGAACCUUAUUUAUCAU (SEQ ID NO.3)。核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。核苷酸进一步被核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物特别是三价无机砷。制备治疗癌症药物中的应用。癌症包括 ：肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道 癌、口腔癌、贲门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中耳癌、骨癌、 睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。本研究受国家自然科学基金的支持（81860572）。

本发明（优点）：发明的核苷酸具有很好的circ_0005050抑制效果，作用于特异性的靶位点，特异性强、毒性低、副作用小和修饰半衰期长，可以与多种抗肿瘤药物合用。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教 导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式：

实施例1

本实施例中的沉默RNA序列为：AAACGUAUGAACCUUAUUUdTdT(SEQ ID NO.2) ,以及互补序列AAAUAAGGUUCAUACGUUUdTdT(SEQ ID NO.4)。所有的序列都是从5端到3端,其中dTdT不足19核苷酸加上去了TT尾巴, CIRC_0005050的RNA序列信息存在于UCSC数据库中。本研究受国家自然科学基金的支持（81860572）。

对照合成

首先，由上海吉玛制药技术有限公司合成核苷酸，合成包含其互补序列的双链RNA序列，对照组使用吉玛制药技术有限公司的A06001序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ IDNO.5)以及互补的ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (SEQ ID NO.6)作为阴性对照。

细胞培养：将A549或者MBA-MD-231细胞在含有10％胎牛血清的1640培养基中培养，胎牛血清购自cellmax公司，1640培养基来自于Hyclone，于37℃，5％CO2条件下培养。收集生长状态良好的细胞，离心计数，以5000个每孔铺于96孔板内200000个接种于六孔板内，37℃，5％CO2培养。

RNA转染：

采用碧云天公司Lipo8000™转染试剂，按照操作说明进行操作，A549使用六孔板转染时候，六孔板中SIRNA量为每孔20ul，转染试剂为15ul,培养基为2ml，MBA-MD-231使用六孔板转染时候，六孔板中SIRNA量为每孔10ul，转染试剂为7.5ul,培养基为2ml，96小时检测沉默效果,其结果见表1。

表1. circ_0005050沉默效果

沉默效果	对照组	沉默组1	沉默组1
				A549	1.02±0.07	0.24±0.05	0.19±0.02
MBA-MD-231	1.04±0.09	0.13±0.04	0.17±0.05

表1为本发明SIRNA沉默的效果表1，对照组使用的是阴性对照片段，沉默组1为实施例1沉默核苷酸片段的结果；沉默组2为实施例2沉默核苷酸片段的的结果，数据使用2^^-ΔΔCt表示。

A549使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.5ul，转染试剂为0.5ul培养基为0.1ml， MBA-MD-231使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.25ul，转染试剂为0.25ul培养基为0.1ml，二者转染后24小时加入亚砷酸钠A549加入30uM(微摩尔每升),MBA-MD-231 5uM，其中一排不加入亚砷酸钠，再培养48小时后MTS检测细胞活力,其结果见表2。

表2. circ_0005050沉默后加入砷后活力（%）

活力%	未加砷组	对照组	实验组1	实验组2
					A549	100±4.53	83±3.52	61±3.91	59±3.42
MBA-MD-231	101±5.62	84±3.77	43±2.49	46±3.81

表2为本发明MTT的结果表2；未加入砷组：不加入亚砷酸钠，对照组：为使用阴性对照片段后加入亚砷酸钠的结果，定为100%，实验组1实施例1沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果，实验组2实施例2沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果。

MTS检测采用Promega公司CellTiter 96® AQueous One Solution CellProliferation Assay，an说明书的方法进行操作计算。

检测沉默效果采用荧光定量PCR，PCR的条件是1、95度2-10分，2、95度10秒，3、54度10秒，4、72度15秒，PCR试剂采用罗氏或者康为世纪的，引物序列如下：AACGTATGAACCTTATTTATC(SEQ ID NO.7)和CCAGCTGCTAGAGAACCAGAAG (SEQ ID NO.8)采用2^^ΔΔCt表示表达量。

实施例2

本实施例中的RNA序列为：CGUAUGAACCUUAUUUAUCAU(SEQ ID NO.3),互补序列为AUGAUAAAUAAGGUUCAUACG(SEQ ID NO.9)细胞培养和转染等试验方法同实施例1，仅使用的沉默RNA序列不同。沉默效果，其结果见表1,MTT其结果见表2。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明医科大学

<120> 一种抑制circ_0005050表达的siRNA及其应用

<130>

<140>

<141>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaacguauga accuuauuua ucau 24

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacguauga accuuauuu 19

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

cguaugaacc uuauuuauca u 21

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaauaagguu cauacguuu 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aacgtatgaa ccttatttat c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccagctgcta gagaaccaga ag 22

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

augauaaaua agguucauac g 21

Claims (9)

1.一种抑制circ_0005050环状RNA表达的核苷酸，其特征在于：所述核苷酸的序列由AAACGUAUGAACCUUAUUUAUCAU序列或者互补序列中的18-24个连续核苷酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于其序列为AAACGUAUGAACCUUAUUU或者CGUAUGAACCUUAUUUAUCAU，及其互补序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于：所述聚核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。

4.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述聚核苷酸进一步被核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。

5.根据权利要求4所述的核苷酸，其特征在于所述修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。

6.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求 1-5 任一项所述的核苷酸和其他抗肿瘤治疗药物。

7.根据权利要求6所述药物组合物，其特征在于其他抗肿瘤治疗药物为三价无机砷。

8.权利要求 7所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。

9.权利要求 8 所述的应用，其中所述癌症包括 ：肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道 癌、口腔癌、贲门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中耳癌、骨癌、 睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。