CN109824693A - Brd4抑制剂及其在肿瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

Brd4抑制剂及其在肿瘤治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向BRD4的抑制剂及其在肿瘤治疗药物中的应用，属于抗肿瘤药学技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种作为BRD4抑制剂的化合物。该化合物包括如下所示的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的化合物或其药学上可接受的盐，可以作为BRD4抑制剂，具有较明显的抗乳腺癌治疗效果。

Description

BRD4抑制剂及其在肿瘤治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及BRD4抑制剂及其在肿瘤治疗药物中的应用，属于肿瘤治疗药物发现技术领域。
背景技术
溴含蛋白质4(BRD4)是溴和额外的终端(BET)蛋白家族的成员，在细胞分裂和转录调控作为一个中央单元传输表观遗传记忆。除了BRD4，还有其他三个成员，如BRD2、BRD3和BRDT，他们可能调控许多细胞过程通过溴结构域间的相互作用。BRD4是一种广泛表达的核蛋白，分子量为200kDa，含有两个串联的溴结构域(BD1和BD2)，在结构上是保守的但具有不相同的功能和一个ET结构域。最近，BRD4被报道参与致癌基因重排，导致高度致癌融合蛋白，从而在许多类型的癌症的发展中起着关键的作用，如乳腺癌。BRD4调节乳腺癌细胞转移是通过调节Sipa1酶的活性和调节ERα诱导的基因表达通过影响乳腺癌的RNA聚合酶II和组蛋白H2B单泛素化延伸相关的磷酸化。此外，BRD4调节细胞外基质基因的表达，在转移预测基因信号中经常出现；并能通过它的激活信号预测乳腺癌的进展和/或生存。
自噬是一种进化上保守的、多步骤的溶酶体降解过程，用于清除受损或多余的蛋白质和细胞器。自噬机器包括超过36自噬相关基因(ATGs)，和UNC-51-样激酶1(ULK1)，它是酵母菌Atg1的直接同源基因，是唯一的丝氨酸苏氨酸激酶，是这些自噬相关基因中的启动酶。ULK的复杂互合体，包括ULK1，mAtg13,FIP200和Atg101，这些是启动自噬过程所必须的[17]。在自噬中，mTORC1和AMPK可以通过直接磷酸化对ULK1活性进行负调控。AMPK-mTORC1-ULK1轴可能发挥关键作用在自噬体的形成和自噬的调控。AMPKmTORC1、ULK1的功能及其参与的许多病理生理过程如乳腺癌已得到阐明。自噬是一种生理机制，可以作为暂时的生存手段，因而被称为保护性细胞自噬。相反，如果细胞应激导致连续或过度诱导的自噬，细胞死亡或细胞自噬相关的细胞死亡(ACD)将接踵而至。靶向小分子药物诱导的自噬相关的细胞死亡现在作为一个有前途的策略。因此，靶向AMPK-mTORC1-ULK1调制自噬相关的细胞死亡是乳腺癌治疗的新途径。
最近，(+)JQ1作为第一个BRD4抑制剂，已经在保护性细胞自噬方面得到验证。例如，在急性髓系白血病(AML)中，AMPK-ULK1调节的保护自噬对BRD4抑制剂(+)JQ1产生了耐药性。(+)JQ1也已被报道抑制保护细胞自噬从而增加NPM1和HEXIM1表达在AML细胞中。可见，长期用药会伴随肿瘤细胞的耐药性，导致肿瘤的复发和转移。虽然(+)JQ1具有良好的活性，但是其缺乏专一性，是一种泛BET家族的抑制剂，不能够专一性的抑制BRD4。此外，(+)JQ1的体内药效动力学性质极差，成药性很低，阻碍了其进入临床试验。因此，需要开发一种新型的BRD4抑制剂。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种作为BRD4抑制剂的新化合物。
本发明提供结构式如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R1和R2独立地为氢或C1-C4烷基，且R1和R2不同时为氢；或者R1和R2连接形成环状结构，所述环状结构为
R3为苯环或被取代的苯环；
n为0或1。
本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
进一步的，所述治疗乳腺癌药物优选为BRD4抑制剂类药物。
本发明还提供一种治疗乳腺癌的药物组合物，它包含有效剂量的上述化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐，可以作为BRD4抑制剂，具有较明显的抗乳腺癌治疗效果。特别是化合物36，能够专一性的与BRD4的BD1结构域结合，在乳腺癌中它能够在体内外诱导BRD4-AMPK调节的自噬性细胞死亡，这是第一个被报道的同时靶向BRD4和BRD4-AMPK相互作用的小分子抑制剂，将为在治疗乳腺癌治疗中，开发具有新的结构和PPIs作用的BRD4抑制剂提供了一个有效的范例。
附图说明
图1为分别用1.5或3μM的FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞一定时间后，然后细胞用荧光显微镜检测MDC荧光染色图片。
图2为分别用1.5或3μM的FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞一定时间后，然后用电子显微镜检测的图片。
图3为用GFP-LC3质粒转染MCF-7和MDA-MB-231细胞，然后用1.5或3μM的FL-411的处理，在荧光显微镜下检测的图片。
图4为分别用1.5或3μM的FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24小时，通过免疫组化检测LC3B的表达。
图5为分别用FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞一定时间后，用免疫印迹法检测Beclin-1，p62和LC3的表达。
图6为在BafA1的存在下，用分别用FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24小时，用免疫印迹法检测p62和LC3的表达。
图7为分别用1.5或3μM的FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞一定时间后，再用FL-411处理之前加入3-MA，然后用MTT检测细胞存活率。
图8为分别用1.5或3μM的FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞一定时间后，用免疫印迹法检测AKT，p-AKT，mTOR，p-mTOR，p70S6K和p-p70S6K的表达量。
图9为分别用1.5或3μM的FL-411的处理MCF-7和MDA-MB-231细胞一定时间后，用免疫印迹法检测ULK1，p-ULK1，ATG13，p-ATG13，FIP200和ATG101的表达量。
图10为用两种特异性BRD4的siRNA和阴性对照siRNA转染MCF-7和MDA-MB-231细胞，用免疫印迹法检测BRD4，c-Myc，AMPKα，p-AMPKα，ULK1，p-ULK1，p62和LC3的表达。
图11为接种MCF-7或MDA-MB-231的小鼠每天用空白对照或不同浓度的FL-411处理一次。肿瘤体积用标准误(mean±SEM)表示。
图12为分析最后一天的肿瘤体积变化。*p<0.05,***p<0.001，与对照组作比较。
图13为各组小鼠的肿瘤重量。*p<0.05,***p<0.001，与对照组作比较。
图14为FL-411处理期间小鼠的体重变化。
图15为免疫组化分析小鼠肿瘤中的增殖标记物KI67和自噬标志物LC3II。定量分析各组图片阳性染色的百分比。肿瘤取自对照和FL-411(100mg/kg)处理组小鼠。***p<0.001，与对照组作比较。标尺为200μm。
图16为取MCF-7和MDA-MB-231异种移植小鼠的肿瘤组织，裂解。western blot分析BRD4,c-Myc,LC3,和caspase3的表达。
图17为FL-411在斑马鱼模型中的抗肿瘤活力。CM-DIL标记的MCF7细胞加入空白或12.5,25,50μM的FL-411处理，用荧光显微镜捕捉亮场和荧光图片。
图18为斑马鱼模型中的肿瘤荧光强度分析(mean±SEM)及各浓度FL-411处理48h后各组肿瘤体积的抑制率(**p<0.01,***p<0.001，与对照组作比较)。
具体实施方式
本发明提供如式Ⅰ所示的化合物：
其中，R1和R2独立地为氢或C1-C4烷基，且R1和R2不同时为氢；或者R1和R2连接形成环状结构，所述环状结构为R3为苯环或被取代的苯环；n为0或1。
作为其中一种实施方式，n为0；R1和R2独立地为氢或C1-C4烷基，且R1和R2不同时为氢；或者R1和R2连接形成环状结构，所述环状结构为 R3为苯环或被取代的苯环。
以下为n为0的几种优选的实施方式。
一种是R1和R2连接形成R3为苯环或被取代的苯环。
优选R1和R2连接形成R3为
更优选R1和R2连接形成R3为
第二种是R1和R2优选独立地为氢或C1-C4烷基，且R1和R2不同时为氢；R3为苯环或被取代的苯环。
优选R1为氢；R2为C1-C4烷基；R3为
更优选R1为氢；R2为R3为
进一步优选R1为氢；R2为R3为
第三种是R1和R2连接形成R3为苯环或被取代的苯环。
更优选R1和R2连接形成R3为
第四种是R1和R2连接形成R3为苯环或被取代的苯环。
优选R1和R2连接形成R3为
更优选R1和R2连接形成R3为
还有一种为R1和R2连接形成R3为苯环或被取代的苯环。
优选R1和R2连接形成R3为
作为另一种实施方式，n为1；R1和R2独立地为氢或C1-C4烷基，且R1和R2不同时为氢；或者R1和R2连接形成环状结构，所述环状结构为R3为苯环或被取代的苯环。
优选的，n为1，R1和R2连接形成R3为
更优选n为1，R1和R2连接形成R3为
下面是本发明的化合物的一些优选结构。
本发明还提供本发明所述的化合物的药学上可接受的盐。所述盐可以为硝酸盐、盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐等。
本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗乳腺癌药物中的用途。进一步的，所述治疗乳腺癌药物优选为BRD4抑制剂类药物，用于乳腺癌的相关治疗。
本发明还提供一种治疗乳腺癌的药物组合物，它是包含有效剂量的上述化合物或其药学上可接受的盐的制剂。可以通过本领域已知的方法可将本发明化合物制成以下形式：片剂、胶囊剂、水性或油性溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、喷鼻剂、栓剂、用于吸入的细小分散的粉剂或气雾剂或喷雾剂、用于胃肠道外(包括静脉内、肌内或输注)的无菌水性或油性溶液或混悬剂或无菌乳剂。可采用无菌水或水-丙二醇溶液作为溶剂来制备液体制剂，还可将活性组分配制在聚乙二醇水溶液中。用于口服给予的水性溶液可通过将活性组分溶解在水中并按需要加入合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制备。口服使用的水性混悬剂可通过将细小分散的活性组分与粘性物质一道分散在水中，所述粘性物质如为天然合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素和其他药剂领域已知的悬浮剂。
药物组合物可为单位剂量形式。在这些形式中，将所述组合物分成含适量活性组分的单位剂量。该单位剂量形式可为包装制剂，包装中包括分隔量的制剂，例如盒装片剂、胶囊剂和在管形瓶或安瓿中的粉剂。单位剂量形式还可为胶囊剂、扁囊剂或片剂或其可为适当数量的任何这些包装形式。
本发明的药物组合物，其活性成分可仅为本发明的化合物，也可与其他抗乳腺癌化合物组合作为活性成分。
在治疗乳腺癌的过程中，可采用本发明的药物组合物与其他抗乳腺癌药进行联合治疗。
在治疗乳腺癌时，可通过同时、序贯或单独给予各种治疗成分可实现这种联合治疗。此类组合产品应用有效剂量范围内的本发明化合物和准许剂量范围内的其他药学活性剂。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1化合物1～42的合成
中间体2a-e的合成通法：
取酮或醛(30.0mmol)，氰基乙酸乙酯(30.0mmol)，单质硫(30.0mmol)溶于200ml无水乙醇中，再加入三乙胺(35.0mmol).The resulting was allowed to refluxed for12h.反应混合物升温至回流，保温反应12小时左右。反应完毕后，冷却至室温过滤，用无水乙醇洗涤(30ml x 3)，合并滤液减压除去溶剂，粗品经过硅胶柱层析纯化得到中间体，浅黄色固体。
中间体2a 1H-NMR(400MHz,CDCl3-d6),δ(ppm):5.73(1H,s),4.18(2H,q,J＝7.1Hz),2.47(2H,m),1.53(2H,m),1.25(3H,t,J＝7.0Hz),0.87(3H,t,J＝7.2Hz).HRMS(ESI)+calculated forC10H15NO2S,[M+H]+:m/z 214.0902,found 214.0910.
中间体2b 1H-NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):5.85(2H,s),4.24(2H,m),2.84(2H,m),2.72(2H,m),2,30(2H,m),1.32(3H,t,J＝7.1Hz)；HRMS(ESI)+calculated for C10H14NO2S,[M+H]+:m/z 212.0745,found 212.0752.
中间体2c 1H-NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):5.73(2H,s),4.26(2H,q,J＝6.9Hz),2.94(2H,t,J＝5.3Hz),2.55(2H,t,J＝5.3Hz),1.79(2H,m),1.60(4H,m),1.32(3H,t,J＝7.2Hz).
中间体2d 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):5.92(2H,s),4.26(2H,q,J＝14.2,7.13Hz),2.87(1H,m),2.56(2H,m),2.12(1H,m),1.81(2H,m),1.33(4H,t,J＝7.1Hz),1.04(3H,d,J＝6.5Hz)；HRMS(ESI)+calculated for C12H18NO2S,[M+H]+:m/z 240.1058,found240.1067.
中间体2e 1H-NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):5.98(2H,s),4.26(2H,m),3.37(2H,t,J＝2.0Hz),2.84(2H,m),2.66(2H,t,J＝5.9Hz),2,44(3H,s),1.33(3H,t,J＝7.1Hz).
化合物1～42的合成通法：
分别取上步制得的中间体(2.0mmol)溶于3ml盐酸气饱和的无水二氧六环中，再加入腈衍生物(2.2mmol)。混合物加热至100℃保温反应6-12小时。反应完毕后冷却至室温，用20ml饱和的碳酸氢钠水溶液猝灭反应。过滤收集析出的固体并用甲醇洗涤的类白色固体产物。
反应试剂和反应条件：(a)NCCH2CO2Et,S8,EtOH,Et3N,回流,12h；(b)腈,二氧六环/HCl,100℃,12h。
以下是核磁结果：
化合物1
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.85(2H,m),7.25(1H,t,J＝7.9Hz),6.88(1H,ddd,J＝8.4,2.7,1.0Hz),6.78(1H,br s),3.80(3H,s),2.71(2H,t,J＝7.3Hz),1.65(2H,m),0.94(3H,t,J＝7.3Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.6,155.2,150.5,149.1,131.7,124.3,123.9,123.0,120.4,118.4,118.0,112.4,55.1,31.6,23.6,11.4；HRMS(ESI)+calculated for C16H17N2O2S,[M+H]+:m/z 301.1011,found 301.1020.
化合物2
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.42(1H,t,J＝1.6Hz),8.26(1H,dt,J＝7.8,1.3Hz),7.49(1H,dq,J＝7.8,1.0Hz),7.32(1H,t,J＝7.8Hz),6.79(1H,br s),2.71(2H,t,J＝7.0Hz),1.65(2H,m),0.94(3H,t,J＝7.3Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.5,156.6,153.2,151.8,141.5,133.8,133.0,128.5,127.6,126.8,126.5,120.4,34.0,26.0,13.8；HRMS(ESI)+calculated for C15H14BrN2OS,[M+H]+:m/z 349.0010,found 349.0017.
化合物3
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.09(2H,d,J＝8.3Hz),6.72(2H,t,J＝8.2Hz),2.69(2H,t,J＝7.4Hz),1.63(2H,q,J＝14.4,7.1Hz),0.93(3H,t,J＝7.5Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.5,156.6,153.2,151.8,141.5,133.8,133.0,128.5,127.6,124.8,113.8,111.6,34.0,26.0,13.8；HRMS(ESI)+calculated for C15H15N2O2S,[M+H]+:m/z 287.0854,found 287.0863.
化合物4
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.62(2H,dd,J＝8.4,1.3Hz),7.55(2H,d,J＝8.4Hz),7.41(4H,m),7.32(1H,m),6.81(1H,s),3.80(2H,s),2.70(2H,t,J＝7.0Hz),1.61(1H,m),0.91(3H,t,J＝7.5Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.1,152.6,152.6,150.7,145.6,141.5,132.3,132.3,130.8,130.8,130.6,130.6,130.0,128.8,128.8,126.5,120.3,120.3,39.8,33.9,26.1,13.9；HRMS(ESI)+calculated for C22H21N2OS,[M+H]+:m/z 361.1375,found 361.1381.
反应试剂和反应条件：(a)NCCH2CO2Et,S8,EtOH,Et3N,回流,12h；(b)腈,二氧六环/HCl,100℃,12h。
化合物5
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.60(1H,s),7.71(2H,m),7.45(1H,dd,J＝8.8,6.1Hz),7.13(1H,d,J＝6.1Hz),3.86(3H,s),2.41(4H,m),2.95(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):161.6,155.5,151.2,150.7,146.4,142.7,132.7,125.5,124.0,121.4,113.2,112.6,56.1,29.4,28.6,28.4；HRMS(ESI)+calculated forC16H15N2O2S,[M+H]+:m/z 299.0854,found 299.0860.
化合物6
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.83(1H,s),8.33(2H,d,J＝8.1Hz),7.90(2H,d,J＝8.1Hz),2.96(4H,m),2.95(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.7,157.3,153.1,151.8,136.4,136.4,135.2,135.2,131.3,131.3,126.4,124.5,120.6,34.2,26.2,14.0；HRMS(ESI)+calculated forC16H12F3N2OS,[M+H]+:m/z 337.0622,found337.0630.
化合物7 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.69(1H,s),8.34(1H,dd,J＝1.8,1.7Hz),8.12(1H,d,J＝8.0Hz),7.73(1H,d,J＝7.8Hz),7.47(1H,dd,J＝8.0,7.8Hz),2.93(4H,m),2.40(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):161.3,159.2,155.5,152.1,151.6,130.3,130.3,129.1,129.1,128.8,125.8,116.4,30.4,29.5,29.3；HRMS(ESI)+calculated for C15H12BrN2OS,[M+H]+:m/z 346.9854,found 346.9863.
化合物8 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.54(1H,s),7.32(4H,m),7.25(1H,m),3.93(2H,s),2.88(4H,m),2.36(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):168.8,158.7,156.2,139.8,137.2,137.0,129.3,129.3,129.0,129.0,127.3,118.6,29.4,29.1,27.9；HRMS(ESI)+calculated forC16H15N2OS,[M+H]+:m/z 283.0905,found 283.0914.
化合物9 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.70(1H,s),8.07(2H,d J＝8.6Hz),7.73(2H,d J＝8.6Hz),2.95(4H,m),2.41(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):161.3,159.2,155.5,152.1,151.6,130.3,130.3,129.1,129.1,128.8,125.8,116.4,30.4,29.5,29.3；HRMS(ESI)+calculatedfor C15H12BrN2OS,[M+H]+:m/z 346.9854,found 346.9864.
化合物10 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.22(1H,s),8.99(1H,s),7.81(2H,s),2.92(4H,m),2.39(2H,m),2.23(6H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.8,156.7,155.6,146.4,144.0,136.5,131.1,130.9,130.9,129.6,125.0,116.5,30.8,30.1,29.9,16.5,16.5；HRMS(ESI)+calculated for C17H17N2O2S,[M+H]+:m/z 313.1011,found313.1020.
化合物11 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.61(1H,s),8.13(2H,m),7.55(3H,m),2.96(4H,m),2.41(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.9,157.3,151.8,133.6,133.6,129.3,129.3,128.1,128.1,126.9,121.6,117.0,29.8,29.0,28.8；HRMS(ESI)+calculated for C15H13N2OS,[M+H]+:m/z 269.0749,found 269.0753.
化合物12 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.73(1H,s),8.32(2H,d,J＝8.0Hz),7.90(2H,d,J＝8.0Hz),3.28(2H,m),2.87(2H,m),1.87(2H,m),1.60(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.9,157.8,153.3,146.7,144.7,138.9,138.0,,128.3,127.1,126.5,123.8,122.8,121.1,31.3,29.2,26.8,26.8,25.8；HRMS(ESI)+calculatedfor C18H16F3N2OS,[M+H]+:m/z 365.0935,found 365.0942.化合物13 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.33(1H,m),8.15(1H,d,J＝7.8Hz),7.70(1H,d,J＝7.8Hz),7.44(1H,t,J＝7.8Hz),3.29(2H,m),2.83(2H,m),1.85(2H,m),1.61(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.1,155.6,149.0,146.7,141.4,141.2,133.8,132.8,128.4,127.3,126.8,125.0,33.7,31.6,29.2,28.8,28.1；HRMS(ESI)+calculated for C17H16BrN2OS,[M+H]+:m/z375.0167,found 375.0174.
化合物14 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.39(1H,s),9.71(1H,s),7.52(2H,m),7.30(1H,t,J＝7.5Hz),6.95(1H,d,J＝6.7Hz),3.29(2H,br s),2.84(2H,br s),1.85(2H,br s),1.64(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.6,158.3,158.3,156.4,149.0,146.3,141.0,134.2,126.8,125.8,123.0,116.5,33.6,31.4,29.1,28.7,28.1；HRMS(ESI)+calculated for C17H17N2O2S,[M+H]+:m/z313.1011,found 313.1020.
化合物15 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.20(1H,s),10.04(1H,s),8.00(2H,d,J＝8.8Hz),6.86(2H,d,J＝8.8Hz),3.27(2H,m),2.82(2H,m),1.85(2H,br s),1.62(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.4,157.6,155.8,149.3,147.0,141.4,132.5,132.5,125.3,125.3,125.1,124.9,34.0,31.8,29.4,29.0,28.4；HRMS(ESI)+calculated for C17H17N2O2S,[M+H]+:m/z 313.1011,found313.1019.
化合物16 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.61(1H,s),8.07(2H,d,J＝8.1Hz),7,75(2H,d,J＝8.1Hz),3.32(2H,m),2.88(2H,m),1.89(2H,br s),1.65(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.5,156.3,152.7,146.6,141.3,136.3,136.3,135.0,131.2,131.2,124.9,116.9,33.9,31.7,29.3,29.0,28.3；HRMS(ESI)+calculated forC17H16BrN2OS,[M+H]+:m/z 375.0167,found 375.0174.
化合物17 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.11(1H,s),8.97(1H,s),7.80(2H,s),3.28(2H,m),2.83(2H,m),2.23(6H,s),1.86(2H,br s),1.63(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.6,156.2,152.6,149.6,145.0,140.9,136.3,130.9,130.8,130.8,129.5,129.5,33.9,31.5,29.3,28.9,28.3,16.4,16.4；HRMS(ESI)+calculated for C19H21N2O2S,[M+H]+:m/z 341.1324,found 341.1331.
化合物18 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.52(1H,s),7.41-7.29(4H,m),7.25(1H,br s)3.91(2H,s),3.23(2H,br s),2.80(2H,br s),1.84(2H,s),1.59(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.8,152.4,151.9,131.9,131.9,131.8,131.8,131.6,131.6,129.8,129.8,116.6,39.7,33.6,31.1,29.0,28.7,28.0；HRMS(ESI)+calculatedfor C18H19N2OS,[M+H]+:m/z 311.1218,found 311.1223.
化合物19 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.63(4H,m),7.44(4H,m),7.34(1H,m),3.92(2H,s),3.23(2H,m),2.77(2H,m),1.82(2H,m),1.56(4H,m)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.2,158.6,157.4,145.9,143.6,143.1,139.2,138.5,129.8,129.8,128.4,128.4,128.2,128.2,127.6,126.4,126.4,122.5,37.2,31.4,29.0,26.8,26.5,25.8；HRMS(ESI)+calculated for C24H23N2OS,[M+H]+:m/z 387.1531,found 387.1540.
反应试剂和条件：(a)NCCH2CO2Et,S8,EtOH,Et3N,回流,12h；(b)腈,二氧六环/HCl,100℃,12h。
化合物20 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.51(1H,s),7.73(1H,d,J＝7.9Hz),7.68(1H,t,J＝1.9Hz),7.42(1H,t,J＝8.2Hz),7.13(1H,dq,J＝8.2,0.7Hz),3.85(3H,s),3.13(1H,m),2.87(1H,dd,J＝16.5,4.9Hz),2.76(1H,m),2.36(1H,m),1.89(2H,m),1.41(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.6Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):163.0,160.0,157.0,151.2,142.0,135.1,134.1,126.7,125.4,124.5,122.8,114.6,57.5,34.5,31.3,31.1,26.5,21.6；HRMS(ESI)+calculated for C18H19N2O2S,[M+H]+:m/z 327.1167,found 327.1170.
化合物211H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.74(1H,s),8.33(2H,d,J＝8.4Hz),7.90(2H,d,J＝8.4Hz),3.13(1H,m),2.90(1H,dd,J＝17.8,5.5Hz),2.83(1H,m),2.40(1H,m),1.90(2H,m),1.40(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.5Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.9,156.3,151.4,142.8,135.3,130.9,130.9,129.7,129.6,129.2,126.3,125.0,123.6,34.7,31.4,31.1,26.5,21.7；HRMS(ESI)+calculated for C18H16F3N2OS,[M+H]+:m/z365.0935,found 365.0941.
化合物22 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.60(1H,s),8.31(1H,s),8.13(1H,d,J＝8.0Hz),7.77(1H,d,J＝7.9Hz),7.48(1H,t,J＝8.0Hz),3.13(1H,m),2.88(1H,dd,J＝17.2,4.7Hz),2.80(1H,m),2.38 1H,m),1.90(2H,m),1.38(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.4Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):161.0,156.0,151.2,142.4,141.5,141.5,135.1,133.9,133.9,133.0,128.5,127.4,126.8,34.5,31.3,31.0,26.5,21.6；HRMS(ESI)+calculated for C17H16BrN2OS,[M+H]+:m/z 375.0167,found 375.0178.
化合物23 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.65(1H,m),8.10(2H,m),3.13(1H,m),2.89(1H,m),2.78(1H,m),2.39(1H,m),1.89(2H,m),1.38(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.7Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.9,156.2,154.5,153.7,151.8,148.8,146.1,142.9,135.2,124.9,122.1,115.8,34.7,31.4,31.1,26.6,21.7；HRMS(ESI)+calculated for C17H14F3N2OS,[M+H]+:m/z 351.0779,found351.0087.
化合物24 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.4(1H,s),9.73(1H,s),7.55(2H,m),7.30(1H,t,J＝7.7Hz),6.95(1H,ddd,J＝8.1,2.4,0.8Hz),3.12(1H,m),2.83(1H,dd,J＝16.6,4.7Hz),2.75(1H,m),2.36(1H,m),1.87(2H,m),1.38(1H,m),1.06(3H,d,J＝6.6Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.9,158.6,157.2,151.2,142.2,135.2,134.5,127.1,126.1,124.7,123.3,116.7,34.7,31.4,31.2,26.6,21.7；HRMS(ESI)+calculated for C17H17N2O2S,[M+H]+:m/z 313.1011,found 313.1020.
化合物25 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.25(1H,s),10.15(1H,s),8.01(2H,d,J＝8.7Hz),6.87(2H,d,J＝8.7Hz),6.87(2H,d,J＝8.7Hz),3.11(1H,m),2.84(1H,m),2.75(1H,m),2.35(1H,m),1.88(2H,m),1.40(1H,m),1.06(3H,d,J＝6.5Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):165.2,160.0,156.5,151.3,141.1,134.9,132.6,132.6,123.7,119.9,119.9,117.4,34.4,31.3,31.1,26.4,21.6；HRMS(ESI)+calculated forC17H17N2O2S,[M+H]+:m/z 313.1011,found 313.1022.
化合物26 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.59(1H,s),8.07(2H,d,J＝8.5Hz),7.73(2H,dt,J＝8.7,1.9Hz),3.13(1H,m),2.88(1H,dd,J＝16.6,4.8Hz),2.78(1H,m),2.33(1H,m),1.88(2H,m),1.39(1H,m),1.07(3H,d,J＝6.6Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.3,156.7,151.5,142.2,136.4,136.4,135.2,135.1,131.2,131.2,124.6,124.3,34.6,31.4,31.1,26.5,21.7；HRMS(ESI)+calculated for C17H16BrN2OS,[M+H]+:m/z 375.0088,found 375.0093.
化合物27 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.12(1H,s),8.97(1H,s),7.79(2H,s),3.10(1H,m),2.83(1H,dd,J＝16.6,4.6Hz),2.73(1H,m),2.34(1H,m),2.22(6H,s),1.87(2H,m),1.37(1H,m),1.06(3H,d,J＝6.5Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.7,160.2,156.6,151.5,140.7,134.9,130.9,130.9,129.6,129.6,123.5,116.4,34.5,31.4,31.1,26.5,21.6,16.4,16.4；HRMS(ESI)+calculated for C19H21N2O2S,[M+H]+:m/z341.1324,found 341.1330.
化合物28 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.57(1H,s),9.78(1H,s),7.52(2H,m),7.32(1H,t,J＝7.9Hz),6.98(1H,ddd,J＝8.1,2.4,0.6Hz),4.03(2H,s),3.11(4H,s),2.66(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):159.6,158.8,154.4,134.6,134.6,131.5,129.6,127.1,126.7,123.7,123.4,117.1,54.4,54.1,45.3,45.3,24.6；HRMS(ESI)+calculated for C17H17N2OS,[M+H]+:m/z 297.1062,found297.1071.
化合物29 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.45(1H,s),7.31(4H,m),7.24(1H,m),3.90(2H,s),3.01(1H,m),2.77(1H,dd,J＝16.8,4.8Hz),2.69(1H,m),2.31(1H,m),1.84(2H,m),1.34(1H,m),1.03(3H,d,J＝6.6Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):161.8,159.4,150.5,141.7,134.9,132.3,132.3,132.1,131.9,131.9,130.1,124.7,40.1,34.5,31.4,31.1,26.5,21.6；HRMS(ESI)+calculated for C18H19N2OS,[M+H]+:m/z 311.1218,found 311.1222.
化合物30 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.50(1H,s),7.64(4H,m),7.45(4H,m),7.34(1H,m),3.96(2H,s),3.06(1H,m),2.81(1H,dd,J＝16.6,4.7Hz),2.71(1H,m),2.32(1H,m),1.85(2H,m),1.35(1H,m),1.03(3H,d,J＝6.5Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):161.4,159.4,150.5,145.4,141.7,141.6,134.8,132.4,132.4,130.9,130.9,130.6,130.6,130.1,129.4,128.8,128.8,124.7,39.7,34.5,31.4,31.1,26.5,21.7；HRMS(ESI)+calculated for C24H23N2OS,[M+H]+:m/z 387.1531,found387.1540.
化合物31 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.57(1H,s),7.73(1H,d,J＝7.8Hz),7.69(1H,m),7.44(1H,dd,J＝8.5,7.8Hz),7.13(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz),3.85(3H,s),3.60(2H,s),2.99(2H,m),2.70(2H,m),2.39(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.1,158.6,156.3,141.8,134.0,133.4,131.4,129.4,128.9,128.4,127.0,123.4,54.5,54.3,45.4,45.4,24.7；HRMS(ESI)+calculated forC17H18N3O2S,[M+H]+:m/z 328.1120,found 328.1131.
化合物32 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.83(1H,s),8.34(2H,d,J＝8.2Hz),7.96(2H,d,J＝8.2Hz),3.61(2H,s),2.99(2H,m),2.69(2H,m),2.39(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.0,159.8,154.7,134.4,134.4,131.6,129.4,127.0,126.3,123.3,123.3,115.0,115.0,57.7,54.4,45.4,24.6；HRMS(ESI)+calculated forC17H15F3N3OS,[M+H]+:m/z 366.0888,found 366.0897.
化合物33 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.83(1H,s),8.40(1H,t,J＝1.8,1.7Hz),8.23(1H,ddd,J＝8.0,1.4,1.1Hz),7.58(1H,m),7.37(1H,dd,J＝8.0,7.8Hz),3.50(2H,s),2.96(2H,m),2.63(2H,m),2.37(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.7,158.4,158.4,140.3,140.0,131.1,129.5,129.5,129.3,126.5,123.8,123.3,54.6,54.4,45.4,24.7；HRMS(ESI)+calculated forC16H15BrN3OS,[M+H]+:m/z 376.0119,found376.0126.
化合物34 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.55(1H,s),8.12(2H,d,J＝8.0Hz),7.54(2H,d,J＝8.0Hz),3.12(2H,s),2.82(2H,m),2.38(2H,m),1.90(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.2,157.5,157.5,151.2,141.9,138.8,135.1,132.7,132.7,130.0,125.5,124.7,34.5,31.3,26.5,21.6；HRMS(ESI)+calculated forC16H16N3O2S,[M+H]+:m/z 314.0963,found 314.0973.
化合物35 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.05(2H,d,J＝8.7Hz),6.78(2H,d,J＝8.7Hz),3.49(2H,s),2.95(2H,m),2.63(2H,m),2.36(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):165.2,160.0,156.5,151.3,141.1,134.9,132.6,132.6,123.7,119.9,119.9,117.4,34.4,31.3,31.1,26.4；HRMS(ESI)+calculated for C17H18N3O2,[M+H]+:m/z296.1399,found 296.1402.
化合物36 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.18(1H,s),8.99(1H,s),7.83(2H,s),3.56(2H,s),2.96(2H,m),2.67(2H,m),2.38(3H,s),2.23(6H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):160.3,159.9,158.9,154.0,131.5,131.5,131.5,129.9,129.9,128.2,122.1,115.8,54.4,54.2,45.4,24.5,16.5,16.5；HRMS(ESI)+calculated for C18H20N3O2S,[M+H]+:m/z 342.1276,found 342.1280.
化合物37 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.58(1H,s),7.63(4H,m),7.44(4H,m),7.35(1H,m),3.97(2H,s),3.52(2H,m),2.91(2H,m),2.67(2H,m)2.35(3H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):164.7,159.0,153.5,145.9,141.7,132.6,132.6,131.4,131.0,131.0,130.8,130.8,130.2,130.2,129.4,129.0,129.0,128.5,54.3,54.1,45.4,40.3,24.5；HRMS(ESI)+calculated for C23H22N3OS,[M+H]+:m/z 388.1484,found388.1494.
化合物38 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.58(1H,br s),7.74-7.69(2H,m),7.45-7.28(6H,m),7.13(1H,d,J＝7.0Hz),3.85(3H,s),3.72(2H,s),3.64(2H,s),2.98(2H,br s),2.79(2H,br s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.8,159.1,154.1,152.1,133.8,133.3,132.3,132.3,131.7,131.7,130.0,128.2,126.5,125.8,122.8,119.4,116.5,114.3,63.6,57.2,51.7,51.3,24.2；HRMS(ESI)+calculated forC23H22N3O2S,[M+H]+:m/z 404.1433,found 404.1434.
化合物39 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.19(1H,s),8.99(1H,s),7.81(2H,s),7.39-7.27(5H,m),3.72(2H,s),3.62(2H,s),2.96(2H,br s),2.79(2H,br s),2.22(6H,s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):164.0,157.7,156.6,151.7,131.6,130.6,130.6,130.0,130.0,129.6,129.3,129.3,127.7,127.7,126.5,126.4,119.9,113.6,61.9,50.0,49.6,22.4,14.3,14.3；
HRMS(ESI)+calculated for C24H24N3O2S,[M+H]+:m/z 418.1589,found 418.1597.
化合物40 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.57(1H,s),8.13(2H,d,J＝7.0Hz),7.59-7.50(3H,m),7.39-7.26(5H,m),3.72(2H,s),3.64(2H,s),2.98(2H,br s),2.79(2H,br s)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):162.2,159.2,159.2,153.7,152.1,139.1,133.3,132.5,132.5,132.3,132.3,131.7,131.7,130.0,130.0,129.3,125.0,122.7,63.7,51.7,51.4,24.2；HRMS(ESI)+calculated for C22H20N3OS,[M+H]+:m/z374.1327,found 374.1330.
化合物41 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.80(1H,s),8.33(2H,d,J＝8.2Hz),7.89(2H,d,J＝8.2Hz),7.39-7.26(5H,m),3.72(2H,s),3.65(2H,s),2.89(2H,t,J＝5.8Hz),2.72(2H,t,J＝5.8Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):164.0,157.9,155.7,155.4,137.5,131.1,130.1,130.1,129.5,129.5,128.8,128.4,128.4,128.2,126.8,126.0,123.9,121.2,120.6,61.3,49.6,49.3,22.0；HRMS(ESI)+calculated forC23H19F3N3OS,[M+H]+:m/z 442.1201,found 442.1210.
化合物42 1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.08(2H,d,J＝8.7Hz),7.39-7.26(5H,m),6.76(2H,d,J＝8.7Hz),3.68(2H,s),3.54(2H,s),2.89(2H,t,J＝5.8Hz),2.72(2H,t,J＝5.8Hz)；13C-NMR(100MHz,CF3COOD),δ(ppm):164.2,157.4,156.6,151.6,131.5,131.0,131.0,130.4,130.4,129.8,129.8,129.5,126.5,126.3,120.0,118.7,118.7,118.0,61.8,49.9,49.8,22.3；HRMS(ESI)+calculated for C22H20N3O2S,[M+H]+:m/z390.1276,found 390.1280.
试验例1化合物1～42的BRD4抑制活性及自噬率活性
本实验的目的是检测本发明的化合物对体外BRD4抑制活性，及对细胞的自噬率活性，其结果见表1。
1、AlphaScreen检测
所有的试剂稀释在50毫米hepes、100mM NaCl，0.1％牛血清白蛋白，pH值为7.4，添加0.05％CHAPS允许平衡至室温。配体浓度范围配制为0～100μM，取4μL加入到384板中，再加入4μLBRD4(1)酶(250nM)，室温密封孵育30分钟，之后加入等摩尔的生物素肽H-SGRGK(Ac)GGK(Ac)GLGK-(Ac)GGAK(Ac)RHRK(Biotin)-OH。在弱光条件下，密封进一步孵育30分钟后加入4μL链霉亲和素(25μ克/毫升)和4μl镍螯合物受体珠(25μ克/毫升)。板箔密封，避光，室温孵育60min，上板阅读器读取(PHERAstar FS BMG LABTECH)使用AlphaScreen 680励磁/570发射滤波器组。IC50计算用Prism 6.0。
2、细胞活性检测
MCF-7和MDA-MB-231细胞在96孔平底微量滴定板的密度为5×104细胞/毫升。孵育24小时后，细胞用不同浓度的化合物处理。细胞存活实验采用MTT法测定。5mg/mL MTT添加到每个孔中。孵育4小时后，移除溶媒，在加入150微升DMSO易溶解晶体。在570nm测定吸光度值。
3、自噬活性筛选
MCF-7细胞用5μM的化合物处理，孵育6小时。然后在37℃加入0.05mM MDC孵育30min。利用流式细胞术测定细胞荧光强度。
表1化合物1～42BRD4抑制活性及自噬率活性
实验结果表明，本发明的化合物对BRD4具有不同程度的抑制活性及自噬活性，其中，化合物5、化合物15、化合物17、化合物18、化合物35、化合物36的效果较好，最优的，化合物36(记为FL-411)对BRD4具有较强的抑制活性及自噬活性。
试验例2 FL-411诱导乳腺癌细胞发生自噬相关的细胞死亡
我们观察到FL-411能诱导大量的细胞质空泡化在处理MCF-7和MDA-MB-231细胞时，这与自噬密切相关。因此，我们研究是否FL-411能诱导乳腺癌细胞发生自噬。MDC是一种自噬泡的检测探针，应用于FL-411处理细胞，在荧光显微镜下观察并拍照发现产生大量绿色荧光点(图1)。随后，我们在电镜下观察自噬的形态标志，细胞质内产生了广泛的空泡(图2)。细胞自噬被GFP-LC3的转染和LC3免疫荧光所证实(图3，图4)。为了进一步确证FL-411能够诱导自噬，我们发现FL-411处理过的细胞Beclin-1表达增加，自噬底物p62/SQSTM1发生下调；同时自噬标志物LC3Ⅱ呈现时间依赖性的聚集(图5)。接下来，我们使用了溶酶体抑制剂，BafA1，来验证自噬流的产生。我们发现在BafA1存在下LC3-II和p62/SQSTM1发生了明显的聚集，表明自噬流被FL-411加强了(图6)。为了进一步确定FL-411诱导的自噬是细胞毒性和细胞保护作用，我们应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤，它能抑制细胞自噬体的形成通过抑制III型磷脂酰肌醇-3激酶。应用MTT法评估了细胞活力。我们发现细胞存活率显著增加在用3-MA处理后(图7)。以上结果表明FL-411又到了自噬相关的细胞死亡在MCF-7和MDA-MB-231细胞中。
试验例3 FL-411诱导的自噬是通过BRD4-AMPK-mTOR-ULK信号通路
因为BRD4是很多酪氨酸激酶激活的反馈，包括PI3K/AKT。因此，我们研究了自噬信号的上游机制来阐明FL-411诱导的自噬。首先，我们检测了AKT，p-AKT(Ser473)、p-Akt(Thr308)，mTOR和p-mTOR(ser2448)的表达在FL-411处理后。正如预期的那样，FL-411能明显降低p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)和p-mTOR(ser2448)的表达，同时Akt和mTOR的表达均不变(图8)。因为ULK1复合体与自噬小体的形成密切相关。我们随后检查了ULK1，p-ulk1(ser317)、Atg13，p-atg13(ser318)和FIP200的表达。结果表明，在FL-411处理后，ULK1和Atg13磷酸化显著增加；而ULK1，Atg13和FIP200略有下调；表明FL-411能够通过ULK1复合体调节自噬(图9)。为了探索FL-411诱导的自噬是否仅与BRD4抑制相关，我们使用了两种特异性siRNA抑制BRD4的表达。有趣的是，我们发现沉默BRD4能够降低c-myc原癌基因的表达，这与FL-411处理效果一致。但是，不同于FL-411的处理，AMPKα和ULK1的表达和磷酸化及LC3-II聚集和p62降解在BRD4敲降后能够被改变。这表明BRD4的沉默不能够诱导自噬(图10)。综上，FL-411诱导的自噬是通过BRD4-AMPK-mTOR-ULK信号通路。
试验例4 FL-411在体内具有潜在治疗作用通过靶向BRD4调控的自噬
为了评价FL-411体内抗肿瘤活性，两个乳腺肿瘤异种移植模型即MCF-7和MDA-MB-231细胞模型分别被使用。我们使用了三种不同剂量的FL-411体内研究：25毫克/千克，50毫克/千克和100毫克/公斤。在所有的模型中，FL-411表现出明显的肿瘤生长的抑制作用并呈剂量依赖性在MCF-7和MDA-MB-231细胞模型的肿瘤生长抑制率分别为80％和76％(图11，图12)。我们观察到在所有剂量组的肿瘤重量都显着减少(图13)。并且，FL-411显示在所有治疗组中对体重均无明显影响(图14)。为了检查是否FL-411调节的体内抑制肿瘤生长是与减少细胞增殖和增加自噬性细胞死亡相关。我们对肿瘤组织进行了Ki-67和LC3的免疫组化分析。我们发现FL-411能够显著减少Ki-67阳性细胞数量并且增加自噬水平(图15)。接下来，我们进行了免疫印迹分析，进一步明确FL-411体内机制。我们发现FL-411能够显著LC3Ⅱ的积累和caspase3活化及抑制BRD4和c-Myc的表达。这基本与免疫组化分析结果和体外获得的结果一致(图16)。此外，我们利用斑马鱼异种移植模型，进一步确证了FL-411的抗肿瘤作用。与对照组相比，我们发现所有三个剂量的FL-411明显抑制肿瘤的生长(图17，图18)。综上，这些结果表明FL-411在小鼠异种移植和斑马鱼模型中都具有良好的抗肿瘤活性。

Claims (8)

1.结构式如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R1和R2连接形成环状结构，所述环状结构为
R3为苯环或被取代的苯环；
n为0或1。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：n为0。
3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R3为
4.根据权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
R1和R2连接形成R3为
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述式Ⅰ化合物为如下化合物：
6.权利要求1～5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗乳腺癌药物中的用途，其特征在于：所述乳腺癌治疗药物为BRD4抑制剂类药物。
8.一种治疗乳腺癌的药物组合物，其特征在于：其活性成分包含有效剂量的权利要求1～5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
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