CN109824622A - 一类细胞内形成纳米结构杀死癌细胞的前体药物及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类细胞内形成纳米结构杀死癌细胞的前体药物及其制备方法，特征是该前体药物含有苯并噻唑氰‑D型半胱氨酸结构，能够利用癌细胞内高浓度的还原剂和特异性高表达的酶控制小分子前药发生苯并噻唑氰与半胱氨间的点击反应形成纳米结构的过程，从而控制药物对癌细胞和正常细胞的毒性。与已有的利用组胞内组装单体亲疏水性或浓度改变原位获得纳米药物的前体药物相比，本发明对前药的亲疏水性要求更低，且由于所用的点击反应可被pH、酶以及生物小分子等多种因素控制，因而前药可以根据具体需要进行多种修饰，具有更广的应用范围。本发明填补了利用点击反应触发无毒小分子前药原位形成抗癌纳米药物的空白。

Description

一类细胞内形成纳米结构杀死癌细胞的前体药物及其制法
技术领域
本发明属于纳米医学药物技术领域，具体涉及可在癌细胞内发生苯并噻唑氰与半胱氨酸间点击反应形成纳米结构杀死癌细胞的小分子前体药物及其制备方法。
背景技术
《自然·通讯》杂志(Nat.Commun.,2017,8,26)报导了可在癌细胞内富集产生纳米纤维结构杀死癌细胞的两亲性小分子前体药物。《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.2016,138,3813-3823；J.Am.Chem.Soc.2016,138,10758-10761；J.Am.Chem.Soc.2018,140,9566-9573)等期刊报道了亲水性的小分子前体药物被癌细胞内高表达的蛋白酶酶切产生疏水性小分子，并进一步自组装形成纳米结构杀死癌细胞。虽然这些报道中的胞内原位形成纳米结构的策略可以避免纳米结构对正常组织与细胞的纳米毒性，但是上述两种策略对前药的亲疏水性要求严格，限制了它们的发展和推广。相较于上述两种策略，《自然·化学》(Nat.Chem.2010,2,54-60)报导的苯并噻唑氰-半胱氨酸点击反应触发的自组装过程对所合成前体的亲疏水性和组装单体的浓度要求低，反应快速，且该反应可被pH、酶、以及还原型谷胱甘肽(GSH)等多种生物信号调控，因而更容易被设计与调控。但至今尚未见到用苯并噻唑-半胱氨酸点击反应触发无毒小分子前药的自组装形成可杀死癌细胞的纳米结构方面的研究工作及文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的是提出一类细胞内形成纳米结构杀死癌细胞的前体药物及其制备方法，以获得可高效杀死癌细胞并不损伤正常细胞的癌症化疗新药物，填补利用点击反应触发无毒小分子前药原位形成抗癌纳米药物方面的空白。
本发明一类细胞内形成纳米结构杀死癌细胞的前体药物及其制备方法，是指一类含有苯并噻唑氰-D型半胱氨酸结构的小分子化合物及其制备方法，包括可杀死多种癌细胞的前体药物D-2、以及可选择性杀死氟林酶高表达的癌细胞的前体药物Pro-D-2，及其制备方法。
本发明的一类细胞内形成纳米结构可杀死多种癌细胞的前体药物D-2的制备方法，其特征在于：
第一步，按：将两口烧瓶反复抽真空通氮气三次以去除烧瓶中的氧气，在氮气保护下往烧瓶中加入7.2毫摩尔(1586.2毫克)溶于3毫升脱气甲醇的2,2’-二硫二吡啶；将4.8毫摩尔(346微升)乙硫醇溶解于8毫升脱气甲醇，在氮气保护下逐滴加入上述溶液中，将混合溶液在氮气保护下室温搅拌过夜，用旋转蒸发仪去除甲醇后，将粗产物用高效液相色谱分离提纯，得到第一种纯化合物，命名为化合物A；
第二步，将两口烧瓶反复抽真空通氮气三次以去除烧瓶中的氧气，将1.3毫摩尔(217.8毫克)化合物A溶解于2毫升脱气N，N-二甲基甲酰胺溶液，在氮气保护下加入烧瓶中；将1.2毫摩尔(254.5毫克)N-叔丁氧羰基-D型半胱氨酸溶解于1.4毫升脱气N，N-二甲基甲酰胺，在氮气保护下逐滴加入上述溶液中，混合溶液在氮气保护下室温搅拌12小时后，经过高效液相色谱分离提纯，得到第二种纯化合物，命名为化合物B；
第三步，将0.4毫摩尔(112.6毫克)化合物B溶解于1毫升无水四氢呋喃，加入2毫摩尔(224.5微升)4-甲基吗啉，将混合溶液冷却至0℃后加入0.4毫摩尔(54.2微升)氯甲酸异丁酯，维持温度为0℃搅拌1小时；0.48毫摩尔(84毫克)2-氰基-6-氨基苯并噻唑(CBT)溶解于3毫升无水四氢呋喃中，并用注射器加入上述反应混合液中，在0℃下继续搅拌2小时，然后于室温下搅拌过夜，经过高效液相色谱分离提纯，得到第三种纯化合物，命名为化合物C；
第四步，合成可杀死多种癌细胞的前药D-2，按：将0.2毫摩尔(97.3毫克)化合物C溶解在20毫升含95％体积浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，加入200微升三异丙基硅烷，室温下搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，即得到可杀死多种癌细胞的第四种纯化合物，前药D-2。
本发明的一类细胞内形成纳米结构可用于选择性杀死氟林酶高表达的癌细胞的前药Pro-D-2的制备方法，其特征在于将上述合成前药D-2的氨基修饰上可被氟林酶识别剪切的寡肽链醋酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸(Ac-Arg-Val-Arg-Arg-OH)，分三步合成：
第一步，合成一段序列为Ac-Arg(Pbf)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的寡肽，按：将0.7克2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀30分钟后，加入0.95毫摩尔(616毫克)N-芴甲氧羰基-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)，再加入1.2毫摩尔(200微升)N，N-二异丙基乙胺，反应6-8小时后，用200微升甲醇反应30分钟，去除反应溶液，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；加入活化的0.8毫摩尔(519毫克)第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)反应6-8小时，去除反应溶液，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；加入活化的0.8毫摩尔(218毫克)第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸反应6-8小时，去除反应溶液，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去丙氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；加入活化的0.8毫摩尔(519毫克)第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)反应6-8小时，去除反应溶液，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；加入400微升醋酸酐和1.2毫摩尔(200微升)N，N-二异丙基乙胺，反应3小时，最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，使用高效液相色谱纯化后得到第五种纯化合物，命名为化合物D；
以上固相合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等物质的量的N，N-二异丙基乙胺、1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；在每接上一个氨基酸和切去9-芴甲氧羰基保护基时，都采用凯氏测试(Kaiser Test)试剂检测氨基存在与否：若阳性，显蓝色，即表明已脱除9-芴甲氧羰基保护基；若阴性，显黄色，则表明氨基酸已接上；
第二步，将0.12毫摩尔(161.2毫克)D，0.097毫摩尔(32.9毫克)D-2，0.14毫摩尔(19毫克)1-羟基苯并三唑和0.14毫摩尔(53.2毫克)苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐的混合物溶解于1毫升N，N-二甲基甲酰胺，加入0.15毫摩尔(25微升)N，N-二异丙基乙胺，反应液在室温下搅拌12小时后，经过高效液相色谱分离提纯，得到第六种纯化合物，命名为化合物E，
第三步，合成可选择性杀死氟林酶高表达的癌细胞的前药Pro-D-2，按：将0.06毫摩尔(100.9毫克)化合物C溶解在20毫升含95％体积浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，加入200微升三异丙基硅烷，室温下搅拌反应3小时后，经过高效液相色谱分离提纯，即可得到可杀死氟林酶高表达的癌细胞的纯化合物前药Pro-D-2。
在本发明的上述方法中合成的七种化合物A、B、C、前药D-2、化合物D、E,和前药Pro-D-2，其特征在于结构分别为：
本发明的另一种产品----可以杀死癌细胞的超分子纳米药物、及其制备方法，其特征在于通过还原型谷胱甘肽(GSH)还原前药D-2形成纳米粒子用于杀死癌细胞，按照如下方法形成纳米药物：将30毫克前药D-2溶于887.6微升二甲基亚砜中制得浓度为100毫摩尔/升的D-2储备液；取1微升浓度为100毫摩尔/升的D-2储备液，用pH为7.4、浓度为10毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至500微升，则得到终浓度为200微摩尔/升的D-2溶液；再加入2.5微升浓度为400毫摩尔/升的GSH水溶液，振荡溶液使之混合均匀，并用1摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为7.4，在37℃下孵育1小时至溶液浑浊，即制得纳米粒子----可以杀死癌细胞的超分子纳米药物。
本发明一方面将肿瘤原位形成纳米结构杀死癌细胞的策略进行了深化和发展，本发明中的策略不仅可以杀死多种癌细胞并且不损伤正常细胞，而且可以通过特定修饰控制性地杀死某种或某一类癌细胞，本发明为获得安全高效、副作用小的临床癌症化疗新方法提供了新机会。另一方面，本发明首次对苯并噻唑-半胱氨酸间的点击反应在癌症治疗方面的潜力进行了研究与探讨。本发明制备可以杀死癌细胞的超分子纳米粒子的方法应用了苯并噻唑氰与半胱氨酸间的点击反应，反应快速高效，能被还原剂GSH控制。GSH是细胞中非常重要的生物分子，胞内浓度高达1-10毫摩尔，能有效地还原双硫键使D-2中的巯基暴露出来，从而触发点击反应和缩合自组装过程，得到纳米粒子。同时与以前报导的用L型半胱氨酸与苯并噻唑氰之间发生点击反应制备纳米粒子的策略相比，由于细胞内缺乏降解D型氨基酸的酶，本发明所用D型半胱氨酸与苯并噻唑氰反应制备的纳米粒子在生物系统中的稳定性大大提高，从而对癌细胞的杀伤效果会增强。而通过对D-2进行修饰，可制得能特异性杀死某种或某几种癌细胞的前药，例如本发明中的Pro-D-2可以在氟林酶的剪切下释放出D-2，再在GSH触发下发生点击缩合反应，形成可杀死癌细胞的纳米结构，因而Pro-D-2可以特异性地杀死氟林酶高表达的人乳腺癌细胞MDA-MB-468细胞。与现有的利用胞内前体药物亲疏水性改变和前体药物胞内浓度富集获得纳米药物的策略相比，本发明采用的苯并噻唑氰-半胱氨酸点击反应触发纳米药物的形成的策略对前药的亲疏水性要求更低，且由于本发明中应用的点击反应可被pH、酶和生物小分子等多种因素控制，因而前药D-2可以根据具体需要进行多种修饰，比前述两种策略应用范围更广。本发明填补了利用点击反应触发无毒小分子前药原位形成抗癌纳米药物方面的空白。
附图说明
图1为实施例1中合成的第一种纯化合物A的质谱图；
图2为实施例1中合成的第一种纯化合物A的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1中合成的第一种纯化合物A的核磁共振碳谱图；
图4为实施例1中合成的第二种纯化合物B的质谱图；
图5为实施例1中合成的第二种纯化合物B的核磁共振氢谱图；
图6为实施例1中合成的第二种纯化合物B的核磁共振碳谱图；
图7为实施例1中合成的第三种纯化合物C的质谱图；
图8为实施例1中合成的第三种纯化合物C的核磁共振氢谱图；
图9为实施例1中第三种纯化合物C的核磁共振碳谱图；
图10为实施例1中第四纯化合物前药D-2的质谱图；
图11为实施例1中第四纯化合物前药D-2的核磁共振氢谱图；
图12为实施例1中第四纯化合物前药D-2的核磁共振碳谱图。
图13为实施例2中第五种纯化合物D的质谱图；
图14为实施例2中第六种纯化合物E的质谱图；
图15为实施例2中第七种纯化合物前药Pro-D-2的质谱图；
图16为实施例2中第七种纯化合物前药Pro-D-2的核磁共振氢谱图；
图17为实施例2中第七种纯化合物前药Pro-D-2的核磁共振碳谱图。
图18为实施例3中第四种纯化合物前药D-2形成纳米粒子前后的光学照片对比图；
图19为实施例3中第四种纯化合物前药D-2在GSH作用下形成的纳米粒子的透射电子显微镜表征。
图20为实施例4中被第四种纯化合物前药D-2处理后的人宫颈癌细胞透射电子显微镜表征。
图21为实施例4中图20的白色方框所圈区域的透射电子显微镜放大图。
图22为实施例4中被第四种纯化合物前药D-2处理前的人宫颈癌细胞透射电子显微镜表征。
图23为实施例5中顺铂对多种癌细胞的抗癌活性以及对正常细胞的毒性测试结果；
图24为实施例5中第四种纯化合物前药D-2对多种癌细胞的抗癌活性以及对正常细胞的毒性测试结果。
图25为实施例6中第四种纯化合物前药D-2和第七种纯化合物前药Pro-D-2对氟林酶高表达癌细胞的选择性毒性测试结果。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例对本发明作进一步详细的说明。其中实施例1提供了第一种纯化合物A，第二种纯化合物B，第三种纯化合物C和第四种纯化合物前药D-2的合成。实施例2中提供了第五种纯化合物D，第六种纯化合物E和第七种纯化合物前药Pro-D-2的合成。实施例3为由前药D-2制备纳米药物和纳米药物的形貌表征实验。实施例4为前药D-2在人宫颈癌细胞内形成纳米粒子的实验。实施例5为第四种纯化合物前药D-2对多种癌细胞的毒性实验。实施例6为前药Pro-D-2对氟林酶高表达的癌细胞的选择性毒性实验。
实施例1：纯化合物A、B、C和前药D-2的合成
本实施例具体介绍一种可在癌细胞内发生苯并噻唑氰-半胱氨酸间点击反应形成纳米结构杀死多种癌细胞并不损伤正常细胞的小分子前体药物D-2的合成方法，共分四步完成，前三步分别得到纯化合物A、B和C，合成路线如下：
第一步，将7.2毫摩尔(1586.2毫克)2,2’-二硫二吡啶溶于3毫升脱气甲醇，在氮气保护下逐滴加入4.8毫摩尔(346微升)溶解于8毫升脱气甲醇的乙硫醇溶液，将混合溶液在氮气保护下室温搅拌过夜，用旋转蒸发仪去除甲醇后，用高效液相色谱分离提纯，得到第一种纯化合物，命名为化合物A；
第二步，将两口烧瓶反复抽真空通氮气三次以去除烧瓶中的氧气，将1.3毫摩尔(217.8毫克)化合物A溶解于2毫升脱气N，N-二甲基甲酰胺溶液，在氮气保护下加入烧瓶中；将1.2毫摩尔(254.5毫克)N-叔丁氧羰基-D型半胱氨酸溶解于1.4毫升脱气N，N-二甲基甲酰胺，在氮气保护下逐滴加入上述溶液中，混合溶液在氮气保护下室温搅拌12小时后，经过高效液相色谱分离提纯，得到第二种纯化合物，命名为化合物B；
第三步，将0.4毫摩尔(112.6毫克)化合物B溶解于1毫升无水四氢呋喃中，加入2毫摩尔(224.5微升)4-甲基吗啉，将混合溶液冷却至0℃后加入0.4毫摩尔(54.2微升)氯甲酸异丁酯，在0℃下搅拌1小时；将0.48毫摩尔(84毫克)2-氰基-6-氨基苯并噻唑(CBT)溶解于3毫升无水四氢呋喃中，并用注射器加入上述反应混合液中，在0℃下继续搅拌2小时，然后于室温下搅拌过夜，经过高效液相色谱分离提纯后，得到第三种纯化合物，命名为化合物C；
第四步，将0.2毫摩尔(97.3毫克)化合物C溶解于20毫升含95％体积浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，加入200微升三异丙基硅烷，室温下搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯后，即可得到本实施例中的终产物，第四种纯化合物前药D-2。
采用赛默飞公司生产的Finnigan LCQ先进离子捕获质谱仪对纯化合物A、B、C和前药D-2进行电喷雾离子质谱数据采集分别得到如图1、图4、图7和图10的质谱图；采用德国布鲁克公司(bruker)布鲁克核磁软件解析纯化合物A、B、C和前药D-2得到如图2、图3、图5、图6、图8和图9所示的核磁共振谱图：
图1是本实施例中合成的第一种纯化合物A的质谱图；图2是第一种纯化合物A的核磁共振氢谱图；图3是第一种纯化合物A的核磁共振碳谱图。由图1可见，第一种纯化合物A的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)+]:m/z 172.06；由图2可见，第一种纯化合物A的核磁共振氢谱(d4-甲醇,400MHz)δ(ppm):8.39(d,J＝4.3Hz,1H),7.89(d,J＝8.1Hz,1H),7.87–7.80(m,1H),7.24(ddd,J＝7.2,5.0,1.1Hz,1H),2.83(q,J＝7.3Hz,2H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H)；由图3可见第一种化合物A的核磁共振碳谱(d4-甲醇,75MHz)δ(ppm):162.71(1C),150.97(1C),140.47(1C),123.34(1C),122.27(1C),34.79(1C),15.54(1C)。
图4是本实施例中合成的第二种纯化合物B的质谱图；图5是第二种纯化合物B的核磁共振氢谱图；图6是第二种纯化合物B的核磁共振碳谱图。由图4可见，第二种纯化合物B的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(2M+H)+]:m/z 562.50；由图5可见，第二种纯化合物B的核磁共振氢谱(d3-乙腈,300MHz)δ(ppm):5.73(d,J＝7.0Hz,1H),4.39(td,J＝8.4,4.6Hz,1H),3.17(dd,J＝13.9,4.4Hz,1H),2.95(dd,J＝13.8,8.8Hz,1H),2.73(q,J＝7.3Hz,2H),1.41(s,9H),1.28(t,J＝7.3Hz,3H)；由图6可见第二种化合物B的核磁共振碳谱(d3-乙腈,75MHz)δ(ppm):171.33(1C),155.17(1C),79.03(1C),52.45(1C),39.86(1C),31.86(1C),27.20(3C),13.39(1C)。
图7是本实施例中合成的第三种纯化合物C的质谱图；图8是第三种纯化合物C的核磁共振氢谱图；图9是第三种纯化合物C的核磁共振碳谱图。由图7可见，第三种纯化合物C的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)+]:m/z 438.67；由图8可见，第三种纯化合物C的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜,400MHz)δ(ppm):10.67(s,1H),8.76(s,1H),8.21(d,J＝9.0Hz,1H),7.81(d,J＝8.8Hz,1H),7.38(d,J＝7.7Hz,1H),4.42(d,J＝4.9Hz,1H),3.14(dd,J＝13.2,4.6Hz,1H),3.03–2.93(m,1H),2.75(dd,J＝14.3,7.1Hz,2H),1.40(s,9H),1.24(t,J＝7.0Hz,3H)；由图9可见第三种化合物C的核磁共振碳谱(d6-二甲亚砜,100MHz)δ(ppm):169.88(1C),155.24(1C),147.75(1C),139.22(1C),136.56(1C),135.12(1C),124.69(1C),121.01(1C),113.48(1C),111.71(1C),78.45(1C),54.66(1C),40.57(1C),31.55(1C),28.10(1C),14.13(1C)。
图10是本实施例中合成的第四种纯化合物前药D-2的质谱图；图11是第四种纯化合物前药D-2的核磁共振氢谱图；图12是第四种纯化合物D-2的核磁共振碳谱图。由图10可见，第四种纯化合物前药D-2的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)+]:m/z 338.88；由图11可见，第四种纯化合物前药D-2的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜,400MHz)δ(ppm):11.24(s,1H),8.69(d,J＝1.9Hz,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.79(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),4.29(t,J＝6.3Hz,1H),3.27(qd,J＝14.3,6.4Hz,2H),2.72(q,J＝7.3Hz,2H),1.19(t,J＝7.3Hz,3H)；由图12可见第四种化合物前药D-2的核磁共振碳谱(d6-二甲亚砜,100MHz)δ(ppm):168.88(1C),150.84(1C),141.02(1C),139.31(1C),138.53(1C),127.68(1C),123.71(1C),116.14(1C),114.91(1C),55.08(1C),41.23(1C),33.95(1C),16.70(1C)。
实施例2：纯化合物D、E和前药Pro-D-2的合成
本实施例主要介绍了可选择性杀死氟林酶高表达的癌细胞的第七种化合物前药Pro-D-2的合成方法，具体分三步合成，前两步分别得到第五种纯化合物D和第六种纯化合物E，其中第五种纯化合物D(Ac-Arg(Pbf)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH)采用固相合成法合成，Pro-D-2合成路线如下：
第一步，固相合成第五种纯化合物D：将0.7克2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀30分钟后，加入0.95毫摩尔(616毫克)N-芴甲氧羰基-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)，再加入1.2毫摩尔(200微升)N，N-二异丙基乙胺，反应6-8小时后，用200微升甲醇反应30分钟，去除反应溶液，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入活化的0.8毫摩尔(519毫克)第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)反应6-8小时，去除反应溶液，凯氏测试显黄色，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入活化的0.8毫摩尔(218毫克)第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸反应6-8小时，去除反应溶液，凯氏测试显黄色，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去丙氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入活化的0.8毫摩尔(519毫克)第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)反应6-8小时，去除反应溶液，凯氏测试显黄色，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入400微升醋酸酐和1.2毫摩尔(200微升)N，N-二异丙基乙胺，反应3小时，凯氏测试显黄色；最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，使用高效液相色谱纯化后得到本发明中第五种纯化合物，命名为化合物D；
第二步，将0.12毫摩尔(161.2毫克)化合物D，0.097毫摩尔化合物D-2(32.9毫克)，0.14毫摩尔1-羟基苯并三唑(19毫克)和0.14毫摩尔(53.2毫克)苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐的混合物溶解于1毫升N，N-二甲基甲酰胺，加入0.15毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应液在室温下搅拌12小时，经过高效液相色谱分离提纯后，得到第六种纯化合物，命名为化合物E；
第三步0.06毫摩尔(100.9毫克)化合物E溶解在20毫升含95％体积浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，加入200微升三异丙基硅烷，室温下搅拌反应3小时后，经过高效液相色谱分离提纯，即可得到本实施列的目标产物，第七种纯化合物前药Pro-D-2。
采用赛默飞公司生产的Finnigan LCQ先进离子捕获质谱仪对纯化合物D、E和前药Pro-D-2进行电喷雾离子质谱数据采集分别得到如图13、图14和图15的质谱图；采用德国布鲁克公司(bruker)布鲁克核磁软件解析纯化合物前药Pro-D-2得到如图16和图17所示的核磁共振谱图：
图13是本发明中合成的第五种纯化合物D的质谱图；图14是本发明中合成的第六种纯化合物E的质谱图；图15是本发明中合成的第七种纯化合物前药Pro-D-2的质谱图；图16是本发明中合成的第七种纯化合物前药Pro-D-2的核磁共振氢谱图；图17是本发明中合成的第七种纯化合物前药Pro-D-2的核磁共振碳谱图。由图13可见，第五种纯化合物D的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)+]:m/z 1384.64；由图14可见，第六种纯化合物E的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)+]:m/z 1705.68；由图15可见，第七种纯化合物前药Pro-D-2的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+3H)3+/3]:m/z 316.81158。由图16可见，第七种纯化合物前药Pro-D-2的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜,300MHz)δ(ppm):10.68(s,1H),8.74(d,J＝1.8Hz,1H),8.51(d,J＝7.4Hz,1H),8.19(dd,J＝19.3,8.4Hz,3H),8.05(d,J＝7.3Hz,1H),7.82(dd,J＝9.1,1.9Hz,1H),7.69(d,J＝5.3Hz,1H),4.69(dd,J＝13.7,7.7Hz,1H),4.28(td,J＝12.4,5.3Hz,3H),4.23–4.14(m,1H),3.22(dd,J＝13.4,5.5Hz,1H),3.03(dd,J＝14.0,9.0Hz,7H),2.73(q,J＝7.3Hz,2H),1.97(dq,J＝13.4,6.5Hz,1H),1.87(s,3H),1.67(d,J＝7.2Hz,3H),1.49(d,J＝3.7Hz,9H),1.22(t,J＝7.3Hz,3H),0.83(dd,J＝10.0,6.8Hz,6H)；由图17可见第七种纯化合物前药Pro-D-2的核磁共振碳谱(d4-甲醇,100MHz)δ(ppm):174.61(1C),174.35(1C),174.14(1C),173.77(1C),173.73(1C),171.19(1C),158.64(2C),158.51(1C),150.07(1C),140.31(1C),137.94(1C),137.02(1C),125.95(1C),122.77(1C),114.06(1C),113.17(1C),60.28(1C),55.42(1C),54.72(2C),54.13(1C),41.96(1C),41.93(1C),33.20(1C),31.89(1C),30.32(1C),29.92(1C),29.76(1C),29.50(1C),26.47(1C),26.34(1C),26.03(1C),22.46(1C),19.79(1C),18.79(1C),14.76(1C),9.16(1C)。
实施例3：由前药D-2制备纳米药物及纳米药物形貌表征实验
本实施例中按照如下方法制备抗癌超分子纳米药物：将30毫克前药D-2溶于887.6微升二甲基亚砜中制得浓度为100毫摩尔/升的D-2储备液；取1微升浓度为100毫摩尔/升的D-2储备液，用pH为7.4、浓度为10毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至500微升，则得到终浓度为200微摩尔/升的D-2溶液；再加入2.5微升浓度为400毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽水溶液，振荡溶液使之混合均匀，并用1摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为7.4，在37℃下孵育1小时至溶液浑浊，即制得抗癌超分子纳米药物。
图18为本实施例中前药D-2形成纳米药物前后的光学照片对比图；图19为本实施例中纳米药物的透射电镜图。图18给出的对比光学照片中a瓶为第四种纯化合物前药D-2形成纳米药物前的光学照片，表现为澄清透明的溶液；b瓶为D-2转化为纳米药物之后的光学照片，表现为浑浊的非均相溶液。图19为对该浑浊溶液进行进一步的透射电镜表征，发现该浑浊液中确实形成了粒径为57.36±12.85纳米的纳米粒子。表明经过还原型谷胱甘肽作用，我们确实能得到纳米药物。
实施例4：前药D-2在人宫颈癌细胞内形成纳米粒子的实验
本实施例主要给出了第四种纯化合物前药D-2在人宫颈癌细胞(HeLa)中形成纳米粒子的实验。具体步骤按如下进行：将HeLa细胞以每皿七百万个的密度种植于10厘米细胞培养皿中，并在37℃，5％CO2浓度下培养12个小时让细胞贴壁生长。接着，将培养基吸出，并将细胞用PBS溶液清洗两遍，加入9毫升前药D-2浓度为80微摩尔/升的培养基。将细胞在37℃，5％CO2浓度下继续培养6小时，将培养基吸出，并用PBS溶液将细胞洗涤3遍，用2毫升胰酶消化液消化一分钟后，将细胞收集到2毫升离心管中，在800转/分下离心5分钟，弃去上清液。然后在离心管中加满电镜固定液，将细胞在室温下固定2小时。然后将细胞用乙醇脱水并用环氧树脂固定，切成约80纳米厚的薄片，并负载到铜网上，用饱和醋酸铀染色15分钟和柠檬酸铅染色5分钟后，将样品置于透射电镜下进行观察。
图20是被前药D-2处理了6小时的HeLa细胞的透射电镜图，图21是图22中白色方框部分的放大图，图22是未被前药D-2处理的HeLa细胞的透射电镜图。由图20和图21可以看到，前药D-2在HeLa细胞中形成了大量的纳米粒子，而图22中未被前药D-2处理的HeLa细胞则几乎没有纳米粒子。对比图20和图22，可以看到图c中的细胞核有明显的皱缩，说明细胞状态为非良好。这些结果说明前药D-2在活的HeLa细胞中能形成纳米粒子，并对细胞产生毒性。
实施例5：前药D-2对多种常见癌细胞的毒性实验
本实施例主要给出了第四种纯化合物前药D-2对多种常见癌细胞的毒性实验，并将其与临床癌症化疗药物顺铂(cisplatin)相比，说明本发明中的前药D-2的抗癌活性。本实施例中前药D-2和顺铂的抗癌活性通过3-(4,5-二甲基-噻吩)-2,5-二苯基溴化四氮噻唑蓝(MTT)法检测，具体按照如下步骤进行：将几种常见的肿瘤细胞，人宫颈癌细胞(HeLa)，人肝癌细胞(HepG 2)，人结肠癌细胞系(LoVo)，和人肺癌细胞(A549)以及人正常肝细胞(L02)按照每孔5000个细胞的密度种植于96孔板中，并在37℃，5％CO2浓度下培养24小时。接着，将96孔板中的正常培养基吸出，向每孔加入100微升含第四种纯化合物前药D-2或临床抗癌药物顺铂的培养基，药物浓度设定为2.5微摩尔/升，5微摩尔/升，10微摩尔/升，20微摩尔/升，40微摩尔/升，80微摩尔/升或160微摩尔/升。然后将细胞置于37℃，5％CO2浓度下培养24小时，再向每孔加入10微升质量浓度为5％的MTT/PBS溶液，继续将细胞置于37℃，5％CO2浓度下培养。4小时后，吸出96孔板中的液体，加入100微升二甲亚砜，使细胞中生成的甲臜充分溶解，再用酶标仪测试其在490纳米处的吸光值。按照如下公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(样品吸光值-背景吸光值)/(参比吸光值-背景吸光值)×100％。
图23为顺铂对上述细胞系作用24小时后的毒性测试结果，点线图c，d，e，f和g分别为顺铂对HeLa细胞，HepG 2细胞，LoVo细胞，A549细胞和L02细胞作用24小时后的毒性结果。顺铂对HeLa细胞，HepG 2细胞，LoVo细胞，A549细胞和L02细胞作用24小时后的半抑制浓度(IC50)值分别为18.6±2.3微摩尔/升，44.0±6.9微摩尔/升，67.5±6.2微摩尔/升，95.9±25.1微摩尔/升和66.0±5.7微摩尔/升。由点线图c-f可以看出，顺铂对四种癌细胞系均有较强的毒性，其中对HeLa细胞的毒性最强，但是由点线图g可以看出，顺铂对人正常肝细胞L02细胞同样具有很强的毒性，尤其当顺铂浓度达到160微摩尔/升时，L02细胞的存活率明显低于LoVo细胞和A549细胞。由此可见顺铂虽然有着良好的抗癌活性但是对正常细胞也会有非常大的损伤。图24为第四种纯化合物前药D-2对上述细胞系在24小时的毒性测试结果，点线图h，i，j，k和l分别为前药D-2对HeLa细胞，HepG 2细胞，LoVo细胞，A549细胞和L02细胞作用24小时后的毒性结果。前药D-2对HeLa细胞，HepG 2细胞，LoVo细胞，A549细胞和L02细胞作用24小时后的半抑制浓度(IC50)值分别为21.8±2.9微摩尔/升，42.3±6.3微摩尔/升，59.3±5.4微摩尔/升，58.6±9.5微摩尔/升，113.7±12.2微摩尔/升。由点线图h-k可以看出，当D-2浓度大于20微摩尔/升后其对四种癌细胞均有较强毒性，其中对HeLa细胞的毒性最强。而对于L02细胞，由点线图l可以看到只有当D-2浓度到达80微摩尔/升后，细胞存活率才明显下降。同时，对比图23和图24，可以看到，和顺铂相比，对于相同的癌细胞系，D-2均展示出可比的甚至更低的IC50值，说明D-2同样具有良好的抗癌活性。上述实验结果说明第四种纯化合物前药D-2能在杀死癌细胞的同时对正常细胞产生较小的损害作用，有望成为临床癌症化疗新药物。
实施例6：前药Pro-D-2对氟林酶高表达癌细胞的选择性毒性实验
本实施例主要介绍了第七种纯化合物前药Pro-D-2对氟林酶高表达癌细胞的选择性毒性实验，并将其与未修饰氟林酶特异性剪切肽段的第四种纯化合物前药D-2相比，说明本发明中的前药Pro-D-2对氟林酶高表达癌细胞有选择性抗癌活性。本实施例中选择了氟林酶高表达的人乳腺癌癌细胞(MDA-MB-468)和氟林酶低表达的人结肠癌细胞(LoVo)进行实验，并用3-(4,5-二甲基-噻吩)-2,5-二苯基溴化四氮噻唑蓝(MTT)法检测Pro-D-2和D-2对这两种细胞系的抗癌活性。具体按如下步骤进行：将MDA-MB-468细胞和LoVo细胞按照每孔5000个细胞的密度种植于96孔板中，并在37℃，5％CO2浓度下培养24小时。接着，将96孔板中的培养基吸出，向每孔加入100微升含第四种纯化合物前药D-2或第七种纯化合物前药Pro-D-2的培养基，药物浓度设定为5微摩尔/升，10微摩尔/升，20微摩尔/升，40微摩尔/升，80微摩尔/升，160微摩尔/升或320微摩尔/升。然后将细胞置于37℃，5％CO2浓度下继续培养48小时，再向每孔中加入10微升质量浓度为5％的MTT/PBS溶液，继续将细胞置于37℃，5％CO2浓度下培养。4小时后，吸出96孔板中的液体，并加入100微升二甲亚砜，使细胞中生成的甲臜充分溶解，再用酶标仪测试其在490纳米处的吸光值。按照如下公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(样品吸光值-背景吸光值)/(参比吸光值-背景吸光值)×100％。
图25是第四种纯化合物前药D-2和第七种纯化合物前药Pro-D-2对上述两种细胞系作用48小时后的毒性测试结果。点线图m和n为第四种纯化合物前药D-2对MDA-MB-468细胞和LoVo细胞作用48小时后的毒性结果，其半抑制浓度(IC50)值分别为26.0±3.2微摩尔/升和35.9±2.3微摩尔/升；点线图o和p分别为第七种纯化合物前药Pro-D-2对MDA-MB-468细胞和LoVo细胞作用48小时后的毒性结果，其半抑制浓度(IC50)值分别为67.5±6.9微摩尔/升和220.0±36.8微摩尔/升。IC50值的结果表明，D-2对MDA-MB-468细胞和LoVo细胞的都有着较强的毒性，但两者的IC50值只存在约9微摩尔/升的差值，说明D-2对MDA-MB-468细胞和LoVo细胞的选择性较差。相比较而言，虽然Pro-D-2对MDA-MB-468细胞的抗癌活性和D-2对MDA-MB-468细胞的抗癌活性相比有所减弱，但是Pro-D-2对MDA-MB-468细胞和LoVo细胞作用48小时后的IC50值存在152.5微摩尔/升的差距，相比D-2大大提高。同时，由点线图o可以看出，当Pro-D-2浓度达到40微摩尔/升时，即会对MDA-MB-468细胞产生很强的毒性；而由点线图p可以看出，只有当Pro-D-2浓度达到160微摩尔/升时，其才会对LoVo细胞表现出可观的抗癌活性。以上结果说明Pro-D-2能选择性杀死氟林酶高表达的MDA-MB-468细胞。
通过上述实施例及其实验结果可知：本发明中可杀死多种癌细胞的前药D-2，以及可选择性杀死氟林酶高表达的癌细胞的前药Pro-D-2均可通过简单的有机合成得到，制备较为容易。超分子纳米药物的获得也能简单地通过向D-2中加入还原剂GSH并在37℃下进行孵育实现。同时透射电镜结果表明，D-2确实能在癌细胞内形成纳米粒子。D-2对多种常见癌细胞以及正常细胞的抗癌活性检测结果很好地说明了D-2可以杀死多种癌细胞且不损伤正常细胞。Pro-D-2对MDA-MB-468细胞和LoVo细胞的抗癌活性检测结果也充分表明Pro-D-2可以选择性地杀死氟林酶高表达的MDA-MB-468细胞而对氟林酶低表达的细胞如实施例6中的LoVo细胞产生较小毒性。综上，本发明提出可在癌细胞内发生苯并噻唑氰与半胱氨酸间的点击反应形成纳米结构杀死癌细胞的小分子前体药物，其制备简单，且小分子前药D-2可以杀死癌多种细胞且不损伤正常细胞，通过修饰氟林酶特异性剪切肽段制备的前药Pro-D-2可以特异性地杀死氟林酶高表达的癌细胞，说明苯并噻唑-半胱氨酸点击反应触发的纳米药物形成在癌症治疗方面具有潜在的应用价值，有望作为一种化疗新手段。本发明填补了利用点击反应触发无毒小分子前药原位形成抗癌纳米药物的空白，为获得安全高效、副作用小的临床癌症化疗新方法提供了新机会。

Claims (7)

1.一种可在癌细胞内发生苯并噻唑氰与半胱氨酸间点击反应形成纳米结构杀死癌细胞并不损伤正常细胞的小分子前体药物D-2的制备方法，其特征在于：
第一步，将7.2毫摩尔2,2’-二硫二吡啶溶于3毫升脱气甲醇，在氮气保护下逐滴加入4.8毫摩尔溶解于8毫升脱气甲醇的乙硫醇溶液，将混合溶液在氮气保护下室温搅拌过夜，用旋转蒸发仪去除甲醇后，用高效液相色谱分离提纯，得到第一种纯化合物A；
第二步，将两口烧瓶反复抽真空通氮气三次以去除烧瓶中的氧气，将1.3毫摩尔化合物A溶解于2毫升脱气N，N-二甲基甲酰胺溶液，在氮气保护下加入烧瓶中；将1.2毫摩尔N-叔丁氧羰基-D型半胱氨酸溶解于1.4毫升脱气N，N-二甲基甲酰胺，在氮气保护下逐滴加入上述溶液中，混合溶液在氮气保护下室温搅拌12小时后，经过高效液相色谱分离提纯，得到第二种纯化合物B；
第三步，将0.4毫摩尔化合物B溶解于1毫升无水四氢呋喃中，加入2毫摩尔4-甲基吗啉，将混合溶液冷却至0℃后加入0.4毫摩尔氯甲酸异丁酯，在0℃下搅拌1小时；将0.48毫摩尔2-氰基-6-氨基苯并噻唑溶解于3毫升无水四氢呋喃中，并用注射器加入上述反应混合液中，在0℃下继续搅拌2小时，然后于室温下搅拌过夜，经过高效液相色谱分离提纯后，得到第三种纯化合物C；
第四步，将0.2毫摩尔化合物C溶解于20毫升含95％体积浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，加入200微升三异丙基硅烷，室温下搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯后，即可得到第四种纯化合物前药D-2。
2.一种权利要求1所述方法制备的第三种纯化合物C，其特征在于结构为：
3.一种权利要求1所述方法制备的第四种纯化合物前药D-2，其特征在于结构为：
4.一种以权利要求1所述方法制备的抗癌前药即第四种纯化合物前药D-2制得的抗癌超分子纳米药物，其特征在于按照如下方法制得纳米粒子：将30毫克前药D-2溶于887.6微升二甲基亚砜中制得浓度为100毫摩尔/升的D-2储备液；取1微升浓度为100毫摩尔/升的D-2储备液，用pH为7.4、浓度为10毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液稀释至500微升，则得到终浓度为200微摩尔/升的D-2溶液；再加入2.5微升浓度为400毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽水溶液，振荡溶液使之混合均匀，并用1摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为7.4，在37℃下孵育1小时至溶液浑浊，即制得抗癌超分子纳米药物。
5.一种细胞内形成纳米结构可用于选择性杀死氟林酶高表达的癌细胞的前药Pro-D-2的制备方法，其特征在于：
第一步，合成一段寡肽：将0.7克2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀30分钟后，加入0.95毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-精氨酸，再加入1.2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应6-8小时后，用200微升甲醇反应30分钟，去除反应溶液，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入活化的0.8毫摩尔第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-精氨酸反应6-8小时，去除反应溶液，凯氏测试显黄色，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入活化的0.8毫摩尔第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸反应6-8小时，去除反应溶液，凯氏测试显黄色，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去丙氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入活化的0.8毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-精氨酸反应6-8小时，去除反应溶液，凯氏测试显黄色，加入3毫升含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，反应15分钟切去精氨酸的保护基9-芴甲氧羰基；凯氏测试显蓝色，加入400微升醋酸酐和1.2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应3小时，凯氏测试显黄色，最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，使用高效液相色谱纯化后得到第五种纯化合物D；
第二步，将0.12毫摩尔化合物D，0.097毫摩尔化合物D-2，0.14毫摩尔1-羟基苯并三唑和0.14毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐的混合物溶解于1毫升N，N-二甲基甲酰胺，加入0.15毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应液在室温下搅拌12小时后，经过高效液相色谱分离提纯后，得到第六种纯化合物E；
第三步0.06毫摩尔化合物E溶解在20毫升含95％体积浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，加入200微升三异丙基硅烷，室温下搅拌反应3小时后，经过高效液相色谱分离提纯，即可得到第七种纯化合物前药Pro-D-2。
6.一种权利要求5所述方法制备的第六种纯化合物E，其特征在于结构为：
7.一种权利要求5所述方法制备的第七种纯化合物前药Pro-D-2，其特征在于结构为：
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