CN109813685B - 一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法 - Google Patents

一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面；废水样品加入：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化；细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。本发明分析单细菌的纳米振动行为。观察加入样品后细菌振动衰减情况，快速监测废水急性毒性信息。相比传统方法，本发明速度快、抗干扰性强。分析结果不易受溶液色度、盐度、硬度的影响，结果准确。

Description

一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像 方法
技术领域
本发明涉及环境技术领域，尤其是涉及一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子机械振动成像方法。
背景技术
频繁发生的水污染事故严重影响着人们的用水安全，威胁着流域生态环境。而急性毒性作为废水毒理学分析的重要指标，也具有极其重要的实际意义。传统的急性毒性分析方法包括藻类生长抑制法、溞类活动抑制法、种子发芽根伸长毒性实验法等等。然而这些方法需要使用模式动植物，实验耗时较长，并且操作复杂，难以满足人们对于水质毒性的实时在线监测与事故早期预警的需求。
较之模式动植物，微生物生长繁殖速度快，吸收转化效率高，是急性毒性分析的理想测试物种。目前利用细菌的急性毒性分析方法主要有发光细菌法与生物电化学系统法。发光细菌法将明亮发光杆菌或基因工程菌株等特定发光细菌置于测试废水之中，通过细菌发光强度的衰减程度来判断测试废水的毒性强弱。然而这种方法依赖于特定的发光、基因工程菌株，并且易受溶液色度、离子强度的影响，难以推广应用。
生物电化学系统法则利用异化金属还原菌的胞外电子传递行为，来监测生物电化学系统注入废水前后异化金属还原菌生物电流的强度改变。而这种方法同样依赖于特定的异化金属还原菌，并且分析结果易受溶液中氧化还原活性物质的干扰，灵敏度不佳、重复性较差，难以实现准确定量毒性分析。由此可见，目前的微生物急性毒性监测方法难以快速准确监测废水急性毒性，这为技术的改进留下了空间。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，本发明提供的方法快速、准确、灵敏。
本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：
A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面；
B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；
C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化；
D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
优选的，所述表面等离子体机械振动成像系统包括：沿光路方向依次设置的光源、光路方向控制系统、荧光激发滤光片高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、反射镜、分束器、CCD相机；
其中，样品池设置于所述表面等离子体共振传感芯片上；表面等离子体共振传感芯片设置于所述荧光激发滤光片高数值孔径物镜上；所述光路方向控制系统包括沿光路方向依次设置的透镜、偏振片和低通分束器。
优选的，所述表面等离子体共振光源为660nm的发光二极管；所述样品池材质为聚二甲基硅氧烷。
优选的，所述表面等离子体共振传感芯片为经磁控溅射在玻璃载玻片上依次镀铬层、镀金层，再经11-巯基-1-十一醇溶液浸泡修饰而成。
优选的，所述铬层的厚度为1.5～2nm；金层的厚度为45～47nm；所述11-巯基-1-十一醇溶液的浓度为1mM；所述浸泡时间为10～12h。
优选的，光路全内反射入射角为：调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
优选的，所述CCD相机采集参数为：采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧，采集频率为106.7Hz，曝光时间为5000μs。
优选的，步骤D)所述细菌毒性分析具体为：采用matlab代码提取单个细菌的表面等离子体共振强度信息值，根据消逝波在表面随垂直距离增加而指数衰减的特性，计算出细菌的垂直位置变化，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
优选的，所述毒理学模型包括Logistic模型。
优选的，所述细菌为Escherichia coli JM109；
所述细菌培养方法具体为：从细菌培养LB平板中挑取单克隆E.coli JM109菌落，接种进LB培养基中，在恒温摇床中35～37℃震荡培养10～12h,离心收取细菌菌体，并用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤，最后分散于1×磷酸盐缓冲溶液至细菌OD600值为0.2。
与现有技术相比，本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面；B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化；D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。本发明利用表面等离子体机械振动成像系统，单细菌的纳米振动可以被实时采集分析。通过观察系统中细菌在加入废水样品后振动的衰减情况，即可快速监测废水急性毒性信息。相比传统急性毒性分析方法，本发明具备速度快和抗干扰的优势。因为单细菌纳米机械振动传感依靠的是高频率的细菌纳米振动信息，不易受基质静态背景干扰，并且由于分析的是机械振动振动信息，分析结果不易受溶液色度、盐度、硬度的影响，结果准确。
附图说明
图1为表面等离子体纳米机械振动成像系统示意图(a)及细菌表面振动分析方法示意图(b)；(c)表面等离子体纳米机械振动成像系统记录的大肠杆菌界面振动行为；
图2为表面等离子体纳米机械振动成像系统的2,4-二氯苯酚毒性检测示例(a)，及2,4-二氯苯酚对大肠杆菌纳米振动的抑制及其剂量效应关系分析(b)；
图3为表面等离子体纳米机械振动成像系统毒性传感应用；(a)不同氯代苯酚毒性的大肠杆菌纳米振动分析；(b)农药废水对细菌纳米振动的抑制及其剂量效应关系分析(c)；
图4为本发明其中一个具体实施例所述的表面等离子体机械振动成像系统简图。
具体实施方式
本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：
A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面；
B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；
C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化；
D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
本发明提供的废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法首先为细菌表面固定步骤，即为首先将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面。
首先详细阐述表面等离子体机械振动成像系统，本发明所述表面等离子体机械振动成像系统包括：沿光路方向依次设置的光源、光路方向控制系统、荧光激发滤光片高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、反射镜、分束器、CCD相机；
其中，样品池设置于所述表面等离子体共振传感芯片上；表面等离子体共振传感芯片设置于所述高数值孔径物镜上；所述光路方向控制系统包括沿光路方向依次设置的透镜、偏振片和低通分束器。
具体依次包括沿光路方向依次设置的光源、透镜、偏振片、低通分束器、荧光激发滤光片高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、透镜、反射镜、低通分束器、CCD相机。
本发明其中一个具体实施例所述的表面等离子体机械振动成像系统如图4所示，其中1为明场光源；2为聚二甲基硅氧烷样品池；3为传感芯片；4为SPR图像采集CCD相机；5为明场图像采集CCD相机；6为反射镜；7为660nm发光二极管；8为透镜；9为偏振片；10为分束器；11为高数值孔径物镜镜头。此装置是本发明人由全内反射荧光显微镜改造得到。
本发明上述部件为本领域技术人员熟知的，本发明对此不进行特殊限定。
其中，本发明对于所述样品池的大小和形状不进行限定，圆形或立方体均可。所述样品池材质为聚二甲基硅氧烷。
所述光源为660nm的发光二极管；
本发明光路全内反射入射角为：调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。约为70°。
上述设置对细菌表面等离子体共振强度进行定量，优化了细菌表面等离子体共振成像的采集条件，方便追踪细菌振动的位置信息。
在本发明中，所述表面等离子体共振传感芯片为经磁控溅射在玻璃载玻片上依次镀铬层、镀金层，再经11-巯基-1-十一醇溶液浸泡修饰。
其中，本发明对所述磁控溅射的具体参数不进行限定，本领域技术人员熟知的即可，所述铬层的厚度为1.5～2nm；金层的厚度为45～47nm；所述11-巯基-1-十一醇溶液的浓度为1mM；所述浸泡时间为10～12h。
本发明对于所述玻璃载玻片的规格不进行限定，可以为22mm×22mm×0.1mm。
通过修饰可以增加金膜的亲水性，从而削弱细菌表面粘附的强度。还优化了细菌表面振动幅度以方便细菌振动统计。
本发明对将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中的具体方式不进行限定，直接注入即可，而后静置5～8min，使得细菌粘附于传感芯片表面。
本发明所述细菌包括但不限于中科院城市污染物转化重点实验室保藏的Escherichia coli JM109；
所述细菌培养方法优选具体为：从细菌培养LB平板中挑取单克隆E.coli JM109菌落，接种进LB培养基中，在恒温摇床中35～37℃震荡培养10～12h,离心收取细菌菌体，并用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤，最后分散于1×磷酸盐缓冲溶液至细菌OD600值为0.2。
而后是废水样品处理步骤，具体为：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；本发明对于所述加入方式不进行限定，直接注入即可，而后混合均匀。
而后为细菌振动分析步骤，即为采用CCD相机采集细菌等离子共振信号变化。
本发明为分析细菌的高速振动，CCD相机的采集频率优选为106.7Hz，曝光时间优选为5000μs。为得到可靠统计信息，采集帧数优选定位3000帧，结果中分析的是3000帧中细菌位置波动情况。
而后为细菌毒性分析步骤，具体为：根据成像得到单细菌等离子共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
所述细菌毒性分析具体为：采用matlab代码提取单个细菌的表面等离子体共振强度信息值，根据消逝波在表面随垂直距离增加而指数衰减的特性，计算出细菌的垂直位置变化，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
原理如下式：
Figure BDA0001974710980000061
上式中Iz为细菌在垂直位置z的表面等离子体共振强度值，L为消逝波衰减常数，I0为细菌在参考位置的强度值。
方法中利用细菌振动的标准差作为衡量细菌垂直位置振动的指标，并由此进行后续的计算。
本发明所述毒理学模型包括Logistic模型。
本发明中提出了细菌的纳米振动幅度这一生理指标，利用等离子体纳米机械振动传感系统实现了对废水毒性的快速监测。本发明拓宽了细菌纳米机械振动分析的实际应用，对于毒理学研究与水质快速评估具有重要的应用价值。相比传统急性毒性分析方法，本发明具备速度快和抗干扰的优势。因为单细菌纳米机械振动传感依靠的是高频率的细菌纳米振动信息，不易受基质静态背景干扰，并且由于分析的是机械振动信息，分析结果不易受溶液色度、盐度、硬度的影响。
本发明创造的表面等离子体机械机械振动成像系统与现有技术的表面等离子体共振仪的差别主要在本发明中的表面等离子体共振显微镜具有成像功能，可以得到实时成像结果，进而可以对单细菌进行力学分析(传统方法只能得到总体强度变化信息)。传统的急性毒性分析方法主要是基于生物发光抑制以及生长抑制，其测量受到受试物种与溶液色度、浊度的限制，并且操作繁琐，耗时较长。本方法基于单细菌受到毒物胁迫之后纳米振动幅度的改变，具有更高的灵敏度，并且操作较为简便。
本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面；B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化；D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。本发明利用表面等离子体机械振动成像系统，单细菌的纳米振动可以被实时采集分析。通过观察系统中细菌在加入废水样品后振动的衰减情况，即可快速监测废水急性毒性信息。相比传统急性毒性分析方法，本发明具备速度快和抗干扰的优势。因为单细菌纳米机械振动传感依靠的是高频率的细菌纳米振动信息，不易受基质静态背景干扰，并且由于分析的是机械振动信息，分析结果不易受溶液色度、盐度、硬度的影响，结果准确。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法进行详细描述。
实施例1表面等离子体机械振动成像系统
按照本发明所述组装表面等离子体机械振动成像系统，具体依次包括沿光路方向依次设置的光源、透镜、偏振片、低通分束器、荧光激发滤光片高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、透镜、反射镜、低通分束器、CCD相机。样品池设置于所述表面等离子体共振传感芯片上；表面等离子体共振传感芯片设置于所述荧光激发滤光片高数值孔径物镜上；
其中，光源为660nm的发光二极管；调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一；样品池材质为聚二甲基硅氧烷；表面等离子体共振传感芯片为经磁控溅射在22mm×22mm×0.1mm的玻璃载玻片上依次镀1.5～2nm铬层、镀47nm金层，再经1mM11-巯基-1-十一醇溶液浸泡修饰12h。
实施例2：2,4-二氯苯酚模拟废水急性毒性监测
(1)以1×磷酸盐缓冲溶液配置1g/L的2,4-二氯苯酚溶液，作为模拟废水储备液。
(2)调试本发明实施例1组装的表面等离子体机械振动成像系统，调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
(3)安装传感芯片于表面等离子体机械振动成像系统样品台，并在样品池中注入细菌悬液，静置5min，使部分细菌粘附于亲水基团修饰的传感芯片表面。
(4)用CCD相机记录粘附细菌的表面等离子体机械振动成像。采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧。
(5)注入2,4-二氯苯酚模拟废水，使得样品池内2,4-二氯苯酚终浓度为5mg/L。
(6)10min后，用CCD相机记录粘附细菌的表面等离子体机械振动成像。采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧。
(7)使用图像分析软件分析成像结果，获取单细菌表面等离子体机械振动成像强度。利用消逝波在近表面指数衰减的性质，将表面等离子体机械振动成像强度的波动转化为细菌垂直位置的振动。以此为基础分析细菌在该毒物剂量下的振动幅度特征。
(8)将步骤(5)中2,4-二氯苯酚终浓度改为10、50、100、200mg/L，重复(3)-(7)步，分别记录细菌在这些模拟废水剂量下的振动行为。
结果分析：
为了验证本专利的定量准确性，我们选用了模式毒物2,4-二氯苯酚配制模拟废水，进行了单细菌表面等离子体机械振动成像的急性毒性测试。测试结果如附图2所示。随着2,4-二氯苯酚施加剂量的增加，传感芯片上细菌纳米尺度振动的幅度明显下降，并在较高2,4-二氯苯酚浓度时达到稳定。其振幅中位值从未施加毒物时的3.5nm，下降到施加100mg/L2,4-二氯苯酚时的1.3nm(见附图2(a))。
细菌在不同浓度毒物添加后的振幅变化可以用Logistic模型较好拟合(R2＝0.998)，拟合得到2,4-二氯苯酚对于细菌纳米尺度振动的半数抑制浓度EC50＝4.82±0.48mg/L(见附图2(b))。此结果与前人采用传统方法实验测得的EC50数值(5.04mg/L)较为接近，表明本发明具有良好的准确性。
实施例3：不同氯代苯酚急性毒性强弱比较
(1)以1×磷酸盐缓冲溶液配置苯胺、苯酚、2-氯苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚的储备液。
(2)调试本发明实施例1组装的表面等离子体机械振动成像系统，调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
(3)安装传感芯片于表面等离子体机械振动成像系统样品台，并在样品池中注入E.coli JM109细菌悬液，静置5min，使部分细菌粘附于亲水基团修饰的传感芯片表面。
(4)用CCD相机记录粘附细菌的表面等离子体机械振动成像。采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧。
(5)注入含有苯酚的模拟废水，调节其终浓度至50mg/L。
(6)10min后，用CCD相机记录粘附细菌的表面等离子体机械振动成像。采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧。
(7)使用图像分析软件分析成像结果，获取单细菌表面等离子体机械振动成像强度。利用消逝波在近表面指数衰减的性质，将表面等离子体机械振动成像强度的波动转化为细菌垂直位置的振动。以此为基础分析细菌在该剂量苯酚胁迫下振幅特征。
(8)将步骤(5)中苯酚溶液换为苯胺、2-氯苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚溶液，重复(3)-(7)步，分别记录细菌在这些模拟废水剂量下的振动行为。
结果分析：
随着氯代基团数目的增加，氯代苯酚的毒性逐渐增强。为了验证本表面等离子体机械振动成像方法的灵敏度，我们选择了同浓度的苯酚、2-氯苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚以及与其结构类似的苯胺进行毒性测试。分析加入同浓度不同毒物模拟废水之后细菌的振动幅度，我们可以发现振幅由大到小顺序依次为：苯胺、苯酚、2-氯苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚。这反映出其毒性强度也是如此由小到大变化(见附图3(a))。该结果与之前实验、理论研究结果中，随着苯酚氯代原子个数增加其毒性增加的结果相一致，证明了本专利方法具有较好的灵敏度。
实施例4：实际农药废水的急性毒性快速分析
(1)取用江苏箭牌农化公司的农药废水，使用0.22μm醋酸纤维滤膜对农药废水进行过滤，并对废水进行常规水质指标测试。
(2)调试本发明实施例1组装的表面等离子体机械振动成像系统，调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
(3)安装传感芯片于表面等离子体机械振动成像系统样品台，并在样品池中注入细菌悬液，静置5min，使部分细菌粘附于亲水基团修饰的传感芯片表面。
(4)用CCD相机记录粘附细菌的表面等离子体机械振动成像。采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧。
(5)注入稀释后的农药废水，使得样品池内农药废水的稀释比例为200倍。
(6)静置10min后，用CCD相机记录粘附细菌的表面等离子体机械振动成像。采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧。
(7)使用图像分析软件成像结果，获取单细菌表面等离子体机械振动成像强度，利用消逝波在近表面指数衰减的性质，将表面等离子体机械振动成像强度的波动转化为细菌垂直位置的振动。以此为基础分析细菌在该毒物剂量下的振幅特征。
(8)将步骤(5)中农药废水稀释倍数改为50、10、5倍，重复(3)-(7)步，分别记录细菌在这些模拟废水剂量下的振动行为。
结果分析：
随着农业的快速发展，农化产业也发展迅猛。然而随之而来的农化废水问题也逐渐凸显。农化废水具有成分复杂、有机物种类多、浓度高的特点，是较难处理的工业废水。
为了验证本专利的抗干扰性与实用性，我们选用了江苏箭牌农化公司的农药废水进行了单细菌表面等离子体机械振动成像的急性毒性测试。该废水成分复杂，有机物浓度较高(CODCr＝19026mg/L)。其急性毒性测试结果如附图3(b)(c)所示。随着农药废水稀释倍数的减少，传感芯片上细菌纳米尺度振动的幅度明显下降。细菌在不同浓度毒物添加后的振幅变化可以用Logistic模型较好拟合。拟合得到该农药废水的半数抑制浓度EC50＝0.4±0.015％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：
A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面；
B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中；
C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化；
D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面等离子体机械振动成像系统包括：沿光路方向依次设置的光源、光路方向控制系统、高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、反射镜、分束器、CCD相机；
其中，样品池设置于所述表面等离子体共振传感芯片上；表面等离子体共振传感芯片设置于显微镜载物台上；所述光路方向控制系统包括沿光路方向依次设置的透镜、偏振片和低通分束器。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光源为660nm的发光二极管；所述样品池材质为聚二甲基硅氧烷。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表面等离子体共振传感芯片为经磁控溅射在玻璃载玻片上依次镀铬层、镀金层，再经11-巯基-1-十一醇溶液浸泡修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述铬层的厚度为1.5～2nm；金层的厚度为45～47nm；所述11-巯基-1-十一醇溶液的浓度为1mM；所述浸泡时间为10～12h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，光路全内反射入射角为：调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CCD相机采集参数为：采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧，采集频率为106.7Hz，曝光时间为5000μs。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D)所述细菌毒性分析具体为：采用matlab代码提取单个细菌的表面等离子体共振强度信息值，根据消逝波强度在表面随垂直距离增加而指数衰减的特性，计算出细菌的垂直位置变化，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毒理学模型包括Logistic模型。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌为Escherichia coliJM109；
所述细菌培养方法具体为：从细菌培养LB平板中挑取单克隆E.coliJM109菌落，加入LB培养基中，在恒温摇床中35～37℃震荡培养10～12h,离心收取细菌菌体，并用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤，最后分散于1×磷酸盐缓冲溶液至细菌OD600值为0.2。
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