CN109811047A - 用于检测川崎氏病的方法及套组以及用于治疗川崎氏病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用用于诊断及/或治疗川崎氏病的新颖生物标记的方法。本发明的新颖生物标记显示相对于没有川崎氏病个体，患有川崎氏病个体在部分CpG基因座的胞嘧啶甲基化状态有所改变。更提供包含特定用于部分CpG基因座的改变的胞嘧啶甲基化的至少一引子或试剂的套组以检测川崎氏病。

Description

用于检测川崎氏病的方法及套组以及用于治疗川崎氏病的 方法
相关申请的交互参照
本申请案主张2017年11月21日申请之美国申请案No.62/589,345之 效益，其公开内容于此并入作为参考。
技术领域
本发明涉及CpG双核酸苷的胞嘧啶低甲基化检测川崎氏病以及用于 治疗川崎氏病的方法。
背景技术
川崎氏病(KD)也称为未知病源学的黏膜皮肤淋巴结症候群，是影响小 型及中型尺寸两者的血管管壁(脉管炎)，特别是冠状动脉的急性孩童脉管炎症候 群。亚洲孩童的川崎氏病的发生率为美洲及欧洲孩童的10倍以上。
川崎氏病早期及最明显的症状为发烧至少5日。如果不及时治疗，将 导致严重的冠状动脉并发症，其包含冠状动脉扩张、瘘管形成、冠状动脉动脉 瘤(coronary arteryaneurysms,CAAs)以及心肌梗塞。在开始发烧的前面10天内成 功地检测川崎氏病，且接续高剂量静脉注射免疫球蛋白(IVIG)可使冠状动脉动脉 瘤的发生率从20～25％大幅地降低至3～5％。
根据美国心脏协会(American Heart Association,AHA)于2004年的诊断 基准，目前针对川崎氏病并没有决定性的实验室诊断测试，且川崎病的诊断大 多数为临床诊断。这些诊断基准包括发烧超过5日、两侧非化脓性结膜炎(bilateral nonsuppurativeconjunctivitis)、黏膜变化、手脚的硬结性血管性水肿(indurative angioedema of thehands and feet)、多形皮疹(dysmorphous skin rashes)以及直径大 于1.5cm的急性非化脓性颈部淋巴结肿大(acute nonpurulent cervical lymphadenopathy)。
然而，AHA针对川崎氏病的诊断基准与日本循环器学会针对川崎氏病 的指导方针略微不同，其使得川崎病的临床诊断复杂化。此外，传染性疾病， 像是葡萄球菌或链球菌的感染，可能会拟似川崎氏病。在受感染的孩童中，临 床医师难以精确地诊断川崎氏病且迅速地施予IVIG以防止冠状动脉疾病。
针对川崎氏病之经济且精确的实验室诊断测试的需求尚未被满足，而 本发明满足此需求与其他需求。
发明内容
在一实施例中，本发明公开一种用于在个体检测川崎氏病的方法，其 包含以下步骤：(a)自个体的样本中测定选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少一CpG双核酸苷的胞嘧啶甲基 化状态；以及(b)若与对照样本相比，该个体具有在步骤(a)中的至少一CpG双核 酸苷的胞嘧啶低甲基化，则识别该个体具有川崎氏病。
在另一实施例中，本发明公开一种用于检测个体中的川崎氏病的方 法，其包含以下步骤：(a)测定选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其组合的CpG 双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态；以及(b)测量铁调素的表现水平。
在另一实施例中，本发明提供用于治疗患有川崎氏病的个体的方法， 其包含：通过本文公开的方法是别患有川崎氏病的个体；以及施予川崎氏病的 治疗剂。
本发明也公开一种用于检测个体中的川崎氏病的套组，其包含特定用 于测定选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少一CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态的至少一引子或试剂。
也提供一种用于侦测个体中的川崎氏病的套组，其包含：(a)特定用 于测定下列CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态的至少一引子或试剂：SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2或其组合；以及(b)用于测量铁调素的表现水平的药剂。
也提供一种本文所述的套组用于侦测川崎氏病的用途。
本发明提供用于用于测定选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5的至少一CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化 状态的引子或试剂制造用于侦测个体中的川崎氏病的套组。
在此专利中所使用之用语「发明(invention)」、「该发明(the invention)」、 「此发明(this invention)」及「本发明(the present invention」」旨在大致代表本专 利之所有标的以及权利要求书。包含此些用语之论述应理解为非限制本文所述 标的或限制权利要求书之意思或范畴。由本专利所涵盖之本发明实施例是由权 利要求书所定义，而非此发明内容所定义。此发明内容是本发明各种态样的上 位概述且引介将进一步在下列实施方式说明之一些概念。此发明内容非旨在认 定所主张标的之关键或必要特征，亦非旨在用于独立地判断所主张标的之范畴。 标的应参照整个说明书、任何或所有图式及各权利要求之适当部分而理解。
本发明在一同阅览附图及下列详细说明下将变得更加显而易见。
附图说明
本发明的描述性实施例将参考以下图式于下文中详细地说明：
图1是描述使用Infinium HumanMethylation450BeadChip(Illumina, USA)分析18位发热的对照样本、18位IVIG治疗前的川崎氏病样本以及18位 IVIG治疗后的川崎氏病样本的下列CpG双核酸苷的相对甲基化水平的长条图： cg23677000(SEQ ID NO:1)、cg04085447(SEQ ID NO:2)、cg17907567(SEQ ID NO:3)、cg26283059(SEQ ID NO:4)、cg27273033(SEQ ID NO:5)、cg23063900(SEQ ID NO:6)、cg00029640(SEQ ID NO:7)、cg04668516(SEQ ID NO:8)、 cg18149657(SEQ ID NO:9)。「***」、「**」以及「*」分别代表p<0.001、p<0.01 以及p<0.05。
图2是描述使用靶向特异性Infinium HumanMethylation450BeadChip 分析113位发热的对照样本、92位IVIG治疗前的川崎氏病样本以及16位IVIG 治疗后的川崎氏病样本在cg23677000及cg04085447的CpG双核苷酸甲基化水 平的长条图。「***」代表p<0.001。
图3是描述使用ELISA的Bio-Plex系统分析非川崎氏病发热的对照组 (n＝113)以及92位IVIG治疗前的川崎氏病样本以及16位IVIG治疗后的川崎氏 病样本的血浆铁调素(hepcidin)水平的长条图。各点表示单一个体。「*」代表使 用非配对Student t检验P<0.05。
图4A及图4B分别是血浆铁调素水平与在cg23677000及cg04085447 的CpG双核苷酸甲基化水平的散点图，以证实血浆铁调素水平与DNA甲基化 水平为负相关(皮尔森的相关系数(Pearson’s correlation coefficient)(分别为N＝209 且p<0.001)。
具体实施方式
如本文所使用，冠词「一(a)」以及「一(an)」指称冠词的语法对象的 一个或一个以上(即，至少一个)。
用语「个体(subject)」可指称疑似患有川崎氏病的脊椎动物。个体包 括温血动物，诸如哺乳类，像是灵长类，且较佳地是人类。非人类的灵长类也 是个体。用语个体包括驯养动物，诸如猫、狗等，家畜(举例来说，牛、马、猪、 绵羊、山羊等)以及实验动物(举例来说，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。
如本文所使用的「样本(sample)」是指含有待检测材料的组成物，且 包含例如「生物样本(biological samples)」，其是指自例如人类或可能患有川崎氏 病的其他哺乳动物等的活体来源所获得的任意材料。生物样本可为任意形式， 其包含例如组织、细胞、细胞沉淀物、细胞萃取物、手术样本、生物检体或细 针穿刺的固体材料，或是其可为生物体液的形式，例如尿液、全血、血浆或血 清、或是自个体产生的任何其他体液样本，例如唾液。
应用于基因的用语「甲基化水平(methylation level)」是指存在于CpG 环境中的一个或多个胞嘧啶残基是否具有甲基化基团。甲基化水平也可指样本 中的在胞嘧啶的C5或N4位上具有或不具有甲基化基团的细胞部分。CpG双核 苷酸的甲基化可存在于非编码转录对照序列(例如，启动子、强化子等)或存在于 包含相关基因的插入子及外显子的编码序列中。
用语「低甲基化(hypomethylation)」是指相对于在正常对照DNA样本 中的对应CpG双核苷酸发现的5-mCyt的量，对应于测定DNA样本的DNA序 列中的一或多个CpG双核苷酸处的存在减少的平均甲基化状态。
用语CpG基因座(CpG locus)也称为CpG双核苷酸或CpG位点。
本文中的所有数字可理解为由「约(about)」修饰。如本文所使用的用 语「约」表示涵盖特定值±15％的变异。
用于诊断川崎氏病的方法
本发明部分基于识别特异性CpG双核苷酸的差异甲基化水平来预测 川崎氏病。本发明的部分实施例是关于诊断个体是否患有川崎氏病或发展成川 崎氏病的风险的方法，其包含下列步骤：a)使来自个体样本的基因组DNA与区 分表1所列的CpG双核苷酸的至少一试剂或一系列试剂接触，以及b)若个体水 平相对于无川崎氏病或对照样本具有表1所列的至少一CpG双核苷酸或基因座 的较低甲基化水平，则识别个体患有川崎氏病或有发展成川崎氏病的风险。
在另一实施例中，所述方法包含自个体获得生物样本；以及测定来自 个体样本中DNA区域内至少一胞嘧啶的甲基化水平，其中DNA区域与选自由 SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5所组成的群组的序列的至少为90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或包含选自由SEQ ID NO:1 至SEQ ID NO:5所组成的群组的序列。
表1、显示染色体位置、SEQ ID NO及DNA序列
*「基因座(CpG loci)」列为由甲基化的Golden Gate and分析的参考编号.
在一实施例中，下列CpG基因座至少其一的甲基化水平降低(可由本 领域技术人员已知或本文阐述的方法确定)表示该个体患有川崎氏病或可能有发 展成川崎氏病的风险：cg23677000、cg04085447、cg17907567、cg26283059或 cg27273033。在另一实施例中，(藉由本文阐述的任何方法)可测定上述CpG基 因座至少其一的甲基化水平，以识别个体是否患有川崎氏病或可能有发展成川 崎氏病的风险。在部分实施例中，测量铁调素的水平。在一些实施例中，两个 或两个以上的CpG双核苷酸的甲基化水平及/或铁调素水平的测量提供用于川崎 氏病诊断的较高准确性、敏感性或特异性。
在一些实施例中，测定选自表1中识别的CpG基因座的DNA区域或 其部分(例如，至少一胞嘧啶残基)内的染色体DNA的甲基化水平。在一些实施 例中，还测定至少20、50、100、200、500或更多个CpG基因座的邻近碱基对 内的所有胞嘧啶的甲基化水平。例如，在一些实施例中，测定在cg23677000的 胞嘧啶的甲基化水平。
在本发明的一些实施例中，预定且接着标准化对照组或无川崎氏病的 CpG基因座的甲基化水平。通常，对照基因座具有已知且相对恒定的甲基化水 平。无川崎氏病或对照样本中预定的甲基化水平来自无川崎氏病个体的代表性 池(representative pool)，且其为无川崎氏病或对照样本中甲基化水平的平均值、 中位数或其他统计学操作或其他汇总或聚集代表性的甲基化水平。
较低甲基化水平或低甲基化为相对性用语且可通过比较测试川崎氏 病样本中的表1的CpG基因座的甲基化水平与参考对照水平的甲基化水平来测 定。在一些实施例中，测试样本中的表1的CpG基因座的甲基化水平低于无川 崎氏病或对照个体的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
侦测DNA的甲基化水平的任何方法可使用于本发明的方法。甲基化 水平侦测方法的非限制例包含甲基化敏感限制酶分析、通过用包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、焦亚硫酸盐(disulfite)、酸式亚硫酸盐(hydrogen sulfite)或其组合的试 剂处理手段的化学分析或焦磷酸测序(pyrosequencing)。
当亚硫酸氢钠与DNA接触时，未甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，并 且甲基化的胞嘧啶不被修饰。此额外的实施例包含基于阵列分析的使用，例如 HumanMethylation450BeadChip及多重PCR分析(multiplex PCR assays)。
定量扩增法(例如，定量PCR或定量线性扩增)可于限制性消化后使用 于定量通过扩增引子侧接的基因座内的完整DNA的量。定量扩增的方法公开于 例如美国专利号No.6,180,349；No 6,033,854；以及No 5,972,602。
额外的甲基化水平侦测方法包含但不限于核酸扩增、聚合酶链锁反应 (PCR)、甲基化特异性PCR(MCP)、甲基化CpG岛恢复分析(methylated-CpG island recovery assay,MIRA)、结合亚硫酸氢盐限制分析(combined bisulfite-restriction analysis,COBRA)、单股结构多形性(SSCP)分析、限制性分析及微阵列分析(Lian ZQ et al,screening ofsignificantly hypermethylated genes in breast cancer using microarray-basedmethylated-CpG island recovery assay and identification of their expressionlevels,International Journal of Oncology,41:629-638,2012)。
在实施例中，所述方法更包含测量血浆铁调素水平。血浆铁调素水平 的测量可使用本领域已知或本文公开的方法来达成，例如酶联免疫分析法 (ELISA)。在另一实施例中，所述方法更包含测量铁调素miRNA表现。铁调素 miRNA表现水平的测量是指定量样本中存在的miRNA量且可使用本领域已知 或本文公开的任意方法来达成，例如通过即时聚合酶链锁反应(real-time PCR)、 北方墨点分析或本领域技术人员公知的其他技术。铁调素miRNA表现水平的测 量包含测量成熟形式的miRNA或与miRNA表现相关的前驱物形式的表现。
在特定实施例中，至少一miRNA的水平是使用北方墨点分析侦测。 例如，总细胞RNA可通过在核酸萃取缓冲液的存在中均质化，接着离心而自细 胞纯化。沉淀核酸，且通过以DNase处理并沉淀而移除DNA。接着，RNA分 子根据标准技术通过琼脂糖凝胶的凝胶电泳分离，并转移至硝化纤维素滤器。 接着，将RNA通过加热在滤器上固定。特异性RNA的侦测及定量是使用与所 讨论的RNA互补的适当标记DNA或RNA试剂所完成。例如参照MolecularCloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook et al.,eds.,2nd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989,Chapter 7，其公开的全部内容于此并入作为参考。
在一些实施例中，定量RT-PCR使用于测量铁调素的miRNA。定量 RT-PCR(qRT-PCR)为用于快速测量定量的聚合酶链锁反应产物的量的修改的聚 合酶链锁反应。本领域已知的qRT-PCR方法有几种变异，其包括但不限于通过 琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green(双股DNA染料)的使用以及萤光报导试剂的使用。
在川崎氏病及非川崎氏病个体中的表1所列的至少一CpG基因座的差 异甲基化水平的测定允许以多种方式使用此讯息。例如，当以本文公开的方法 确认川崎氏病的诊断时，可以以治疗剂(例如，一剂或多剂的IVIG、阿司匹林、 抗TNF-α剂、皮质类固醇、环孢菌素(cyclosporin)、IL-1抑制剂(阿那白滞素 (anakinra)及卡纳单抗(canakinumab))、环磷酰胺(cyclophosphamide)、利妥昔单抗 (Rituximab)、托珠单抗(Tocilizumab)、己酮可可碱(Pentoxifylline)、血浆分离术 (plasmapheresis)或其组合)立即治疗个体。在另一实例中，可评估特定的治疗方 案(例如，用以确定治疗是否有效避免川崎氏病个体的冠状动脉并发症)。相似地， 诊断可通过将测试样本中的表1所列出的至少一CpG基因座的甲基化水平与来 自非川崎氏病样本的已知表现基因谱比较来进行或确认。此外，这些甲基化基 因谱允许筛选加强川崎氏病的甲基化表现的候选药物或将较差预后概况转换成 较佳预后概况。
用于诊断川崎氏病的套组
本发明也提供一种用于诊断川崎氏病的套组。该套组包含具体用于测 定选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少一CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态的至少一引子或试剂。
在一实施例中，用于检测甲基化水平的套组可包含与表1中识别的 CpG基因座的其一(或与表1的CpG基因座至少90％相同的核酸序列)杂交、或 与侧接表1中识别的CpG的其一的DNA区域杂交的至少一引子、以及选自亚 硫酸氢钠、甲基化敏感或甲基化依赖性限制酶或扩增(例如PCR)试剂的用于检测 甲基化的至少一试剂。所述套组可以适用于分析的分析设备的形式提供固体支 持物。所述套组还可包含用于川崎氏病诊断的可检测标记或指示。用于执行分 析的其他材料也可包含在套组中，其包含试管、移液吸管及其类似物。
在一些实施例中，理想为使用微阵列。微阵列是可对复杂的生化样本 进行平行分析的核酸、蛋白质、小分子、细胞或其他物质的微观有序阵列。微 阵列可使用包含用细尖针打印到载玻片上、使用预制遮罩的光蚀刻法 (photolithography)、使用动态微镜装置的光蚀刻法、墨喷式印刷或微电极阵列上 的电化学的各种技术来制造。
在一实施例中，微阵列包含用于测定表1中的至少一CpG基因座的甲 基化状态的特异性引子寡核苷酸。
本发明的实施例通过下列实例进行说明，其不以任何方式解释成强加 对其范畴的限制性。相反地，应当清楚地认知到本申请可具有各种其他实施例、 其修饰、以及其等效物，在阅读本文的描述之后，对于本领域技术人员而言可 建议该些实施例、修饰及等效物而不背离本发明的精神。在下列实例描述的研 究期间，除非另有说明，否则将遵照常规程序。以下仅为了说明性的目的而描 述一些程序。
在实例中所使用的材料及方法的描述
患者
来自台湾的高雄长庚纪念孩童医院的总共259位个体登记在此研究 中。，从被诊断出患有川崎病及无患有川崎病(或「FC」)的病患收集全血液样本。 透过内科医师诊断的临床川崎病被认为是本研究的黄金准则。FC是发烧超过5 日然并非患有川崎病的病患。其中，18位个体为发烧对照组(发烧但没有川崎氏 病)且剩下18位个体为自IVIG治疗之前及IVIG治疗3周后收集血液样本的川 崎氏病患者。发烧对照组的患者被诊断有上呼吸道感染或尿路感染。
实验设计
收集的全血样本进行白血球(WBC)富集，接着进行DNA分离。DNA 样本如Huang YHet al.(Oncotarget2017,8(7):11249-11258)所述的以亚硫酸氢盐 处理。
以Illumina M450K BeadChip进行的DNA甲基化基因谱
Illumina HumanMethylation450(M450K)BeadChip(Illumina,USA)使 用于进行DNA甲基化形式(methylation patterns)的全基因组筛选。根据制造商指 示，将200ng亚硫酸氢盐转换的基因组DNA施加于各M450K BeadChip分析。 计算在各样本中的各CpG双核苷酸的胞嘧啶的甲基化比例(β值)。
通过酶联免疫分析法(ELISA)测量铁调素
血浆铁调素水平使用ELISA套组(可自Bachem Bioscience,UK商业上 购得)测量。
通过焦磷酸测序验证DNA甲基化
基因组DNA(0.5μg)使用EZ DNA甲基化套组(Zymo Research,USA) 进行亚硫酸氢盐修饰并在20μl的Tris缓冲液(10mM)中洗提。聚合酶链锁反应 (PCR)在含有25ng的亚硫酸氢盐转换DNA、1X PyroMark PCR Master Mix (Qiagen，德国)及生物素化正向引子ATTTTTGTAGGTTGAGGGTGATATAATT 以及生物素化反向引子CCTCCCCTTTACTCTATCTCAT的25-μl反应混合物中 进行。使用下列PCR参数：于95℃进行5分钟，接着于95℃进行30秒后， 于52℃进行30秒，且于72℃进行30秒的45个循环，并在72℃进行5分钟 的最后延伸。扩增之后，纯化生物素化的PCR产物并与设计用以和感兴趣的CpG 位点相邻结合的定序引子TTTGTTTTAGTTTATTTT培养。焦磷酸测序使用 PyroMark Q24仪器(Qiagen)进行，随后以PyroMark Q24 1.010软件测定甲基化水 平的定量化。
统计分析
所有数据以平均±标准误差表示。使用Student’s t-test或one-way ANOVA分析定量数据。IVIG治疗之前及之后的数据使用配对的样本t-test分析。 所有统计分析利用Windows XP(SPSS,Inc.,Chicago,USA)的SPSS 22.0版本进 行，且双侧p值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
图1是显示发热对照样本与川崎氏病患者之间的下列CpG双核酸苷的 统计上显著的低甲基化：cg23677000、cg04085447、cg17907567、cg26283059 及cg27273033。
为了确保CpG双核苷酸的低甲基化足够强大以区分川崎氏病与非川 崎氏病患者，上述甲基化结果在具有92位IVIG治疗前的川崎氏病患者、16位 IVIG治疗后的川崎氏病患者以及113位发热对照组的个别患者群中通过焦磷酸 测序使用使用前2个CpG双核苷酸的靶向特异性测序来验证：cg23677000及 cg04085447图2是显示cg23677000及cg04085447的验证甲基化状态，其与发 热对照组相比，cg23677000及cg04085447在IVIG治疗前的川崎氏病患者显示 具有统计上显著的低甲基化(分别为P<0.001及<0.001)。图2进一步描述川崎氏 病患者的cg23677000及cg04085447的甲基化状态在IVIG治疗后显著地增加(分 别为P<0.001及<0.001)。甲基化分析的结果在甲基化阵列与焦磷酸测序之间一 致。
使用Bio-Plex系统通过ELISA测量非川崎氏病发热对照组(n＝113)与 IVIG治疗前(N＝92)及IVIG治疗后(N＝16)的川崎氏病患者的血浆铁调素水平。 图3显示与发热对照组相比，川崎氏病患者的血浆铁调素水平显著地较高。
图4A及图4B显示血浆铁调素水平与cg23677000及cg04085447的甲 基化状态呈负相关(分别为R＝-0.311，p<0.001且R＝-0.326，p<0.001)。
支持向量机(Support vector machines,SVM)分类模式
发展Kuo HC et al.(The Journal of allergy and clinical immunology2016, 138(4):1227-1230)的SVM分类模式以识别发热对照组与川崎氏病个体。cg23677000及cg04085447的甲基化比例与铁调素的血浆ELISA水平为用于 SVM分类模式的SVM载体。包含66位川崎氏病个体及74位发热对照个体的 模式作为训练集(training set)且26位川崎氏病个体及39位发热对照个体作为盲 测集(blind test set)。三个SMV载体的训练集基于5倍交叉验证策略用于训练 SVM模式。给定特定的参数(成本＝2且伽玛(γ)＝1)。自上述衍伸的川崎氏病特异 性SVM校准模式用于计算三个SVM载体的敏感性、特异性及准确性且结果显 示于表2。
表2、cg23677000及cg04085447的甲基化比例及铁调素的血浆ELISA 水平在川崎 氏病诊断中的敏感性、特异性及准确性
川崎氏病的生物标记 敏感性 特异性 准确性 P值
cg23677000 76.25％ 55.40％ 0.69 0.00015
cg04085447 65.00％ 82.43％ 0.78 0.00046
铁调素 77.5％ 81.08％ 0.88 6.78x 10<sup>-13</sup>
cg23677000+cg04085447 88.75％ 95.95％ 0.96
cg23677000+铁调素 96.25％ 98.65％ 0.99
cg04085447+铁调素 93.75 94.59％ 0.98
cg23677000+cg04085447+铁调素 100％ 100％ 1
序列表
<110> 长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院
<120> 用于诊断川崎氏病的方法及套组以及用于治疗川崎氏病的方法
<130> CGMFK-17002-TWI
<150> US62/589,345
<151> 2017-11-21
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tctgccggct gagggtgaca caaccctgtt ccctgtcgct ctgttcccgc ttatctctcc 60
cgccttttcg gcgccaccac cttcttggaa atgagacaga gcaaagggga gggggctcag 120
ac 122
<210> 2
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
agggtgacac aaccctgttc cctgtcgctc tgttcccgct tatctctccc gccttttcgg 60
cgccaccacc ttcttggaaa tgagacagag caaaggggag ggggctcaga ccaccgcctc 120
cc 122
<210> 3
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
gtcactcggt cccagacacc agagcaagct caagacccag cagtgggaca gccagacaga 60
cggcacgatg gcactgagct cccagatctg ggccgcttgc ctcctgctcc tcctcctcct 120
cg 122
<210> 4
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gctggcgagg aggaggagga gcaggaggca agcggcccag atctgggagc tcagtgccat 60
cgtgccgtct gtctggctgt cccactgctg ggtcttgagc ttgctctggt gtctgggacc 120
ga 122
<210> 5
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
acctcaagtg ggctgcctgc ctcaacctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac 60
cgtgcctgtc ctggttcctg ttcagctgcc agtactcctg agacgtcctg agctctgctc 120
ag 122
<210> 6
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
gatccctcct ttactctggg gggcgagggg accaggagcc ttagggcagg caccgcccac 60
cggcctccac cccagggatg actcccgagc cccatggctg ttggactttc tgcatgcaag 120
gg 122
<210> 7
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gaggccggcg tgggcggcgg cggctgcgtg gtggtggcgg gcgtcactgc cgggtgccct 60
cgcccaccat ctccaggttg tgctgctgca gctgggctcg aagcagggcg ttctcattct 120
tc 122
<210> 8
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
aacacagcag ggcacagcgg tatgctagac ctggctcaac atagcagacc atgcacatct 60
cgaaactctg cattcagtgg catcatgctg gtatcctgaa atcagcagca gtgggagtct 120
tg 122
<210> 9
<211> 122
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
acagggaaca gggttgtgtc accctcagcc ggcagaggtg tgttcagggg gtggggcaga 60
cggggtcaca gacacacact gctcaccagc catctgggga gccctttccc catcacgatg 120
tc 122

Claims (12)

1.一种用于诊断个体中的川崎氏病的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(a)自个体的样本测定选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少一CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态；以及
(b)若在步骤(a)中的至少一CpG双核酸苷的胞嘧啶甲基化低于对照样本或无川崎氏病样本，则识别所述个体患有川崎氏病。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，更包含测量铁调素的表现水平。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，铁调素的表现水平是通过ELISA或即时PCR来测量。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本是选自由生物检体、血液、血浆、血清、淋巴液、淋巴组织、脑脊液、骨髓、唾液及其组合所组成的群组。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定胞嘧啶甲基化状态的步骤包含使用选自由核酸扩增、聚合酶链锁反应(PCR)、甲基化特异性PCR(MCP)、甲基化CpG岛恢复分析(MIRA)、结合亚硫酸氢盐限制分析(COBRA)、焦磷酸测序、单股结构多形性(SSCP)分析、限制性分析及微阵列分析所组成的群组中的一或多种方法。
6.一种用于诊断川崎氏病的套组，其特征在于，包含特定用于测量选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少一CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态的至少一引子或试剂。
7.如权利要求6所述的套组，其特征在于，所述引子或所述试剂是使用于DNA聚合、DNA杂交过程或DNA亚硫酸氢盐转换过程。
8.如权利要求6所述的套组，其特征在于，所述引子或所述试剂是亚硫酸氢钠、甲基化敏感酶、甲基化依赖性限制酶或PCR试剂。
9.如权利要求6所述的套组，其特征在于，更包含用于测量铁调素的表现水平的药剂。
10.如权利要求6所述的套组，其特征在于，所述药剂为ELISA套组或即时PCR。
11.一种用于治疗个体中的川崎氏病的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(a)自个体的样本测定选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少一CpG双核苷酸的胞嘧啶甲基化状态；
(b)若在步骤(a)中的至少一CpG双核酸苷的胞嘧啶甲基化低于对照样本或无川崎氏病样本，则识别所述个体患有川崎氏病；以及
(c)以川崎氏病的治疗药剂治疗所述个体。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，更包含测量铁调素的表现水平。
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