CN109803976A - 含有n-杂环卡宾配体的钯(ii)配合物、合成、以及在癌症治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
描述了在生物硫醇的存在下稳定的钯(II)N‑杂环卡宾(NHC)配合物。代表性配合物[Pd(C^N^N)(N,N’‑nBu2NHC)](CF3SO3)(Pd1d,HC^N^N=6‑苯基‑2,2’‑联吡啶,N,N’‑nBu2NHC=N,N’‑二正丁基咪唑鎓)对癌细胞系表现出有效的杀伤活性,但是对正常的人成纤维细胞系的细胞毒性较小。
Description
技术领域
本文中描述了在生物硫醇的存在下稳定的钯(II)N-杂环卡宾(NHC)配合物,其对癌细胞系显示出有效的杀伤活性。
发明背景
除催化之外,人们越来越关注扩展钯配合物的应用范围,如功能性分子材料和有机电子学。在这方面,钯(II)配合物近来已经研究作为潜在的抗癌化疗剂。自20世纪80年代以来已经报道了钯配合物的抗增殖特性。大多数报道的钯(II)配合物显示出一定的DNA结合特性。但是,仅有少数钯(II)配合物表现出良好的体内抗癌活性。开发抗癌钯(II)配合物的主要挑战是它们对含硫生物分子如谷胱甘肽(GSH)不合意的高反应性以及在生理条件下容易发生取代反应,导致低体内稳定性和多种形态,这使得潜在的治疗应用变得复杂。
发明概述
抑制酶(如组蛋白脱乙酰酶、端粒酶、拓扑异构酶、硫氧还蛋白还原酶和蛋白激酶)的活性的金属配合物可以有效用于治疗癌症,包括具有耐药性的那些。本文中描述了生理上稳定的抗癌金属配合物,其有利于尽量减少影响生物活性和药代动力学性质的多种形态。通过引入强金属-碳键和多齿配体作为抑制金属配合物脱金属的有效途径,部分实现了所述优点。N-杂环卡宾(NHC)是强σ-供体配体,其可以与大多数过渡金属离子形成稳定的金属-卡宾键。此外,NHC本身相对无毒,并可以容易地制备NHC的通用结构。
与三齿钳形配体的螯合效应所提供的改善的稳定性一起,本文中描述了一系列含有NHC配体的抗癌环金属化钯(II)配合物[Pd(C^N^N)(NHC)]+,其在生物硫醇的存在下是稳定的。该钯(II)NHC配合物表现出体外细胞毒性,和体内抗癌活性。蛋白质组学和随后的生化分析显示该配合物诱导线粒体功能障碍并抑制促进表皮生长因子受体途径的癌症。
附图概述
图1显示了可以如下例示的作为抗癌药物的含有N-杂环卡宾(NHC)配体的环金属化钯(II)配合物的一系列化学结构。
图2显示了通过ICP-MS定量的钯的细胞摄取。HeLa、NCI-H1650和正常CCD-19Lu细胞用该钯配合物(5 µM)处理3小时。
图3显示了a)获自用Pd1d处理的HeLa细胞的蛋白质组学数据的Keynode网络分析,显示Pd1d作用于EGFR/Grb2途径。b-d)Pd1d对EGFR信号传导的抑制效果。癌细胞用所述浓度的Pd1d处理2小时。用EGF(50 ng/mL)刺激EGFR 15分钟后,收获细胞并裂解,通过Western印迹法分析EGFR(pEGFR)及其下游蛋白激酶(pERK)的活化/磷酸化。b)HeLa宫颈癌细胞,c)NCI-H460肺癌细胞,d)HCC-827肺癌细胞。
图4显示了a)用溶剂或Pd1d经8次重复剂量的腹腔内注射治疗17天的带有NCI-H460异种移植物的小鼠的平均肿瘤体积。误差条显示标准偏差,n = 5,*表示与溶剂对照物相比p<0.05。b)不同组的小鼠的体重。
图5显示了提出的[Pd(C^N^N)(NHC)]+的抗癌作用机理。
图S1显示了298 K下在CD3CN中的Pd1b的500 MHz 1H-1H COSY NMR谱:a)1H-1H COSYNMR谱。b)1H-1H NOESY NMR谱。c)1H NMR谱。
图S2显示了Pd1a(左)和Pd1c(右)的阳离子的X射线晶体结构的透视图。未显示氢原子。
图S3显示了a)298 K下在CH3CN(实线)、CH2Cl2(短划线)和CH3OH(虚线)中的Pd1d(50 µM)。b)在DMSO:PBS(1:19)中的Pd1a–Pd1d(50 µM)的UV-可见吸收光谱。
图S4显示了以下的UV-可见吸收光谱:a)298 K下在CH3CN 中的Pd1a、C^N^N配体、[Pd(C^N^N)Cl]和(CH3)2NHC配体(50 µM) ,和b)在CH3CN中的Pd1a和Pd2a(50 µM)。
图S5显示了a)在混合1小时和24小时后D2O:DMSO(9:1 v/v)溶液混合物中的Pd1b(2 mM)和GSH(20 mM)的1H NMR谱(400 MHz,298或310 K)。没有发现Pd1b的信号的明显变化。b)1:10比率下的Pd1a与GSH的反应混合物(反应时间:1小时和24小时)的ESI-MS-TOF光谱。
图S6显示了a)刚刚混合后在D2O(150 mM碳酸氢铵溶液):DMSO(9:1, v/v)溶液混合物中的Pdiso(2 mM)和GSH(20 mM)的1H NMR谱(400 MHz, 298 K)。b)刚刚混合后在D2O(150 mM碳酸氢铵溶液):DMSO(9:1, v/v)溶液混合物中的PdPPh3(4 mM)和GSH(16 mM)的31PNMR谱(400 MHz, 298 K)。
图S7显示了a)在CH3OH/碳酸氢铵缓冲液(50 mM)(1:9, v/v)中的反式-[Pd(NHC)2Cl2]的ESI-MS-TOF光谱。b)在CH3OH/碳酸氢铵缓冲液(50 mM)(1:9, v/v)中在1:100比率下反式-[Pd(NHC)2Cl2]与GSH的反应混合物(反应时间:1小时)的ESI-MS-TOF光谱。
图S8显示了(顶部)用Pd1a(10 µM)处理的、(中部)在细胞培养基中的Pd1a(10 µM)处理48小时的、和(底部)CH3CN中的Pd1a(10 µM)处理的HeLa细胞的细胞提取物的a)代表性LC-MS色谱图和b)质谱。
图S9显示了基于ICP-MS分析将不同的钯配合物与人血清白蛋白(HAS)一起培养2小时后未结合的钯含量。
图S10显示了随着Pd1a、Pd1d和Pd2a浓度的提高,HAS(3 µM,在Tris−HCl缓冲液(0.05 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.40)中)的发射光谱变化。化合物浓度由0.0变为56.61µM。λex = 280 nm。
图S11显示了在不同的时间点用或不用Pd1a和Pd1d(0.5 µM)处理的HeLa细胞中的半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9活性。
图S12显示了在用Pd1a或Pd1d(0.5 μM)处理0、12、24或48小时后HeLa细胞中PARP的表达和裂解。
图S13显示了随着ctDNA浓度的提高,在PBS:DMSO(9:1, v/v)中的Pd1d的UV-可见光谱变化。插图:[DNA]/εap vs [DNA]。在323 nm处监测吸光度。
图S14显示了(左侧)1.5%琼脂糖凝胶中123 bp DNA梯(50 µM碱基对)的凝胶电泳,显示了在不存在(第一泳道)或以1:1或1:10的摩尔比存在Pd1a–Pd1d(第四至第七泳道)以及溴化乙锭(EB,第二和第三泳道)的情况下DNA的迁移率。(右侧)凝胶迁移率变动分析,显示了在不存在(第一和最后一个泳道)或以1:1或1:10的摩尔比存在PdPPh3和Pdiso(第三至第六泳道)和以1:1的摩尔比存在溴化乙锭(EB,第二泳道)的情况下DNA的迁移率。
图S15显示了在用[Pd(C^N^N)(NHC)]+(1 μM)培养HeLa细胞后对DNA双链断裂的分析。在处理样品的图像中由箭头指示的集落形成表明,顺铂可以诱导DNA DSBs。该HeLa细胞还用DAPI染色,该DAPI显示蓝色荧光以显现细胞核。
图S16显示了在培养2小时后[Pd(CNN)(NHC)]+配合物(2.5 µM)或CCCP(2.5 µM)或载体对照物对HeLa细胞的线粒体电位的影响。a)未处理的细胞,因JC-1的强J聚集体显示橙色荧光。b)CCCP处理的细胞,因低ΔΨm显示绿色荧光,导致单体JC-1的胞质累积。c)和d)分别用Pd1a和Pd1d(2.5 µM)处理的细胞。
图S17显示了在用或未用硫醇抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理的HeLa细胞中a)Pd1a或b)Pd1d的细胞毒性曲线。
图S18显示了在用Pd1d(2 mg/kg)经由8次重复剂量的腹腔内注射17天的a)肿瘤,b)血液中[C27H31N4Pd]+离子在m/z 517.2处的阳性MS/MS谱,碰撞能量为37 V。
图S19显示了a)用溶剂或Pd1d经7次重复剂量的腹腔内注射治疗13天的带有HeLa异种移植物的小鼠的平均肿瘤体积。误差条显示标准偏差,n = 5,*表示与溶剂对照物相比p<0.05。b)不同组的小鼠的体重。c)显示了用溶剂或Pd1d经7次重复剂量的腹腔内注射治疗13天后带有HeLa异种移植物的小鼠的照片。
图S20显示了[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物对MS1细胞的体外抗血管生成性质。a)在1小时处理后通过血管生成试验显露的Pd1a和Pd1d(0.25或0.5 µM)的抗血管生成活性。b)在MS1细胞上的伤口愈合试验。(i)在48小时后,细胞迁移到受伤区域。(ii)用0.5 μM的Pd1a培养,无明显的抑制效果。(iii)通过用0.5 μM的Pd1a培养,抑制了迁移。照片以100×放大率拍摄。
图S21至S28显示了钯(II)-卡宾配合物的表征。
发明详述
本文未具体定义的术语应当给出本领域技术人员根据本公开和上下文所给出的含义。但是,如本说明书中所用,除非有相反的说明,否则以下术语具有所示含义并遵守以下约定。
要理解的是,除非另行说明,本发明不限于特定的反应物、反应条件等等,因为其可能有所不同。还要理解的是,本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而非意在为限制性的。
如说明书和所附权利要求中所用,除非上下文另行明确规定,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。因此,例如,提及“一种催化剂”或“一种配合物”包括不同催化剂或配合物的组合或混合物以及单一催化剂或配合物,提及“取代基”包括单一取代基以及两个或更多个可能相同或不同的取代基等等。
在本说明书和随后的权利要求中,将参考许多术语,其应定义为具有以下含义:
本文中所用的术语“烷基”是指通常尽管并非一定含有1至大约20个碳原子、优选1至大约12个碳原子、1至6个碳原子的直链、支链或环状的饱和烃基团,如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基等等,以及环烷基如环戊基、环己基等等。通常,尽管并非必要,术语“环烷基”意指环状烷基,通常具有4至8个、优选5至7个碳原子。术语“取代烷基”是指被一个或多个取代基取代的烷基,术语“含杂原子的烷基”和“杂烷基”是指其中至少一个碳原子被杂原子替换的烷基。如果没有另行说明,术语“烷基”包括直链、支链、环状、未取代、取代和/或含杂原子的烷基。
本文中所用的术语“烷烃”是指直链、支链或环状的饱和烃,通常但不一定含有1至大约20个碳原子、优选1至大约12个碳原子、1至6个碳原子,如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、辛烷、癸烷等等。
本文中所用的术语“烷氧基”是指经由单个末端醚键键合的烷基基团;也就是说,“烷氧基”可以表示为-O-烷基,其中烷基如上文所定义,如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、辛氧基、癸氧基等等。
如本文中所用且除非另行说明,术语“芳环”是指单个芳环或稠合在一起、直接连接或间接连接(使得不同的芳环键合到共同基团如亚甲基或亚乙基部分上)的多个芳环。优选的芳环含有5至20个碳原子,特别优选的芳环含有5至14个碳原子。示例性芳环含有一个芳环或两个稠合或连接的芳环,例如苯、萘、噻吩、苯并噻吩、蒽、芘、呋喃、嘧啶、吡咯、吡啶、芴、咔唑、碳硼烷、异喹啉、1-异喹啉、2-喹啉等等。“取代芳环”是指被一个或多个取代基取代的芳环部分。
如一部分前述定义中所提及的那样,“取代”指的是键合到碳(或其它)原子上的至少一个氢原子被一个或多个非氢取代基替换。此类取代基的实例包括但不限于:官能团,如卤素、羟基、巯基、C1-C20烷氧基、C2-C20链烯氧基、C2-C20炔氧基、C5-C20芳氧基、C6-C20芳烷氧基、C6-C20烷芳氧基、酰基(包括C2-C20烷基羰基(-CO-烷基)和C6-C20芳基羰基(-CO-芳基))、酰氧基(-O-酰基,包括C2-C20烷基羰氧基(-O-CO-烷基)和C6-C20芳基羰氧基(-O-CO-芳基))、C2-C20烷氧基羰基(-(CO)-O-烷基)、C6-C20芳氧基羰基(-(CO)-O-芳基)、卤代羰基(-(CO)-X,其中X是卤素)、C2-C20烷基碳酸根合(-O-(CO)-O-烷基)、C6-C20芳基碳酸根合(-O-(CO)-O-芳基)、羧基(-COOH)、羧酸根合(-COO-)、氨基甲酰基(-(CO)-NH2)、单-(C1-C20烷基)-取代的氨基甲酰基(-(CO)-NH(C1-C20烷基))、二-(C1-C20烷基)-取代的氨基甲酰基(-(CO)-N(C1-C20烷基)2)、单-(C5-C20芳基)-取代的氨基甲酰基(-(CO)-NH-芳基)、二-(C5-C20芳基)-取代的氨基甲酰基(-(CO)-N(C5-C20芳基)2)、二-N-(C1-C20烷基)、N-(C5-C20芳基)-取代的氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基(-(CS)-NH2)、单-(C1-C20烷基)-取代的硫代氨基甲酰基(-(CO)-NH(C1-C20烷基))、二-(C1-C20烷基)-取代的硫代氨基甲酰基(-(CO)-N(C1-C20烷基)2)、单-(C5-C20芳基)-取代的硫代氨基甲酰基(-(CO)-NH-芳基)、二-(C5-C20芳基)-取代的硫代氨基甲酰基(-(CO)-N(C5-C20芳基)2)、二-N-(C1-C20烷基)、N-(C5-C20芳基)-取代的硫代氨基甲酰基、脲基(-NH-(CO)-NH2)、氰基(-C=N)、氰酸根合(-O-C≡N)、硫代氰酸根合(-S-C=N)、异氰酸根合(-N+≡C-)、甲酰基(-(CO)-H)、硫代甲酰基(-(CS)-H)、氨基(-NH2)、单-(C1-C20烷基)-取代的氨基、二-(C1-C20烷基)-取代的氨基、单-(C5-C20芳基)-取代的氨基、二-(C5-C20芳基)-取代的氨基、C2-C20烷基酰胺基(-NH-(CO)-烷基)、C6-C20芳基酰胺基(-NH-(CO)-芳基)、亚氨基(-CR=NH,其中R = 氢、C1-C20烷基、C5-C20芳基、C6-C20烷芳基、C6-C20芳烷基等等)、C2-C20烷基亚氨基(-CR=N(烷基),其中R =氢、C1-C20烷基、C5-C20芳基、C6-C20烷芳基、C6-C20芳烷基等等)、芳基亚氨基(-CR=N(芳基),其中R = 氢、C1-C20烷基、C5-C20芳基、C6-C20烷芳基、C6-C20芳烷基等等)、硝基(-NO2)、亚硝基(-NO)、磺基(-SO2-OH)、磺酸根合(-SO2-O-)、C1-C20烷基硫烷基(-S-烷基;也称为“烷基硫基”)、C5-C20芳基硫烷基(-S-芳基;也称为“芳基硫基”)、C1-C20烷基联硫基(-S-S-烷基)、C5-C20芳基联硫基(-S-S-芳基)、C1-C20烷基亚磺酰基(-(SO)-烷基)、C5-C20芳基亚磺酰基(-(SO)-芳基)、C1-C20烷基磺酰基(-SO2-烷基)、C5-C20芳基磺酰基(-SO2-芳基)、硼烷基(-BH2)、二羟硼基(-B(OH)2)、硼酸根合(-B(OR)2,其中R是烷基或其它烃基)、膦酰基(-P(O)(OH)2)、膦酸根合(-P(O)(O-)2)、亚膦酸根合(-P(O)(O-))、磷酸根合(-PO2)、膦基(-PH2)、甲硅烷基(-SiR3,其中R是氢或烃基)和甲硅烷氧基(-O-甲硅烷基);以及烃基部分C1-C20烷基(优选C1-C12烷基,更优选C1-C6烷基)、C2-C20链烯基(优选C2-C12链烯基,更优选C2-C6链烯基)、C2-C20炔基(优选C2-C12炔基,更优选C2-C6炔基)、C5-C20芳基(优选C5-C14芳基)、C6-C20烷芳基(优选C6-C16烷芳基)和C6-C20芳烷基(优选C6-C16芳烷基)。
此外,如果特定的基团允许,前述官能团可以用一个或多个附加的官能团或一个或多个烃基部分(如上文具体列举的那些)进一步取代。类似地,前述烃基部分可以用一个或多个官能团或附加的烃基部分(如具体列举的那些)取代。
除非另行说明,本文中所用的“药学上可接受的阴离子”可以是氯、溴、碘、酒石酸根、酒石酸氢根、琥珀酸根、马来酸根、富马酸根、硫酸根、硫酸氢根或甲基硫酸根阴离子。
作为抗癌药物的含有N-杂环卡宾(NHC)配体的环金属化钯(II)配合物的一系列化学结构可以例示如下。
N-杂环卡宾(NHC)配体是一种强σ-供体配体,其可以形成稳定的金属-C键,并且易于制备且无毒。配合物可以含有三齿CNN配体以改善稳定性。合成了Pdiso、PdPPh3、[Pd(C^N^N)Cl]和反式-[Pd(NHC)2Cl2]以便在生理稳定性和细胞毒性方面与[Pd(C^N^N)(NHC)]+进行比较。
制备了含有烷基链长度不同的NHC配体的环金属化钯(II)配合物(Pd1a–Pd1d 图1)。通常,在回流下,在KOtBu的存在下加热[Pd(C^N^N)Cl]与相应的NHC配体的混合物24小时,以便在通过柱色谱法和再结晶后获得纯钯(II)NHC配合物。该配合物通过FAB-MS、1HNMR、19F NMR和31P NMR光谱法以及元素分析(支持信息)来表征。还制备了其它钯(II)配合物——Pd2a、PdPPh3、Pdiso、反式-[Pd(NHC)2Cl2]和[Pd(C^N^N)Cl]来进行比较研究。通过戊烷或二乙醚扩散到二氯甲烷溶液中获得了适于X射线晶体分析法的Pd1a与Pd1c的晶体。晶体结构的透视图显示在图S2中。Pd1a和Pd1c的Pd–C卡宾距离为1.995 Å。Pd1a和Pd1c的晶体学与结构细化数据以及所选键角/距离总结在支持信息的表S1-S6中。
下表1显示了钯(II)配合物与顺铂对肺癌(NCI-H1650和NCI-H460)、乳腺癌(MDA-MB-231)、宫颈癌(HeLa)、卵巢癌(A2780)及其耐顺铂克隆(A2780cis)以及正常肺成纤维细胞(CCD-19Lu)的人细胞系的体外细胞毒性IC50值(µM,72小时)。
该[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物的UV-可见吸收数据和光谱显示在表S7和图S3与S4中。配合物Pd1a-Pd1d显示了在233-330 nm区域中的强吸收带以及在大约383 nm处较弱的吸收,这可以归因于配体内(IL)电荷转移跃迁。
检查了钯(II)配合物在生物学上重要的硫醇类的存在下的稳定性。水性缓冲溶液(150 mM碳酸氢铵)/DMSO(4:1,v/v)混合物中的Pd1b(2 mM)在40℃下在10倍过量的GSH(20mM)的存在下是稳定的,并且显示Pd1b在1H NMR谱中的信号24小时无显著变化(图S5)。相反,在向Pdiso(2 mM)或PdPPh3(4 mM)中添加过量的GSH(20 mM)后,Pdiso在芳族区域(6–8.5 ppm)中的1H NMR信号不同于在没有GSH的情况下获得的那些信号(图S6a),而PdPPh3的31P NMR信号在由40 ppm至-8 ppm的化学位移中显示出明显的变化(图S6b)。这些发现表明,与[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物不同,钯(II)膦和异氰化物配合物容易与GSH发生反应。通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)进一步检验了[Pd(C^N^N)(NHC)]+在GSH的存在下的溶液稳定性。新鲜制备Pd1a(0.2 mM)和100倍过量的GSH(20 mM)在水性缓冲溶液(50 mM碳酸氢铵,pH 7.6)中的混合物并记录质谱(图S5b)。在用GSH培养24小时后仍观察到对应于[Pd1a-PF6]+的在m/z = 433.3处的峰。相反,如通过用GSH培养1小时后反式-[Pd(NHC)2Cl2](m/z =503.4)的离子峰消失和[Pd(NHC)2(GSH)]+加合物峰(m/z = 772.3)的出现(图S7)所显示的那样,发现反式-[Pd(NHC)2Cl2](0.2 mM)在pH 7.6缓冲溶液中容易与GSH(20 mM)反应。此外,还通过LC-MS研究了Pd1a的体外稳定性。在细胞培养基或HeLa细胞提取物与Pd1a(10 µM)一起培养48小时所获得的LC-MS色谱图(图S8)中没有发现新的峰。此外,与硫醇反应性Pdiso和PdPPh3相比,[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物对硫代依赖性酶硫氧还蛋白还原酶的抑制性降低至少5倍(表S8)。我们还研究了Pd1d与大量过量的非硫醇生物还原剂(抗坏血酸)的反应。Pd1d的吸收光谱不具有显著变化,并且通过监测265 nm处的吸光度测定的抗坏血酸氧化直到24小时仍不明显。
由于血清白蛋白已知与药物分子强力结合并因此降低药物分子的生物利用度,通过经电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)测量该配合物(2 µM)与HSA(60 µM)的溶液混合物中未结合的钯的量,检验了游离钯(II)配合物在人血清白蛋白(HSA)的存在下的水平(图S9)。已经发现,超过60%的Pd1a和55%的Pd1d在2小时培养后仍未结合,而对其它钯(II)配合物发现小于16%的未结合钯。这表明,与其它钯(II)配合物相比,[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物与HSA的相互作用较弱。通过蛋白质荧光滴定试验,Pd1a、Pd1d和Pd2a与HSA的结合常数分别测定为(2.5±0.1)×105、(4.7±0.3)×104和(1.8±0.2)×106 M−1(图S10)。
研究了钯(II)配合物对不同人癌症细胞系,包括宫颈上皮癌(HeLa)、肺癌(NCI-H1650和NCI-H460)、侵袭性三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)和卵巢癌(A2780)及其耐顺铂克隆(A2780cis)的体外细胞毒性(表1)。发现所有的[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物均对癌细胞系表现出有希望的抗增殖活性,IC50值为0.09-2.5 µM,其与顺铂相比细胞毒性高最多172倍。[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物在A2780和A2780cis中显示出类似的细胞毒性,而顺铂对耐顺铂性A2780cis的细胞毒性与A2780相比相对较低(~20倍)。值得注意的是,[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物对人正常肺成纤维细胞系(CCD-19Lu)的细胞毒性较低,例如,Pd1d对CCD-19Lu显示出11.8 µM的IC50值,这比对NCI-H1650细胞高大约140倍。另一方面,发现其它钯(II)配合物显示出低得多的对癌细胞的细胞毒性。这可能归因于上文所述的这些配合物在细胞条件下较差的稳定性(图S6和S7)以及它们与血清蛋白的更显著的结合(图S9)。
检验了细胞凋亡在[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物对癌细胞的细胞毒性作用中的参与。用Pd1a或Pd1d(0.5 µM)处理的HeLa细胞显示出DNA含量降低(流式细胞术分析中的亚G1阶段)的细胞群落的显著增加(表S9)、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9的酶活性的提高(图S11)和PARP-1的裂解(图S12),表明诱导了细胞凋亡。
通过使用ICP-MS测量细胞裂解物中的钯金属含量(图2)研究了[Pd(C^N^N)(NHC)]+和其它钯(II)配合物的细胞摄取。与正常CCD-19Lu细胞相比,发现癌细胞(HeLa和NCI-H1650)显示出高2倍的[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物的细胞摄取。另一方面,在用于癌症治疗的钯药物设计中,与[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物相比,PdPPh3、Pdiso、反式-[Pd(NHC)2Cl2]和[Pd(C^N^N)Cl]均表现出低得多的进入癌细胞与正常细胞的摄取(最高50倍差异)(表1)。
由UV-可见吸收数据和Scatchard图测定的Pd1a、Pd1d和Pd2a与小牛胸腺DNA(ctDNA)的结合常数Kb分别为(14.2±0.8)×103、(8.5±0.6)×103和(9.5±0.7)×103 M−1(图S13)。Pd1a、Pd1d和Pd2a的Kb值显著低于文献中其它钯(II)配合物(Kb = 104-5 M-1)[4c, 9]以及典型的DNA嵌入剂溴化乙锭(Kb = 107)的Kb值达几个数量级[4]。在凝胶迁移率变动分析中,以等效于碱基对的摩尔浓度与[Pd(C^N^N)(NHC)]+混合的DNA梯(123 bp)未显示延迟的迁移率(图S14)。为了检验[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物是否在细胞内部触发DNA损伤如双链断裂(DSB),进行磷酸化组蛋白2AX(γH2AX)的荧光显微镜检查。γH2AX是DSB的既定标记物,在DNA断裂位置处形成焦点并在免疫荧光染色实验中在细胞核中出现点状染色[10]。人们发现,HeLa细胞在用顺铂处理24小时后显示γH2AX焦点,但是用[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物未显示焦点(图S15)。这些结果表明,DNA不太可能是[Pd(C^N^N)(NHC)]+的主要分子靶标。
由于线粒体已知在激活细胞凋亡方面起到关键作用,通过线粒体膜电位的荧光探针JC-1研究了Pd1a和Pd1d对线粒体的影响。用Pd1a或Pd1d(2.5 µM)处理2小时并随后用JC-1染色的HeLa细胞显示绿色荧光,而在用溶剂对照物处理的HeLa细胞中观察到橙色荧光(图S16)。来自用[Pd(C^N^N)(NHC)]+处理的细胞的绿色荧光表明线粒体膜电位被该配合物破坏,这导致了绿色发光单体JC-1的胞质累积。为了评估活性氧类(ROS)的产生——其可能因线粒体功能障碍而增加——是否参与[Pd(C^N^N)(NHC)]+诱导的细胞毒性,在过量的细胞渗透性抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)的存在下用Pd1a或Pd1d处理HeLa细胞,并且未发现细胞活力的显著变化(图S17)。这些数据也与[Pd(C^N^N)(NHC)]+在硫醇类的存在下的体外稳定性一致。
采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS后接计算途径分析进行由Pd1d介导的蛋白质表达的变化的蛋白质组学分析。将其表达被Pd1d改变的蛋白质列表(表S10)上载到 ExPlainTM,其连接到用于上游检索途径关键节点与关键节点分析的BIOBASE数据库。通过途径分析发现,分别从用Pd1d 处理2小时和10小时的HeLa细胞中识别出24种和56种受调节的途径(表S11)。许多这些途径与凋亡性细胞死亡和血管新生有关。此外,关键节点网络分析[11]推知Pd1d作用于涉及生长因子受体结合蛋白2(Grb2)的上游信号传导途径,所述生长因子受体结合蛋白2是多种促癌生长因子受体如表皮生长因子受体(EGFR)的关键衔接蛋白(图3a)。为了验证蛋白质组学分析所暗示的Pd1d对EGFR信号传导途径的作用,通过Western印迹法试验研究了EGFR及其下游蛋白激酶ERK1/2在HeLa细胞中的EGF刺激的磷酸化(图3b)。用Pd1d培养HeLa细胞2小时导致EGFR与ERK1/2的磷酸化以剂量依赖性方式显著减低,表明Pd1d抑制了EGFR信号传导。还在相同的实验条件下在两种肺癌细胞系(NCI-H460和HCC-827)中证实了类似的EGFR抑制(图3c和3d)。
检验了Pd1d的体内抗癌活性。发现与使用溶剂对照物治疗的那些相比,用Pd1d以1mg/kg和2 mg/kg经8次重复剂量的腹腔内注射17天来治疗带有NCI-H460 癌细胞的异种移植物的裸小鼠分别抑制肿瘤生长32%(p<0.05)和61%(p<0.05)(图4a)。重要的是,在以这些剂量用Pd1d治疗后未发现小鼠死亡或显著的体重损失(图4b)。在试验结束时(最后一次化合物给药后两天),将小鼠处死并通过LC-MS/MS研究Pd1d的体内稳定性。在肿瘤(0.048±0.015微克/克组织)和血浆(9±3 nM)中发现了Pd1d的完整阳离子(图S18)。还用Pd1d以1mg/kg和3 mg/kg经7次重复剂量的腹腔内注射13天在带有HeLa癌细胞的异种移植物的裸小鼠中检验了Pd1d的体内抗癌活性。发现与使用溶剂对照物治疗的那些相比分别抑制肿瘤生长40%(p<0.05)和55%(p<0.05)(图S19)。此外,研究了[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物在其抗血管生成活性方面的抗癌特性。在亚细胞毒性浓度(0.25和0.5 μM)下用Pd1a和Pd1d培养小鼠内皮细胞(MS1)导致基质胶中内皮细胞管形成的畸变(图S20)和伤口愈合试验中的细胞移行(图S21)。
总之,[Pd(C^N^N)(NHC)]+配合物表现出在体外和在生理硫醇的存在下的高稳定性。最终,该配合物显示出对癌细胞的有效的体外细胞毒性,以及在裸小鼠中对肿瘤异种移植物的有效的体内抗癌活性,并且不具有可观察的毒性。如通过蛋白质组学分析和生化分析所研究的那样,该配合物的抗癌作用机制涉及诱导线粒体功能障碍和抑制与癌细胞的凋亡性细胞死亡相关的EGFR信号传导途径(图5)。这突出了使用NHC和钳型环金属化配体开发用于抗癌治疗的钯(II)配合物的光明前景。
如支持信息中所示,实施例显示了用于实施本发明的实施方案。这些实施例不应解释为限制性的。除非另行说明,所有百分比均按重量计,所有溶剂混合物比例均按体积计。
对于给定特征的任何数字或数值范围,来自一个范围的数字或参数可以与相同特征的来自不同范围的另一数字或参数组合以产生数值范围。
除了在操作实施例中或另行说明之外,在说明书和权利要求书中使用的涉及成分量、反应条件等等的所有数字、值和/或表述应理解为在所有情况下均被术语“大约”修饰。
应当理解的是,本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明目的,并且本领域技术人员可以建议对其进行各种修改或改变,并且所述修改或改变包括在本申请的精神和范围内。
上文提及的以下支持信息经此引用并入本文。
支持信息:Anti-cancer Cyclometalated Palladium(II) Complexes with N-Heterocyclic Carbene Ligands Exhibit High Stability and Cytotoxicity In Vitroand Suppress Tumor Growth In Vivo(Tommy Tsz-Him Fong、Chun-Nam Lok、Clive Yik-Sham Chung、Yi-Man Eva Fung、Pui-Keong Chow、Pui-Ki Wan和Chi-Ming Che*)。
材料与方法
除非另行说明,在所有试验中使用分析级有机溶剂。根据文献程序[2]合成Pd(C^N^N)Cl[HC^N^N = 6-苯基-2,2’-联吡啶][1]、溴化1,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓、溴化1,3-二乙基-1H-咪唑-3-鎓、溴化1,3-二丙基-1H-咪唑-3-鎓、溴化1,3-二丁基-1H-咪唑-3-鎓。先前已经报道了Pd(R-C^N^N-R’)Cl(R-C^N^N-R’ = 3-(6’-芳基-2’-吡啶基)异喹啉)[3]和[Pd(C^N^N)(PPh3)](CF3SO3)(PdPPh3)[1]。在Perkin-Elmer Lambda 19 UV/可见分光光度计上记录UV/可见光谱。对于MTT和蛋白质分析,使用Perkin-Elmer Fusion Reader(PackardBioScience Company)量化吸光度。在Finnigan Mat 95质谱仪上获得快原子轰击(FAB)质谱。相对于四甲基硅烷的信号在DPX 300, 400 M Bruker FT-NMR光谱仪上获得1H NMR和13CNMR光谱。由中国科学院化学研究所(北京)进行元素分析。除非另行说明,其它化学品均购自Sigma-Aldrich Co。
单晶X射线衍射
通过将戊烷或Et2O扩散到该配合物在二氯甲烷中的浓缩溶液中来生长适于X射线衍射分析的配合物Pd1a和Pd1c的单晶。在Bruker X8 Proteum衍射仪上收集X射线衍射数据。在数据收集过程中,晶体保持在100 K。通过使用程序SAINT来解释衍射图像和对衍射强度进行积分。多扫描SADABS应用于吸收校正。通过使用Olex2[4],采用直接法用ShelXS[5]结构解决程序来解析结构,并用XL[5]细化包使用最小二乘法优化进行细化。基于riding模式计算H原子的位置,热参数等于相关C原子的1.2倍,并且这些位置参与最终R指数的计算。在最小二乘法细化的最后阶段,所有非氢原子均各向异性细化。晶体学参数总结在表S1中。CCDC1448613-1448614包含本文的补充晶体学数据。该数据可以经由www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif从剑桥晶体数据中心免费获得。
钯(II)-卡宾配合物的合成与表征
配合物Pd1a. 将[Pd(C^N^N)Cl](80.0 毫克,0.215 毫摩尔)、溴化1,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓(25.1 毫克,0.258 毫摩尔)和KOtBu(29.0 毫克,0.258 毫摩尔)在30毫升二甲基甲酰胺中的混合物加热至回流24小时。加入过量的六氟磷酸铵,反应混合物进一步回流1小时。在冷却至室温后,通过减压蒸馏除去DMF,残余物用水并随后用二乙醚洗涤。在用CH2Cl2和CH3CN(13:1,v/v)作为洗脱剂的硅胶色谱法分离后获得浅黄色产物。产率:50%。1H NMR(400 MHz, CD3CN, 25℃): 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.83–7.92 (m, 3 H), 7.74(m, 1 H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.40 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.27 (m, 1H), 7.06 (s, 2 H), 6.88 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 6.75 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 6.07(d, J = 7.5 Hz, 1 H), 3.65 (s, 6 H);31P NMR (161 MHz, CD3CN): -144.53;19F NMR(376 MHz, CD3CN): -73.86;正FAB-MS: m/z 433 [M - PF6]+;元素分析:对C21H19F6N4PPd的计算值: C, 43.58; H, 3.31; N, 9.68; 实测值: C, 43.72; H, 3.32; N, 9.66。参见图S21。
配合物Pd1b. 程序类似于Pd1a,除了使用溴化1,3-二乙基-1H-咪唑-3-鎓。产率:45%。1H NMR (300 MHz, CDCl3, 25℃): 8.26 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 8.10–8.14 (m, 1H), 8.06–8.09 (m, 2 H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1 H),7.59–7.62 (m, 1 H), 7.53 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 7.26 (s, 2 H), 7.12 (t, J =7.6 Hz, 1 H), 6.99 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 6.29 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 4.34–4.46(m, 4 H, -CH2-), 1.45 (t, J = 7.4 Hz, 6 H, CH3);31P NMR (400 MHz, CD3CN): -144.24;19F NMR (376 MHz, CD3CN): -73.25;正FAB-MS: m/z 461 [M - PF6]+;元素分析,对C23H23F6N4PPd的计算值: C, 45.45; H, 3.98; N, 9.22; 实测值: 45.10, H 3.88, N9.00。参见图S22。
配合物Pd1c. 程序类似于Pd1a,除了使用溴化1,3-二丙基-1H-咪唑-3-鎓。产率:48%。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 25℃): 8.29 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.98–8.17 (m, 4H), 7.73 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.58–7.62 (m, 1 H), 7.53 (d, J = 7.6 Hz, 1 H),7.27 (s, 2 H), 7.12 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 6.99 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 6.31 (d,J = 7.5 Hz, 1 H), 4.20–4.39 (m, -N-CH2-在-nPr上, 4 H), 1.89 (六重峰, J = 7.3Hz, 4 H, -CH2-在-nPr上), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 6 H, -CH3在-nPr上);31P NMR (161MHz, CD3CN): -144.76;19F NMR (376 MHz, CD3CN): -73.23;正FAB-MS: m/z 489 [M -PF6]+;元素分析,对C25H27F6N4PPd•(H2O)0.5的计算值: C, 46.63; H, 4.38; N, 8.70; 实测值:46.50, H 4.26, N 8.49。参见图S23。
配合物Pd1d. 程序类似于Pd1a,除了使用溴化1,3-二丁基-1H-咪唑-3-鎓。产率:52%。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 25℃): 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.02–8.23 (m, 4H), 7.71 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.63–7.64 (m, 1 H), 7.53 (d, J = 7.6 Hz, 1 H),7.27 (s, 2 H), 7.14 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 6.99 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 6.30 (d,J = 7.0 Hz, 1 H), 4.25–4.42 (m, 4 H, -N-CH2-在-nBu上), 1.84 (六重峰, -CH2-在-nBu上, J = 7.1 Hz, 4 H), 1.28 (六重峰, 4H, J = 7.6 Hz, -CH2-在-nBu上), 0.80(t, J = 7.3 Hz, 6 H, -CH3在-nBu上);31P NMR (161 MHz, CD3CN): -144.14;19F NMR(376 MHz, CD3CN): -73.66;正FAB-MS: m/z 517 [M - PF6]+;元素分析,对C27H31F6N4PPd的计算值: C, 48.92; H, 4.71; N, 8.45; 实测值:48.76, H 4.86, N 8.38。参见图S24。
配合物Pd2a. 程序类似于Pd1a,除了使用π-延伸的Pd(R-C^N^N-R’)Cl。产率:45%。1HNMR (300 MHz, CDCl3, 25℃): 8.93 (s, 1 H), 8.52 (s, 1 H), 8.41 (d, J = 7.8Hz, 1 H), 8.0–8.06 (m, 2 H), 7.87–7.92 (m, 1 H), 7.74–7.83 (m, 2 H), 7.65 (d,J = 7.8 Hz, 2 H), 7.54 (s, 2 H), 7.27 (s, 2 H), 7.18 (t, J = 7.4 Hz, 1 H),7.05 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 6.36 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 4.04 (s, 6 H), 1.24–1.67 (s, 18 H);正FAB-MS:m/z 671 [M - CF3SO3]+;元素分析,对C40H41F3N4O3PdS•2H2O的计算值: C, 56.04; H, 5.29; N, 6.54; 实测值: 55.95, H 5.07, N 6.78。参见图S25。
配合物Pdiso. 在室温下向[Pd(C^N^N)Cl](0.10克,0.22 毫摩尔)在CH3CN:CHCl3(1:1,v/v;20毫升)中的黄色悬浮液中添加过量的异氰酸叔丁酯(0.5毫升,4.4 毫摩尔)。在搅拌时,混合物颜色在30分钟后变为淡黄色。添加过量的在乙腈中的LiClO4,接着添加二乙醚,产生白色沉淀物,将其收集并干燥。通过将二乙醚缓慢扩散到粗产物的乙腈溶液中来进行再结晶,得到白色晶体:产量0.12克,91%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): 8.66(s, 1 H), 8.57 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 8.29–8.36 (m, 3 H), 8.14 (d, J = 6.8 Hz,1 H), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.21–7.27 (m, 3 H), 1.70 (s, 9 H);正FAB-MS:m/z 378 [M+ - C≣NtBu + CH3CN];元素分析,对C21H20ClN3O4Pd的计算值: C, 48.48; H,3.87; N, 8.08; 实测值: C, 48.62; H, 3.69; N, 8.18。参见图S26。
反式-[Pd(NHC)2(Cl)2]. 其根据文献中报道的程序的修改来合成[6]。在室温下将二氯甲烷(30毫升)中的溴化1,3-二丁基-1H-咪唑-2-鎓(0.274克,1.26毫摩尔)和Ag2O(0.146克,0.63 毫摩尔)搅拌4小时。随后通过硅藻土过滤溶液,滤液在减压下蒸发。通过缓慢蒸发技术从粗产物的乙腈溶液中结晶[1,3-二丁基-1H-咪唑-2-亚基]AgCl。产量 =0.117克(29%);1H NMR (400 MHz, CDCl3):7.23 (s, 2 H), 4.17 (t, J = 7.1 Hz, 4 H),1.84 (五重峰, J = 7.2 Hz, 4 H), 1.36 (六重峰, J = 7.3 Hz, 4 H), 0.95 (t, J =7.3 Hz, 6 H)。随后通过在回流下加热[1,3-二丁基-1H-咪唑-2-亚基]AgCl(0.117克,0.36毫摩尔)和Pd(COD)Cl2(47.4毫克,0.17 毫摩尔)的乙腈溶液(15毫升)6小时来合成反式-[Pd(NHC)2(Cl)2]。溶液混合物体积减少至~1毫升,通过缓慢蒸发乙腈溶液获得反式-[Pd(NHC)2(Cl)2]的浅黄色晶体。产量 = 30毫克(32.8%);1H NMR (400 MHz, CDCl3): 6.82(t, J = 3.9 Hz, 4 H), 4.49 (m, 8 H), 2.08 (m, 8 H), 1.47 (m, 8 H), 1.01 (t, J= 6.3 Hz, 12 H); 13C{1H} NMR (150 MHz, CDCl3): 169.1, 120.5, 50.7, 33.0, 20.1,13.8;正ESI-MS: m/z = 503.4 [M - Cl]+;元素分析,对C22H40Cl2N4Pd的计算值: C,49.12; H, 7.50; N, 10.42; 实测值: C, 48.72; H, 7.89; N, 10.28。参见图S27和S28。
稳定性分析
通过ESI-MS、31P NMR和1H NMR研究了钯(II)配合物的溶液稳定性。通过ESI-MS、31PNMR和1H NMR分析了含有配合物(2 mM)和GSH(20 mM)的含10% DMSO的水溶液以检验配合物-GSH加合物的形成。
还采用LC/MS在HeLa细胞中检验了Pd1a的稳定性。将Pd1a(1 µM)添加到HeLa细胞中2小时、8小时、24小时和48小时。HeLa细胞用PBS洗涤两次,并加入500微升超纯水,并在室温下培养10分钟。其随后用乙腈稀释20倍。溶液随后在4℃下以15000 rpm离心15分钟。保留上清液并干燥。加入乙腈(200 µL)并再次离心,上清液随后转移至UPLC小瓶中进行LC/MS分析。
与人血清白蛋白的相互作用
通过修改的程序[7]测定与人血清白蛋白(HSA)的结合。通常,280毫克量的HSA溶解在7毫升的最小必需培养基中。向含有HSA的介质中加入Pd(C^N^N)Cl和反式-[Pd(NHC)2(Cl)2],最终浓度为2 µM,混合物在50 rpm下摇振。2小时后,采取100 μL该溶液,并用500 μL冷的(-20℃)丙酮处理,并在-20℃下储存30分钟以便使蛋白质级分沉淀。随后,该溶液在4℃下以13000 rpm离心处理1分钟。采取上清液,蛋白质沉淀物用500 μL的60% HNO3(*)在60-70℃下处理2小时,并在室温下处理12小时。将最终体积调节至10毫升以便进行电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)分析。通过在没有沉淀的情况下消化钯与HSA混合物的溶液来测量总钯含量。结合的钯的百分比确定为沉淀蛋白质中的钯含量除以总钯含量。
(*)注意:浓HNO3与丙酮具有高度反应性,导致爆炸。应在添加HNO3之前蒸发丙酮,该消化必须小心操作。
细胞培养
所有细胞系获自American Type Culture Collection(ATCC)。细支气管肺泡癌(NCI-H1650)、乳腺癌(MDA-MB-231)、宫颈上皮癌(HeLa)和正常肺成纤维细胞(CCD-19Lu)保持在Eagle’s最低必需培养基中。所有细胞培养基补充有10%(v/v)胎牛血清、L-谷氨酰胺(2 mM)和青霉素/链霉素(100 U/mL)。细胞在5% CO2加湿空气气氛中在37℃下培养,当达到80%汇合时进行传代培养。
细胞毒性分析
通过溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)分析来评估该配合物的细胞毒性[8]。细胞在96孔板中接种并在检查前培养整夜。所有配合物均溶解在DMSO中。根据通过元素分析确定的配合物的元素组成计算配合物的浓度。在受试配合物的存在下加入介质并连续稀释至各种浓度(即50 μM至0.2 μM),含有顺铂的介质用作阳性对照物。介质中DMSO的最大浓度不超过0.1%(v/v)。该细胞培养72小时并随后加入MTT溶液。该细胞进一步培养3小时,并随后加入增溶性缓冲液(100 μL,10% SDS在0.01 M HCl中)。通过Perkin-Elmer FusionTM α-FP读板器测量各个孔中580 nm处的吸收强度。由细胞活力百分比对配合物浓度的曲线图确定配合物的IC50值(与阴性对照物相比可以抑制细胞生长50%时的浓度)。对各组数据,进行至少三次独立实验。
细胞摄取测量
根据文献方法进行细胞摄取实验,并做了一些修改。细胞以1×106个细胞/皿的密度在6厘米培养皿中接种。在培养24小时后,细胞未经处理或用该金属配合物处理。在24和48小时后收获细胞,胰蛋白酶化并用冷PBS洗涤四次。加入超纯水(500 μL)并从培养皿中刮掉单层细胞。所有样品(300 μL)在70% HNO3(500 μL)中在70℃下消化2小时,其随后在水中稀释1:100用于ICP-MS分析。
体内肿瘤生长抑制实验
4-7周龄的雌性BALB/cAnN-nu(裸)小鼠购自Charles River Laboratories(Wilmington, MA)。小鼠保持在特定的无病原体条件下。在Committee on the Use ofLive Animals in Teaching and Research of the University of Hong Kong批准的指引下进行所有动物实验。为了产生肿瘤,将悬浮在PBS(100 μL)中的5×106个HeLa细胞分别通过皮下注射注入到各小鼠的右后侧和左后侧。在肿瘤体积达到大约30 mm3(肿瘤接种后2-3天)后,将小鼠分为使用溶剂对照物组和药物治疗组的不同组。通过腹腔内注射根据体重每2-3天一次用该化合物或溶剂对照物处理小鼠,直到处死小鼠。使用数字卡尺每2-3天测量一次肿瘤尺寸,并通过公式V = ab2 × 0.52计算肿瘤体积,其中a和b是肿瘤的最长和最短直径。在所有小鼠中,注射的PET稀释剂的体积保持每次注射≤3 μL,并且所有组中的小鼠接受相同量的PET稀释剂。
Western印迹法分析
HeLa细胞(5×105)在60毫米培养皿上培养并在实验前温育整夜。HeLa细胞用各种浓度(0.5、2和4 μM)的Pd1d处理。在2小时培养后,收获细胞,并用含有混合型蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(150 mM NaCl、100 mM Tris-HCl pH 7.4、10%甘油、1% Triton X-100、10 mMNaF、5 mM焦磷酸钠、5 mM原钒酸钠、0.1% SDS)裂解。通过Protein Assay(Bio-Rad)来定量细胞蛋白质含量。将总蛋白质提取物(40 μg)装载到12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上,通过电泳分离,随后将蛋白质由凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转移蛋白质后,该膜随后用TBST缓冲液中3%的BSA封闭,并在4℃用相应的一抗培养整夜。PARP(1:1500)、裂解的PARP(1:1500)、EGFR(1:1000)、pEGFR(1:1000)、ERK 1/2(1:1500)、pERK 1/2(1:1500)、GAPDH(1:2000)和肌动蛋白(1:2000)的一抗获自Cell Signaling Technology。在洗涤后,该膜用缀合有辣根过氧化物酶的二抗(1:5000)培养90分钟。使用增强型化学发光试剂盒(GEhealthcare)按照用户手册中给出的程序检测免疫反应性信号。通过β-肌动蛋白的强度证实了各泳道的相等负荷。
免疫荧光染色
在玻璃盖玻片上接种细胞(2×104个),并在37℃、5% CO2下培养整夜后用新鲜制备的钯(II)配合物(1 μM)或顺铂(10 μM)处理。简而言之,对γH2AX染色,细胞固定在4%低聚甲醛/PBS中(15分钟,RT),用0.3% Triton X-100/PBS透性化(15分钟,在冰上),在0.2% BSA/PBS中封闭(1小时,RT),对γH2AX染色(细胞信号传导,#2577L,1:100稀释,在4℃下,2小时),并用二抗标记(Invitrogen,Alexa Fluor® 568染料,1:200稀释,2小时,RT)。对于DNA染色,细胞用DAPI染色(1:400稀释,在4℃下,15分钟)。载玻片随后用荧光显微镜(ZEISS)可视化。
纯化的TrxR酶分析
用NADPH(0.2 mM)还原重组大鼠TrxR1(ICMO Corp, Sweden;1 nM)并随后在100 mM磷酸钾缓冲液,pH 7.4和1 mM EDTA中用金属配合物(1 nM至1 µM)培养30分钟。使用3 mMDTNB测量酶活性(在O.D.412 nm中的初始提高速率)。
荧光猝灭实验
荧光猝灭实验遵循报道的程序[5]。简而言之,HSA溶液(3 µM,在Tris−HCl缓冲液(0.05M Tris,0.1 M NaCl,pH 7.40)中)在280 nm处激发,并记录发射光谱。随后向溶液中加入该配合物的储备溶液(5 mM/10 mM)的等分试样,并在每个等分试样平衡1分钟后在相同的激发波长下记录发射光谱,直到几乎达到饱和点。应用以下等式确定结合常数
log[(I0−I)/I] = logK + nlog[Q]
其中I0和I分别是不含和含有配合物的HSA的荧光强度;[Q]是配合物浓度。log[(I0−I)/I]对log[Q]的曲线图给出了等于logK的y-截距,并可以相应地获得结合常数。
吸收-滴定实验
根据报道的程序进行吸收-滴定实验[4]。记录该配合物在PBS(含有5% DMSO)中的溶液的吸收光谱,向该溶液中添加ctDNA的储备溶液(2.63 mM)的等分试样,并在每个等分试样平衡1分钟后记录吸收光谱,直到几乎达到饱和点。应用Scatchard方程确定结合常数:
[DNA]/Δεap = [DNA]/Δε+ 1/(Δε×Kb)
其中Δεap = |εA–εF|,其中εA = Abs/[配合物],并且Δε = |εB−εF|,其中εB和εF分别对应于DNA-结合和DNA-未结合的配合物的消光系数。[DNA]/Δεap对[DNA]的曲线图给出了等于1/Δε的斜率和等于1/(Δε×Kb)的y截距,并且由该斜率对该y截距的比率获得K。
线粒体膜电位的测量
在含有补充的培养基的玻璃底培养皿中接种HeLa细胞(2×104个细胞/毫升),并培养24小时,随后在CO2培养箱中在37℃下用2.5 µM或5 µM的该配合物或载体对照物处理2小时。随后将JC-1(5 μM)染色溶液添加到细胞中,并继续培养30分钟。在用无血清培养基洗涤两次后,用荧光显微镜法使细胞可视化。对于阳性对照物,羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP,50 μM)和JC-1(5 μM)与HeLa细胞一起共同培养30分钟,并用荧光显微镜进行检查。用96孔读板器测量J-聚集体和单体形式的JC-1的荧光强度(J-聚集体:激发/发射 = 535/580 nm;JC-1单体:激发/发射 = 485/530 nm)。
蛋白质组学分析
样品制备
HeLa细胞在CO2培养箱中在37℃下用0.5 µM浓度的Pd1d处理2小时和10小时。向HeLa细胞中加入等量的DMSO作为阳性对照物。该细胞随后用冷PBS洗涤两次,用脲裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,8 M脲,混合型蛋白磷酸酶抑制剂,pH 8.0)裂解细胞。随后在1.5毫升微量离心管中刮下该细胞并在4℃下以10,000 rpm旋转15分钟。保留上清液并随后测量蛋白质浓度。随后通过添加5×体积的冰冷丙酮(储存在-20℃下)来沉淀50 µg蛋白质。将样品混合并保持在-20℃下30分钟,随后在4℃下以13,000 rpm离心20分钟。弃去溶剂,片状沉淀物通过SpeedVac(Thermo Fisher Scientific)干燥。干燥的样品用25 μL的悬浮缓冲液(100 mMTris,8 M脲,pH 8.5)重新悬浮,并加入DTT以获得5 mM的最终浓度,以便在60℃下使样品变性。在变性20分钟后,加入碘乙酰胺以获得25 mM的最终浓度。随后使样品在25℃下在黑暗中保持30分钟,加入100 mM Tris(pH 8.5)以便将脲浓度稀释至1 M,并向各反应混合物中加入0.5 μg胰蛋白酶,接着在37℃下消化整夜。随后通过添加10 μL甲酸将该反应混合物酸化以停止蛋白酶解。在以14,000 rpm离心15分钟后,将上清液转移到新的试管中(在-80℃下冷冻以便长期储存)。通过StageTips将所得肽脱盐并富集。对每个样品,制备三个生物学重复样本。样品用H2O(含有0.1%甲酸,v/v)重新溶解以便进行后续的HPLC-MS/MS分析。
HPLC-MS/MS分析
使用与HPLC在线连接的LTQ Orbitrap Velos Orbitrap MS(Thermo)进行MS分析。分析柱是填充有10 cm长度的C18材料(ODS-A C18 5-μm珠粒,YMC)的自填充PicoTip®柱(360 μm外径,75 μm内径,15 μm尖端,New Objective),配有高压注射泵(Next Advance)。HPLC的流动相是A(在HPLC级H2O中的0.1%甲酸,体积百分比)和B(在HPLC级乙腈中的0.1%甲酸,体积百分比)。通过自动进样器将三微克样品装载到分析柱上,并用2% B冲洗6分钟,随后用2%至40%的线性梯度B洗脱120分钟。对于MS分析,LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(Thermo FisherScientific)以数据依赖模式运行,通过在Orbitrap中的高分辨率(在400 m/z下为6000)全扫描MS1(300–2000 m/z)后接在LTQ中的CID MS2扫描对来自前一次全扫描的20种最丰富的离子进行循环。所选离子用2-Da质量窗口分离,并在它们首次选择用于CID后放入排除名单60秒。
蛋白质识别与定量
使用MaxQuant(版本1.5.0.25)将原始数据直接用于蛋白质识别与定量。数据对IPI人数据库(版本3.87)进行检索,其中使用胰蛋白酶特异性,允许最多两次遗漏的裂解。蛋氨酸氧化设定为可变修饰,并将半胱氨酸的碘乙酰胺衍生物设定为固定修饰。默认设置用于MS1和MS2的质量容差。通过检索反向数据库确定错误发现率(FDR),并将FDR保持在1%。
信号传导途径分析
将定量蛋白质列表(显示为它们的蛋白质ID)上载到ExPlainTM工具(版本3.1,BIOBASE)并转化为基因(显示为其基因符号)用于进一步的信号传导途径分析。先前已经描述了途径分析的程序的细节[9, 10]。
细胞内活性氧类(ROS)测量
使用氧化敏感性荧光染料醋酸二氯二氢荧光素(DCF-DA)在HeLa细胞系中测量细胞内ROS的产生。在用DCF染色之前,HeLa细胞暴露于0.5 µM的配合物1-2小时。绿色荧光强度的提高用于量化细胞内ROS的生成。在以5 µM的最终浓度向培养基中添加DCF之后,细胞在37℃下再培养1小时,收获,用PBS洗涤,并立即用读板器测量荧光信号(激发/发射 = 440/530nm)。
半胱天冬酶活性
分别通过半胱天冬酶底物Ac-DEVD-AMC和Ac-LHED-AMC测定了半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9的活性。简而言之,通过刮片收集细胞并通过离心成丸。随后向细胞丸粒中加入细胞裂解缓冲液(0.5毫升/10厘米板)并均化。细胞裂解物通过离心澄清。200 μl荧光底物溶液(50 μM)和25 μl裂解物溶液在黑色微孔板中混合。该板在37℃下培养。在荧光读板器上读取RFU,激发波长为380 nm,发射波长为460 nm。通过Biorad蛋白质分析测量裂解物的蛋白质浓度。
细胞周期停滞
HeLa细胞(2×105个)用配合物(0.5 μM)处理12小时、24小时和48小时。通过胰蛋白酶化收集细胞,并在-20℃下在70%乙醇中固定30分钟。在固定后,用PBS洗涤细胞两次,并用RNase A(0.1 mg/mL)在37℃下处理1小时。细胞随后用碘化丙锭(10 μg/mL)染色。用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)操纵荧光信号。对每个样本获得10,000个非门控事件。用CellQuest Pro软件分析处于细胞周期不同阶段的细胞群落。
血管生成试验
通过使用体外血管新生试剂盒,将10×稀释缓冲液和ECMatrixTM溶液以1:9的比率混合。将混合物(50 μL)转移到96孔板的每个孔中。将基质溶液在37℃下培养以进行聚合。在1小时后,将在100 μL的DMEM介质中与不同浓度的Pd1a/Pd1d(0.25或0.5 μM)预混合的MS1细胞(50,000个)添加到聚合基质的顶部。在37℃下培养8小时后,在倒置光学显微镜下以100×放大检验血管形成,并使用Sigma Scan Pro.软件进行量化。基于相对于未处理的对照物测得的距离,计算抑制百分比。
伤口愈合分析
MS1细胞在60毫米培养皿上以2×106个细胞/培养皿的密度培养。在24小时后,通过用无菌塑料移液管尖端轻轻移除附着的细胞,在细胞单层中部产生单个伤口。细胞用PBS洗涤两次,并加入5毫升DMEM中不同浓度的Pd1a/Pd1d(0.25或0.5 μM)的溶液。在37℃下培养8小时后,在倒置显微镜下观察细胞向伤口中的迁移。
使用LC-MS/MS量化小鼠肿瘤和血浆中的Pd1d
带有NCI-H460癌细胞的异种移植物的裸小鼠用Pd1d以2 mg/kg经8次重复剂量的腹腔内注射处理17天。对小鼠施以心脏穿刺。向收集的血液(大约600-800 µL)中以10:1的比率添加Na2EDTA(20 mg/mL)以防止凝结,离心(4℃下3500 rpm离心15分钟)并将血浆转移至离心管中。收获小鼠肿瘤并解剖成片,称重。通过组织匀浆器将各称重的组织在1×PBS(1:3,w/v)中均化。血浆和均化的组织样品均储存在-80℃下直到对其进行分析。
色谱和质谱条件
在Waters ACQUITYTM UPLC系统和配备有电喷雾离子源(Micromass MSTechnologies)的Waters Q-TOF PremierTM质谱仪上进行分析。使用Waters MassLynx版本4.1进行数据采集和分析。通过连接到Waters ACQUITYTM BEH C18保护柱(5×2.1 mm内径,1.7 µM)上的Waters ACQUITYTM BEH C18柱(100×2.1 mm内径,1.7 µM)用在水中0.1%甲酸(A)和在乙腈中0.1%甲酸(B)组成的梯度洗脱体系实现分离。通过使用以下实现分离:0至3分钟5-55%的B;3至15分钟55-90%的B;15至25分钟90-100%的B;25至30分钟100%的B,返回初始条件并平衡3分钟。流量为0.4毫升/分钟,注射体积为2 µL。
质谱仪以正模式运行,条件优化如下:源温度120℃;去溶剂化温度500℃;雾化气体流量800 L/h;进样锥气体流量20 L/h;毛细管电压3 kV;采样锥电压25 V。将数据收集到两个单独的数据通道中,仪器对各通道的数据采集花费0.5秒,通道间延迟为0.1秒。TOF扫描范围为100至1000 Da。对Pd1d量化的优化碎裂过渡为m/z 517.2→337.0,碰撞能量为37eV。
标样和样品制备
使用甲醇制备各分析物的储备溶液(2 µM)。对它们施以连续稀释以获得以下Pd1d浓度:0.005、0.01、0.05和0.1 µM。使用简单和快速的蛋白质沉淀方法进行样品制备。将来自各种浓度的各种分析物的100 µL体积转移到离心管中并通过浓缩器蒸发至干燥。加入空白血浆/肿瘤匀浆(100 µL),随后加入乙腈(300 µL),将混合物涡旋10秒并离心(15000 rpm)15分钟。收集上清液并通过浓缩器蒸发至干燥。加入甲醇(100 µL),随后再次涡旋10秒并离心(15000 rpm)15分钟。对上清液(2 µL)施以LC-MS分析。以类似的方式制备分析物处理的血浆和肿瘤。
支持表
表S1. 配合物Pd1a的晶体数据
表S2. 配合物Pd1c的晶体数据
表S3. Pd1a的键距
表S4. Pd1c的键距
表S5. Pd1a的键角
表S6. Pd1c的键角
表S7. 钯(II)配合物的UV-可见吸收数据
表S8. 通过钯(II)Pd1a-Pd1d、Pdiso、PdPPh3、反式-[Pd(NHC)2Cl2]、[Pd(C^N^N)Cl]和金诺芬抑制纯化的TrxR
表S9. 在不同时间点在Pd1a和Pd1d(0.5 µM)处理后的细胞周期各阶段中细胞的百分比
参考文献
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Claims (10)
1.用于治疗癌症的药物组合物,包含具有式I的环金属化N-杂环卡宾配合物或其药学上可接受的盐:
其中
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为烷基或-H;
R6和R7独立地为烷基链;
A为OSO2CF3、Cl、PF6或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
2.权利要求1的式I的药物组合物,其中,
R1、R2、R3、R4和R5各自为-H;
R6和R7为C2烷基链;
A为OSO2CF3、Cl、PF6或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
3.权利要求1的式I的药物组合物,其中,
R1、R2、R3、R4和R5各自为-H;
R6和R7为C3烷基链;
A为OSO2CF3、Cl、PF6或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
4.权利要求1的式I的药物组合物,其中,
R1、R2、R3、R4和R5各自为-H;
R6和R7为C4烷基链;
A为OSO2CF3、Cl、PF6或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
5.权利要求1的式I的药物组合物,其中,
R1、R2、R3、R4和R5各自为-H;
R6和R7为C1至C4烷基链的组合;
A为OSO2CF3、Cl、PF6或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
6.用于治疗癌症的药物组合物,包含具有式II的环金属化配合物:
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为烷基或-H;
R6是
或;
A为OSO2CF3、Cl、ClO4或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
7.权利要求5的式II的药物组合物,其中,
R1、R2、R3、R4和R5各自为-H;
R6是
;
A为OSO2CF3、Cl或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1。
8.用于治疗癌症的药物组合物,包含具有式III的环金属化N-杂环卡宾配合物或其药学上可接受的盐:
其中,
R1、R2、R3和R4各自独立地为烷基链。
9.权利要求7的式III的药物组合物,其中,
R1、R2、R3和R4各自为C2烷基链、C3烷基链或C4烷基链。
10.用于治疗癌症的药物组合物,包含具有式IV的环金属化N-杂环卡宾配合物或其药学上可接受的盐:
其中,
R1是含有任何芳环/取代芳环的取代基,所述芳环不限于苯、萘、噻吩、苯并噻吩、蒽、芘、呋喃、嘧啶、吡咯、吡啶、芴、咔唑、碳硼烷;或任何烷氧基链,所述烷氧基链不限于甲氧基、乙氧基;或含有任何饱和烃链的取代基,所述饱和烃链不限于烷烃、乙烷、丙烷、丁烷;
R2和R3独立地为C1-C4烷基链;
A为OSO2CF3、Cl、PF6或药学上可接受的阴离子;
n为+1;
b为-1;和
y为1;
环A是向钯(II)离子提供阴离子碳供体的任何芳环/取代芳环;其不限于苯、萘、噻吩、苯并噻吩、蒽、芘、呋喃、嘧啶、吡咯、吡啶、芴、咔唑、碳硼烷;和
环B是具有与钯(II)离子配位的氮的任何芳环/取代芳环;其不限于嘧啶、吡啶、异喹啉、1-异喹啉、2-喹啉。
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CN102741262A (zh) * | 2009-10-28 | 2012-10-17 | 香港大学 | 用于治疗癌症的含有环金属n-杂环卡宾络合物的药物组合物 |
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2017
- 2017-07-31 WO PCT/CN2017/095174 patent/WO2018028453A1/en active Application Filing
- 2017-07-31 CN CN201780049254.4A patent/CN109803976B/zh active Active
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WO2018028453A1 (en) | 2018-02-15 |
CN109803976B (zh) | 2022-02-11 |
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