CN109796966A - 一种次氯酸比率荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种次氯酸比率荧光探针，是由豆素荧光团(能量供体)、(E)‑4‑(4‑(二乙胺基)‑2‑羟基苯乙烯基)‑1‑甲基吡啶氯盐(能量受体)和酰基哌嗪(链接基团)构成。其化学结构式如式(I)所示。本发明的探针能够选择性地与次氯酸作用，随着次氯酸浓度的增加，其荧光发射强度在478nm处逐渐增强，在610nm处逐渐减弱；二者比值(I₄₇₈/I₆₁₀)与次氯酸浓度在一定范围内呈线性关系。本发明的探针能够在培养的细胞内实现比率成像，有望在工业生产和临床医学检测中发挥作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种次氯酸比率荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种比率荧光探针及其应用，尤其涉及一种基于荧光共振能量转移机理的次氯酸比率荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

次氯酸是生物体内的一种重要的活性氧，由氯离子和过氧化氢在过氧化酶的催化下生成，作为内源性杀菌剂能够抵抗细菌入侵，在生物体内起着至关重要的作用。另一方面，次氯酸生成量的失控与某些疾病密切相关，如：关节炎、肾脏疾病、肺损伤、动脉硬化以及肿瘤等疾病。为了研究体内次氯酸的生理、病理作用，发展生物体内次氯酸成像技术、实时检测细胞内次氯酸的时空与浓度分布具有重要的意义。

次氯酸荧光探针具有高选择性、超灵敏性及快速响应等优点，吸引了科学家的广泛关注[H.Zhu et al,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,12820；Q.A.Best et al,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,13365]；比率荧光探针因其能够有效消除环境、探针浓度及激发光强度的干扰而备受青睐[L.Yuan et al,Acc.Chem.Res.,2013,46,1462]。在众多类荧光比率探针中，基于FRET机理的比率荧光探针是能量供体荧光团通过连接单元与能量受体荧光团连接而成。能量供体吸收能量后转移到能量受体，能量受体发射荧光。依据被检测物的浓度变化，供体荧光和受体荧光强度发生变化，因而两者的荧光强度比率与被检测物的浓度呈现线性关系。为了兼顾能量传递效率以及两个发射波长之间的距离，需要研究开发能量供体及能量受体荧光团，构成新的FRET体系。因此，开发新的基于FRET机理的次氯酸比率荧光探针意义重大。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于FRET机理的次氯酸比率荧光探针及其应用。

本发明所述的基于FRET机理的次氯酸比率荧光探针，其特征在于：所述荧光探针由作为能量供体的香豆素荧光团、作为能量受体的(E)-4-(4-(二乙胺基)-2-羟基苯乙烯基)-1-甲基吡啶氯盐和作为链接基团的酰基哌嗪构成；其化学结构式如式(I)所示，

上述次氯酸比率荧光探针的制备方法是：用已知方法合成1-(2-(4-(7-(二乙胺基)-2-氧代-2H-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-2-氧乙基)-4-甲基吡啶-1-盐氯化物，然后与4-(二乙基胺基)-2-羟基苯甲醛缩合反应，即得到所述次氯酸比率荧光探针。

本发明所述的次氯酸比率荧光探针在检测含次氯酸样品中的应用。

其中：所述含次氯酸样品优选是培养的细胞或含次氯酸的溶液。

本发明所述的探针在无次氯酸的条件下，能量供体被激发后将能量传递给能量受体，能量受体发射荧光；在次氯酸存在下，能量受体单元中的双键与次氯酸发生反应生成稠环衍生物，见图1，从而将阻断能量转移，能量供体被激发时，能量供体发射荧光。根据次氯酸的浓度不同，两个发射波长的荧光强度发生改变；从而达到比率荧光检测次氯酸的效果。

具体的：配制含本发明所述的次氯酸比率荧光探针的乙醇与PBS缓冲液(v/v＝4:6，pH＝7.4)的溶液，分别加入定量的活性氧或活性氮的水溶液，如：t-BuOOH,t-BuOO^.,H₂O₂,HO^.,NOOO^-,¹O₂,Hcy,GSH，Cy及HOCl。然后对上述溶液进行荧光测试，结果表明上述探针对次氯酸有很好的选择性，见图2。

本发明所述的荧光探针随次氯酸浓度的增加，478nm处荧光强度逐渐增强，610nm处荧光强度逐渐减弱；二者比值相对次氯酸浓度在一定范围内呈线性关系。所以该探针能够定量检测低浓度的次氯酸，见图3。

在加入本发明所述的次氯酸比率荧光探针的RAW264.7活细胞中，对照不加LPS(对照组A)和加入LPS(LPS：细胞产生次氯酸的刺激剂)(对照组B)的细胞荧光显微成像变化。可以看出对照组A细胞红色通道荧光较强，蓝色通道荧光较弱；对照组B红色通道荧光较A组减弱，蓝色通道荧光较A组增强；其蓝色通道荧光与红色通道荧光强度统计值的比值变化非常明显，见图4。

综上，本发明所述的基于FRET机理的次氯酸比率荧光探针不仅可以定量检测低浓度次氯酸，而且能够用于细胞内的比率成像；所以有望在工业生产和临床医学检测中发挥作用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述的次氯酸探针与次氯酸反应生成产物的核磁共振谱(¹H NMR)。

图2为本发明所述的次氯酸探针对各种活性氧、活性氮等被分析物响应荧光强度比柱状图。

图3为本发明所述的次氯酸探针在478nm与610nm处的荧光强度变化(A)，及其比值与次氯酸浓度间的线性关系图(B)。

图4为本发明所述的次氯酸探针在RAW264.7细胞内荧光显微成像图(A)，蓝色通道(450-555nm)和红色通道(560-700nm)。

其中：一组细胞用本发明所述的次氯酸探针(2μM)溶液孵化2小时后的蓝色和红色通道成像；另一组细胞先用2μg mL^-1LPS孵化12h后，再用2μM该次氯酸探针溶液孵化2小时。两组成像中，蓝色通道荧光与红色通道荧光强度统计值的比值对比图(B)。

具体实施方式

实施例1

1-(2-(4-(7-(二乙胺基)-2-氧代-2H-色烯-3-羰基)哌嗪-1-基)-2-氧乙基)-4-甲基吡啶-1-盐氯化物(499mg,1mmol)与4-(二乙胺基)-2-羟基苯甲醛(193mg,1mmol)和哌啶0.5mL在乙醇中回流8h，得到混合物。用柱层析(甲醇：二氯甲烷＝1:15)分离产物，提纯即得到本发明所述的次氯酸比率荧光探针，命名ZOC，固体，产率54.1％。

结构确认谱图数据：

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝1.131(t,J＝5.1Hz,12H),3.317-3.750(m,16H),5.569(s,2H),6.247(s,1H),6.303(dd,J＝9.0and 2.1Hz,1H),6.569(s,1H),6.749(dd,J＝8.85and 2.1Hz,1H),7.119(d,J＝15.9Hz,1H),7.474(m,2H),7.959-8.035(m,3H),8.009(d,J＝15.9Hz,1H),8.455(d,J＝6.6Hz,2H),10.204(s,1H)；

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ＝12.77,13.11,44.48,59.68,96.82,97.92,105.18,107.66,109.96,110.95,116.12,121.41,130.67,131.42,139.24,144.72,144.93,151.74,151.86,155.38,157.17,158.99,160.13,164.59,164.89；

IR:(KBr)ν/㎝-1:3422.80,2970.15,2926.98,2869.28,1706.37,1618.10,1578.78,1519.70,1416.05,1354.11,1240.63,1186.18,820.46；

MS(M/Z):[M]+calcd for[C₃₇H₄₄N₅O₅]⁺,638.3337；found 638.3350。

上述荧光探针的制备如下式所示：

实施例2

在装有5μM实施例1制得的次氯酸探针的10ml容量瓶中，用微量进样器分别加入20当量的：t-BuOOH,t-BuOO^.,H₂O₂,HO^.,NOOO^-,¹O₂,Hcy,GSH，Cy及HClO。作用1h后进行荧光测试。

结果表明，该探针只对HClO有较好的响应和选择性。结果见图2。

实施例3

在装有5μM实施例1制得的次氯酸探针的10ml容量瓶中，用微量进样器分别加入不同当量的HClO，作用1h后进行荧光测试。

结果表明，478nm处荧光强度与610nm处荧光强度的比值相对次氯酸浓度在一定范围内呈线性关系。结果见图3。

实施例4

细胞内荧光成像测试：

将RAW264.7细胞转移到小的玻璃瓶中孵化24h后，一组用实施例1制得的次氯酸探针(2μM)溶液孵化2小时，然后PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。另一组用2μg mL^-1LPS孵化12h后，再用2μM该次氯酸探针溶液孵化2小时，接着用PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。

检测中所用激发波长为405nm，蓝色通道收集波长为450-550nm，红色通道收集波长为560-700nm。

两组成像中，蓝色通道荧光与红色通道荧光强度统计值的比值对比图。

结果见图4。

Claims (3)

1.一种次氯酸比率荧光探针，其特征在于：所述荧光探针由作为能量供体的香豆素荧光团、作为能量受体的(E)-4-(4-(二乙胺基)-2-羟基苯乙烯基)-1-甲基吡啶氯盐和作为链接基团的酰基哌嗪构成；其化学结构式如式(I)所示，

2.权利要求1所述的次氯酸比率荧光探针在检测含次氯酸样品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含次氯酸样品是培养的细胞或含次氯酸的溶液。