CN109793705A - 知母皂苷bii温度/离子敏感型鼻用原位凝胶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,包括重量份计的如下原料:知母皂苷BII 25份、泊洛沙姆407 18份、去乙酰结冷胶0.3份、海藻酸钠0.1份、三氯叔丁醇0.5份以及羟丙基‑β‑环糊精2.5份。本发明提供的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶对阿尔茨海默症具有一定的预防和治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域。更具体地说,本发明涉及知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是指一种起病隐匿、多发于中老年的进行性发展的慢性神经退行性疾病,主要表现在认知功能下降和行为障碍。AD发病机制并不明确,主要包括三种显著的病理特征,即β-淀粉样蛋白沉积构成的神经炎性斑、Tau蛋白过度磷酸化所表现的神经元纤维缠结以及脑基底核胆碱能神经元受损伴随的神经元大量丢失]。临床试验发现,神经元细胞炎症损伤同样可以加快AD发生和发展。AD病程长,初期不易被察觉,且由于我国中老年人群尚未重视未病先治的理念,以至于延误疾病的诊断和治疗。
脑靶向递药系统已成为国内外药剂学领域研讨的重点和难点,适用于AD的预防和治疗。但血脑屏障(blood brain barrier,BBB)是阻碍药物进入脑内发挥疗效的最主要生理屏障。鼻黏膜因其具有特殊的生理结构,可通过嗅球部位摄取或三叉神经通路绕开BBB直接靶向药物入脑,实现脑靶向。原位凝胶(In situ hydrogels,ISG)是一种智能化给药制剂,当环境改变可以在局部迅速发生相转变。原位凝胶还具有滞留性好、缓控释、使用方便、生物利用度高等优势。
知母皂苷BII(Timosaponin BII)是中药知母的主要活性成分之一,具备多重药理作用,如体外研究表明知母皂苷BII可以抑制血小板的异常聚集,干扰凝血因子的活性。同样,知母皂苷BII在抗骨质疏、抗抑郁、等方面同样也具有一定的功效和研究意义。但其在预防和治疗阿尔茨海默病的功效还未被关注。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,其对阿尔茨海默症具有显著的预防和治疗作用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,包括重量份计的如下原料:
知母皂苷BII 5~50份、泊洛沙姆407 16~20份、去乙酰结冷胶0.1~0.3份、海藻酸钠0.1~0.3份、抑菌剂0.1~0.5份以及吸收促进剂1~2.5份。
优选的是,所述抑菌剂是尼泊金甲酯、尼泊金乙酯和三氯叔丁醇中的一种。
优选的是,所述吸收促进剂是璜丁基-β-环糊精(SBE-β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、β-环糊精(β-CD)、吐温-80、氮酮中的一种。
优选的是,包括重量份计的如下原料:
知母皂苷BII 5~50份、泊洛沙姆407 16~20份、去乙酰结冷胶0.1~0.3份、海藻酸钠0.1~0.3份、三氯叔丁醇0.1~0.5份以及羟丙基-β-环糊精1~2.5份。
优选的是,包括重量份计的如下原料:
知母皂苷BII 25份、泊洛沙姆407 18份、去乙酰结冷胶0.3份、海藻酸钠0.1份、三氯叔丁醇0.5份以及羟丙基-β-环糊精2.5份。
本发明进一步要求保护知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶的制备方法,包括:
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶于烧杯中,加入适量去离子水,于70~80℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407和海藻酸钠,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5~20h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入抑菌剂和吸收促进剂,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
本发明进一步要求保护知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶在制备预防或者治疗阿尔茨海默病药物中的用途。
本发明至少包括以下有益效果:其一、本发明提供的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶对阿尔茨海默症具有显著的预防和治疗作用;其二、本发明筛选得到了知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶的抑菌剂和吸收促进剂;其三、本发明得到了知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶的优化处方,克服了滴鼻剂等传统剂型局部滞留时间短的缺点。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为不同处方原位凝胶对蟾蜍上颚纤毛结构的影响图(200×);
图2为加入不同促渗剂后透过鼻黏膜的单位面积累计渗透量曲线;
图3为知母皂苷BII原位凝胶对东莨菪碱致小鼠损伤逃避潜伏期的影响图;
图4为知母皂苷BII原位凝胶对东莨菪碱致小鼠损伤避暗穿梭试验的影响图;
图5为小鼠胆碱能M1受体的含量表达图;
图6为小鼠胆碱能M1受体的含量表达柱形图;
图7为小鼠海马H.E.染色图(200×);
图8为不同浓度LPS对PC12细胞存活率的影响图;
图9为不同浓度知母皂苷BII对PC12细胞存活率的影响柱状图;
图10为不同浓度知母皂苷BII对LPS致PC12细胞存活率的影响柱状图;
图11为不同浓度知母皂苷BII对LPS致PC12细胞炎性因子的表达情况图;
图12为不同浓度知母皂苷BII对LPS致PC12细胞骨架的影响图(200×);
图13为小动物活体成像图(注:从左至右依次是空白对照组、灌胃组、鼻腔组)
图14为180min时小鼠的组织荧光分布图;
图15为单次给药后兔眼角膜、虹膜、结膜刺激性情况图;
图16为多次给药角膜、虹膜、结膜观察图;
图17为多次给药后兔眼角膜H.E.染色图(200x)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.3份于烧杯中,加入适量去离子水,于70℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 20份和海藻酸钠0.1份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入三氯叔丁醇0.5份和羟丙基-β-环糊精2.5份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 25份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
实施例2
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.1份于烧杯中,加入适量去离子水,于80℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 16份和海藻酸钠0.3份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置10h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入三氯叔丁醇0.5份和羟丙基-β-环糊精2.5份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 5份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
实施例3
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.2份于烧杯中,加入适量去离子水,于70℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 18份和海藻酸钠0.2份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入三氯叔丁醇0.5份和羟丙基-β-环糊精2.5份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 50份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
实施例4
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.2份于烧杯中,加入适量去离子水,于70℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 18份和海藻酸钠0.2份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入尼泊金乙酯0.1份和璜丁基-β-环糊精2.5份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 50份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
实施例5
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.2份于烧杯中,加入适量去离子水,于70℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 18份和海藻酸钠0.2份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入尼泊金乙酯0.1份和β-环糊精2.5份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 40份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
实施例6
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.2份于烧杯中,加入适量去离子水,于70℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 18份和海藻酸钠0.2份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入尼泊金甲酯0.1份和吐温-80 1份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 35份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
实施例7
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶0.2份于烧杯中,加入适量去离子水,于70℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407 18份和海藻酸钠0.2份,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入尼泊金甲酯0.2份和氮酮2份,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII 20份,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
一、正交实验筛选空白凝胶基质的最佳配比:
根据预试验结果,选取去乙酰结冷胶浓度、泊洛沙姆407浓度、海藻酸钠浓度作为主要影响因素,采用L9(34)正交试验设计,设置3因素3水平(表1),制备不同处方的原位凝胶。
各取2mL原位凝胶放至10mL西林瓶中,加入人工鼻液(V双敏凝胶:V人工鼻液=4:1),于水浴锅中从室温逐渐升温至38℃,每隔30min升温1次,每次升温1℃。快速倾斜西林瓶至不再流动,则认为形成凝胶,记录相变温度及胶凝时间,以相变温度接近34℃、胶凝时间短为指标,筛选最佳处方。
表1正交试验因素和相应水平L9(34)
表2正交试验分析表L9(34)
表2可见,由凝胶时间的极差值得知,影响因素主次为:去乙酰结冷胶浓度(A)>泊洛沙姆浓度(B)>海藻酸钠浓度(C)。鼻腔胶凝时间在3min内为佳,所以初步确定最佳配比为A3B2C1或A3B3C2。
表3正交试验分析表L9(34)
由表3可知,凝胶温度的极差值得知,影响因素主次为:去乙酰结冷胶浓度(A)>泊洛沙姆浓度(B)>海藻酸钠浓度(C)。鼻腔温度为32~34℃,所以初步确定最佳配比为A3B2C1。综合考虑温度/离子双重敏感型原位凝胶的两个指标以及成本问题,最终确定最佳配比为A3B2C1,即18%泊洛沙姆407(w/v)、0.3%去乙酰结冷胶(w/v)和0.1%海藻酸钠(w/v)。
二、蟾蜍上颚黏膜纤毛毒性筛选吸收促进剂、抑菌剂:
1、分组
采用蟾蜍上腭黏膜纤毛摆动试验筛选吸收促进剂和抑菌剂,以毒性最小作为评价指标。1%去氧胆酸钠作为阳性对照、生理盐水作为阴性对照,2.4项下筛选出最优配比的去乙酰结冷胶/泊洛沙姆407/海藻酸钠组作为基础处方(A),在此基础上,分别加入2.5%(w/v)SBE-β-CD组、2.5%HP-β-CD组、2.5%β-CD组、2%氮酮组、1%吐温-80组、0.1%尼泊金甲酯组、0.1%尼泊金乙酯组、0.5%三氯叔丁醇。
按照上述正交试验筛选出的凝胶基质处方配比,精密称取适量去乙酰结冷胶于烧杯中,加入适量去离子水,70-80℃热水浴中充分溶胀,4℃冷却完全。另取适量泊洛沙姆407和海藻酸钠,边搅拌下缓慢加入已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置,得到空白原位凝胶。边搅拌下分别加入备选五种吸收促进剂2.5%SBE-β-CD、2.5%HP-β-CD、2.5%β-CD、2%氮酮、1%吐温-80和三种抑菌剂0.1%尼泊金甲酯、0.1%尼泊金乙酯、0.5%三氯叔丁醇,4℃静置,制得不同处方的知母皂苷BII原位凝胶。
2、离体蟾蜍上颚纤毛毒性实验:
取中华大蟾蜍,随机分成12组,每组3只。迅速将蟾蜍断头,用锋利的眼科手术剪剪约3mm×3mm的上腭黏膜,生理盐水清洗。黏膜纤毛面朝上平铺于载玻片上,于黏膜表面分别滴加100μL生理盐水、1%去氧胆酸钠和上述不同处方的原位凝胶,显微镜下连续观察蟾蜍上颚纤毛的摆动情况。室温下置于密闭的培养皿中,内加少许生理盐水维持湿度。每隔30min观察纤毛的摆动情况,若未停止则继续放回培养皿中,直至纤毛不再摆动,记录纤毛持续摆动的总时间。纤毛摆动停止后,生理盐水清洗上颚黏膜,重复上述操作,观察能否恢复摆动。
纤毛的相对运动百分率=给药组的纤毛摆动总时间/生理盐水组的纤毛摆动总时间。数值越低代表药物对纤毛的影响越大。所得结果见表4。
由蟾蜍上腭黏膜纤毛毒性试验结果可以看出,生理盐水组相对运动百分率最高,去氧胆酸钠组相对运动百分率最低。与空白凝胶A组相比较,氮酮作为吸收促进剂,纤毛相对运动百分率最低,纤毛毒性远远大于环糊精类和吐温-80,而环糊精类安全性高于吐温-80;尼泊金类作为防腐剂,纤毛毒性大于三氯叔丁醇。所以选择三氯叔丁醇作为最优抑菌剂。
表4离体纤毛毒性试验结果
2、蟾蜍上颚黏膜纤毛结构的观察
纤毛运动停止观察后,清洗上颚黏膜,固定于10%甲醛溶液中,上颚黏膜经梯度乙醇脱水后进行二甲苯透化,再用液体石蜡包埋,切片,H.E.染色,最后用中性树胶封片,于显微镜下进行组织病理学检查。
不同处方的原位凝胶对蟾蜍上颚纤毛结构的影响见图1。由图1可知,生理盐水组蟾蜍上颚纤毛结构完整,纤毛摆动频率快,呈麦田状;去氧胆酸钠组未观察到纤毛摆动,纤毛完全脱落,周围出现许多脱落的细胞;A组可观察到纤毛流水状摆动,周围有少量脱落细胞。与A组相比较,添加尼泊金类防腐剂和三氯叔丁醇组均出现细胞脱落,但是三氯叔丁醇组的程度最低,毒性较小;氮酮作为吸收促进剂,没有清晰的纤毛结构,细胞脱落完全,纤毛毒性远远大于环糊精类和吐温-80,而三种环糊精类细胞结构较完整,安全性高于吐温-80。
三、体外鼻黏膜吸收实验筛选最佳吸收促进剂
羊鼻黏膜的剥离:沿头部稍偏于中线的位置劈开,剪下鼻中隔,沿鼻中隔软骨位置小心剥离鼻黏膜,生理盐水清洗,于4℃生理盐水保存。
体外吸收实验:Franz扩散池法,其中接收液:9.9mL生理盐水;搅拌速度:300r·min-1;水浴温度:36.5℃;取样体积:1.5mL;渗透膜:羊鼻中隔黏膜;有效扩散面积:1.47cm2。
取处理好的羊鼻黏膜,黏膜纤毛面朝上,紧密包裹于给药池与接受池之间,接收池充满生理盐水。36.5℃条件下,给药室中加入100μL人工鼻液和200μL 250mg·mL-1知母皂苷BII温度/离子原位凝胶,排除气泡,于15、30、45、60、90、120、180min取样1.5mL并补等温等量生理盐水,每组平行测定三次。HPLC法测定样品中知母皂苷BII的含量,计算单位面积上羊鼻黏膜的累积渗透量。
表5加入不同促渗剂后透过鼻黏膜的平均累积渗透量
含不同吸收促进剂的知母皂苷BII原位凝胶与空白凝胶相比,显著提高了单位面积上药物透过鼻黏膜的累计渗透量(图2,表5),吸收促进剂的促透效果依次为:2.5%HP-β-CD>2.5%SBE-β-CD>2.5%β-CD,综合毒性实验和体外吸收实验,选择2.5%HP-β-CD为最佳吸收促进剂。
通过正交试验设计确立了在制备工艺中泊洛沙姆407、去乙酰结冷胶、海藻酸钠的用量比是影响胶凝温度和胶凝时间的主要因素,筛选出最佳配比18%(w/v)泊洛沙姆407、0.3%(w/v)去乙酰结冷胶、0.1%(w/v)海藻酸钠。经离体蟾蜍上颚纤毛毒性试验,观察纤毛摆动情况、纤毛脱落程度和脱落细胞数量和苏木精-伊红染色,判断并筛选出较为安全的抑菌剂三氯叔丁醇和毒性较小的三种β-环糊精类吸收促进剂,再结合羊鼻黏膜体外Franz扩散池法得到促透效果最佳的吸收促进剂HP-β-CD。
四、知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶对不同AD小鼠模型预防作用的实验
1、知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶对东莨菪碱诱导的AD小鼠学习记忆能力和胆碱能受体的影响
动物:ICR小鼠,健康,雄性,SPF级,体重26~28g,采购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2016-0011。
分组及给药:42只雄性ICR小鼠适应性饲养2天,进行水迷宫训练,剔除差异明显者。随机分为7组,即正常组、模型组、空白凝胶组、盐酸多奈哌齐生理盐水溶液组、5mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1知母皂苷BII原位凝胶组(实施例1所得知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶),每组6只。盐酸多奈哌齐组小鼠连续灌胃给药30天,每天给药1次,给药剂量为0.03mg·d-1。知母皂苷BII组和空白凝胶组小鼠分别进行鼻腔给药,每天3次,连续30天,每日给药容积为3mL·kg-1;正常组和模型组不做处理。
模型建立:于给药第26-30天给药后1小时,模型组及各给药组小鼠分别腹腔注射0.2mL的东莨菪碱水溶液,给药剂量为0.5mg·kg-1建立AD模型,正常组不做处理。
空间学习能力的考察:
Morris参数设置:Morris水迷宫主要由一圆形水池和一可移动的平台两部分构成。水池分别与摄像机和计算机相连接,水池高度为40m,直径为120cm,平台直径为8cm。加水至深度为20cm,池中滴少许墨汁使池水成乌黑色,平台同样为黑色,低于水面1cm。室温22±2℃,水温为25±1℃,维持光线均匀,室内安静。水池上缘等距离的设置东、南、西、北4个标记点作为小鼠入水点,等分为四个象限,平台固定于任一象限。
定位航行实验:于给药第26-28天,采用小鼠Morris水迷宫测试仪,测定小鼠的空间学习能力。每组小鼠于试验前10分钟分别腹腔注射东莨菪碱,正常组不做处理。实验时将小鼠放于从任一象限,头朝壁入水中,Morris录像记录系统记录小鼠自主找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)和游泳路径。小鼠登上平台后使其休息15s,若60s内找不到平台,则按60s计,引导小鼠登上平台,休息15s后按照规定次序完成下一象限的航行实验。每日定于固定时间段进行试验。每只小鼠的4次逃避潜伏期的平均值作为当日的成绩。
实验数值以表示,采用SPSS 16.0中One-way ANOVA判断各组间差异的显著性,以p<0.05或p<0.01表明具有显著性差异。
如图3,模型组逃避潜伏期较正常组明显增加(p<0.01),其余各给药组逃避潜伏期也较正常组有所延长,说明东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍模型建造成功。与模型组比较,空白凝胶组和知母皂苷BII 5mg·kg-1逃避潜伏期减低,但无显著性差异(p>0.05),并不能明显改善其空间记忆能力。盐酸多奈哌齐组、知母皂苷BII 10、20mg·kg-1与模型组比较,随时间的延长均具有明显下降(p<0.01)。知母皂苷BII 10~20mg·kg-1与盐酸多奈哌齐组比较,无显著性差异(p>0.05)。知母皂苷BII可以显著降低小鼠的记忆损伤,提高空间学习记忆能力。
避暗穿梭学习能力的考察:
穿梭模式:穿梭;测定通道数:2个;电压:40V;电流:0.6mA;穿梭警示信号:灯光+声响;警示信号延时时间:10s;穿梭电击延迟时间:15s;穿梭测试周期时间:20s;避暗测定时间:5min;穿梭次数:10次。
避暗穿梭试验是一种检测联想记忆的经典方法,两个相同串通的性子,下面的电栅轮流通电,通电前有声光提示,小鼠很快将声光信号与电栅电击联系起来,一有灯光声响时就迅速逃到无电的另一箱中,当该箱灯亮声响时又逃回另一箱中形如穿梭。受试动物从开始被动逃避到能把灯光声响与电击联系起来主动回避,这个学习过程越短则记忆能力越好。提高记忆的药物能明显缩短受试动物学习过程,并在同时间内主动回避的比例也将高于被动回避的比例。
于给药第29、30天,通过避暗穿梭试验,测定小鼠的联想记忆能力。开始时先将小鼠头背着洞口放入串联的箱子,先适应环境3min,电栅轮流通电。小鼠喜暗自觉进入暗室,暗室有电击,其正确反应则是回到无电击明室。电网持续通电5min,记录5min内小鼠进入暗室被电击的次数(该过程为被动回避次数),完成训练程,作为小鼠的学习成绩。24h后,正式测试,记录小鼠5min内避暗穿梭的被动回避次数。
如图4,避暗穿梭试验结果可以看出,模型组5min内被动穿梭次数明显多于正常组(p<0.01),模型组小鼠联想记忆能力明显下降,而其他各给药组被动穿梭次数均高于正常组,说明造模成功。空白凝胶组和知母皂苷BII 5mg·kg-1被动穿梭次数较模型组稍有降低,但不显著(p>0.05)。而阳性药盐酸多奈哌齐,知母皂苷BII 10mg·kg-1和20mg·kg-1剂量组被动穿梭次数明显低于模型组(p<0.05)。BII 20mg·kg-1与盐酸多奈哌齐组无显著性差异(p>0.05),进一步佐证知母皂苷BII可以一定程度上改善东莨菪碱致AD小鼠模型的学习记忆能力,起到预防作用。
Western Blot检测小鼠胆碱能M1受体的表达水平:
避暗穿梭试验结束后,迅速用锋利的手术剪刀剪断小鼠头部,快速在冰上剥离海马组织冻存于液氮中,通过蛋白质免疫印迹分析法(Western Blot)测定各样品中胆碱能M1受体的表达量。
图5和图6可以看出,与正常组相比,模型组小鼠海马中M1受体密度灰度值明显下降(p<0.01),而盐酸多奈哌齐组灰度无明显差异。空白凝胶组及知母皂苷BII 5mg·kg-1与模型组灰度相比差异不明显(p>0.05)。知母皂苷BII 10~20mg·kg-1灰度较模型组显著增加(p<0.05)。知母皂苷BII 20mg·kg-1与盐酸多奈哌齐组差异不明显(p>0.05),说明知母皂苷BII连续预防给药30天,可以明显上调模型动物的胆碱能M1受体。
行为学试验完毕,处死取海马组织。加入适量提前预冷的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。取10mg小鼠海马组织加入100μL RIPA裂解液,匀浆。-20℃孵育20min,15000×g,4℃,离心20min。取上清,保存于-80℃,备用。
采用BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋白浓度。根据样品数量,按照筛选的比例配制适量BCA工作液,摇匀。取10μL蛋白标准品加BCA工作液稀释至100μL,摇匀,使其终浓度为0.5mg·mL-1。分别加入0、1、2、4、8、12、16、20μL标准品于96孔板对应孔中,再加入标准品稀释液至每孔总体积为20μL。待测样品同样加至96孔板对应孔中,再加入标准品稀释液至每孔每孔总体积为20μL。各实验孔继续加入200μL BCA工作液,37℃,平衡30min。测定570nm下的吸光度值,建立标准曲线并计算M1受体的浓度。
通过RIPA裂解液来调整M1受体浓度,使其终浓度为2ug·uL-1,95℃,变性5min。
根据M1受体的分子量,配制5%浓缩胶。设定电泳浓缩胶恒压为80V,时间为20min,分离胶恒压120V。每孔分别上待测样品20μg。
湿法转膜:恒流300mA,0.45um孔径PVDF膜,转膜时间90min,转膜完成后进行染色,观察转膜效果。
封闭:将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配),封闭1h。
一抗孵育:5%BSA-TBST稀释一抗,4℃孵育过夜。
洗膜:用TBST在室温下脱色摇床上清洗3次,每次5min。
二抗孵育:用5%BSA-TBST稀释二抗,山羊抗鼠,山羊抗兔IgG 1:10000,室温孵育40min。
化学发光:TBST清洗3次,每次10min。滴加化学放光剂至膜的蛋白面,反应3~5min,胶片曝光0.17~5min,显影2min,定影。
凝胶图像分析:将胶片进行扫描存档,PhotoShop整理去色,Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
脑组织病理学检查:取小鼠全脑固定于10%甲醛溶液中,脑组织经梯度乙醇脱水后进行二甲苯透化,再用液体石蜡包埋,切片,H.E.染色,最后用中性树胶封片,于显微镜下观察组织病理学改变。
如图7所示,正常组海马CA1区为3~4层锥体神经细胞呈栅栏状排列,锥体神经细胞核圆形,核膜清楚,染色质稀疏,有核仁;胞体胞浆淡蓝色,突起胞浆淡红色。模型组海马CA1区有明显改变,锥体细胞层不完整,锥体细胞排列紊乱、稀疏,神经元数目较正常组减少,其中一些细胞核固缩深染。盐酸多奈哌齐组与正常组相比,差异性不大。知母皂苷BII5mg·kg-1组小鼠海马CA1区出现细胞周隙增宽。知母皂苷BII 10~20mg·kg-1组小鼠海马CA1区病理改变较模型组明显减轻,其锥体细胞层较完整,神经元数目未出现明显减少。说明知母皂苷BII可以保护海马区神经元的结构。
采用东莨菪碱作为模型药物,建立AD小鼠模型。知母皂苷BII原位凝胶连续鼻腔给药30天,通过行为学考察,得出知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶剂量为10~20mg·kg-1可以显著降低小鼠逃避潜伏期和被动穿梭次数,增强小鼠的空间学习记忆能力和联想记忆能力。Western blot试验结果显示知母皂苷BII能够显著上调小鼠脑内乙酰胆碱M1受体表达水平。脑组织病理学结果看出知母皂苷BII对小鼠海马神经细胞具有保护作用。
五、知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶对脂多糖致PC12细胞损伤的治疗
细胞:大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞),由中国人民解放军空军总医院制剂实验室提供。
细胞培养:完全培养基的配制:1640:FBS:双抗=9:1:0.1(v/v/v)。
双抗的配制:各取1瓶青霉素和链霉素,分别加入4mL、5mL无菌生理盐水,震荡摇匀。各取2mL稀释至40mL,得到1万U/mL青霉素和1万U/mL链霉素的混合液,分装,封口,-20℃保存。
冻存液的配制:1640:FBS:DMSO=7:2:1(v/v/v)。
取出液氮中冻存的PC12细胞,迅速于37℃水浴不断摇晃加速融化。将细胞悬液转移至含1640完全培养基中,100×g,离心5min。吸弃上清液,加入3mL 1640完全培养基,轻轻吹打重悬细胞,分瓶培养,置于5%CO2,37℃饱和湿度下,隔天更换新鲜培养基。
待细胞长至约80~90%时,弃去旧培养基,加入适量的PBS洗涤三次;室温下,加0.25%胰蛋白酶2mL消化,显微镜下观察细胞形态,出现变圆欲脱离瓶壁时,迅速加入等体积的完全培养基终止消化。轻轻吹打并转移至离心管中,100×g,离心5min。PBS重悬,再次离心,吸弃上清液,完全培养基重悬,分瓶传代培养。
待细胞生长至瓶底90%时,吸弃废培养基,PBS洗涤三次。室温下,加0.25%胰蛋白酶2mL消化,轻拍瓶外壁加速细胞脱落,显微镜下观察细胞形态,出现变圆欲脱离瓶壁时,迅速加入等体积的完全培养基终止消化。轻轻吹打并转移至离心管中,100×g,离心5min。PBS重悬,再次离心,吸弃上清液。加适量冻存液,吹打混匀后转移至冻存管,4℃放置1~2h,-20℃放置3~4h,-80℃过夜,最终液氮中储存。
细胞损伤模型的建立:
筛选神经炎症模型LPS诱导PC12细胞损伤的最佳浓度,设立正常组、空白对照组、LPS 0.625、0.125、0.25、0.5、1、2mg·mL-1组。取对数生长期的PC12细胞进行消化、计数(5000~10000个/孔)、接种于96孔板,每孔100μL,各组平行测定6次。待细胞贴壁后,以换液的形式加入含不同浓度LPS的完全培养基,正常组和空白对照组加入等体积的完全培养基,各自培养24h。各组再以换液形式加入含10%CCK-8的完全培养基,培养1~2h。450nm和630nm波长下测定的各组的吸光度值,计算细胞存活率,筛选出细胞存活率为50%左右时,LPS的致损伤浓度。细胞存活率(%)=(药物处理组A450nm-630nm-空白对照组A450nm-630nm)/(正常对照组A450nm-630nm-空白对照组A450nm-630nm)×100%。
知母皂苷BII原位凝胶对PC12细胞存活的影响:为了确立不同浓度知母皂苷BII单独使用对PC12是否有细胞毒性,设立正常组、空白对照组、知母皂苷BII 0.3125、0.625、1.25、2.5、5mg·mL-1组。取对数生长期的PC12细胞进行消化、计数,以5000~10000个/孔的浓度接种于96孔板,每孔100μL,空白对照组各复孔不加细胞。待细胞贴壁后,每孔加入100μL 0.3125、0.625、1.25、2.5、5mg·mL-1知母皂苷BII的完全培养基溶液,,正常组和空白对照组加入100μL完全培养基,培养24h。各组再加入含10%(v/v)CCK-8完全培养基溶液,培养1h。每个样品设6个复孔。使用酶标仪于450nm和630nm波长下测定各样品吸光度值,计算细胞存活率。细胞存活率=(A给药组-A空白对照组)/(A正常对照组-A空白对照组)。
如图8,不同浓度的LPS单独作用于PC12细胞,可以看出LPS致PC12损伤随浓度的增加细胞存活率降低,具有浓度依赖性。LPS的致损伤浓度在1.25mg·mL-1时,细胞存活率在50%(p<0.01)左右。而当LPS浓度<1.25mg·mL-1时,与正常组相比,细胞存活率有所下降,但是没有显著性差异(p>0.05)。当LPS浓度>1.25mg·mL-1时,与正常组相比,细胞存活率显著性降低(p<0.01),说明对细胞的损伤较严重。
如图9,不同浓度知母皂苷BII单独作用PC12细胞,可以看出细胞存活率不具备浓度依赖性。与正常组相比,知母皂苷BII随浓度的增加,细胞存活率均在80%(p>0.05)以上,对PC12细胞基本无影响。
知母皂苷BII原位凝胶对LPS诱导的PC12细胞损伤的保护作用:设立正常组、空白对照组、知母皂苷BII 0.3125、0.625、1.25、2.5、5mg·mL-1组。取对数生长期的PC12细胞消化、计数(5000~10000个/孔)、接种于96孔板,每孔100μL,组平行测定6次。待细胞贴壁后,加入含不同浓度知母皂苷BII的完全培养基预处理12h,各组再以换液形式加入2.2项下筛选出最佳损伤浓度的LPS,继续培养8h,正常组和空白对照组加入等体积的完全培养基。加入10%CCK-8的完全培养基,培养1~2h,450nm和630nm波长下测定的各组的吸光度值,计算细胞存活率。
如图10,知母皂苷BII 0.3125~0.625mg·mL-1对LPS致PC12细胞存活率与模型组无显著性差异。知母皂苷BII 1.25,2.5和5mg·mL-1作用于PC12细胞12h,可以显著性提高(p<0.01)LPS诱导PC12致细胞存活率。
ELISA检测细胞上清TNF-α和IL-1β的表达:
PC12细胞分别用知母皂苷BII 0.3125、0.625、1.25、2.5、5mg·mL-1预处理12h,以换液的形式加入2.2项下筛选LPS的最佳致损伤的浓度,继续作用PC12细胞8h,刺激PC12细胞炎性损伤,收集各组细胞上清液,100×g,离心10min,取上清,用ELISA试剂盒检测PC12细胞上清液中炎性因子TNF-α和IL-1β表达情况。
取出已平衡至室温的实验用板条,加不同浓度的标准品和待测样品,建立随行标曲,空白孔加入100μL标准品和标本通用稀释液。反应孔紧密封口,于37℃恒温培养箱中孵育90min。
提前20min稀释生物素化抗体工作液。计时结束将板取出,洗涤液洗板5次。
标本孔及标准品孔加入已稀释的生物素化抗体工作液,空白孔加入100μL空白抗体稀释液。反应孔紧密封口,37℃恒温培养箱孵育60min。
提前20min稀释酶结合物工作液,室温避光放置。计时结束将板取出,洗涤液洗板5次。
标本空及标准品孔加入已稀释的酶结合物工作液,空白孔加入100μL酶稀释液。反应孔紧密封口,37℃恒温培养箱避光孵育30min。
将板取出,洗涤液洗板5次。
各组实验孔加入100μL显色底物。反应孔紧密封口,37℃恒温培养箱避光孵育15min。
各组实验孔加入100μL终止液。混合均匀后,3min内测定450nm处各孔的吸光度值,记录数据。
知母皂苷BII原位凝胶对LPS致PC12细胞F肌动蛋白的结构的影响
PC12细胞接种于六孔板(50000个/孔),分别加知母皂苷BII 0.3125、0.625、1.25、2.5、5mg·mL-1预处理12h,然后加入2.2项下筛选出最佳损伤浓度的LPS,孵育8h,吸弃旧培养基,4%的多聚甲醛固定15min。PBS清洗3次;含0.5%牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)的PBS封闭,0.1%聚乙二醇辛基苯基醚透化10min;PBS清洗3次;在25℃±2℃温度下,用1μmol·L-1罗丹明标记的鬼笔环肽继续培养PC12细胞30min;PBS清洗3次,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核;PBS清洗3次,荧光显微镜下进行观察PC12细胞的结构。
如图11,模型组PC12细胞与正常组相比较,上清液中释放炎性因子TNF-α和IL-1β的浓度显著增加(p<0.01)。BII 0.3125~5mg·mL-1提前作用于PC12细胞12h,能显著抑制LPS所致IL-1β水平的升高(p<0.01);BII 1.25~5mg·mL-1提前作用于PC12细胞12h,能显著抑制LPS所致TNF-α水平的升高(p<0.01),说明知母皂苷BII在具有一定的抗炎作用。
如图12,通过荧光显微镜进行观察,正常组PC12细胞内F肌动蛋白细胞膜染色清晰,分布均匀,骨架完整。LPS模型组PC12细胞骨架散乱,细胞轮廓不清晰;BII 0.5mg·mL-1组细胞骨架与LPS组比较无明显差异;BII 1mg·mL-1及2mg·mL-1组细胞骨架结构完好,细胞形态完整,F肌动蛋白分布均匀。表明知母皂苷BII可以预防LPS诱导的PC12细胞F肌动蛋白骨架损伤,起到保护治疗作用。
知母皂苷BII原位凝胶可以显著抑制LPS诱导的PC12细胞损伤,并且显著降低细胞炎性因子TNF-α和IL-1β的表达,保护细胞F肌动蛋白的结构功能。知母皂苷BII具有良好的抗炎作用,保护神经元骨架结构,中枢神经系统具有保护治疗作用。
六、知母皂苷BII温度/离子敏感型原位凝胶的脑靶向作用研究
动物:BALB/c小鼠,健康,SPF级,体重22-24g,雄性,购于北京维通利华动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0006。
方法:精密称取0.12mg Cy7溶于60μL温度/离子敏感型原位凝胶(实施例2所提供的原位凝胶),得到2mg·mL-1Cy7的温度/离子敏感型原位凝胶,4℃避光保存。精密称取0.40mg Cy7溶于200μL生理盐水溶液,得到2mg·mL-1Cy7的生理盐水溶液,4℃避光保存。
取3只Balb/c小鼠分别作为空白对照组、灌胃2mg·mL-1Cy7生理盐水溶液组和鼻腔给药2mg·mL-1Cy7温度/离子敏感型原位凝胶组。以745nm作为激发波长,于给药后5、30、60、90、120、180min进行荧光成像。
180min观察后,处死动物,分离各组心、肝、脾、肺、肾、膀胱、全脑,测定荧光分布。
1、鼻腔与口服给药在体荧光分布
如图13,口服组在给药后在5~60min时,开始富集在胃肠部分,肝肾有微弱荧光,而心和脾脏几乎无荧光。90min时,小肠部位荧光最强。鼻腔给药后5min时,药物首先在脑部富集,然后逐渐分布到动物全身。与5min相比,30min时药物在脑部有较高的分布,其次是在肝、心、肺、肾荧光强度增加等。60~90min时脑部的荧光强度仍是最强,并开始逐渐降低。180min时,组织中的荧光强度在7个时间点中最低。口服给药只能通过胃肠道进行吸收,无法实现脑靶向。而温度/离子敏感型原位凝胶可以起到滞留作用,实现脑靶向。
2、鼻腔与口服给药的组织荧光分布
如图14,180min后各组脱颈椎处死,解剖组织进行荧光成像,发现口服组的荧光主要出现在胃、肠道部分,而鼻腔组在180min时脑部和全身各组织均有荧光分布。可以佐证鼻腔给药可以实现脑靶向。
通过小动物活体成像技术,以结构特征相似的Cy7为模型药物替代知母皂苷BII,采用与口服对比的给药方式,考察温度/离子敏感型鼻用原位凝胶给药后在体内的分布及脑靶向性。药物经鼻腔给药后到达脑部最高荧光强度的时间较短,可以起到脑靶向的作用。Cy7温度/离子敏感型原位凝胶鼻腔给药后进入脑组织主要存在2种通路,即一部分药物通过呼吸部黏膜吸收进入血液循环后,透过血脑屏障而进入脑组织;另一部分药物通过嗅黏膜或三叉神经通路直接进入脑组织,后者避开了血脑屏障。
七、知母皂苷BII温度/离子敏感型原位凝胶的黏膜刺激性研究
以新西兰大白兔为动物模型,采用眼刺激性试验评价知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶的黏膜刺激性。通过观察一定时间内兔眼角膜、虹膜和结膜对受试药的刺激性反应,按照眼刺激反应进行评分,为知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶的安全性提供佐证。
动物:新西兰大白兔,健康,雄性,体重1800~2000g,购于军事科学院军事医学研究院动物中心,许可证号:SCXK(京)2015-0001。
1、黏膜刺激性评价—单次给药
方法:取健康新西兰大白兔3只,采用同体自身对照法,左眼结膜囊内滴入100μL生理盐水作为对照组,右眼结膜囊内滴入100μL 5mg·ml-1知母皂苷BII温度/离子敏感型原位凝胶作为供试组(实施例3所提供的原位凝胶),给药后使眼睛被动闭合10s,记录给药后0.08、0.17、0.33、0.5、1、6、24、48、72h眼睛的局部反应情况。参照Draize眼部刺激试验评分标准进行打分(表6),受试动物眼刺激反应的总积分等于角膜、虹膜和结膜的刺激反应的相加,再除以动物数,即该受试药物对眼黏膜刺激新的最终分值。按“眼刺激性评价标准考察受试动物的刺激程度(表7)。
表6 Draize眼部刺激试验评分标准
表7眼刺激性评价标准
表8眼部刺激性试验结果
如图15和表8所示,单次给药后,生理盐水对兔眼结膜、角膜和虹膜均无异常变化,无刺激性,最终得分为0分;而滴入知母皂苷BII温度/离子敏感型原位凝胶后,兔眼结膜、角膜和虹膜变化较小,出现少量分泌物,最终得分为1分。“眼刺激性评价标准”评定该制剂在单次给药条件下无刺激性。
2、黏膜刺激性评价—多次给药
方法:取健康新西兰大白兔3只,采用同体自身对照法,左眼结膜囊内滴入100μL生理盐水作为对照组,右眼结膜囊内滴入100μL 5mg·ml-1知母皂苷BII温度/离子敏感型原位凝胶作为供试组,给药后使眼睛被动闭合10s。每天给药3次,连续给药五天,每天给药前及最后一次给药后0.08、0.17、0.33、0.5、1、6、24、48、72h对眼部进行检查。参照“Draize眼部刺激试验评分标准”进行打分,将每个受试动物的角膜、虹膜和结膜的刺激反应相加即是全部受试动物眼刺激反应的总积分,再将总积分除以动物数,即该受试药物对眼黏膜刺激新的最终分值。按“眼刺激性评价标准”判断受试动物的刺激程度。
末次观察后,空气栓塞法处死,分别摘取左右眼球,10%甲醛溶液固定。按照常规方法依次乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,切片,苏木精-伊红染色,中性树胶封片,于光学显微镜下进行组织病理学检查。
如图16和表8所示,多次给药后,可看出生理盐水对兔眼结膜、角膜和虹膜同样无异常变化,无刺激性,最终得分为0分;而滴入知母皂苷BII温度/离子敏感型原位凝胶后,兔眼结膜出现轻微水肿、轻微充血、少量分泌物,最终得分为3分。按“眼刺激性评价标准”评定该制剂在多次给药条件下无刺激性。如图17所示,多次给药后兔眼角膜H.E.染色结果显示生理盐水组角膜完整,无损伤。而原位凝胶组仅出现轻微水肿。
综上结果,知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶在单次给药和多次给药条件下,积分均在0~3分之间,无刺激性。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的具体实施例。
Claims (7)
1.知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,其特征在于,包括重量份计的如下原料:
知母皂苷BII 5~50份、泊洛沙姆407 16~20份、去乙酰结冷胶0.1~0.3份、海藻酸钠0.1~0.3份、抑菌剂0.1~0.5份以及吸收促进剂1~2.5份。
2.如权利要求1所述的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,其特征在于,所述抑菌剂是尼泊金甲酯、尼泊金乙酯和三氯叔丁醇中的一种。
3.如权利要求1所述的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,其特征在于,所述吸收促进剂是璜丁基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精、吐温-80、氮酮中的一种。
4.如权利要求1所述的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,其特征在于,包括重量份计的如下原料:
知母皂苷BII 5~50份、泊洛沙姆407 16~20份、去乙酰结冷胶0.1~0.3份、海藻酸钠0.1~0.3份、三氯叔丁醇0.1~0.5份以及羟丙基-β-环糊精1~2.5份。
5.如权利要求1所述的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶,其特征在于,包括重量份计的如下原料:
知母皂苷BII 25份、泊洛沙姆407 18份、去乙酰结冷胶0.3份、海藻酸钠0.1份、三氯叔丁醇0.5份以及羟丙基-β-环糊精2.5份。
6.如权利要求1~5任一项所述的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶的制备方法,其特征在于,包括:
步骤一、按重量份计称取去乙酰结冷胶于烧杯中,加入适量去离子水,于70~80℃热水浴中充分溶胀后,4℃冷却;
步骤二、按重量份计另取泊洛沙姆407和海藻酸钠,边搅拌边缓慢加入到步骤一已溶胀好的去乙酰结冷胶中,搅拌均匀,4℃静置5~20h,得凝胶基质;
步骤三、边搅拌边向步骤二所得凝胶基质中加入抑菌剂和吸收促进剂,得复合凝胶;
步骤四、搅拌下向步骤三所得的复合凝胶中加入重量份计的知母皂苷BII,即得所述知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶。
7.权利要求1~5任一项所述的知母皂苷BII温度/离子敏感型鼻用原位凝胶在制备预防或者治疗阿尔茨海默病药物中的用途。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112516081A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-03-19 | 郑州百瑞动物药业有限公司 | 一种新型双氯芬酸注射液及其制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102462713A (zh) * | 2010-11-09 | 2012-05-23 | 复旦大学 | 一种具有相转变性质的三七总皂苷鼻用原位凝胶剂 |
CN103169649A (zh) * | 2013-04-11 | 2013-06-26 | 中国人民解放军总医院 | 温度和离子双重敏感型原位凝胶鼻腔给药系统 |
CN109431968A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-08 | 天津凯茵科技有限公司 | 基于克霉唑的妇科用复方组合物 |
-
2019
- 2019-02-02 CN CN201910106473.2A patent/CN109793705A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102462713A (zh) * | 2010-11-09 | 2012-05-23 | 复旦大学 | 一种具有相转变性质的三七总皂苷鼻用原位凝胶剂 |
CN103169649A (zh) * | 2013-04-11 | 2013-06-26 | 中国人民解放军总医院 | 温度和离子双重敏感型原位凝胶鼻腔给药系统 |
CN109431968A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-08 | 天津凯茵科技有限公司 | 基于克霉唑的妇科用复方组合物 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN112516081A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-03-19 | 郑州百瑞动物药业有限公司 | 一种新型双氯芬酸注射液及其制备方法 |
CN112516081B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-03-10 | 郑州百瑞动物药业有限公司 | 一种双氯芬酸注射液及其制备方法 |
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