CN109790520B

CN109790520B - 血脑屏障模型

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Publication number: CN109790520B
Application number: CN201780059047.7A
Authority: CN
Inventors: 简·阿尔德; 丽莎·肖; 克莱尔·劳伦斯; 斯瓦蒂·库马尔
Original assignee: University of Central Lancashire
Current assignee: University of Central Lancashire
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: EP3491125B1; CN109790520A; EP3491125A1; GB201613187D0; US20200339956A1; WO2018020274A1; EP3985107A1

Abstract

提供了一种包括细胞群体和3D(三维)细胞生长材料的结构，该细胞群体包括内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞，该细胞群体被定位于3D(三维)细胞生长材料内。该结构具有至少450Ω/cm²的TEER值。该结构的细胞可以来源于脑。细胞可以是人类细胞，并且特别地可以是原代来源的非永生化细胞。该结构特别地适用于血脑屏障的模型中，并且本发明还提供这样的模型。该结构被定位于容器中，在该容器中，该结构将定位于结构的第一侧上的第一室和定位于结构的第二侧上的第二室分开。第一室和第二室分别包含与结构的第一侧和第二侧接触的第一液体和第二液体。液体模拟脑细胞外液和血液。所提供的血脑屏障模型可以被用于脑疾病的模型中，并且用于研究剂进入脑或患病脑中的摄取。

Description

血脑屏障模型

发明领域

本发明涉及血脑屏障模型和用于构建血脑屏障模型的结构。本发明还涉及制造血脑屏障模型的方法和使用本发明的模型研究血脑屏障的渗透性的方法。

引言

血脑屏障是将中枢神经系统与血液分开的高度选择性的物理、运输和代谢屏障。稳定的微环境对于神经回路至关重要，因此脑稳态被血脑屏障高度控制，以避免突触信号传送和轴突信号传送的干扰。神经元距离毛细管从不多于8-20μm，因此血脑屏障对于脑细胞的直接微环境发挥最大的控制。此控制的一个功能是血脑屏障阻止分子移动跨过屏障进入中枢神经系统中的能力。

现在已知的是，血脑屏障包括呈动态界面形式的代谢屏障和物理屏障两者，其表型严重依赖于完整的功能性神经血管单元(Abbott等人，2006)。神经血管单元由动态地整合的内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞构成。内皮细胞之间的紧密连接阻止细胞旁运输，并且周细胞在脑微血管的发育和血流的调节中起关键作用。星形胶质细胞和基底膜支持神经元的功能，调节周细胞分化并且与微血管的节段通信。

在过去30年中，存在被设计成模拟血脑屏障的各种模型迭代。这些已经被创建以便研究血脑屏障的特征以及其行为。特别地，鉴于许多分子经历跨过血脑屏障的困难，已经出现基于细胞的体外模型作为预测分子的体内渗透(例如治疗剂通过血脑屏障)的潜在工具。

此外，在相关领域例如纳米技术、微流体和三维细胞生长材料中已经取得相关进展。对培养物中有效的细胞-细胞通信所需的3D层次结构、细胞外基质以及多种细胞类型存在的重要性的公认，已经导致体外建模的一般研究领域的发展(Goodman等人，2008)。此外，已经越来越强调物种特异性模型对于产生用于体内-体外相关性的相关比例因子的重要性(Polikov等人，2008)。

然而，话虽如此，目前缺少已经使用全部为人类组分培养的体外血脑屏障模型，并且此外缺少可以提供体内血脑屏障的物理状态和代谢状态两者的准确表示的血脑屏障模型。目前，可用的体外血脑屏障模型倾向于使用非人类细胞，并且已经仅仅对于物理屏障而不是包括功能性神经血管单元的细胞的代谢屏障被表征。

因此，存在对于以下血脑屏障模型的需求，该血脑屏障模型是生理学上相关的，并且集中于在血液和脑连接处存在的代谢屏障，目的是帮助开发用于治疗脑病理(brainpathology)的可渗透疗法。

本发明人已经产生包含功能性神经血管单元的细胞的血脑屏障的3D体外模型。该模型已经被优化，以表现准确地反映血脑屏障的物理状态和代谢状态两者的最大跨内皮阻力、紧密连接、转运蛋白与酶的表达和活性，。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供一种结构，所述结构包括：

细胞群体，细胞群体包含内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞；

和3D(三维)细胞生长材料，细胞群体被定位于3D细胞生长材料内；

其中该结构具有至少450Ω/cm²的TEER值。

根据本发明的第二方面，提供了血脑屏障模型，该血脑屏障模型包括：

容器，容器包括第一方面的结构；

其中该结构将定位于该结构的第一侧上的第一室和定位于该结构的第二侧上的第二室分开；

并且其中第一室包含与该结构的第一侧接触的第一液体，并且第二室包含与该结构的第二侧接触的第二液体。

根据本发明的第三方面，提供了制造结构的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将包括内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的细胞群体分布在3D(三维)细胞生长材料中；以及

(b)在剪切应力下培养细胞群体。

根据本发明的第四方面，提供了研究血脑屏障的渗透性的方法，所述方法包括：

(a)将第二方面的血脑屏障模型暴露于测试分子；以及

(b)测量血脑屏障模型的渗透性。

附图描述

本发明通过附图进一步说明，在附图中：

图1图示比较性体外血脑屏障transwell模型的方案，其中存在以下细胞：内皮单一培养物(a)；星形胶质细胞和内皮细胞不接触的共培养物(e/-/a)*(b)以及星形胶质细胞和内皮细胞接触的共培养物(e/a/-)*(c)；内皮细胞和周细胞不接触的共培养物(e/-/p)*(d)以及内皮细胞和周细胞接触的共培养物(e/p/-)*(e)；以及与周细胞不接触的三培养物(e/ap/-)*(f)；

图2图示以下的方案：(a)本发明的体外3D血脑屏障模型，和(b)具有通过流体流动实施的剪切应力的本发明的体外3D血脑屏障模型的形成，以及(c)具有通过流体流动实施的剪切应力的包括代表疾病状态的细胞群体的本发明的体外血脑屏障模型；

图3图示单一培养物(A)、共培养物(B)、三培养物(C)、3D静态培养物(D)和3D剪切应力培养物(E)以及用于对比的组合培养物(F)的相对于时间的平均值±SD TEER测量值(n＝5)；

图4图示紧密连接蛋白表达的蛋白印迹：A.闭锁蛋白(occludin)的不同模型的蛋白印迹(65kDa)。B.连接蛋白(claudin)-5蛋白的不同模型的蛋白印迹(23kDa)。每个孔被加载有10μg蛋白质。β-肌动蛋白(42kDa)被用作加载对照；

图5图示CYP450酶表达的蛋白印迹：A.CYP3A4的不同模型的蛋白印迹(57kDa)。B.CYP2D6的不同模型的蛋白印迹(55kDa)。每个孔被加载有10μg蛋白质。β-肌动蛋白(42kDa)被用作加载对照；

图6图示外排转运蛋白表达(efflux transporter proteins expression)的蛋白印迹：A.ABCB1转运蛋白的不同模型的蛋白印迹(170kDa)。B.ABCG2的不同模型的蛋白印迹(72kDa)。每个孔被加载有10μg蛋白质。β-肌动蛋白(42kDa)被用作加载对照；

图7图示不同体外模型中的外排转运蛋白的活性：A.ABCB1转运蛋白的活性(170kDa)。B.ABCG2转运蛋白的活性(72kDa)。图表以相对于对照的百分比绘制，对照被定义为外排转运蛋白在4℃的0％活性；

图8图示三培养物模型中原代来源的非永生化细胞和永生化细胞的TEER测量值对比：左)使用永生化hcmec/d3细胞的三培养物模型设置。右)使用原代来源的hbmec细胞的三培养物模型设置。

图9图示原代来源的(HBMEC)和永生化(hCMEC/D3)内皮细胞系中闭锁蛋白(65kDa)、连接蛋白-5(23kDa)、ABCB1(170kDa)和ABCG2(72kDa)的外排转运蛋白和紧密连接蛋白的蛋白印迹。每个孔被加载有10μg蛋白质，并且β肌动蛋白(42kDa)被用作加载对照；

图10在用递送到在静态条件下培养的血脑屏障模型的顶部隔室对比递送到在剪切应力条件下培养的血脑屏障模型的顶部隔室的100μg/mL各种分子量FITC右旋糖酐孵育60分钟之后，血脑屏障模型的基底外侧隔室中测量的FITC-右旋糖酐的浓度的对比；

图11图示跨过血脑屏障模型的跨内皮电阻的变化(A-D)以及在基底外侧隔室中化合物的出现(C副轴线和D副轴线)；A：已知的化合物伊文思蓝没有跨过血脑屏障模型的渗透性；B.对于相同的实验时期，对照血脑屏障模型(无测试化合物)的渗透性没有变化；C.靶向神经胶质瘤细胞的命名为GL21的测试适体的渗透由以下指示：TEER相对于对照血脑屏障模型的降低和在基底外侧隔室中的出现；以及D.加扰的适体不渗透跨过血脑屏障模型；

图12与健康血脑屏障模型相比，在基底外侧侧面上具有神经胶质瘤球体的血脑屏障模型中TEER值的图示；

图13通过血脑屏障模型上的神经胶质瘤球体的纳米颗粒摄取(基底外侧侧面)；A.加罗丹明123标签的0.33μg/ml多西他赛加载的脂质纳米颗粒；B.加罗丹明123与转铁蛋白配体标签的0.33μg/ml多西他赛加载的脂质纳米颗粒；C.2.87μg/ml姜黄素加载的脂质纳米颗粒。母液浓度(Stock concentration)是在时间0h接种在血脑屏障模型的顶部侧面上的纳米颗粒的浓度。

图14转染包含肿瘤细胞的疾病状态血脑屏障模型的细胞对ABCB1外排的活性的影响的图示：A：神经胶质瘤细胞系；B：模型的个体组分；以及C：全血脑屏障模型，每个用反义miRNA21进行测试。所有值以相对于对照的百分比绘制，对照是外排转运蛋白(effluxtransporter)的0％活性。数据点是来自两个实验重复的三次重复的平均值，并且误差棒代表来自两个实验重复的六次测量值±标准偏差(±SD)。

发明详述

本发明基于发明人的以下发现，他们通过使用适于模拟功能性神经血管单元的细胞群体能够获得更准确的血脑屏障模型，所述细胞群体具有定位于3D细胞生长材料上和3D细胞生长材料内的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞，3D细胞生长材料支持细胞以保持其3D形状，在其中细胞已经在剪切应力下生长。

本发明的血脑屏障模型是基于这种结构，并且提供非常需要的体外工具用于研究。特别地，它提供体内血脑屏障的更准确的物理反映和代谢反映。不受理论所限制，认为，物理准确性从在剪切应力下生长细胞群体来提供，这给予模型的结构高的跨内皮阻力。认为代谢的准确性是从以3D方式生长细胞群体来提供，这允许细胞群体保持它们如同在体内进行的排列和紧密连接、转运蛋白和酶的表达和活性。

体内血脑屏障模型的更准确的物理反映和代谢反映的组合意味着，本发明对于研究者是无价的工具。

在本公开内容之前，尚未知晓提供准确地反映体内屏障的代谢状态和物理状态两者的血脑屏障模型。具体地，在3D细胞生长材料内，没有现有模型已经使用本发明的具有这样高的跨内皮阻力的三个细胞群体。此外，没有现有模型已经使用全部为人类、全部为原代来源的非永生化细胞。

有利地，本发明的屏障具有改善的生理相关性，并且因此对于研究屏障对各种分子的渗透性是更有用的，特别是在评估屏障对候选药物的渗透性中的应用。本发明的屏障改善与分子相关的体内-体外预测。例如，通过提供更加严格和准确的屏障，将停止CNS生物利用度的过度预测并且因此将停止不合适的分子被选择用于开发。

组分的以下描述意图以任何切实可行的组合应用于本发明的每个方面以及其在本申请中描述的任何实施方案。

结构

如上文所描述的，该结构是血脑屏障模型的关键组成部分，因为该结构包括定位于3D(三维)细胞生长材料内的内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的细胞群体，3D(三维)细胞生长材料意图反映体内血脑屏障结构。

该结构通过上文所描述的方法产生，其中细胞群体分布在3D细胞生长材料中，并且然后细胞在剪切流下在3D细胞生长材料中培养。

该方法产生具有相对高TEER值的性质的结构，以及此外产生其中细胞保持其3D形态并且其中细胞如它们在体内一样自由迁移到它们天然的3D组织中的结构。

这继而允许使用模拟体内血脑屏障的结构产生血脑屏障模型。特别地，血脑屏障模型模拟体内血脑屏障的高TEER的物理性质，并且模拟具有蛋白质例如转运蛋白和酶的高活性的体内血脑屏障中细胞的代谢性质。

细胞群体

如上文所陈述的，细胞群体包括内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的混合物。内皮细胞是在血管的壁排成一行的鳞状细胞。星形胶质细胞是定位于中枢神经系统中的星状的胶质细胞。周细胞是包绕在存在于血管中的内皮细胞周围的收缩细胞。

合适地，内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞来源于脑。

合适地，细胞是人类细胞。人类细胞的使用提供更准确地反映体内血脑屏障的优点，特别是当研究血脑屏障对例如候选药物的渗透性时，并且避免物种间的差异。

内皮细胞可以是微血管内皮细胞。微血管内皮细胞可以选自人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)细胞或人脑微血管内皮细胞(human cerebral microvascular endothelial cells，hCMEC)细胞例如hCMEC/D3细胞。合适地，内皮细胞是HBMEC细胞。

星形胶质细胞可以是人脑星形胶质细胞(HCA)细胞。合适地，星形胶质细胞是SC1800 HA细胞。

合适地，周细胞是人脑血管周细胞(HBVP)细胞。

细胞可以是非永生化细胞，或永生化细胞。非永生化细胞意指具有有限的增殖/分裂潜能并且通常可以经历从2个多达60个传代周期的通过传代来源于原代组织的细胞，这些细胞在本文中被称为术语“原代来源的非永生化细胞”，但还可以称为“原代来源的短期细胞”。永生化细胞意指通常通过转化已经获得无限地增殖的能力的细胞。

合适地，细胞是非永生化的。使用原代来源的非永生化细胞提供更准确地反映体内血脑屏障的优点，因为这样的细胞保留体内发现的相应细胞的所有天然特性。

永生化细胞可以从原代细胞或非永生化细胞通过例如慢病毒载体系统产生(Uric等人，2012)。

合适地，内皮细胞是永生化或非永生化的细胞，并且周细胞和星形胶质细胞是非永生化细胞。

在一个实施方案中，内皮细胞是非永生化HBMEC细胞。

在一个实施方案中，内皮细胞是永生化的hCMEC/D3细胞。

在一个实施方案中，星形胶质细胞是非永生化的SC1800 HA细胞。

在一个实施方案中，周细胞是非永生化的HBVP细胞。

任何合适的来源可以用于细胞。例如，细胞可以从Lonza Group Ltd.UK、MerckMillipore Ltd.UK或Sciencell Ltd.UK购买。

在一些实施方案中，细胞群体中的一种或更多种细胞类型可以代表疾病状态。因此，合适地，一种或更多种细胞类型可以来源于患病来源，或可选择地可以源自疾病模型。例如，星形胶质细胞可以是阿尔茨海默氏症研究中使用的活化的星形胶质细胞细胞系。

可选择地或此外，细胞群体还可以包括患病细胞的群体，例如肿瘤细胞例如神经胶质瘤细胞。合适地，患病细胞可以作为球体存在于模型中。

在一个实施方案中，细胞群体还包括神经胶质瘤球体。

细胞可能已经通过几次传代被生长。细胞可以具有小于30、小于20、小于10、小于5的传代数。合适地，内皮细胞和星形胶质细胞具有小于10、合适地在2-9之间的传代数。合适地，周细胞具有小于6、合适地在2-5之间的传代数。低传代数具有以下优点：细胞没有失去任何其定义的特征，变得静止或去分化。

最终结构内的细胞群体可以包括以下总细胞计数：在约30,000个至约3,000,000个细胞/cm²结构表面积之间、或在约60,000个至约1,500,000个细胞/cm²之间、或在约150,000个至约900,000个细胞/cm²之间、或在约210,000个至约600,000个细胞/cm²之间、或在约240,000个至约450,000个细胞/cm²之间、或在约270,000个至约300,000个细胞/cm²结构表面积之间。合适地，细胞群体包括约300,000个细胞/cm²结构表面积的总细胞计数。

最终结构内的细胞群体可以包括相等数目的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。可选择地，细胞群体可以包括不同数目的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。细胞群体可以包括大多数内皮细胞以及星形胶质细胞或周细胞中的一种。合适地，细胞群体包括大多数内皮细胞。

最终结构内的细胞群体可以包括在约7.5:1:1至约1:1:1之间的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比。

最终结构内的细胞群体可以包括约7.5:1:1或约5:1:1或约2:2:1或约2:1:2或约2:1:1或约1:1:1的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比。合适地，细胞群体包括约2:1:1的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比。

因此，合适地，最终结构内的细胞群体包括每cm²结构表面积约150,000个内皮细胞、约75,000个星形胶质细胞和约75,000个周细胞。

合适地，所有使用的细胞是人类细胞。利用全部为人类细胞的实施方案还可以与其他人类组分(例如下文考虑的3D细胞生长材料和/或血清)组合使用，以提供“全部为人类”实施方案，该实施方案在体外准确地反映人类体内情况的其能力方面是特别有利的。这样的全部为人类模型的生理相关性可以通过使用原代人类细胞来改善，尽管利用永生化人类细胞的全部为人类模型(无论是利用原代细胞或是本身)仍然比现有技术提供显著的益处。

三维(3D)细胞生长材料

如上文所陈述的，3D细胞生长材料是细胞群体被定位在其内以形成血脑屏障模型的结构的组分。

3D细胞生长材料支持细胞群体的3D培养。

3D培养意指，细胞群体的细胞能够在培养材料内采用它们的天然的3D形态和分布。

3D细胞生长材料提供3D支撑部，细胞被保持在3D支撑部内，使得细胞的天然的3D形态被保持，并且使得细胞的天然的3D分布被支持。细胞可以在3D细胞生长材料内以三维增殖并且在3D细胞生长材料内迁移，以形成模拟体内血脑屏障并且保持天然的细胞与细胞相互作用的组织。

3D细胞生长材料可以在约100-300μm之间厚，或在约150-250μm之间厚，或在约175-225μm之间厚，或在约190-210μm之间厚。合适地，3D细胞生长材料是200μm厚。使用此厚度的3D细胞生长材料意味着，没有细胞距离营养介质的来源超过100μm，这与典型的体内环境非常相似。

3D细胞生长材料可以由支架或凝胶形成。

在其中3D细胞生长材料是凝胶的实施方案中，凝胶可以是水凝胶。凝胶可以选自例如HydroMatrix^TM肽水凝胶、MaxGel^TM人类ECM、

干细胞培养物、

或Matrigel^TM。

凝胶可以包括生物聚合物。合适地，生物聚合物选自通常存在于体内细胞外基质中的生物聚合物，或通常存在于体内细胞外基质中的生物聚合物的组合。例如，Matrigel^TM包括60％层粘连蛋白；30％胶原蛋白IV；8％巢蛋白(entactin)；硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(串珠蛋白聚糖(perlecan))；生长因子PDGF、EGF、TGF-β和基质金属蛋白酶。

在其中3D细胞生长材料是支架的实施方案中，合适地，支架包括孔。

孔可以在约20-100μm之间或在约25-80μm之间或在约30-60μm之间或在约35-50μm之间。合适地，孔在约36-40μm之间。

支架可以包括超过50％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％的孔隙率。合适地，3D细胞生长材料包括超过90％的孔隙率。

支架可以由聚合物形成。聚合物可以选自适合用于细胞培养的那些聚合物。合适地，聚合物是惰性的。聚合物可以选自例如聚苯乙烯、

聚碳酸酯、聚酯或丙烯酸酯。合适地，支架由聚苯乙烯形成。

支架可以包括发泡材料。合适地，支架是发泡聚合物。合适地，支架是发泡聚苯乙烯。一种合适的支架材料是由Reinnervate,UK生产的

材料。

支架可以被涂覆。涂层可以存在于支架上。合适地，涂层覆盖支架的表面。

涂层可以包括生物聚合物。合适地，生物聚合物选自通常存在于体内细胞外基质中的生物聚合物。因此，生物聚合物可以选自纤连蛋白、胶原蛋白、聚L-赖氨酸、

或串珠蛋白聚糖。合适地，支架涂覆有纤连蛋白。细胞外基质涂层提供组织化的(organized)组织结构所需的用于细胞粘附的物理结构，并且细胞外基质涂层有助于细胞-细胞通信，允许细胞群间响应于环境压力的协作应答。涂层还调节细胞的生长和细胞的运动。

涂层可以以在约1-20μg/cm²支架表面积之间或在约2-15μg/cm²之间或在约3-10μg/cm²之间或在约4-8μg/cm²之间存在。合适地，3D细胞生长材料以5μg/cm²支架表面积涂覆。

在一个实施方案中，支架被5μg纤连蛋白/cm²支架表面积涂覆。

如上文所提及的，人类衍生的3D细胞生长材料特别适合用于其中所有所使用的细胞是人类和/或所使用的血清是人类血清的实施方案。如别处所陈述的，这样的全部为人类实施方案在反映自然发生的生理状况中是特别相关的。

TEER值

跨内皮电阻(TEER)值是内皮细胞之间紧密连接的形成的量度。TEER定量地测量血脑屏障模型的紧密度，并且通过测量细胞的电阻充当模型中包括的细胞的健康的替代标记物。

如从历史文献中报道的，体内血脑屏障被估计具有2000Ω.cm²的TEER值，因此体外模型旨在复制相同的值以模拟血脑屏障的紧密度。在血脑屏障模型中观察的TEER的增加指示在体内观察到的细胞组织和细胞分布的更接近的表示。

本发明的血脑屏障模型并入如上文定义的具有至少约450Ω/cm²的TEER值的结构。TEER值可以是至少约500Ω/cm²、至少约600Ω/cm²、至少约650Ω/cm²、至少约700Ω/cm²、至少约750Ω/cm²。TEER值可以在约450Ω/cm²和1000Ω/cm²之间，或可以在约700Ω/cm²和800Ω/cm²之间。合适地，TEER值是约710Ω/cm²。

结构的最大TEER值可以与体内TEER值是大约相同的。合适地，结构的最大TEER值是约2000Ω/cm²。

在TEER的上下文中的“约”意指，TEER值可以变化+/-1-20Ω/cm²、或变化约+/-2-15Ω/cm²、或变化约+/-3-10Ω/cm²、或变化约4-9Ω/cm²。合适地，TEER值可以变化+/-8.2Ω/cm²。

结构的TEER值可以通过用增强紧密连接蛋白表达的化学品处理细胞来增加。例如，TEER值可以通过用视黄酸处理细胞来增加。

TEER值可以通过本领域任何已知的方法来测量，比如例如，使用仪器EVOM-2(Merck Millipore,UK)、

或

合适地，TEER值使用EVOM仪器来测量。

结构的TEER值以欧姆每平方厘米测量。如果TEER值使用具有不同测量单位的仪器测量，则仪器的读数将被转化成欧姆每平方厘米。

例如，EVOM仪器被用于通过尺寸4mm宽和1mm厚的一对STX2电极测量TEER值。电极中的每一个包含用于测量电压的银/氯化银小球和用于传送电流的银电极。每个电极的小尺寸被设计成有助于将电极放置到小规模细胞模型中。EVOM不仅定性地测量细胞单层的健康，而且还定量地测量细胞汇合。在STX2电极之间流动的电流和电压检测细胞的汇合，并且与血脑屏障模型中连接的紧密度相关。

合适地，TEER值是从多个读数获得的平均值，合适地，至少3个测量结果或至少4个或至少5个测量结果被获取用于计算平均值。

合适地，TEER值跨血脑屏障模型的结构中的一系列位置测量。

合适地，TEER值通过减去单独的3D细胞生长材料、并且不存在细胞群体的TEER值获得。单独的3D细胞生长材料的TEER值代表TEER值的量度的阴性对照。

血脑屏障模型

如上文所提到的，血脑屏障模型包括结构被定位在其中的容器，以及被定位于其间的结构隔开的第一室和第二室。该结构可以具有大体上平面的形式，例如呈细胞片的形式。第一室和第二室各自包含与结构的相应的第一侧和第二侧接触的液体。

该结构将容器分开以形成两个室，每个室在其任一侧上。因此，结构包括第一侧和第二侧。第一室被定位于结构的第一侧上，并且第二室被定位于结构的第二侧上。将理解的是，大体上平面的结构(对于本发明的目的，该结构可以被认为是其中该结构的端部不彼此连接的结构，如可能是呈管状结构或球体结构中的情况)在此上下文中提供优点。特别地，使用大体上平面的结构分开容器允许在所形成的两个室的尺寸方面很大的灵活性，并且还允许容易接近两个室的内容物，而不需要破坏结构的组成部分(在球体结构或管状结构方面不可获得的优点)。

第一室和第二室意图模拟血脑屏障的血液侧和脑侧。

合适地，代表血液侧的室被称为顶室。合适地，代表脑侧的室被称为基底外侧室。

因此，第一侧和第二侧中的一侧可以模拟血液侧，并且第一侧和第二侧中的另一侧可以模拟脑侧。

因此，第一室和第二室是可互换的，这是在如下文讨论的每种细胞类型接触结构的血液侧或脑侧的要求的上下文中。

因此，第一液体和第二液体中的一种代表脑细胞外液，并且第一液体和第二液体中的另一种代表血液。合适地，包含代表脑细胞外液的液体的侧面被称为基底外侧侧面。

合适地，包含代表血液的液体的侧面被称为顶侧。

以类似的方式，第一液体和第二液体也是可互换的，在如下文讨论的接触结构的血液侧或脑侧的每种细胞类型要求的上下文中也是如此。

出于本文讨论的目的，合适地，第一侧模拟血液侧，并且第二侧模拟脑侧。因此，合适地，第一室模拟血液，并且第二室模拟脑细胞外液。

因此，合适地，第一侧是顶侧，并且第二侧是基底外侧侧面。因此，合适地，第一室是顶室，并且第二室是基底外侧室。

因此，出于本文讨论的目的，合适地，第一液体代表血液，并且第二液体代表脑细胞外液。

为了保持血脑屏障模型为有效模型，第一室和第二室不连通并且彼此不同，使得第一液体和第二液体被保持分离。

如上文所描述的，血脑屏障模型的结构包括定位于3D细胞生长材料内的细胞群体。

细胞群体以3D分布在3D细胞生长材料内。

因此，细胞群体可以包括在3D细胞生长材料内的特定3D组织。

细胞群体可以包括在3D细胞生长材料内的层。因此，该结构可以包括分层的细胞群体。

合适地，在3D细胞生长材料内存在两层或三层细胞，所述层由细胞群体的内皮细胞、星形胶质细胞或周细胞形成。每一层可以包括细胞群体的内皮细胞、星形胶质细胞或周细胞中的一种或更多种。

在一个实施方案中，第一层细胞包括内皮细胞，第二层细胞包括星形胶质细胞，并且第三层细胞包括周细胞。

在另一个实施方案中，第一层细胞包括内皮细胞，并且第二层细胞包括星形胶质细胞和周细胞。

该结构可以包括靠近3D细胞生长材料的第一侧的第一层细胞、在3D细胞生长材料的中心中的第二层细胞和靠近3D细胞生长材料的第二侧的第三层。

可选择地，该结构可以包括靠近3D细胞生长材料的第一侧的第一层细胞和靠近3D细胞生长材料的第二侧的第二层细胞。

内皮细胞被定位于靠近结构的血液侧的层中。这反映体内的血脑屏障结构。

星形胶质细胞和/或周细胞被定位于结构的中心层或靠近结构的脑侧的层中。这反映体内的血脑屏障结构。

如上文所提到的，对结构或3D细胞生长材料的第一侧和第二侧的提及可以是可互换的。然而，为了本文本发明讨论的目的，合适地，第一侧模拟血脑屏障的血液侧，并且第二侧模拟血脑屏障的脑侧。

因此，在一个实施方案中，该结构包括靠近3D细胞生长材料的第一侧的包括内皮细胞的第一层细胞、在3D细胞生长材料的中心中的包括星形胶质细胞的第二层细胞以及靠近3D细胞生长材料的第二侧的包括周细胞的第三层细胞。

因此，在另一个实施方案中，该结构包括靠近3D细胞生长材料的第一侧的包括内皮细胞的第一层细胞，以及靠近3D细胞生长材料的第二侧的包括星形胶质细胞和周细胞的第二层细胞。当提到神经血管单元时，这提供最生理相关的细胞定向和分布。

合适地，如上文所描述的，细胞群体还可以包括患病细胞。合适地，患病细胞可以包括肿瘤细胞，例如神经胶质瘤细胞。合适地，患病细胞可以形成该结构的另外的层。合适地，另外的层可以定位于以上描述的结构内的任何地方，以模拟相关的疾病状态。合适地，该层可以包括患病细胞的小滴。

合适地，患病细胞可以与模型的其他细胞接触，或可以与模型的其他细胞不接触。

合适地，在神经胶质瘤的情况下，神经胶质瘤细胞被定位成与代表脑细胞外液的液体接触，合适地被定位在结构的基底外侧侧面上，合适地被定位在结构的第二侧上。合适地，神经胶质瘤细胞被定位于星形胶质细胞下方。

合适地，神经胶质瘤细胞作为神经胶质瘤球体存在。

合适地，神经胶质瘤球体被包含在小滴中。

合适地，神经胶质瘤球体与星形胶质细胞接触。

在任一实施方案中，层可以由相关的细胞类型组成。

血脑屏障模型的容器适合于容纳该结构以及第一室和第二室。

该结构可以被定位在插入物(insert)中以用于插入容器中。

插入物可以是transwell插入物。容器可以是例如管或孔或板。合适地，容器是孔，合适地定位于多孔板上，例如24孔板或12孔板或6孔板。多孔板允许每个孔是单独的容器，并且因此可以一次进行多个血脑屏障模型实验。

该容器适合于容纳包括安装在其上的结构的插入物。合适地，插入物装配在容器内。

在一个实施方案中，该结构被定位在transwell插入物上，该transwell插入物被放置和容纳在多孔板的孔中。

合适地，当该结构被定位于插入物中时，该结构形成插入物的基部。

合适地，安装在插入物上的结构被大致设置在容器的中心，使得第一室和第二室可以在其任一侧上。

任选地，血脑屏障模型可以被小型化。因此，合适地，容器可以是载玻片、合适地显微镜载玻片。合适地，在这样的实施方案中，第一室和第二室以及第一液体和第二液体通过微流体技术实现。

合适地，血脑屏障模型的容器可以与下文关于形成血脑屏障模型描述的培养容器相同。

因此，该设置可以用于血脑屏障模型的形成和用于使用的最终血脑屏障模型。

任选地，血脑屏障模型还可以包括流体流动。流体流动可以在容器中实施，如下文关于培养容器所描述的。因此，血脑屏障模型的结构可以处在剪切应力下。

血脑屏障模型的形成

如上文所描述的，血脑屏障模型的结构包括定位于3D细胞生长材料内的细胞群体。该结构定位于容器中，容器分隔在结构任一侧上的第一室和第二室。

为了形成血脑屏障模型，首先使用上文描述的方法制造该结构，然后将该结构放置在容器内，以在其第一侧上形成第一室并且在其第二侧上形成第二室。然后，对第一室填充第一液体，并且对第二室填充第二液体，每种液体代表血液或脑细胞外液体中的一种。

制造该结构的方法包括将细胞群体的细胞分布在3D细胞生长材料中的第一步骤。

为了使细胞群体被包括在结构内，将细胞分布在结构中，特别是分布在3D细胞生长材料中。

细胞可以以任何已知的方式分布在3D细胞生长材料中。

分布细胞可以包括用细胞接种3D细胞生长材料，或分布细胞可以包括将3D细胞生长材料与细胞混合。分布还可以包括孵育3D细胞生长材料的时期，以便允许细胞迁移到3D细胞生长材料中，或以便允许3D细胞生长材料凝固(set)，并且在这两种情况下允许细胞增殖。

细胞可以以低于如上文定义的最终结构中细胞群体的数目的数目沉积，以允许细胞的增殖和生长。因此，分布在3D细胞生长材料中的总细胞数可以是最终结构中总细胞群体的大约一半。

分布在3D细胞生长材料中的细胞群体可以包括以下的总细胞计数：在约15,000个至约1,500,000个细胞/cm² 3D细胞生长材料的表面积之间、或在约30,000个至约750,000个细胞/cm² 3D细胞生长材料之间、或在约75,000个至约450,000个细胞/cm²之间、或在约105,000个至约300,000个细胞/cm²之间、或在约150,000个至约225,000个细胞/cm²之间、或在约135,000个至约165,000个细胞/cm²之间。

分布在3D细胞生长材料中的总细胞群体可以是约150,000个细胞/cm²3D细胞生长材料的表面积。

任选地，细胞群体可以以比上文陈述的更低的总数分布在3D细胞生长材料中，并且培养时间可以被相应地调节，以延长细胞增殖到结构中所期望的总细胞计数的时间。

细胞合适地以其如上文关于细胞群体所定义的近似比分布。

因此，分布在3D细胞生长材料中的每种细胞类型的数目可以是约75,000个内皮细胞/cm² 3D细胞生长材料、37500个星形胶质细胞/cm²和37500个周细胞/cm²。此接种密度对于在3D细胞生长材料内形成完整的血脑屏障模型是最佳的。

细胞群体中包括的每种细胞类型可以单独地或以任何组合一起分布到3D细胞生长材料中。

细胞群体中包括的每种细胞类型可以在3D细胞生长材料上或3D细胞生长材料内的任何位置处被分布到3D细胞生长材料中。合适地，细胞群体被分布在3D细胞生长材料的第一侧和/或第二侧上。

面对的侧面可以被称为3D细胞生长材料的第一侧，或如上文所描述的3D细胞生长材料的第二侧。

合适地如上文关于血脑屏障模型所描述的，细胞群体被分布到3D细胞生长材料上，以便在3D细胞生长材料中形成3D分布，特别是分层分布。

在上文描述的第一实施方案中，合适地，内皮细胞被分布到3D细胞生长材料的第一侧上，星形胶质细胞被分布到3D细胞生长材料的中心，并且周细胞被分布到3D细胞生长材料的第二侧上。

在上文描述的第二实施方案中，合适地，内皮细胞被分布到3D细胞生长材料的第一侧上，并且星形胶质细胞和周细胞的混合物被分布到3D细胞生长材料的第二侧上。

分布细胞可以包括接种细胞。

在任一实施方案中，可以首先分布3D细胞生长材料的一侧上的细胞，并且可以第二分布3D细胞生长材料的中心的细胞，并且可以第三分布3D细胞生长材料的相对侧上的细胞。

合适地，3D细胞生长材料的一侧的细胞首先被分布，随后是孵育第一时间段。合适地，在第一孵育期间，3D细胞生长材料被倒置。孵育允许细胞附着到3D细胞生长材料。

合适地，在第一孵育之后，3D细胞生长材料被倒置，并且3D细胞生长材料的中心和/或相对侧的细胞被分布，随后是孵育第二时间段。

孵育的第一时间段可以在约1-8小时之间、或在约2-7小时之间、或在约3-6小时之间、或在约4-5小时之间。合适地，孵育的第一时间段是约4小时。

孵育的第二时间段可以在约12-36小时之间、或在约15-33小时之间、或在约18-30小时之间、或在约21小时至27小时之间、或在约23-35小时之间。合适地，孵育的第二时间段是约24小时。

一旦细胞群体已经分布在3D细胞生长材料上并且被孵育，细胞群体就被认为分布在3D细胞生长材料内。

任选地，该方法还可以包括将另外的患病细胞群体分布到3D(三维)细胞生长材料上或3D(三维)细胞生长材料中的步骤。合适地，此步骤可以与细胞群体的以上分布同时发生，或可以在细胞群体已经分布之后发生。

合适地，患病细胞被分布到3D细胞生长材料上。合适地，在细胞群体已经分布之后。

合适地，患病细胞被分布到3D细胞生长材料上，在3D细胞生长材料的脑侧或基底外侧侧面上。

合适地，患病细胞被分布到3D细胞生长材料上，使得患病细胞与星形胶质细胞接触。

合适地，患病细胞作为小滴被分布到3D细胞生长材料上。

制造该结构的方法包括在剪切应力下培养细胞群体的细胞的第二步骤。

将细胞在剪切应力下在3D细胞生长材料内培养以形成最终结构。

合适地，细胞通过将包括细胞群体的3D细胞生长材料放置到培养容器中来培养。

因此，一旦细胞群体的细胞被分布在3D细胞生长材料中，3D细胞生长材料就可以定位在支撑物上。支撑物可以是transwell支撑物。

支撑物适合于安置在培养容器内。

支撑物可以包括聚合物。聚合物选自适合用于细胞培养的那些聚合物；合适地，聚合物是惰性的。聚合物可以选自例如聚苯乙烯、

聚碳酸酯、聚酯或丙烯酸酯。合适地，支撑物由聚碳酸酯形成。

支撑物可以与上文关于血脑屏障模型描述的插入物相同。

如下文所描述的，在剪切应力下培养可以通过任何手段实现。

合适地，剪切应力以横向方向施加在细胞上。

在本文描述的一个实施方案中，剪切应力通过在包括细胞群体的结构上使用流体流动来实现。

因此，培养容器还可以包括流体入口和流体出口。入口适合用于流体的进入，并且出口适合用于流体的外出。合适地，流体流动发生在入口和出口之间。

合适地，本发明的结构被定位于流体入口和流体出口之间。因此，合适地，该结构被定位于流体流动的路径中，使得合适地剪切应力通过流体被施加到结构上。因此，合适地，在其上包括结构的支撑物被定位于流体流动的路径中。合适地，剪切应力通过流体施加到支撑物上并且围绕支撑物。因此，剪切应力可以通过流体静压施加在支撑物中的结构中的细胞上，流体静压从围绕支撑物的流体流动产生。

合适地，流体入口和流体出口被连接到强制流体装置。强制流体装置迫使流体穿过流体入口，进入容器中和离开流体出口。强制流体装置可以是泵，更具体地，强制流体装置可以是蠕动泵。这种泵是本领域已知的，并且可以从例如Watson-Marlow Ltd.UK获得。

强制流体装置可以通过任何合适的管道连接到流体入口和流体出口。强制流体装置通过入口管合适地连接到流体入口，并且通过出口管合适地连接到流体出口。

合适地，强制流体装置被连接到贮液器，该贮液器包含流体。

合适地，储存器、强制流体装置、入口管、容器和出口管形成流体循环通过的连续流体回路。

流体适合用于细胞生长，因此合适地流体是介质。介质可以由任何已知的培养基介质或培养基介质的混合物形成。合适地，介质包括用于每种细胞类型的培养基介质的混合物。因此，合适地，介质包括内皮细胞培养基、内皮基础培养基、内皮生长培养基、周细胞培养基、周细胞生长培养基、星形胶质细胞基础培养基和星形胶质细胞生长培养基的混合物。

流体还可以包括用于帮助细胞生长的另外的组分，例如血清和盐溶液。合适地，血清是人类血清。合适地，盐溶液是汉克平衡盐溶液。将血清添加到培养物，以促进细胞增殖并且保持体内类似的状况。

如上文所提及的，人类流体比如人类血清特别地适合用于其中所使用的所有细胞是人类和/或所使用的3D细胞生长材料是人类衍生的实施方案。这样的全部为人类实施方案在反映自然发生的生理状况中是特别相关的。

血清可以以在约1％至10％之间、或在约1.5％至8％之间、或在约1.75％至6％之间、或在约2％至5％之间的浓度存在于流体中。合适地，血清以约2％的浓度存在。

在其中流体流动存在于最终血脑屏障模型中的实施方案中，合适地，流体与存在于模型的第二室中的液体相同。

介质和另外的组分可以从例如Sciencell Ltd.UK获得。

合适地，流体包括对于每种细胞类型以近似相等比例的培养基介质。

合适地，在剪切应力下在培养细胞期间流体以适当的时间间隔更换，比如例如每5天更换。

合适地，在血脑屏障模型中使用该结构之前，将细胞培养持续10天至20天之间、或在12天至18天之间、或在13天至17天之间、或在14天至16天之间。合适地，在血脑屏障模型中使用该结构之前，将细胞培养持续约15天。

用于产生本发明的结构的方法还可以包括涂覆3D细胞生长材料的步骤。3D细胞生长材料的涂覆用涂覆材料进行。此步骤可以发生在如上文描述的将细胞群体分布在3D细胞生长材料内的步骤之前。

涂覆材料是如上文关于3D细胞生长材料所描述的。

合适地，涂覆3D细胞生长材料包括用涂覆材料覆盖3D细胞生长材料的表面区域。合适地，涂覆3D细胞生长材料包括将3D细胞生长材料浸入涂覆材料中。3D细胞生长材料的浸没可以发生持续在约30分钟至2小时之间、或在约45分钟至1小时30分钟之间、或在约50分钟至1小时10分钟之间。合适地，浸没发生持续约1小时。

方法还可以包括洗涤3D细胞生长材料的步骤。3D细胞生长材料可以被洗涤多次。合适地，3D细胞生长材料被洗涤三次。3D细胞生长材料可以用任何惰性液体洗涤。合适地，3D细胞生长材料用PBS洗涤。PBS可以是约0.1M浓度。

任选地，3D细胞生长材料可以在将细胞群体分布于培养基中的步骤之前储存在培养基中。

一旦细胞已经被培养以形成本发明的结构，该结构就可以如上文所描述被转移到血脑屏障模型的容器中。

可选择地，一旦细胞已经被培养以形成本发明的结构，该结构就可以在培养容器内在原位被用作血脑屏障模型。在这样的实施方案中，培养容器形成如上文所描述的模型的容器。在这样的实施方案中，培养容器可以在流体流动或没有流体流动的情况下使用。流体流动以及因此由此的剪切应力可以在如上文所描述的培养容器中实施。

剪切应力

如上文所描述的，细胞群体在3D细胞生长材料内在剪切应力下培养，以形成血脑屏障模型的结构。

剪切应力可以在约5达因/cm²至100达因/cm²之间、或在约10达因/cm²至80达因/cm²之间、或在约15达因/cm²至60达因/cm²之间、或在约18达因/cm²至50达因/cm²之间、或在约19达因/cm²至30达因/cm²之间。合适地，剪切应力是至少10达因/cm²。合适地，剪切应力小于约25达因/cm²。合适地，剪切应力是约20达因/cm²。

1达因/cm²等效于0.1Pa。因此，剪切应力可以在约0.5Pa至10Pa、或约1Pa至8Pa、或约1.5Pa至6Pa、或约1.8Pa至5Pa、或约1.9Pa至3Pa之间。合适地，剪切应力是至少1Pa。合适地，剪切应力小于约2.5Pa。合适地，剪切应力是约2Pa。

在剪切应力下细胞群体的生长增强紧密连接表达以及细胞中关键的转运蛋白和酶的表达，这继而增加结构的TEER值。剪切应力允许细胞将机械刺激转化成影响细胞功能的细胞内信号，细胞功能例如增殖、凋亡、迁移、渗透性、重塑和基因表达，这继而有助于细胞能够形成紧密且代谢上适合的屏障(tight and metabolically competent barrier)。

合适地，当与在没有剪切应力的情况下已经构建的血脑屏障模型相比较时，TEER值增加约两倍。

合适地，紧密连接蛋白例如闭锁蛋白和连接蛋白-5的表达被增强。

合适地，细胞结构和功能重塑的发生类似于在体内观察到的。

合适地，主要代谢酶例如细胞色素P450 3A4和2D6的活性增加。

合适地，主要转运蛋白质例如ABCB₁和ABCG₂的活性增加。

在剪切应力下培养可以通过任何手段实现。

合适地，在剪切应力下培养可以通过3D细胞生长材料上的流体流动来实现。

合适地，流体流动在培养容器中实施，血脑屏障模型的结构在模型的形成期间被定位于该培养容器中。任选地，流体流动还可以在容器中实施，血脑屏障模型的结构在使用期间被定位在该容器中。

流体流动可以通过如上文所描述的血脑屏障模型的强制流体装置来实现。强制流体装置迫使流体循环通过由储存器、强制流体装置、入口管、培养容器和出口管限定的流体回路。

合适地，强制流体在剪切流下循环，剪切流在流体回路内施加压力。

合适地，如上文所描述的，剪切流被施加在定位于培养容器或容器中的结构上。

因此，合适地，剪切流被施加在定位于该结构的3D细胞生长材料内的细胞群体上。

一旦3D细胞生长材料内的细胞群体已经在剪切应力下培养，本发明的最终结构就形成，并且准备用作上文描述的血脑屏障模型。

研究血脑屏障的渗透性

如上文所描述的，本发明使用本文所描述的模型提供研究血脑屏障响应于各种测试分子的渗透性。

测试分子可以包括增加或减少血脑屏障的渗透性的分子，或对血脑屏障的渗透性没有影响的分子，或意图穿过血脑屏障的分子，或意图被血脑屏障阻挡的分子。

因此，研究血脑屏障模型的渗透性可以包括测量血脑屏障模型响应于测试分子或由测试分子引起的渗透性的变化，或可以包括测量血脑屏障对测试分子的渗透性。

研究血脑屏障的渗透性可以包括用于每种被测试的分子的测试实验和对照实验。测试实验可以是在测试分子的存在下研究血脑屏障模型的渗透性，或可以是在暴露于测试分子之后研究血脑屏障模型的渗透性。对照实验可以是在测试分子的不存在下研究血脑屏障模型的渗透性，或可以是在暴露于测试分子之前研究血脑屏障模型的渗透性。

在一个实施方案中，测试实验是在血脑屏障模型暴露于测试分子之后，并且对照实验是在血脑屏障模型暴露于测试分子之前。

在一个实施方案中，测试实验是在测试分子的存在下的血脑屏障模型，并且对照实验是在没有测试分子的情况下的血脑屏障模型。

可以当模型在剪切应力下时或当模型不在剪切应力下时进行研究血脑屏障的渗透性。因此，研究血脑屏障的渗透性可以在流体流动的存在或不存在下进行。

当测量由测试分子引起的血脑屏障模型的渗透性的变化时，血脑屏障模型的渗透性可以在暴露于测试分子之前和之后使用已知渗透性的分子来测量。这使得可以确定测试分子对血脑屏障的渗透性的影响。

测量血脑屏障模型的渗透性的变化可以包括:

(a)将血脑屏障模型暴露于已知分子；

(b)测量血脑屏障对已知分子的渗透性；

(c)将血脑屏障模型暴露于测试分子；

(d)将血脑屏障模型第二次暴露于已知分子；

(e)第二次测量血脑屏障对已知分子的渗透性；

(f)测量步骤(b)和步骤(e)之间血脑屏障对已知分子的渗透性的差异；以及

(g)任选地确定测试分子对血脑屏障的渗透性的影响。

如果已经已知血脑屏障对已知分子的渗透性，则步骤(a)和步骤(b)可以任选地从该方法中除去。步骤(g)中测试分子的影响可以是增加、减少或对血脑屏障的渗透性没有影响。

测量血脑屏障对测试分子的渗透性可以包括：

(a)将血脑屏障模型暴露于已知量的测试分子；

和

(b)确定血脑屏障模型对测试分子的渗透性。

确定血脑屏障的渗透性可以包括确定血脑屏障对测试分子是可渗透的或不可渗透的。

将血脑屏障模型暴露于可以是测试分子或已知分子的分子，合适地包括将包含细胞群体的结构暴露于该分子。

合适地，将结构暴露于分子包括将结构的第一侧暴露于分子，第一侧是如上文所定义的。

可选择地，将结构暴露于分子可以包括将整个结构暴露于分子。

将结构暴露于分子可以通过任何手段实现。合适地，将结构暴露于分子通过将分子施用到血脑屏障模型的第一室来进行，第一室被上文定义。可选择地，将结构暴露于分子通过将分子施用到上文定义的流体流动的流体入口中来进行。测量血脑屏障的渗透性可以包括测量分子的量，分子是测试分子或已经通过血脑屏障模型的已知分子。可选择地，它可以包括测量流体流动的流体出口中的测试分子的量。可选择地，它可以包括在暴露于测试分子期间测量血脑屏障的TEER值。可选择地，它可以包括测量通过转运蛋白质外排测试分子的程度。可选择地，它可以包括通过酶测量测试分子的代谢。

转运蛋白质和酶由细胞群体的细胞表达并且定位于细胞群体的细胞中，该细胞群体形成血脑屏障的结构。合适地，测量的转运蛋白质是MDR1转运蛋白和BCRP转运蛋白。合适地，测量的酶是CYP2D6酶和CYP3A4酶。

合适地，当测量外排和代谢时，血脑屏障模型不处在剪切应力下。合适地，在血脑屏障模型中不存在流体流动。

通过测量血脑屏障模型的TEER值，研究者可以使用模型表征测试分子对模型的结构特性的影响。通过测量测试分子的外排和代谢，研究者可以使用模型表征测试分子对模型的代谢特性的影响。

合适地，已经通过血脑屏障模型的分子的量通过以下来测量：测量血脑屏障模型已经暴露于的分子的量，以及测量已经通过血脑屏障模型的分子的量，并且确定分子的量的差异。

测量血脑屏障模型已经暴露于的分子的量合适地包括测量存在于结构的第一侧上的分子的量。合适地，测量存在于结构的第一侧上的分子的量包括测量血脑屏障模型的第一室中的分子的量。

测量已经通过血脑屏障模型的分子的量合适地包括测量存在于结构的与结构暴露于分子的侧面相对的侧面上的分子的量。合适地，已经通过血脑屏障的分子的量在结构的第二侧上测量。合适地，测量存在于结构的第二侧上的分子的量包括测量血脑屏障模型的第二室中的分子的量。

分子的量可以通过分子的浓度来测量。

分子的量的测量可以通过缀合到分子的荧光标签来帮助，例如分子可以是加FITC标签的或加罗丹明123标签的。

因此，分子的量可以通过荧光的水平来测量。

存在于模型的结构的第一侧或第二侧上的分子的量的测量可以通过将模型的结构的两侧成像来实现。各种成像技术在本领域中是可用的，例如当使用荧光标签时，分光光度法可以用于将血脑屏障模型成像并且确定结构的任一侧上的分子的量。

测量血脑屏障模型的TEER值可以如上文关于TEER值所描述的进行。

在暴露于测试分子期间测量血脑屏障的TEER值可以包括在暴露于测试分子之前测量血脑屏障的TEER值，以及在暴露于测试分子期间测量TEER值，并且确定TEER值的差异。

TEER值的降低指示血脑屏障具有增强的渗透性。这指示，紧密连接是打开的。TEER值的增加指示，血脑屏障对相关测试分子具有降低的渗透性。如果TEER值保持相同，这指示血脑屏障的渗透性不被影响。

分子可以选自候选药物或治疗剂，例如适体、短寡核苷酸、药物、营养制品、小分子或生物制剂。

在一些实施方案中，本发明可以包括研究患病的血脑屏障响应于各种测试分子的渗透性。

如上文所描述的，血脑屏障可以包括代表疾病状态的细胞群体。因此，合适地，血脑屏障模型可以包括患病细胞。可选择地，疾病的介质(mediator)可以被引入第一室或第二室的液体中，例如将炎性细胞因子引入第一液体中。可选择地，疾病的特征可以被引入血脑屏障模型的结构中，例如在结构的脑侧上引入神经胶质瘤球体，其中神经胶质瘤球体包括神经胶质瘤细胞。

因此，本发明的血脑屏障模型可以用于评估测试分子例如候选药物对测试分子意图治疗的相关体内病理的影响。因此，研究血脑屏障的渗透性的方法可以是测试患病的血脑屏障对候选药物的渗透性的方法。

在一个实施方案中，测试分子是适体。合适地，适体可以是适体GL21。在一个实施方案中，测试分子是小分子。合适地，小分子可以是多西他赛或姜黄素。

在一个实施方案中，测试分子是miRNA。合适地，miRNA是miRNA21。

任选地，测试分子可以缀合到载体。合适地，载体是可操作的，以运输测试分子，并且可以包括纳米颗粒、肽等等。

本发明的患病的血脑屏障模型可以与本发明的对照“健康”血脑屏障模型比较地使用，以识别新颖的药物靶。合适地，新颖的药物靶在疾病期间在血脑屏障处被差异性地表达。例如，可以识别和选择差异性地结合到疾病血脑屏障模型而不是对照“健康”BBB模型的适体。合适地，这可以使用SELEX适体方案进行。适体辅助的沉淀测定可以用于识别在血脑屏障处结合的适体，LC-MS/MS蛋白质组分析可以用于识别在血脑屏障处差异性地表达的药物靶。

现在将通过参考以下实施例和附图的方式来描述本发明的某些实施方案。

实施例

1.方法和资源

1.1细胞系

从Merck Millipore(Hertfordshire,UK)获得的永生化人脑微血管内皮细胞系(human cerebral microvascular endothelial cell line)(hCMEC/D3)是经由慢病毒载体系统(Urich等人，2012)从原代人脑毛细管内皮细胞产生的细胞系。此外，源自原代组织的包括人类微血管内皮细胞(HMBEC)、人脑血管周细胞(HBVP)和人类星形胶质细胞(HA)的可商购的短期细胞系购自(Sciencell,Buckingham,UK)。培养基和10％二甲基亚砜(DMSO)中的细胞被储存在液氮(-190℃)中的冷冻管中。

1.2培养基和补充物

除非另有提及，磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、包括组织培养瓶、孔板、离心管、移液管(stripette)、巴斯德吸管和1.5ml管的所有塑料制品购自Fisher scientific,Leicestershire,UK。所有实验室消耗品购自Sigma,Dorset,UK。将所有细胞系在75cm²组织培养物处理的烧瓶中培养，并且保持在供应有5％ CO₂的37℃加湿培养箱(ThermoScientific Nunc,UK)中。短期内皮细胞细胞系、周细胞细胞系和星形胶质细胞细胞系分别在内皮细胞培养基、周细胞培养基和星形胶质细胞培养基(Sciencell,UK)中生长。此外，培养基补充有5％(v/v)人类血清(HS)和生长补充物(表1)。将冷冻细胞在37℃的水浴中快速解冻，并且接种在层流柜中的75cm²组织培养瓶中，其中每1ml解冻细胞有10mL生长培养基。生长培养基在12-24h之后更换，以用于完全除去冷冻保存剂。将细胞以5×10⁴个细胞/ml的密度接种在75cm²烧瓶中，将烧瓶在37℃和5％ CO₂在加湿培养箱中孵育，直至汇合。

表1.细胞培养补充物的概述

1.3比较性Transwell模型

在建立三种比较性transwell血脑屏障模型之前，将短期培养物生长直到第6天，以确保细胞处于指数增长阶段。transwell培养物利用人类微血管内皮细胞(HMBEC，第2-9代)、人脑血管周细胞(HBVP，第2-5代)和人类星形胶质细胞(HA，第2-9代)。三种比较性血脑屏障模型是：在transwell板中单一细胞类型的单一培养物、在transwell板中两种细胞类型的共培养物以及在transwell板中三种细胞类型的三培养物，每种培养物在静态条件下培养。

将HBMEC细胞在单一培养物中以50,000个细胞/孔的密度接种，并且在共培养物中以及在三培养物中以25,000个细胞/孔的密度接种。在共培养物中，HBVP以25000个细胞/孔的密度接种，并且HA以25000个细胞/孔的密度接种。在三培养物中，HBVP以12,500个细胞/孔的密度接种，并且HA以12,500个细胞/孔的密度接种。每种模型中的最终细胞数总是相同的，并且不同细胞组分的比不同。在TEER测量的第一天保持细胞的比为1:1:1。插入物用5μg/cm²的细胞外基质(ECM)糖蛋白纤连蛋白(Sigma，Dorset，UK)涂覆持续2h至4h，并且用HBSS，pH 7.4洗涤。

如果插入物的孔径大至足以允许两种培养物之间的物理接触，则共培养物被定义为“接触”(图1中的c)图和e)图)。首先将细胞接种在基底外侧侧面上，并且以倒置位置孵育持续4h，以使得细胞能够附着，并且然后转移到培养板，并且在37℃具有5％ CO₂在加湿培养箱中孵育持续另外的48h。在48h之后，将内皮细胞接种在插入物的顶部内室中。如果不存在直接的物理接触，则共培养物被定义为“不接触”，例如，一个细胞群体在transwell插入物上，并且另一个细胞群体接种在基底外侧室中的孔的底部上。为了接种不接触的共培养物，将细胞接种在孔的底部上，并且在37℃具有5％ CO₂的加湿培养箱中孵育(图1中的b)图和d)图)。在48h之后，将内皮细胞接种在插入物的顶侧上。所有的共培养物在以1:1的比混合的所使用的相应培养物的培养基中培养(表1)。

对于三培养物，将星形胶质细胞接种在插入物的基底外侧侧面上，同时将周细胞接种在底部孔中，或如在图2中的a图中所看到的，将两种细胞类型(星形胶质细胞和周细胞)接种在基底外侧侧面上(全部接触)，并且将两种细胞均在具有5％ CO₂的37℃的加湿培养箱中孵育。在48h之后，将插入物放置在孔中，并且将内皮细胞接种在插入物的顶侧上。将三培养物在以1:1:1的比混合的相应培养物的培养基中培养(表1)。

1.4 3D细胞生长材料模型

3D细胞生长材料模型呈现本发明的血脑屏障模型。图2中的a图图示本发明的血脑屏障模型，并且图2中的b图图示在剪切应力下本发明的模型的形成，本发明的模型包括灌注板，灌注板具有设置在其内的

3D支架材料(Reinnervate，Durham，UK)，灌注板具有蠕动泵，以在细胞的培养期间保持在三维(3D)支架中生长的细胞上的培养基剪切应力流。在一些情况下，本发明的模型已经在以下情况下被测试：在剪切应力下培养或不在剪切应力下培养。然而，本发明的模型在实施例内被称为具有剪切流/剪切应力或在剪切流/剪切应力下培养的‘3D模型’。将3D模型的细胞接种在

三维支架上，以5μg/cm²纤连蛋白预涂覆，并且然后转移到灌注板中。将星形胶质细胞和周细胞接种在3D支架的基底外侧侧面上，并且倒置孵育持续4h。然后将3D支架放回孔中，并且将内皮细胞接种在顶侧上。在进行第一TEER测量之前，将板孵育持续24h。将板连接到入口管道(直径16mm)和出口管道(直径25mm)，入口管道和出口管道被连接到培养基的储存器，培养基的储存器包含呈相等比例的培养基的混合物。使用蠕动泵(Watson-Marlow,Cornwall,UK)，剪切应力的压力被设定为20达因/cm²，并且流动被保持持续15天的时期。储存器中的培养基每5天更换。

图2中的c图表示本发明的血脑屏障模型可以如何包括代表疾病状态的细胞群体的实施例，例如通过引入神经胶质瘤球体。通过将神经胶质瘤球体并入到结构的基底外侧(脑侧)来建立疾病状态模型，以创建有效的血液-肿瘤屏障模型。神经胶质瘤细胞如下产生：将组织培养板涂覆1％无菌琼脂，并且在将细胞接种用于球体之前留置冷却一天。将传代的U87MG神经胶质瘤细胞以3,000个细胞/孔的密度接种到琼脂涂覆的24-孔板上。将板在37℃具有5％ CO₂的加湿培养箱中孵育持续6天，在3天之后更换培养基。在第六天，将含有球体的25μL培养基小滴直接放置成与血脑屏障模型(通常如上文所描述产生)的基底外侧侧面上的星形胶质细胞接触。小滴被安排成倒置悬挂或不接触基底外侧室的底部。其他疾病状态模型也用放置成与星形胶质细胞(未示出)接触的神经胶质瘤球体制造。

1.4跨内皮电阻测量

在24h之后，针对每种模型，每天使用EVOM-2(Merck Millipore,Oxford,UK)跨插入物上的五个位置测量单一培养物、共培养物、三培养物和3D支架培养物的跨内皮电阻(TEER)，持续15天。每种模型被设置成一式三份，以评估测定内可变性(intra-assayvariability)，并且每个实验重复三次，以评估测定间可变性(inter-assayvariability)。空白transwell插入物的TEER值是35Ω/cm²，并且3D支架是42Ω/cm²。从最终测量结果减去这些空白读数，以给出设定模型的TEER值。利用仪表及其电极的电子电路检测到的TEER的增加，是细胞单层的健康和汇合的指示。

1.5荧光免疫染色

将细胞以1×10⁴个细胞/ml的密度接种在24孔板中1mm厚的盖玻片上，并且通过在室温用4％多聚甲醛(PFA)孵育持续15分钟固定，随后用0.1M PBS洗涤。将细胞用0.1M甘氨酸孵育持续10分钟以用于淬灭背景荧光，用0.1M PBS，pH 7.4洗涤5次，然后通过在室温用0.1％triton X-100孵育持续10分钟透化，然后用0.1M PBS，pH 7.4洗涤五次。通过以下封闭细胞：用10％山羊血清孵育持续1h，然后用0.1M PBS，pH 7.4洗涤三次。然后将细胞在室温用兔多克隆一级抗体的相应稀释液(表2)孵育持续1h，并且在孵育时期结束时用0.1MPBS、pH 7.4洗涤三次。然后将细胞用山羊抗兔IgG的二级抗体Alexa

488F(ab')2片段(Life technologies，UK)的1:1000稀释液在黑暗中孵育持续30分钟。在分析之前，将细胞洗涤并且使用VECTASTAIN封固介质(Vector Laboratories,Peterborough,UK)封固在显微镜载玻片上，并且在黑暗中孵育持续24h。

表2.用于免疫染色的一级抗体、来源和稀释液的列表。

1.6蛋白质提取和定量

将细胞在T-75烧瓶中培养直到70-80％汇合，用冰冷的0.1M PBS，pH7.4洗涤，使用无菌细胞刮刀从烧瓶中刮去并且收集在预冷却的加入了500μl冰冷的RIPA裂解缓冲液的1.5ml管中。在插入物上生长的细胞用HBSS,pH 7.2洗涤两次，并且然后用100μl RIPA缓冲液在4℃孵育持续15分钟。将样品在振荡器(VXR Vibrax,Oxfordshire,UK)上以40rpm在4℃搅动持续30分钟，以有利于膜裂解。然后将样品在微型离心机(Sanyo,Leicester,UK)中在4℃以11451x g离心持续20分钟。在离心之后，将上清液收集在预冷却的1.5ml管中，准备用于确定蛋白质浓度。Bradford测定用于蛋白质定量，其中在RIPA裂解缓冲液中稀释的一组牛血清白蛋白(BSA)蛋白质标准品(0.1mg/mL至2mg/mL)用作参考。将样品和标准品在96孔板中在Bradford试剂中稀释(51份稀释液中1份)。使用读板器Tecan GENios

(Tecan，Theale，UK)在612nm处读取吸光度。将BSA样品的吸光度相对于BSA的浓度绘制，并且通过线性回归确定最佳拟合线，以允许确定提取的蛋白质浓度。然后针对稀释因子校正蛋白质浓度。

1.7蛋白印迹

免疫蛋白印迹法(Western immunoblotting)用于检测细胞色素P450酶；CYP3A4、CYP2D6、外排转运蛋白；ABCB1和ABCG2以及紧密连接蛋白；闭锁蛋白和连接蛋白-5蛋白质在提取的蛋白质裂解物中的表达。将来自储存在-20℃的细胞的2mg/ml蛋白质等分试样解冻，并且以1:1的比与2x Laemmli样品加载缓冲液混合，并且在90℃加热(Techne，Staffordshire，UK)持续5分钟。电泳分离使用SDS PAGE进行，使用4％积层凝胶(stackinggel)和10％解析凝胶(resolving gel)以120V的恒定电压持续2h。凝胶通过在冰浴中以90V持续1h的湿法转移到硝酸纤维素膜上。蛋白质转移通过胭脂红S红染色可视化，然后在用相关的兔多克隆一级抗体(表3)在4℃过夜孵育之前，将印迹洗涤并且在室温封闭(具有0.1％吐温20和5％无脂乳的1M tris缓冲盐水)持续1h。将缀合至辣根过氧化物酶的二级抗体(1:10000稀释液)(表3)在室温与印迹孵育持续1h，然后用TBST洗涤三次。然后用dH₂O冲洗印迹，并且按照制造商的说明使用ECL plus试剂盒(GE Healthcare，UK)检测蛋白质，并且在凝胶doc XPS(Bio Rad，Deeside，UK)中成像，以通过化学发光将感兴趣的蛋白质的条带可视化。

表3.一级抗体和稀释液的列表

1.8代谢药物的酶的活性测定(CYP3A4和CYP2D6)

细胞系中CYP3A4和CYP2D6的功能活性在96孔板中通过用感兴趣的CYP的底物探针孵育并且测量荧光代谢物的形成速率测定。用于CYP3A4酶的探针是7-苄氧基-4-三氟甲基-香豆素(BFC)(BD

Oxford,UK)，其形成荧光代谢物7-羟基-4-三氟甲基香豆素(HFC)(BD

Oxford,UK)。CYP2D6的活性使用3-[2-(N,N-二乙基-N-甲基铵)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)(BD

Oxford,UK)确定，该化合物形成荧光代谢物3-[2-(N,N-二乙基-N-甲基铵)乙基]-7-羟基-4-甲基香豆素(AHMC)(BD

Oxford,UK)。在使用之前，将所有底物和代谢物溶解在DMSO中以给出10mM母液，并且在介质中1/400稀释，以确保反应孔中的最终溶剂浓度不超过0.1％的阈值。将辅因子10mM NADPH(-80℃储存)在0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)中新鲜地制备，并且添加到平底、透明的96孔板中，该96孔板含有预热的(37℃)5000个细胞/孔、25μM的最终浓度的底物和0.1M磷酸钾缓冲液,pH7.4，以启动酶反应。HFC的形成在410nm的激发波长和510nm的发射波长测量，并且AHMC的形成在Tecan GENios

读板器(Tecan,Theale,UK)中在390nm的激发波长和460nm的发射波长测量。在37℃每30秒进行测量，持续30分钟，其中在每次读数之前轨道振荡持续5秒。从顶部读取板，并且增益在第一次运行时被优化，并且在随后的所有运行中被设置为35。阳性对照在细菌体(bactosomes)(Cypex，UK)中过表达人重组CYP3A4和CYP2D6，并且阴性对照包括媒介物对照、细胞、培养基或缓冲液和0.1％ DMSO、底物空白(细胞和介质)和酶空白(底物和介质)。使用在0至40μM之间的标准浓度的HFC或AHMC制备代谢物的标准曲线，HFC或AHMC添加到0.1mg/mL细胞蛋白质，以得到在96孔板中250μL的最终孔体积。将来自动力学实验的荧光发射读数转化为每分钟产生的μM HFC或AHMC，针对1mg/ml蛋白质归一化。使用GraphPad Prism^TM 6.05绘制酶活性率(rate of enzyme activity)对比底物浓度的Michaelis-Menten图，并且估计Vmax和Km。

1.9外排转运蛋白(ABCB1和ABCG2)的活性测定

多药耐药性直接染料外排活性试剂盒(Merck Millipore,Oxford,UK)用于通过以下测量ABCB1和ABCG2的功能活性：分别地测定细胞排出荧光ABCB1和ABCG2底物染料3,3’-二乙基氧杂碳菁碘化物[DiOC2(3)]溶液和罗丹明123溶液的能力。非荧光底物长春碱用作ABCB1和ABCG2转运蛋白活性的竞争抑制剂，并且DMSO作为媒介物对照被包括。细胞通过从细胞培养皿中刮去从插入物提取，并且从transwell单一、共、三或3D细胞生长材料模型中胰蛋白酶解。根据试剂盒说明书，转运蛋白活性测量对约2.5×10⁵个细胞的细胞悬浮液进行。

1.10 FTIC右旋糖酐的渗透性

使用在培养基中制备的伊文思蓝(10μg/ml)作为阴性对照和在培养基中的100μg/ml FITC-右旋糖酐(分子量70kDa)评估渗透性。将培养基从插入物的顶侧除去，并且将含有FITC-右旋糖酐的培养基引入培养装置中。将加荧光标签的右旋糖酐在顶侧上孵育，并且培养基在基底外侧侧面上取样以测量模型的表观渗透性(Papp)。将模型在标准组织培养条件中孵育，并且在不同的时间间隔(15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和120分钟)将培养基从插入物的基底外侧侧面取样。取样的培养基的荧光在Tecan GENios

读板器上在激发波长492nm和发射波长518nm读取，其中增益设置为55(Tecan,Theale,UK)，并且使用荧光相对于已知浓度的FITC–右旋糖酐的标准曲线转化为浓度。

每种适体的表观渗透性使用等式1(Artusson,1990)中的式计算。所有数据从三次实验重复获得。

其中：

V＝基底外侧隔室的体积(0.5cm³)

A＝聚碳酸酯膜的表面积(0.3cm²)

C₀＝顶侧中FITC-右旋糖酐的最终浓度(100μg/ml)

dQ＝穿过细胞层到基底外侧侧面的FITC适体的浓度(μg/ml)

dt＝时间(分钟)

1.11本发明的应用

将血脑屏障模型暴露于测试化合物/已知化合物以确定渗透性。引入顶孔的化合物的最终浓度先前使用存活力测定和使BBB细胞的毒性最小化所选择的浓度(<IC₅₀)来确定。在内部制备测试化合物(加cy5标签的短DNA寡核苷酸神经胶质瘤选择性适体(100nM)(GL21，加扰)和加载有0.33μg/ml多西他赛或2.87μg/ml姜黄素、加罗丹明123和转铁蛋白配体标签的的脂质纳米颗粒(NP))。当BBB模型的TEER值达到峰值时，将3.33μg/ml伊文思蓝染料(EBD)添加到BBB模型的顶侧，以确定所形成的屏障是否完整。将测试化合物和对照化合物引入孔，并且时间依赖性TEER测量连同样品的荧光测量在距孔的基底外侧侧面0.5-6h之间的时间点进行，以用于确定加荧光标签的化合物的出现。在用于外排转运蛋白的抑制剂(2μM长春碱)的存在和不存在下，NP也在BBB模型中孵育。活性作为相对于NP的母液浓度的％荧光计算，并且然后绘制。

可以在血脑屏障模型中如何研究疾病的介质的实例是经由用反义寡核苷酸转染细胞，以猝灭与神经胶质瘤细胞侵袭、凋亡和增殖相关的升高的微RNA-21的影响。使用

转染试剂用hsa-miR-21-3p抑制剂质粒转染细胞。简言之，将hsa-miR-21-3p抑制剂在Tris EDTA(TE)缓冲液中重构，并且以100nmol/L的浓度添加到细胞。细胞还用6μl

试剂和200μl

缓冲液孵育。转染培养基在6h之后被生长培养基替换。在48h之后，构建血脑屏障模型，并且剩余细胞用胰蛋白酶处理，并且用于研究ABCB1转运蛋白和ABCG2转运蛋白的表达和活性。此研究的结果在下文更详细地描述，并且显示在图中。

1.12统计学分析

所有数据被表示为一式三份实验的平均值±标准偏差(平均值±SD)，其中n＝3。使用GraphPad Prism(v6.04)进行统计学分析。在使用Bonferroni事后分析的单向ANOVA之前，针对正态性检验数据。p<0.05的概率值被认为具有统计学意义。

2.结果

2.1三种transwell模型和本发明的3D细胞生长材料模型关于TEER的对比

在相同的优化实验条件(人类血清浓度、细胞数和细胞接种的定向、细胞外基质和组成)下，将在剪切应力的存在和不存在下培养的transwell插入物三培养物与三维细胞生长材料培养物(在本发明的实施例中使用

)进行对比(表9)。总之，与transwell插入物上的三培养物模型(图3中的C图)相比，三维支架(图3中的D图)的使用导致TEER从258±5.31Ω/cm²显著增加到440±7.9Ω/cm²。此外，当3D

模型在剪切应力流下培养时，TEER进一步增加到710±8.2Ω/cm²(图3中的D图)。

从2D插入物上的培养物到3D支架的改变更加代表在体内观察到的3D组织组织化(3D tissue organisation)；这反映在TEER值的增加中。如此处所示的，在体外血脑屏障模型中，剪切应力的引入改善紧密连接蛋白的表达，并且增加TEER值。

表9.不同模型的TEER值。

	<![CDATA[最大TEER±SD(Ω/cm<sup>2</sup>)]]>
		静态三培养物模型	258±5.31
静态3D模型	440±7.9
		剪切应力3D模型	710±8.2

2.2紧密连接蛋白的表达

研究相同模型对紧密连接蛋白闭锁蛋白和连接蛋白-5的表达(图4中的A图&B图)。当与单一培养物(泳道2)模型和共培养物(泳道1)模型相比时，三培养物插入物模型e/ap/-(泳道3)和利用剪切流培养的3D模型e/ap/-(泳道4)显示紧密连接蛋白闭锁蛋白和连接蛋白-5的更高表达。数据示出利用流培养的3D模型对连接蛋白和闭锁蛋白的最高表达。因此，可得出的是，内皮细胞暴露于剪切应力流引起编码多种紧密连接蛋白的基因的RNA水平增加，并且增强其蛋白质表达。

2.3代谢药物的酶以及转运蛋白的表达和活性

在表10中，显示了在所研究的每种血脑屏障模型中，两种主要人类代谢药物的酶细胞色素P450(CYP)3A4和CYP2D6的酶活性数据。在利用流培养的3D模型中观察到最高的酶活性。利用共培养物模型和三培养物模型的蛋白质表达也通过免疫蛋白印迹法测量(图5)。

表10.BBB模型中细胞色素P450酶活性的速率

通过免疫蛋白印迹法研究相同模型对ABCB1和ABCG2外排转运蛋白质的表达(图6中的A图&B图)。当与单一培养物(泳道1)模型和共培养物(泳道2)模型相比时，插入物上的三培养物模型(泳道3)和利用剪切流培养的3D模型(泳道4)显示出ABCB1和ABCG2外排转运蛋白的更高的表达。数据显示利用流培养的3D模型对ABCB1和ABCG2外排转运蛋白的最高表达。

外排转运蛋白的功能活性通过测量以下评估：由ABCB1和ABCG2转运蛋白排出的染料相对于对照(在4℃、针对0％的染料外排归一化的等效模型)的百分比。如在图7中的A图和B图中所示的，分别针对ABCB1和ABCG2，观察3D模型的最高活性。

2.4利用永生化内皮细胞替代原代短期内皮细胞

体外血脑屏障模型的最有利的组成将是原代细胞的短期培养物的使用，然而，为了考虑到HBMEC的可用性短缺的时期(对于周细胞或星形胶质细胞不是问题)，我们研究了利用永生化hCMEC/D3替代来自原代细胞的HBMEC短期培养物的可能性。如在图8-右图中所看到的，将三培养物模型(e/ap/-)用永生化HCMEC/D3细胞而不是原代hbmec细胞(图8-左图)替代。hCMEC/D3细胞显示出较高的TEER值，尽管与hCMEC/D3细胞相比较早的峰，并且因此在本发明的剪切应力下培养的3D模型中，hCMEC/D3细胞将是HBMEC的合适替代物。

此外，证实血脑屏障模型功能所需要的关键蛋白质(闭锁蛋白、连接蛋白、ABCB1、ABCG2)的表达的免疫蛋白印迹法在永生化内皮细胞中进行，并且被发现是与原代短期内皮细胞相当的，证实如果替代原代细胞的需求出现时hCMEC/D3细胞的适用性(图9)。

2.5使用FITC-右旋糖酐测量渗透性

将血脑屏障模型利用放置于模型的顶部隔室中的100μg/mL的各种分子量FITC-右旋糖酐孵育持续60分钟，并且在静态条件对比剪切应力流条件下培养。图10图示与静态模型相比当包括剪切应力流时屏障模型功能的显著增强，如通过以下所呈现的：显著较大地排斥所有分子量右旋糖酐移动到基底外侧脑隔室中。<4kDa的低分子量右旋糖酐的表观渗透性(Papp)被用作低分子量溶质和离子细胞旁转运的标记，并且>40kDa的高分子量右旋糖酐是将被BBB排出的蛋白质(11.2-14.6nm)的标记。Papp值随着递增分子量化合物而降低，显示选择性渗透性。此外，在根据本发明的剪切应力下的血脑屏障模型更准确地反映屏障的体内功能，如通过70kDa FITC-右旋糖酐的Papp＝0.47x 10^-5cm/s所示。

2.6血脑屏障模型的应用

本发明的血脑屏障模型的应用的一个实例在图11中示出。将血脑屏障模型暴露于测试化合物，并且测量屏障对所述测试化合物的渗透性，并且与血脑屏障模型对已知化合物的渗透性进行比较。

所选择的测试化合物是命名为GL21的适体，该适体被设计成穿过血脑屏障并且靶向神经胶质瘤细胞。在此情况下，所使用的已知化合物是伊文思蓝(一种不可渗透的染料)和SCRA(具有加扰寡核苷酸序列的适体，不具有渗透血脑屏障的正常能力)。图11显示，测试化合物是经由血脑屏障用于神经胶质瘤靶向的理想候选物，并且在模型中如预期发挥作用。相对于其中没有引入药物的对照血脑屏障模型的TEER值的下降，指示紧密连接打开和血脑屏障模型渗透。这通过检测和测量血脑屏障模型的基底外侧隔室中加荧光标签的测试化合物来进一步证实。此实施例示出，本发明的模型可以成功地用于实验室研究，以测试化合物跨过血脑屏障的能力。

在图12中示出本发明的模型的另外的应用的实例。使用血脑屏障模型可以观察和测量各种疾病状态对血脑屏障的影响。图12示出血脑屏障-神经胶质瘤模型。如上文所描述的，测量神经胶质瘤球体对跨血脑屏障模型的TEER的影响。神经胶质瘤细胞本质上是高度侵袭性的，并且如预期的示出对完整屏障模型的破坏。这是已经在体内记录的现象，并且现在可以使用本发明的血脑屏障模型在体外显示。因此，本发明的模型可以用于准确地反映疾病状态，以用于进一步的体外研究。

进一步测试血脑屏障神经胶质瘤模型，以确定通过神经胶质瘤球体对加罗丹明123标签的多西他赛加载的纳米颗粒的摄取。为了确定外排转运蛋白的作用，纳米颗粒摄取在外排转运蛋白抑制剂长春碱的存在和不存在下进行。图13显示在不同时间点荧光在神经胶质瘤球体中的积累，这反映了相对于引入血液顶部隔室的治疗性纳米颗粒(母液)的荧光，神经胶质瘤对治疗性纳米颗粒的摄取。数据表明，治疗性纳米颗粒化合物确实跨过血脑屏障并且穿透神经胶质瘤，强调了本发明的模型可以如何用于确定与治疗CNS病理例如脑肿瘤相关的测试分子的渗透性。

在图14中示出本发明的血脑屏障模型可以如何用于研究CNS紊乱的介质的另一个实例。该图示出反义miRNA21对屏障模型性质的影响。发现，将反义miRNA21转染到血脑屏障模型的所有细胞组分中降低了个体细胞中和作为整体的模型中ABCB1转运蛋白的外排活性。结果显示，关键药物转运蛋白ABCB1的活性可以在模型中被改变，这暗示着可以研究声称参与炎症和疾病进展的其他miRNA介质的影响。当阐明血脑屏障对于患病状态和健康状态中CNS体内稳态的作用时，此结果可能具有意义，因为miRNA21的表达升高与神经胶质瘤的进展有关。

目前可用的体外血脑屏障模型仅仅针对血脑屏障的物理属性而不是血脑屏障的代谢属性被表征。此外，不存在使用神经血管单元的相关细胞类型培养的多细胞模型。因此，迫切需要开发一种血脑屏障模型，该血脑屏障模型在生理学上是相关的，并且针对血液和脑连接处存在的屏障的代谢特征进行优化。

本发明人已经通过产生充分表征的、生理学上和代谢上相关的体外血脑屏障模型解决了此问题。该模型提供用于物理屏障的高TEER、紧密连接的最大表达以及用于代谢屏障的药物代谢酶和转运蛋白的高活性。

本发明的模型的应用是很多的，包括：改善治疗剂向CNS的递送；阐明血脑屏障处的新治疗靶点，并且进一步了解CNS病理的疾病机制。此模型的建立考虑了血脑屏障的所有基本组分，并且包括体外血脑屏障模型应该必须准确地反映体内状态的基本性质。

本申请提供了以下内容：

项目1.一种结构，所述结构包括：

细胞群体，所述细胞群体包括内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞；

以及3D(三维)细胞生长材料，所述细胞群体被定位于所述3D细胞生长材料内；

其中所述结构具有至少450Ω/cm²的TEER值。

项目2.根据项目1所述的结构，其中所述细胞来源于脑。

项目3.根据项目1或2所述的结构，其中所述细胞是人类细胞。

项目4.根据任一前述项目所述的结构，其中所述细胞是原代来源的非永生化细胞。

项目5.根据项目4所述的结构，其中所述内皮细胞和所述星形胶质细胞具有小于10的传代数，并且所述周细胞具有小于6的传代数。

项目6.根据任一前述项目所述的结构，其中所述结构包括在约7.5:1:1至约1:1:1之间的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比。

项目7.根据项目6所述的结构，其中所述结构包括约2:1:1的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比。

项目8.根据任一前述项目所述的结构，其中所述3D细胞生长材料在约100-300μm之间厚。

项目9.根据任一前述项目所述的结构，其中所述3D细胞生长材料由支架或凝胶形成。

项目10.根据项目9所述的结构，其中所述支架包括孔，所述孔的尺寸是约20-100μm。

项目11.根据项目10所述的结构，其中所述支架包括超过90％的孔隙率。

项目12.根据项目9所述的结构，其中所述支架被涂覆材料涂覆。

项目13.根据项目12所述的结构，其中所述涂覆材料是选自纤连蛋白、胶原蛋白、聚-L-赖氨酸、

或串珠蛋白聚糖的生物聚合物。

项目14.根据项目12或13所述的结构，其中所述涂覆材料以约1-20μg/cm²所述支架表面积的浓度存在。

项目15.根据任一前述项目所述的结构，其中所述TEER值在约450Ω/cm²和1000Ω/cm²之间。

项目16.根据项目15所述的结构，其中所述TEER值在约700Ω/cm²和800Ω/cm²之间。

项目17.一种血脑屏障模型，包括：

容器，所述容器包括项目1-16中任一项所述的结构；

其中所述结构将定位于所述结构的第一侧上的第一室和定位于所述结构的第二侧上的第二室分开；

并且其中所述第一室包含与所述结构的所述第一侧接触的第一液体，并且所述第二室包含与所述结构的所述第二侧接触的第二液体。

项目18.根据项目17所述的血脑屏障模型，其中所述第一室模拟血液，并且所述第二室模拟脑细胞外液，并且其中所述第一液体代表血液，并且所述第二液体代表脑细胞外液。

项目19.根据项目17或18所述的血脑屏障模型，其中所述内皮细胞被定位于靠近所述结构的血液侧的层中，并且所述星形胶质细胞和/或所述周细胞被定位于所述结构的中心层中或靠近所述结构的脑侧的层中。

项目20.根据项目19所述的血脑屏障模型，其中所述结构包括包含内皮细胞的第一细胞层以及包含星形胶质细胞和周细胞的第二细胞层，所述第一层细胞靠近所述结构的所述第一侧，所述第二层细胞靠近所述结构的所述第二侧。

项目21.根据项目17-20中任一项所述的血脑屏障模型，其中所述结构被定位于插入物中，并且其中所述插入物被定位于所述容器中。

项目22.根据项目21所述的血脑屏障模型，其中所述结构形成所述插入物的基部。

项目23.一种制造结构的方法，所述方法包括以下步骤：

(b)在剪切应力下培养所述细胞群体。

项目24.根据项目23所述的方法，其中所述结构如项目2-16中任一项所定义。

项目25.根据项目23或24所述的方法，其中将所述细胞群体分布在所述3D细胞生长材料的第一侧和/或第二侧上。

项目26.根据项目25所述的方法，其中将所述内皮细胞分布到所述3D细胞生长材料的所述第一侧上，并且将星形胶质细胞和周细胞的混合物分布到所述3D细胞生长材料的所述第二侧上。

项目27.根据项目25或26所述的方法，其中所述3D细胞生长材料的一侧的细胞被首先分布，随后是孵育第一时间段，在第一孵育之后，将所述3D细胞生长材料倒置，并且所述3D细胞生长材料的中心和/或相对侧的细胞被分布，随后是孵育第二时间段。

项目28.根据项目23-27中任一项所述的方法，其中所述剪切应力在约5达因/cm²至100达因/cm²之间。

项目29.根据项目28所述的方法，其中所述剪切应力是约20达因/cm²。

项目30.根据项目23-29中任一项所述的方法，其中在剪切应力下培养所述细胞群体通过在所述3D细胞生长材料上方和围绕所述3D细胞生长材料的流体流动来实现。

项目31.根据项目30所述的方法，其中在剪切应力下培养所述细胞群体包括在培养容器中培养所述细胞群体，所述容器包括流体入口和流体出口，在所述流体入口和所述流体出口之间存在流体流动。

项目32.一种研究血脑屏障的渗透性的方法，所述方法包括：

(a)将项目17-22中任一项所述的血脑屏障模型暴露于测试分子；和

(b)测量所述血脑屏障模型的渗透性。

项目33.根据项目32所述的方法，其中所述测试分子是选自以下的分子：增加或减少所述血脑屏障的渗透性的分子，或对所述血脑屏障的渗透性没有影响的分子；或意图穿过所述血脑屏障的分子；或意图被所述血脑屏障阻挡的分子。

项目34.根据项目32或33所述的方法，其中研究所述血脑屏障模型的渗透性包括测量所述血脑屏障模型响应于所述测试分子或由所述测试分子引起的渗透性的变化，或测量所述血脑屏障对所述测试分子的渗透性。

项目35.根据项目32-34中任一项所述的方法，其中所述测试分子是候选药物或治疗剂。

项目36.根据项目32-35中任一项所述的方法，其中所述方法包括研究患病的血脑屏障响应于测试分子的渗透性，并且其中所述血脑屏障模型代表疾病状态。

Claims

1.一种结构，所述结构包括：

细胞群体，所述细胞群体包括内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞，其中所述结构包括在7.5:1:1至1:1:1之间的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比，其中所述细胞群体的细胞是人类原代来源的非永生化细胞；

以及三维细胞生长材料，所述细胞群体被定位于所述三维细胞生长材料内，其中所述三维细胞生长材料是厚度在100-300μm之间、包括超过90％的孔隙率的聚合物支架或凝胶，其中孔的尺寸是20-100μm；

其中所述结构具有至少450Ω/cm²的TEER值。

2.根据权利要求1所述的结构，其中所述细胞群体的细胞来源于脑。

3.根据权利要求1或2所述的结构，其中所述内皮细胞和所述星形胶质细胞具有小于10的传代数，并且所述周细胞具有小于6的传代数。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的结构，其中所述结构包括2:1:1的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比。

5.根据权利要求1所述的结构，其中所述支架被涂覆材料涂覆。

6.根据权利要求5所述的结构，其中所述涂覆材料是选自纤连蛋白、胶原蛋白、聚-L-赖氨酸、

或串珠蛋白聚糖的生物聚合物。

7.根据权利要求5或6所述的结构，其中所述涂覆材料以1-20μg/cm²所述支架表面积的浓度存在。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的结构，其中所述TEER值在450Ω/cm²和1000Ω/cm²之间。

9.根据权利要求8所述的结构，其中所述TEER值在700Ω/cm²和800Ω/cm²之间。

10.一种血脑屏障模型，包括：

容器，所述容器包括权利要求1-9中任一项所述的结构；

11.根据权利要求10所述的血脑屏障模型，其中所述第一室模拟血液，并且所述第二室模拟脑细胞外液，并且其中所述第一液体代表血液，并且所述第二液体代表脑细胞外液。

12.根据权利要求10或11所述的血脑屏障模型，其中所述内皮细胞被定位于靠近所述结构的第一侧的层中，并且所述星形胶质细胞和/或所述周细胞被定位于所述结构的中心层中或靠近所述结构的第二侧的层中。

13.根据权利要求12所述的血脑屏障模型，其中所述结构包括包含内皮细胞的第一层细胞以及包含星形胶质细胞和周细胞的第二层细胞，所述第一层细胞靠近所述结构的所述第一侧，所述第二层细胞靠近所述结构的所述第二侧。

14.根据权利要求10-13中任一项所述的血脑屏障模型，其中所述结构被定位于插入物中，并且其中所述插入物被定位于所述容器中。

15.根据权利要求14所述的血脑屏障模型，其中所述结构形成所述插入物的基部。

16.一种制造权利要求1-9任一项中定义的结构的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将包括内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的细胞群体分布在三维细胞生长材料中，其中所述结构包括在7.5:1:1至1:1:1之间的内皮细胞∶星形胶质细胞∶周细胞的比，其中所述三维细胞生长材料是厚度在100-300μm之间、包括超过90％的孔隙率的聚合物支架或凝胶，其中孔的尺寸是20-100μm；以及

(b)在剪切应力下培养所述细胞群体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中将所述细胞群体分布在所述三维细胞生长材料的第一侧和/或第二侧上。

18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述内皮细胞分布到所述三维细胞生长材料的所述第一侧上，并且将星形胶质细胞和周细胞的混合物分布到所述三维细胞生长材料的所述第二侧上。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述三维细胞生长材料的一侧的细胞被首先分布，随后是孵育第一时间段，在第一孵育之后，将所述三维细胞生长材料倒置，并且所述三维细胞生长材料的中心和/或相对侧的细胞被分布，随后是孵育第二时间段。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述剪切应力在5达因/cm²至100达因/cm²之间。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述剪切应力是20达因/cm²。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其中在剪切应力下培养所述细胞群体通过在所述三维细胞生长材料上方和围绕所述三维细胞生长材料的流体流动来实现。

23.根据权利要求22所述的方法，其中在剪切应力下培养所述细胞群体包括在培养容器中培养所述细胞群体，所述培养容器包括流体入口和流体出口，在所述流体入口和所述流体出口之间存在流体流动。

24.一种研究血脑屏障的渗透性的体外方法，所述方法包括：

(a)将权利要求10-15中任一项所述的血脑屏障模型暴露于测试分子；和

(b)测量所述血脑屏障模型的渗透性。

25.根据权利要求24所述的体外方法，其中所述测试分子是选自以下的分子：增加或减少所述血脑屏障的渗透性的分子，或对所述血脑屏障的渗透性没有影响的分子；或意图穿过所述血脑屏障的分子；或意图被所述血脑屏障阻挡的分子。

26.根据权利要求24或25所述的体外方法，其中研究所述血脑屏障模型的渗透性包括测量所述血脑屏障模型响应于所述测试分子或由所述测试分子引起的渗透性的变化，或测量所述血脑屏障对所述测试分子的渗透性。

27.根据权利要求24-26中任一项所述的体外方法，其中所述测试分子是候选药物或治疗剂。

28.根据权利要求24-27中任一项所述的体外方法，其中所述方法包括研究患病的血脑屏障响应于测试分子的渗透性，并且其中所述血脑屏障模型代表疾病状态。