CN109788755B - 增加胡萝卜的花色素苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
从胡萝卜植物(优选黑胡萝卜植物)获得花色素苷色素着色组合物的方法,包括收获前叶面喷施释放乙烯的化合物;和所获得的花色素苷色素着色组合物用于使可食用产品或药品着色的用途。
Description
技术领域
本发明涉及从胡萝卜植物中获得花色素苷色素着色组合物的方法,包括在收获前叶面喷施释放乙烯的化合物,以及涉及所获得的花色素苷色素着色组合物用于使可食用产品或药品着色的用途。
背景技术
由于法律限制和消费者担忧的加剧,对可替代合成颜色的天然食品着色剂的需求日益增加。黑胡萝卜(Daucus carota ssp.sativus var.atrorubens Alef.)是天然着色剂花色素苷的来源(Montilla et al.2011)。花色素苷是属于酚类化合物的黄酮类的广泛存在的水溶性色素。它们提供明亮的紫蓝色至红色,并具有高pH稳定性、光稳定性和热稳定性,是人造红-紫色食品颜色的极佳替代品。
黑胡萝卜起源于中亚,传统上在东方国家种植。近年来,正在栽培许多具有高色素含量的新品种和老地方品种。如今,黑胡萝卜的提取物广泛用于果汁、糖果糕点、糖果、冰淇淋和软饮料中。
众所周知,花色素苷是一组赋予食品、蔬菜和花卉颜色的化合物,并且是许多植物物种的蓝色、紫色、紫罗兰色、品红色、红色和橙色的原因。花色素苷是无毒色素,因此从水果和蔬菜中提取的花色素苷已被用作提供橙色至紫色范围的颜色的食品着色剂。
花色素苷被认为是次级代谢产物和抗氧化剂。次级代谢产物的累积通常需要经常作为植物应激反应信号分子的诱导子。
当喷施在植物上时释放乙烯的化合物已变得具有重要的经济重要性,用于加速各种乙烯反应,例如诱导开花,刺激乳胶流动,叶和小枝脱落,果实成熟,果实脱落和豆荚开裂。
许多这样的释放乙烯的化合物是本领域已知的——合适的实例是例如Ethephon,Silaid,Alsol,ACC(M.S.Reid,1988;Yoseph Levy et al.1979)。
乙烯利(Ethephon)已被用于改善橙色胡萝卜中的胡萝卜素含量(Bewick etal.1987;Milton et al.1999),并在苹果成熟期间加速成熟和花色素苷含量的提升(Gómez-Cordobés et al.1996)。
发明内容
本发明要解决的问题是提供从胡萝卜植物(优选黑胡萝卜植物)中获得花色素苷色素着色组合物的新方法,其中所述方法提高了所得花色素苷色素的产量/量。
该解决方案基于本发明人确定了通过在黑胡萝卜叶子上在收获前叶面喷施释放乙烯的化合物,与其各自的对照相比,被处理植物的根中平均花色素苷浓度增加超过35%——本文的工作实施例1显示了在两个生长季节的三次重复中,与其各自的对照相比,释放乙烯的化合物处理的植物的平均花色素苷浓度增加49%、38%和65%。
还参见本文的图2-其中可在视觉上清楚地看到与未处理的根相比,被释放乙烯的化合物处理的黑胡萝卜根中花色素苷的量增加。
显然,收获前使用释放乙烯的化合物意味着与从黑胡萝卜中产生花色素苷色素着色产品相关的额外工作/成本——即,如果技术人员不能获得所得到的花色素苷色素产量/量的显著改善,则技术人员不会使用释放乙烯的化合物。
黑胡萝卜是本文优选的胡萝卜-但据信本发明与任何能够产生花色素苷色素的胡萝卜植物都相关。
因此,本发明的第一方面涉及从胡萝卜植物中获得花色素苷色素着色组合物的方法,包括以下步骤:
(i):在胡萝卜植物的叶子上叶面喷施释放乙烯的化合物;
(ii):收获步骤(i)的胡萝卜植物;和
(iii):从步骤(ii)的收获的胡萝卜植物中分离花色素苷,从而获得花色素苷色素着色组合物。
本发明的第二方面涉及根据第一方面的方法和/或其实施方案获得的花色素苷色素着色组合物用于使可食用产品或药品着色的用途。
下文仅以实例的方式描述本发明的实施方案。
附图说明
图1:表中的数据表明,在播种后二十一周测量,田间施用的释放乙烯的化合物诱导花色素苷累积——有关进一步的细节,请参见工作实施例1。
图2:照片显示,释放乙烯的化合物处理的根表现出纯紫色,而未处理的根显示出白色核心,两者在横切面和纵切面均可见-有关进一步的细节,请参见工作实施例1。
图3:从2015年6月30日至2016年1月19日(播种后7-35周),监测了Deep Purple根中总单体花色素苷含量(TMC)(A)、干重(DW)(B)和可溶性固体含量(SSC)(C)。垂直棒表示平均标准误差。根据Tukey检验,不同的字母表示统计学显著性(p≤0.05)。有关进一步的细节,请参见工作实施例1。
图4:从2015年6月30日至2016年1月19日(播种后7-35周)监测Deep Purple根的重量(A)和长度(B)。垂直棒表示平均标准误差。根据Tukey检验,不同的字母表示统计学显著性(p≤0.05)。有关进一步的细节,请参见工作实施例1。
具体实施方式
对于本领域技术人员显而易见的是,本文所讨论的两个优选实施方案的组合应理解为是甚至更优选的实施方案。
从胡萝卜中获得花色素苷色素着色组合物的方法:
如上所述,本发明的第一方面涉及从胡萝卜植物中获得花色素苷色素着色组合物的方法,包括以下步骤:
(i):在胡萝卜植物的叶子上叶面喷施释放乙烯的化合物;
(ii):收获步骤(i)的胡萝卜植物;和
(iii):从步骤(ii)的收获的胡萝卜植物中分离花色素苷,从而获得花色素苷色素着色组合物。
显然,胡萝卜植物在本文中是能够产生花色素苷色素的胡萝卜植物。
优选地,胡萝卜植物是黑胡萝卜植物。
术语“黑胡萝卜”是本领域技术人员公知的,并且技术人员知道感兴趣的胡萝卜是否是黑胡萝卜或其他类型的胡萝卜(例如橙色胡萝卜)。根据现有技术,黑胡萝卜的拉丁学名是Daucus carota ssp.sativus var.atrorubens Alef.。
如本领域所知,术语“叶面喷施”关于通过将液体活性成分(此处指释放乙烯的化合物)直接应用于植物的叶子来供给植物的技术。这是技术人员通常都知道如何执行的熟知技术。
如上所述,当喷施在植物上时释放乙烯的化合物已经变得具有重要的经济重要性,用于加速各种乙烯反应,例如诱导开花,刺激乳胶流动,叶和小枝脱落,果实成熟,果实脱落和豆荚开裂。
许多这样的释放乙烯的化合物是本领域已知的——合适的实例是例如乙烯利、Silaid、Alsol、ACC(M.S.Reid,1988;Yoseph Levy et al.1979)。
与现有技术一致,术语“释放乙烯的化合物”在本文中关于当喷施在植物上时释放乙烯的化合物。所述释放乙烯的化合物也称为“活性成分”。
乙烯利(Ethephon)、Silaid、Alsol、ACC(M.S.Reid,1988)的化学名称为:
乙烯利:2-氯乙基膦酸;
Silaid:(2-氯乙基)甲基二(苯基甲氧基)硅烷;
Alsol:(2-氯乙基)三(2-甲氧基乙氧基)硅烷;
ACC:1-氨基环丙烷-1-羧酸。
释放乙烯的化合物优选为2-氯乙基膦酸、(2-氯乙基)甲基二(苯基甲氧基)硅烷、(2-氯乙基)三(2-甲氧基乙氧基)硅烷或1-氨基环丙烷-1-羧酸。
在第一方面的方法中,使用两种或更多种不同的释放乙烯的化合物可能是相关的——例如,作为乙烯利和Alsol的混合物。
优选地,释放乙烯的化合物是2-氯乙基膦酸。
如上所述,乙烯利是包含具有以下IUPAC名称的化合物的商业产品:2-氯乙基膦酸。其他名称包括例如Bromeflor、Arvest或Ethrel。
乙烯利用于本文的工作实施例中,它可以视为优选的2-氯乙基膦酸组合物的实例。
如本领域所知,术语“收获”关于从田间采集成熟作物的过程。
第一方面的方法可优选用于花色素苷色素的商业相关大规模生产-即从胡萝卜植物中大规模分离。
因此,可以优选从至少15个不同的收获的胡萝卜植物,更优选从至少100个不同的收获的胡萝卜植物,甚至更优选从至少500个不同的收获的胡萝卜植物,例如从至少1000个不同的收获的胡萝卜植物中进行步骤(iii)的花色素苷分离。
显然,当例如至少15个不同的收获的胡萝卜植物用于分离步骤(iii)中时,则已经在至少15个不同的胡萝卜植物上进行了步骤(i)的释放乙烯的化合物(例如2-氯乙基膦酸)的叶面喷施并已在步骤(ii)收获了至少15个不同的收获的胡萝卜植物。
如上所述,本发明人确定,通过在胡萝卜叶子上的收获前叶面喷施2-氯乙基膦酸(例如乙烯利),与其各自的对照相比,被处理植物的平均花色素苷浓度增加超过35%-在本文的工作实施例1中表明,在两个生长季节的三次重复中,与其各自的对照相比,被处理植物的平均花色素苷浓度增加了49%、38%和65%。
基于本文的技术信息-技术人员可以常规地优化所述方法(例如步骤(i)中所用的例如2-氯乙基膦酸的量等)以最大程度地提高所得花色素苷色素的产量/量。
优选地,在第一方面方法的步骤(iii)中获得的花色素苷色素的量是,与在不使用步骤(i)的释放乙烯的化合物的对照实验中获得的花色素苷色素的量相比,高至少15%(w/w)(更优选高至少20%(w/w),甚至更优选高至少25%(w/w),最优选高至少35%(w/w))的花色素苷色素的量。
如本领域技术人员在当前语境下所理解的-对照实验的目的是分析使用释放乙烯的化合物(例如2-氯乙基膦酸)的效果。因此,对照实验中的一切(例如步骤(ii)中的收获时间,步骤(iii)中的具体分离方法等)应当与第一方面的使用释放乙烯的化合物(例如2-氯乙基膦酸)的方法相同。
如本文工作实施例中所讨论的,在120、360和720g ha-1a.i.2-氯乙基膦酸处理(a.i.表示活性成分)中没有发现差异。
在不受理论限制的情况下,相信甚至仅添加5g ha-1a.i.2-氯乙基膦酸仍对获得的花色素苷的产量/量具有积极影响(可能不是最大效果,但仍然是积极效果)-进一步,如果需要,可以添加超过例如720g ha-1a.i.2-氯乙基膦酸。
因此并且就步骤(i)而言–可以优选的是在步骤(i)中通过喷施施用的释放乙烯的化合物的量为5g ha-1活性成分(a.i.)至5000g ha-1a.i.的量。
优选地,步骤(i)施用的释放乙烯的化合物(优选2-氯乙基膦酸)的量为25g ha- 1a.i.至1000g ha-1a.i.的量,更优选其为35g ha-1a.i.至500g ha-1a.i.,例如50g ha-1a.i.至200g ha-1a.i.的量。
在本文的工作实施例中,在种植/播种的6周后开始施用2-氯乙基膦酸施用,并且每3周继续施用,总计例如6次施用。
显然,在黑胡萝卜叶的叶子具有相关尺寸之前,不应通过叶面喷撒向叶施用释放乙烯的化合物(例如2-氯乙基膦酸)。
因此并且就步骤(i)而言,可以优选在种植的1周后进行步骤(i)的释放乙烯的化合物的叶面喷施,优选的是在种植的2周后进行。可以优选的是在种植的4周后进行。
可以优选的是,在步骤(ii)的收获胡萝卜植物之前,进行超过一次(例如2次)步骤(i)的释放乙烯的化合物的叶面喷施。可以优选在步骤(ii)的收获胡萝卜植物之前,进行至少3次,例如至少5次。
第一方面的步骤(ii)关于收获步骤(i)的胡萝卜植物。
如上所述,技术人员常规知道如何进行这样的收获步骤(ii)-即,其可以根据现有技术进行。
在本文的工作实施例中,在种植的7、10、13、16、19、22、25、26、29和35周后收获黑胡萝卜植物,并且2-氯乙基膦酸处理的根在每个收获点都表现出更高的平均花色素苷浓度。
关于步骤(ii),可以优选,在种植的4周后进行第一方面步骤(ii)的胡萝卜植物收获,优选在种植的6周后进行,例如在种植的10周后进行。
第一方面的步骤(iii)关于从步骤(ii)的收获的胡萝卜植物分离花色素苷,从而获得花色素苷色素着色组合物。
步骤(iii)中的术语“分离”应理解为从花色素苷分离出一些液体(例如水)和/或固体-即花色素苷色素着色组合物不包含胡萝卜的所有液体(例如水)和/或固体。
例如,在步骤(iii)中获得的花色素苷色素着色组合物可以是果汁。
技术人员常规知道如何进行分离步骤(iii)-即可以根据现有技术进行,例如通过从收获的胡萝卜植物(优选黑胡萝卜植物)的直根中提取。
可以优选的是(如本文工作实施例中所做),通过从收获的胡萝卜植物(优选黑胡萝卜植物)的直根提取花色素苷色素来进行步骤(iii)的分离花色素苷。
在步骤(iii)中获得的花色素苷色素着色组合物可以具有所需的纯度,并且可以是例如液体形式或干燥形式-可以例如通过使用高效液相层析(HPLC)进行纯化,以获得所需的纯度。
可以优选的是,在步骤(iii)中获得的花色素苷色素着色组合物是包含至少20%(w/w-干物质)的分离的花色素苷色素的组合物——例如,包含至少50%(w/w-干物质)的分离的花色素苷色素的组合物,或包含至少90%(w/w-干物质)的分离的花色素苷色素的组合物。
可以优选的是,在步骤(iii)中获得的花色素苷色素着色组合物是包含少于25%(w/w)的液体(例如水)的液体组合物或干燥的组合物。
花色素苷色素着色组合物用于使产品着色的用途
如上所述,本发明的第二方面关于根据第一方面的方法和/或其实施方案获得的花色素苷色素着色组合物用于使可食用产品或药品着色的用途。
花色素苷已用作许多产品(例如食品)的着色剂,并且可根据现有技术进行第二方面的花色素苷色素着色组合物的着色用途。
可食用产品可以是例如食品或饲料产品。
食品的实例是乳制品、果汁、饮料、酒胶糖(wine gum)、柑橘酱(marmalade)、果酱(jam)、糖果(sugar confectionary)、扁巧克力豆(panned chocolate lentil)、香肠肠衣、意大利面、通心粉(macaroni)、奶酪、预制食品或挤压食品(extruded food)。
通过参考以下非限制性实施例,可以进一步理解本文所述的实施方案。
实施例
实施例1-田间施用释放乙烯的化合物增强了黑胡萝卜生长期间花色素苷的累积
1.材料和方法。
1.1植物材料、田间试验条件和诱导子处理
本实验包括3个胡萝卜品种(Deep Purple F1)和3个播种日期的因子组合:2014年5月19日和2015年5月18日和25日,在丹麦Taastrup的田间试验中,在的实验站(纬度55,经度40.1-40.3)。种子由Chr.Hansen A/S提供。在肥沃的土壤中种植植物。生长期间的气温在两个栽培年中略有不同(2年的平均值为:15.4℃和14.6℃,5月至10月)。在整个胡萝卜生长期间通过灌溉补充降雨,以避免水应激。施用针对胡萝卜作物生产推荐的常规栽培和植物保护技术。
以随机区组设计安排地块(plot),重复三次。在三个播种日,每个地块由三个4.5m长的行组成。此外,2015年5月18日安排了三个12m长的行的地块。2-氯乙基膦酸溶液(商标ETHEPHON,39.9%Bayer CropScience,Leverkusen,德国)作为叶面喷雾施用,避免雨天,在2014年速率为0、120和360g·ha-1a.i.;在2015年,对于小地块,速率为0、360和720g·ha-1a.i.;对于大地块,速率为0和360g·ha-1a.i.。使用间隔50cm的CO2背包进行施用,在种植的6周后开始,并且每3周继续施用,总共施用6次。
1.2.收获和样品制备
播种后21周收获小地块(4.5m长的行)。从每行的中间部分手动收获根。
在2015年6月30日至2016年1月19日的生长期间(种植后7、10、13、16、19、22、25、26、29和35周后)从单独的行段中收获大地块(12m长的行)几次。种植后21周,在大地块中估计胡萝卜产量:从每个地块每行挖出2m,洗涤胡萝卜并称重。将测量的重量外推至每公顷的吨数。
在所有分析中,每个地块洗涤20个完整的胡萝卜根,并纵向分开:在液氮中研磨20个半分,并将产生的粉末储存在-80℃下,用于进一步的基因表达分析;将互补的20个半分在商业混合器中粗磨,并通过使用Waring双速商用搅拌器(VWR-Bie&Berntsen,Herlev,丹麦)将50g所得的果泥(purée)立即在50g 3%硫酸溶液(v/v)中进行均质化。随后将得到的细果泥(4g)与软化水(8g)混合并涡旋。在室温下孵育1小时后,将样品以4500rpm离心20min(分钟),并将上清液(提取物)用于进一步的分析。
1.3.干物质和可溶性固体含量(°Brix)的测定
使用具有自动温度补偿和0-53°Brix操作范围的数字折射计计算可溶性固体。为了计算,将获得的胡萝卜提取物用0.45μm膜过滤器过滤,并使用1mL滤液进行Brix测量。对于每次测量,进行两次技术重复并报告其平均值。
通过新鲜样品和干燥样品之间的质量差异测定干物质。使用90℃的烘箱将样品干燥24小时,直到其达到恒重。结果表示为干物质的百分比。对于每次测量,进行两次技术重复,并报告其平均值。
1.4.总单体花色素苷含量(TMC)的测定。
基于稍作修改的pH示差法通过分光光度法测量TMC。通过加入20体积的0.2M KCl-HCl pH 1稀释胡萝卜提取物,并使用UV-Vis分光光度计(EvolutionTM 220,Thermo FischerScientific,Waltham,MA,USA)在350和700nm下(为了校正沉淀)测量TMC。TMC表示为氰化-3-葡糖苷当量(ppm)。
1.5.统计分析
所有分析均进行三次技术重复和三次生物重复。使用SPSS软件(version 22,SPSSInc.,Chicago,IL,USA)对数据进行统计分析。使用单因素方差分析(ANOVA)然后进行Tukey事后检验来比较处理。p<0.05被认为是显著的。
结果
乙烯释放化合物处理的胡萝卜的总花色素苷含量和产量数据
田间施用的2-氯乙基膦酸诱导在播种后二十一周测量的花色素苷累积(图1)。处理的根显示出纯紫色,而未处理的根则显示出白色核心,两者在横切面和纵切面均可见(图2)。根据两个生长季节的三次重复(收获1-3),与其各自的对照相比,处理的植物的平均花色素苷浓度增加了49%、38%和65%。在这个意义上来讲,施用的2-氯乙基膦酸的总量对花色素苷的累积量没有显著影响,即在任一生长季节中120、360和720g ha-1处理没有发现差异(图1)。2-氯乙基膦酸处理的植物也显示出最低的干重(DW)值和可溶性糖含量(SSC)值。相比之下,2-氯乙基膦酸施用在任一生长季节均不影响根重(图1)。生长季节中花色素苷浓度和产量数据的差异可能是由于温度、光照强度和温度等环境因素的波动所致。
此外,在2015年生长季安排了大块土地,用于在2015年6月30日至2016年1月19日期间(种植后7、10、13、16、19、22、25、26、29和35周)连续收获。在每个收获时间测定TMC和产量数据(图3和4)。处理的根在每个收获点都显示出更高的平均花色素苷浓度。有趣的是,TMC在施用最后一次2-氯乙基膦酸处理的7周后(种植的22-27周后)继续增加(图3A)。通过在种植的13周后形成明显的峰,在生长季节观察到未处理和处理的根的DM含量的意外变化(图3B)。对于SCC含量观察到相同的趋势(图3C)。而且,种植后10-13周达到最高的花色素苷累积率,同时具有最高的DW值和SSC值(图3)。当在每个收获时间比较未处理的和处理的胡萝卜时,根重量和长度差异不显著(图4)。种植后13至19周,根系生长主要是次生的,如由重量的4倍增加和长度的略有增加所引起。
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Claims (12)
1.一种从胡萝卜植物获得花色素苷色素着色组合物的方法,包括以下步骤:
(i):在胡萝卜植物的叶子上叶面喷施释放乙烯的化合物;
(ii):收获步骤(i)的胡萝卜植物;和
(iii):从步骤(ii)的收获的胡萝卜植物分离花色素苷,从而获得所述花色素苷色素着色组合物,
其中步骤(i)中使用的所述释放乙烯的化合物是选自2-氯乙基膦酸、(2-氯乙基)甲基二(苯基甲氧基)硅烷、(2-氯乙基)三(2-甲氧基乙氧基)硅烷和1-氨基环丙烷-1-羧酸的任一种或是选自其的两种的混合物。
2.根据权利要求1 所述的方法,其中所述胡萝卜植物是黑胡萝卜植物(Daucus carotassp.sativus var.atrorubens Alef.)。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述释放乙烯的化合物选自由2-氯乙基膦酸、(2-氯乙基)甲基二(苯基甲氧基)硅烷、(2-氯乙基)三(2-甲氧基乙氧基)硅烷和/或1-氨基环丙烷-1-羧酸组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述释放乙烯的化合物是2-氯乙基膦酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中从至少100个不同的收获的胡萝卜植物进行步骤(iii)的花色素苷分离。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在权利要求1所述方法的步骤(iii)中获得的花色素苷色素的量是,与在不使用步骤(i)的释放乙烯的化合物的对照实验中获得的花色素苷色素的量相比,高至少15%(w/w)的花色素苷色素的量。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在权利要求1的步骤(i)中通过喷施施用的释放乙烯的化合物的量是5g ha-1活性成分(a.i.)至5000g ha-1a.i.的量。
8.根据权利要求7所述的方法,其中在步骤(i)中通过喷施施用的释放乙烯的化合物的量为50g ha-1a.i.至200g ha-1a.i.的量。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在种植的2周后进行步骤(i)的释放乙烯的化合物的叶面喷施。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)的收获胡萝卜植物之前,进行至少3次步骤(i)的释放乙烯的化合物的叶面喷施,并且其中在种植的6周后进行权利要求1的步骤(ii)的所述胡萝卜植物的收获。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中通过从收获的胡萝卜植物的直根提取所述花色素苷色素来进行步骤(iii)的所述花色素苷的分离。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在步骤(iii)中获得的花色素苷色素着色组合物是包含至少20%(w/w-干物质)的分离的花色素苷色素的组合物。
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