CN109771544B - 一种龙血竭总黄酮的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种龙血竭总黄酮的制备方法，将龙血竭药材粉碎成粗粉，加入乙醇和乙酸乙酯混合溶剂，在50～69℃条件下回流提取2次，每次15～29分钟即可。另外，本发明还提供了龙血竭总黄酮在制备防治自身免疫性疾病药物、减肥药物、肿瘤疾病药物、急慢性呼吸道疾病药物、心血管疾病药物中的应用。该发明提取的龙血竭总黄酮对动物的毒性要小于龙血竭，且龙血竭总黄酮阻断Kv1.3钾通道的活性要强于龙血竭，表明龙血竭总黄酮实现了活性组分的富集，剔除了可能产生毒副作用的杂质，提高了安全性的同时增强了对Kv1.3钾通道的阻断效应；另外，龙血竭总黄酮对Kv1.3钾通道的亲和力要高于龙血素B，实现了龙血竭总黄酮中多种阻断Kv1.3钾通道活性成分的协同作用。

Description

一种龙血竭总黄酮的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种龙血竭总黄酮的制备方法及应用。

背景技术

机体正常的免疫反应能够有效抵御外界病原微生物的侵扰，而当机体免疫功能紊乱出现自身免疫抗原时，机体免疫系统会产生自身抗体，通过破坏自身脏器组织引发多种自身免疫性疾病。由于自身免疫性疾病的确切发病机制尚未明确，目前临床尚无彻底根治的办法。多采用激素类传统免疫抑制剂，如环磷酰胺、地塞米松等，这些激素类药物抗炎作用显著，能够快速改善自身免疫性疾病患者的临床症状，但这些药物不能消除病因，而且停药后会有反跳现象，若长期应用同时削弱了病人正常的免疫防御反应，会造成停药困难。目前国际上开发的用于治疗自身免疫性疾病的生物制剂，如白介素-6受体阻断药—Tocilizumab、单抗药物阿达木单抗等，治疗效果明显，但同样不能根治自身免疫性疾病，而这些生物制剂造价成本高，价格昂贵，治疗费用超出国内绝大多数自身免疫疾病患者的实际经济承受能力，不宜在我国广泛使用。

新近的研究表明自身免疫性疾病的发病机制主要涉及效应记忆T淋巴细胞(Effector Memory T细胞，T_EM细胞)的异常激活和增殖，该过程与T_EM细胞膜上电压门控性钾通道Kv1.3过高表达密切相关，药物阻断或基因敲除Kv1.3后，对多种类型的自身免疫性模型动物表现出较强的治疗作用，表明Kv1.3通道是筛选特异性自身免疫性疾病治疗药物的新靶点，Kv1.3通道阻断剂治疗自身免疫疾病应用前景广阔。来源于植物的天然化合物作为传统药物在疾病的治疗过程中发挥了关键作用，被认为是开发新药的重要资源库。以广泛使用的传统中草药为对象，检测其是否可以调节哺乳动物Kv1.3通道功能，并进行相应的生物活性单体筛选和结构优化，将极大加速我国研发Kv1.3通道阻断剂的进程。

傣药龙血竭已被证实能够阻断Kv1.3通道而对自身免疫性脑炎和类风湿性关节炎大鼠产生有效的防治作用，疗效持久，但龙血竭是来自剑叶龙血树浆液的粗制品，含有黄酮类、萜类、酚类、甾体类等多种组分，组成成分复杂，易引发难以预料的毒副作用。另外，龙血竭黄酮类单体龙血素B也被证实能够阻断Kv1.3通道而对自身免疫性脑炎和类风湿性关节炎大鼠产生有效的防治作用，龙血素B的阻断效应容易被洗脱，药效不能持久。

发明内容

本发明提供了一种龙血竭总黄酮的制备方法，制得的龙血竭总黄酮能够阻断Kv1.3钾通道，阻断效率和安全性均要高于龙血竭，且不易洗脱。

本发明的技术方案是提供了一种龙血竭总黄酮的制备方法，将龙血竭药材粉碎成粗粉，加入11倍量的乙醇和乙酸乙酯混合溶剂，在50～69℃条件下回流提取2次，每次15～29分钟即可。

进一步的，所述混合溶剂中乙醇和乙酸乙酯的体积比为5:5～1:10。

另外，本发明还提供了龙血竭总黄酮在制备Kv1.3通道阻断剂中的应用。

进一步的，所述龙血竭总黄酮包括龙血素B，以及至少一种查尔酮类化合物。

进一步的，所述查尔酮类化合物为剑叶龙血素A或剑叶龙血素B。

进一步的，所述Kv1.3通道阻断剂用于制备防治自身免疫性疾病的药物，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、I型糖尿病。

进一步的，所述Kv1.3通道阻断剂用于制备减肥药物。

进一步的，所述Kv1.3通道阻断剂用于制备防治肿瘤疾病的药物，所述肿瘤疾病为骨肉瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、胶质母细胞瘤。

进一步的，所述Kv1.3通道阻断剂用于制备防治急慢性呼吸道疾病的药物，所述急慢性呼吸道疾病为慢性阻塞性肺病、过敏性哮喘、弥漫性全细支气管炎。

进一步的，所述Kv1.3通道阻断剂用于制备防治心血管疾病的药物，所述心血管疾病为动脉粥样硬化。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明提供的这种龙血竭总黄酮的制备方法采用乙醇和乙酸乙酯的混合液为提取溶剂，同时降低提取温度，有效避免乙酸乙酯分解而导致龙血竭总黄酮中部分单体的酚羟基氧化而变构失活，保证了龙血竭总黄酮的提取量和质量。

(2)本发明提供了龙血竭总黄酮能够阻断Kv1.3通道，其阻断效率和安全性均要高于龙血竭，且药效持久，不易被洗脱，从而可用于开发防治自身免疫性疾病药物、减肥药(保健品)、防治星形细胞瘤等肿瘤药物、防治慢性阻塞性肺病和急慢性呼吸道疾病药物、防治动脉粥样硬化等心血管相关疾病药物。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是实施例1中龙血素总黄酮和龙血素B的全波长之外吸收图谱；

图2是实施例1中对照品龙血素B的定量标准曲线图；

图3是实施例3中龙血竭总黄酮和龙血竭阻断内源性表达的Kv1.3通道的量效曲线图；

图4是实施例3中龙血竭总黄酮和龙血竭阻断外源性表达的Kv1.3通道的量效曲线图；

图5是实施例3中龙血素总黄酮和龙血素B对外源性表达在HEK-293T细胞上Kv1.3通道抑制效应的洗脱曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本实施例提供了一种龙血竭总黄酮的制备方法，具体过程如下：

将龙血竭药材粉碎成粗粉，加入11倍量的乙醇和乙酸乙酯混合溶剂，在50～69℃条件下回流提取2次，每次15～29分钟即可；其中，乙醇和乙酸乙酯的体积比为5:5～1:10。优选地，回流提取温度为65℃，每次回流提取时间为25分钟，乙醇和乙酸乙酯的体积比为2:8。提取物中总黄酮含量以龙血素B(Loureirin B，LrB，上海纯优生物科技有限公司)为对照品，于紫外分光光度计277nm处测量对照品及提取物吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程计算提取物中总黄酮的含量。

将龙血素B(LrB)对照品溶液和本实施例的龙血竭提取物样品溶液于220-600nm处进行连续波长扫描，获得紫外吸收图谱如图1所示。由图1可知，本实施例龙血竭提取物的紫外吸收曲线与对照品龙血素B基本一致，二者均在277nm处有明显的吸收峰，表明龙血竭总黄酮(tFRD)提取成功。

为了确定本实施例中龙血竭提取物中龙血竭总黄酮的含量，选择277nm作为检测波长，对对照品龙血素B进行浓度梯度检测，以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线并拟合得到直线回归方程，如图2所示。将本实施例中龙血竭提取物的吸光度值代入回归方程计算出提取物中龙血竭总黄酮的含量为68.01％，符合《药品注册管理办法》中中药5类新药关于植物药提取的有效部位含量的要求，可用于进一步的药理学活性测定。

本实施例中采用乙醇和乙酸乙酯的混合液作为提取溶剂，同时配合降低提取温度，避免了单一乙酸乙酯受热分解成乙酸和乙醇，而使得乙酸具有的酸性和一定的氧化性导致提取的龙血竭总黄酮中部分单体的酚羟基氧化变构失活的问题，从而大大提高了龙血竭提取物中总黄酮的含量和各成分的结构稳定性。

实施例2：

本实施例采用上下法测定龙血竭总黄酮和龙血竭的急性毒性，具体测定过程如下：选用A、B两组雌性小鼠，每组五只，按照上下法对A组中小鼠按照2000mg/kg剂量水平进行腹腔注射龙血竭总黄酮，对B组中小鼠按照2000mg/kg剂量水平进行腹腔注射龙血竭，观察两组小鼠存活情况。其中，上下法的操作方法，2000mg/kg剂量水平的限度试验：将受试物分别给予一只小鼠，如果该小鼠死亡，则进行主试验；如果该小鼠存活，依次将两种药物分别给予另外4只小鼠，动物总数为5只；如果一只动物在实验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价：有三只或三只以上动物死亡时，LD₅₀小于2000mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，LD₅₀大于2000mg/kg。

本实施例试验结果表明，注射龙血竭总黄酮的五只实验小鼠均无死亡情况，而注射龙血竭的五只实验小鼠总共死亡三只，龙血竭总黄酮对小鼠的半数致死浓度要高于2000mg/kg，而龙血竭对小鼠的半数致死浓度要低于2000mg/kg，表明龙血竭总黄酮对大鼠的毒性要弱于龙血竭，显示出龙血竭总黄酮具有毒性较低的优点，龙血竭总黄酮的使用安全性要高于龙血竭。

实施例3：

本实施例采用膜片钳实验检测龙血竭总黄酮对哺乳动物Kv1.3通道功能的抑制作用，具体过程如下：

人白血病淋巴细胞系Jurkat T细胞和HEK-293T细胞(武汉大学典藏中心)分别培养在添加有10％胎牛血清(FBS，Gibco)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640(Hyclone)和高糖型DMEM(Hyclone)培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。将编码有电压门控性钾通道Kv1.1、Kv1.2及Kv1.3的真核表达载体pIRES2-EGFP(由武汉大学李文鑫教授实验室提供)用lipofectamine 2000(Invitrogen)转染至HEK-293T细胞中，24小时后选用发绿色荧光的细胞进行电生理测试。实验中用于记录电压门控性钾通道电流的细胞外液(mmol/L)成分为：140NaCl,5KCl,2CaCl₂,1MgCl₂,10HEPES,10D-Glucose,外液PH值用NaOH调至7.4，渗透压用蔗糖调至310～320mOs/L范围。电极内液(mmol/L)成分：140KCl,1MgCl₂,1EGTA,10HEPES,3Na₂ATP，内液渗透压在280～290mOsm/L范围，PH值用KOH调至7.2。实验中用于配制细胞内外液的各种试剂均购自于sigma公司。龙血竭总黄酮粉末用二甲基亚砜(DMSO，Biosharp)溶解后，以不同浓度配制在细胞外液中用于电生理实验。采用EPC9/2(HEKA)放大器进行全细胞膜片钳记录。实验环境温度控制在22～25℃，实验参数的设置、数据的采集和电压刺激均通过Patch Master软件来完成。微电极玻璃毛细管经程控玻璃电极拉制仪两步拉制，经玻璃微电极抛光仪抛光，灌注电极内液后稍加正压，入液电阻为2～5MΩ。在全细胞记录模式下将细胞膜电位钳制在-60mV，每20s给予400ms步长、+50mV的去极化脉冲刺激以激活电压门控性钾通道电流。待电流稳定后，采用多通道快速微量程控给药系统对所记录细胞依次进行浓度梯度给药，同时记录细胞膜上通道电流变化情况。通过PatchMaster所采集到的电生理数据均用Igor Pro 4及Origin 8进行处理。所有的实验数据均采用x±s表示，n表示独立试验次数。不同的实验组之间的差异采用t检验或者ANOVA检验统计分布，以P＜0.05作为数据差异显著性标准。

在各类电压门控性离子通道蛋白类型中，人源性白血病淋巴细胞系Jurkat T细胞膜上主要表达电压门控性钾通道Kv1.3，因而Jurkat T细胞是研究生物活性物质调节内源性Kv1.3通道的优良细胞模型。本实施例将Jurkat T细胞膜电位钳制在-60mV，予以400ms步长、+50mV去极化电压刺激，激发出细胞膜上Kv1.3通道电流，记录不同浓度龙血竭总黄酮(tFRD)外液灌流时Jurkat T细胞膜上Kv1.3通道电流的变化情况，结果表明，龙血竭总黄酮对内源性Kv1.3通道的电流抑制呈现浓度依赖性特点，且抑制效应难以被洗脱，表现出对Kv1.3通道较强的亲和力。通过Hill方程对龙血竭总黄酮抑制效应的量效曲线进行拟合，结果如图3所示，得到龙血竭总黄酮(tFRD)对内源性Kv1.3通道的半数抑制浓度IC₅₀为(2.23×10^-3±3.61×10^-4)％。在同样的条件下，本实施例对比测试了龙血竭(SD)对Jurkat T细胞膜上内源性Kv1.3通道的抑制效应，结果如图3所示，通过Hill方程拟合得到龙血竭(SD)的半数抑制浓度IC₅₀为(5.21×10^-3±1.16×10^-4)％。对比实验表明，本实施例提取的龙血竭总黄酮阻断内源性Kv1.3通道活性要强于龙血竭，表明阻断Kv1.3的活性组分得到了富集。

HEK-293T细胞极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达外源基因的细胞株。本实施例将编码mKv1.3通道的质粒pIRES₂-EGFP-mKv1.3(由武汉大学李文鑫教授实验室提供)转染至HEK-293T细胞24小时，选用发绿色荧光的阳性细胞进行全细胞膜片钳记录，观察不同浓度的龙血竭总黄酮对外源性表达的Kv1.3通道电流影响。结果如图4所示，龙血竭总黄酮(tFRD)对外源性表达Kv1.3通道就表现出较强的抑制作用，且呈现浓度依赖性特点。通过Hill方程对龙血竭总黄酮抑制外源性Kv1.3通道电流的量效曲线进行拟合，得到其半数抑制浓度IC₅₀为(4.87×10^-4±3.48×10^-5)％。在同样的条件下，本实施例对比测试了龙血竭(SD)对外源性表达的Kv1.3通道抑制效应，通过Hill方程拟合得到龙血竭的半数抑制浓度IC₅₀为(1.09×10^-3±6.86×10^-5)％。由此对比实验表明，本实施例提取的龙血竭总黄酮阻断外源表达的Kv1.3通道活性要强于龙血竭，进一步表明龙血竭提取物中阻断Kv1.3的活性组分得到了富集。

在外源性表达有Kv1.3通道的HEK-293T细胞上，进一步研究龙血竭总黄酮与龙血素B阻断Kv1.3通道的洗脱效果，具体过程为当全细胞膜片钳实验记录到稳定的Kv1.3通道电流后，通过给药系统向所记录细胞施加10μM的龙血素B(LrB)或0.001％的龙血竭总黄酮(tFRD)，待记录到稳定的药物阻断效应后，用正常外液替换龙血素B(LrB)或龙血竭总黄酮(tFRD)开始对所记录细胞进行洗脱，每20秒记录一次Kv1.3通道电流，直到电流大小稳定，以给药或给外液时间为横坐标，以对应的Kv1.3通道电流大小为纵坐标，绘制洗脱曲线。结果如图5所示，其中，A为龙血素B对外源性表达在HEK-293T细胞上Kv1.3通道抑制效应的洗脱曲线；B为龙血竭总黄酮对外源性表达在HEK-293T细胞上Kv1.3通道抑制效应的洗脱曲线。由此结果表明，龙血素B阻断Kv1.3通道的效应容易被正常外液快速洗脱，而龙血竭总黄酮阻断Kv1.3通道的效果持久，不易被洗脱。

另外，对龙血竭总黄酮的组分进行分析，表明龙血竭总黄酮中除了含有龙血素B外，还含有剑叶龙血素A、剑叶龙血素B等多种与龙血素B结构类似的查尔酮类化合物。通过电生理技术检测发现，剑叶龙血素A和剑叶龙血素B也能对外源性表达在HEK-293T细胞上的Kv1.3通道电流也能产生浓度依赖性抑制作用，二者抑制Kv1.3通道电流的半数抑制浓度分别为10.23±1.07μM和14.20±0.96μM，相比于龙血素B，二者阻断Kv1.3的效应难以被洗脱，从而表明龙血竭总黄酮阻断Kv1.3通道是龙血素B、剑叶龙血素B、剑叶龙血素A等多种成分协同作用的结果。

实施例4：

由于电压门控性钾通道具有不同的亚型，不同结构的电压门控性钾通道在生物体内担负着不同的病理生理功能，本实施例检测龙血竭总黄酮阻断免疫调节相关的Kv1.3通道是否具有一定的选择性，检测龙血竭总黄酮对Kv1.3通道最同源的两类钾通道Kv1.1与Kv1.2是否也具有类似的调节作用。具体过程如下：分别将编码有通道mKv1.1、hKv1.2的真核表达载体pIRES2-EGFP-mKv1.1、pIRES₂-EGFP-hKv1.2(由武汉大学提供)转染至HEK-293T细胞中，24小时后选用发绿色荧光的阳性细胞进行全细胞膜片钳测试，记录细胞外液中不同浓度龙血竭总黄酮对外源性表达的Kv1.1、Kv1.2通道电流的影响。相比于对Kv1.3通道的作用，龙血竭总黄酮对Kv1.1和Kv1.2通道的抑制效果较微弱，通过Hill方程对龙血竭总黄酮抑制Kv1.1和Kv1.2通道电流的行量效曲线进行拟合，得到半数抑制浓度分别为(8.21×10^-3±1.32×10^-3)％和(2.73×10^-3±3.74×10^-3)％。龙血竭总黄酮对三种类型钾通道抑制作用对比结果如表1所示。结果表明龙血竭总黄酮阻断Kv1.3通道活性要高于对Kv1.1和Kv1.2的阻断作用，活性差异分别为16.73倍和55.1倍，提示龙血竭总黄酮对免疫调节相关的Kv1.3通道具有一定的选择性阻断作用。

表1：

综上所述，本发明提取的龙血竭总黄酮对动物的毒性要小于龙血竭，且提取物龙血竭总黄酮阻断Kv1.3钾通道的活性要强于龙血竭，表明提取物龙血竭总黄酮实现了活性组分的富集，剔除了可能产生毒副作用的杂质，提高了安全性的同时增强了对Kv1.3钾通道的阻断效应；另外，提取的龙血竭总黄酮对Kv1.3钾通道的亲和力要高于龙血素B，实现了龙血竭总黄酮中多种阻断Kv1.3钾通道活性成分的协同作用。

另外，由于Kv1.3钾通道在CCR7^-T_EM细胞异常活化与增殖中有关键性作用，因而对Kv1.3钾通道的阻断可用于防治自身免疫性疾病；同时Kv1.3钾通道在骨肉瘤细胞、星形细胞瘤、少突胶质瘤、胶质母细胞瘤等肿瘤细胞上高表达，降低Kv1.3钾通道功能能够促使这些肿瘤细胞凋亡，因而Kv1.3钾通道的阻断可用于治疗骨肉瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、胶质母细胞瘤等肿瘤疾病；Kv1.3钾通道表达水平与单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化过程及血管重塑过程呈正相关，因而Kv1.3钾通道阻断剂可用于慢性阻塞性肺病、过敏性哮喘、弥漫性全细支气管炎及动脉粥样硬化等相关疾病的治疗；Kv1.3钾通道阻断剂能够引起实验动物脂肪组织代谢分解，从而引起实验动物体重减轻，因而Kv1.3钾通道阻断剂能够起到减肥效果。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种龙血竭总黄酮的制备方法，其特征在于：将龙血竭药材粉碎成粗粉，加入11倍量的乙醇和乙酸乙酯混合溶剂，在50～69℃条件下回流提取2次，每次15～29分钟即可；所述混合溶剂中乙醇和乙酸乙酯的体积比为5:5～1:10。

2.如权利要求1所述的龙血竭总黄酮的制备方法，其特征在于：制得的龙血竭总黄酮包括龙血素B，以及至少一种查尔酮类化合物。

3.如权利要求2所述的龙血竭总黄酮的制备方法，其特征在于：所述查尔酮类化合物为剑叶龙血素A或剑叶龙血素B。

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