CN109752557A

CN109752557A - 检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用

Info

Publication number: CN109752557A
Application number: CN201810455538.XA
Authority: CN
Inventors: 李丕龙; 周敏; 李维平; 李剑; 王亮; 吴荣波; 王静; 陈鹤
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2017-11-06
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2038-05-14
Also published as: CN109752557B

Abstract

本发明公开了检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用。本发明公开的成套试剂由名称分别为A、B和C的三种试剂组成；A由名称为R的生物分子和名称为X的生物分子连接而成；B含有名称为L的生物分子；R与L相同或不同且二者间具有相互作用，R与L相互作用后发生相变；C由名称为甲的报告基团与名称为X_L的生物分子连接而成；X为蛋白质、核酸或多糖；X_L为蛋白质、核酸或多糖。本发明通过将微观的蛋白互作及其调控等生化过程转化为直观的荧光信号强度变化，可视性强；操作过程简单易行且成本低廉；还具有灵敏度高、适用性广等特点。

Description

检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用。

背景技术

“相变”作为物质的一种特性在物理界及日常生活中早已广为人知，近几年科学家们逐渐发现相变(或相分离)机制也广泛存在于生物细胞中，且在细胞生命周期的时空调控等方面行使重要的生物学功能。

目前的研究发现，当溶液中的多价的大分子与其多价配体互作时，容易产生更大的复合物，后者的溶解度一般会降低，从而从普通溶液相分离出来，形成一个复合物富集的独立的液态相，这个转变过程被称为“液-液分离相变”。其中，多价的价数是指大分子或其配体中含有的可与对方互作的结合区的数量。对蛋白互作而言，多价蛋白和它们的多价配体在体外也会发生“液-液分离相变”(简称为“相变”)现象，即可以产生一个正常的溶液相和一个蛋白富集的粘稠的液体相。在显微镜下可见蛋白富集的液体相内含有大量小液滴(即相变液滴)，液滴直径可达微米级甚至更大。如多价SH3(SRC homology 3domain)与其多价配体PRM(proline-rich motif)在一定浓度下就可以发生相变，而与SH3有更高亲和力的PRMH则可与SH3发生更强烈的相变。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测生物分子间的相互作用及检测调控因子对生物分子间相互作用的影响。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测生物分子间的相互作用及检测调控因子对生物分子间相互作用影响的成套试剂，其名称为成套试剂1，所述成套试1由名称分别为A、B和C的三种试剂组成；

所述A由名称为R的生物分子和名称为X的生物分子连接而成；

所述B含有名称为L的生物分子；

所述R与所述L相同或不同且二者间具有相互作用，所述R与所述L相互作用后发生相变；

所述C由名称为甲的报告基团与名称为X_L的生物分子连接而成；

所述X为蛋白质、核酸或多糖；所述X_L为蛋白质、核酸或多糖。

上述成套试剂1中，所述X与所述X_L间是否具有相互作用未知，所述成套试剂1可用于检测或辅助检测所述X与所述X_L间是否具有相互作用。

上述成套试剂1中，所述X与所述X_L间具有相互作用，所述成套试剂1可用于鉴定或辅助鉴定所述X与所述X_L间相互作用的调控因子。

上述成套试剂1中，所述R含有名称为结合区1的结合区；所述L含有名称为结合区2的结合区；所述R与所述L间的相互作用通过所述结合区1和所述结合区2进行，所述R中所述结合区1和所述L中所述结合区2的个数均可大于等于2。

其中，所述结合区1和所述结合区2均为结合区，结合区是指生物分子间通过非共价键相互作用的最小单元。当所述R与所述L间有大于等于2个结合区时，如所述R中的结合区不完全相同，所述结合区1为所述R中的各结合区的统称，如所述L中的结合区不完全相同，所述结合区2为所述L中的各结合区的统称。

所述R和所述L均为多价分子。其中，多价的价数是指分子与分子间互作时一个分子中所含有的可与另一分子结合的结合区的个数，对于所述R来说，所述R的价数即为所述结合区1的个数，对于所述L来说，所述L的价数即为所述结合区2的个数。

所述R与所述L通过多价相互作用发生相变。

所述成套试剂1可以检测蛋白质与蛋白质间、核酸与核酸间、蛋白质与核酸以及蛋白质与多糖间的相互作用。

上述成套试剂1中，所述R可为蛋白质、核酸或多糖。所述L可为蛋白质、核酸或多糖。

上述成套试剂1中，所述A中可还连接有名称为乙的报告基团。

所述B中还可连接有名称为丙的报告基团。

上述成套试剂1中，所述乙和所述丙相同或不同。

所述甲不同于所述乙和所述丙。

上述成套试剂1中，所述甲、所述乙和所述丙均可为荧光报告基团。进一步，所述甲、所述乙和所述丙均可为荧光蛋白质。

上述成套试剂1中，所述A中所述X和所述R的个数比可为大于等于1的整数。

所述C中所述甲与所述X_L的摩尔比可为1:1。

所述试剂C中，所述甲与所述X_L可通过连接区或化学键相连。所述甲具体可为mCherry。

上述成套试剂1中，所述R可为由R单体形成的多聚体，所述R单体均含有名称为mr的单体，大于等于两个的所述mr能形成多聚体；

所述L可为由L单体形成的多聚体，所述L单体均含有名称为ml的单体，大于等于两个的所述ml能形成多聚体；

所述mr与所述ml相同或不同。

上述成套试剂1中，所述R中可至少有一个单体含有所述结合区1。

所述L中可至少有一个单体含有所述结合区2。

当所述R中只有一个单体含有所述结合区1时，该单体中至少含有两个所述结合区1，当所述R中有两个或两个以上单体含有所述结合区1时，每个单体中含有所述结合区1的个数均至少为1个。

当所述L中只有一个单体含有所述结合区2时，该单体中至少含有两个所述结合区2，当所述L中有两个或两个以上单体含有所述结合区2时，每个单体中含有所述结合区2的个数均至少为1个。

所述R的含有所述结合区1的单体中，所述结合区1可连接在所述mr上。

所述L的含有所述结合区2的单体中，所述结合区2可连接在所述ml上。

所述mr与所述ml相同或不同。

上述成套试剂1中，所述R单体均可含有所述mr和所述结合区1。

所述L单体均可含有所述ml和所述结合区2。

上述成套试剂1中，所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。

所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。

上述成套试剂1中，所述R单体均还可含有所述乙。

所述L单体均还可含有所述丙。

上述成套试剂1中，所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。

所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键相连。

所述R单体中，所述结合区1的个数至少为一个。

所述L单体中，所述结合区2的个数至少为一个。

所述R和所述L单体中，无论各部分(即所述mr或所述ml、所述结合区1或所述结合区2、所述乙或丙)的数量为1个还是多个，彼此间的连接顺序没有要求，只要能满足大于等于两个所述R单体能形成多聚体、大于等于两个所述L单体能形成多聚体，且这两种多聚体能发生相互作用且能引起相变即可。

上文中，所述连接区没有特殊要求，所述连接区只要满足可以连接所述R和所述L的每个单体中的相连两个部分且不影响二者的功能即可。所述连接区可以为多肽。所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子可通过所述连接区或化学键依次相连。

所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子可通过所述连接区或化学键依次相连。

所述R单体均至少连接一个所述X。

在本发明的一个实施例中，所述R单体的C端均通过所述连接区与所述X的N端相连。

上述成套试剂1中，所述R单体可均相同，所述L单体可均相同。

所述mr与所述ml均可为酵母SmF。酵母SmF蛋白是核糖核蛋白复合体的核心组分，其晶体结构显示它是以同源十四聚体的形式存在的。因而以SmF为载体可以实现靶蛋白的多聚化。

所述结合区1可为序列1的第364-431位所示的SH3中与序列5的第366-380位所示的PRMH结合的区域。所述结合区2可为序列5的第366-380位所示的PRMH中与序列1的第364-431位所示的SH3结合的区域。

所述连接区为(Gly-Gly-Ser)_n或含有(Gly-Gly-Ser)_n的多肽，n为大于等于2的自然数。

n具体可为4或2。

所述甲可为红色荧光蛋白，如mCherry。

所述乙和所述丙可为绿色荧光蛋白，如GFP。

上述成套试剂1中，所述mr与所述ml均可为序列1的第17-102位所示的酵母SmF。

所述含有所述结合区1的生物分子可为序列1的第364-431位所示的SH3。

所述含有所述结合区2的生物分子可为序列5的第366-380位所示的PRMH。

上述成套试剂1中，所述R单体可为H1)或H2)或H3)：

H1)氨基酸序列是序列1的第17-431位所示的蛋白质；

H2)将序列表中序列1的第17-431位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

H3)在H1)或H2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述L单体为I1)或I2)或I3)：

I1)氨基酸序列是序列5的第17-380位所示的蛋白质；

I2)将序列表中序列5的第17-380位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

I3)在I1)或I2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使H1)或I1)中的蛋白质便于纯化，可在H1)或I1)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述H2)或I2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述H2)或I2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述H2)或I2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2的第62-1306位所示的编码所述R单体的DNA序列或序列6的第62-1153位所示编码所述L单体的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了名称为成套试剂2的成套试剂，所述成套试剂2由下述X1)和X2)组成：

X1)与所述R单体相关的生物材料，为下述X11)至X14)中的任一种：

X11)编码所述R单体的核酸分子；

X12)含有X11)所述核酸分子的表达盒；

X13)含有X11)所述核酸分子的重组载体、或含有X12)所述表达盒的重组载体；

X14)含有X11)所述核酸分子的重组微生物、或含有X12)所述表达盒的重组微生物、或含有X13)所述重组载体的重组微生物；

X2)与所述L单体相关的生物材料，为下述X21)至X24)中的任一种：

X21)编码所述L单体的核酸分子；

X22)含有X21)所述核酸分子的表达盒；

X23)含有X21)所述核酸分子的重组载体、或含有X22)所述表达盒的重组载体；

X24)含有X21)所述核酸分子的重组微生物、或含有X22)所述表达盒的重组微生物、或含有X23)所述重组载体的重组微生物。

所述成套试剂2可用于检测或辅助检测所述X与所述X_L间是否具有相互作用，也可用于鉴定或辅助鉴定所述X与所述X_L间相互作用的调控因子。

上述成套试剂2中，X11)所述核酸分子可为如下x11)或x12)或x13)：

x11)编码序列是序列表中序列2的第62-1306位的cDNA分子或DNA分子；

x12)与x11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子；

x13)在严格条件下与x11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子。

X21)所述核酸分子可为如下x21)或x22)或x23)：

x21)编码序列是序列表中序列6的第62-1153位的cDNA分子或DNA分子；

x22)与x21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子；

x23)在严格条件下与x21)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述R单体或所述L单体的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

X12)所述的含有编码所述R单体的核酸分子的表达盒(R单体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述R单体的DNA，该DNA不但可包括启动所述R单体基因转录的启动子，还可包括终止所述R单体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

X22)所述的含有编码所述L单体的核酸分子的表达盒(L单体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述L单体的DNA，该DNA不但可包括启动所述L单体基因转录的启动子，还可包括终止所述L单体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的载体构建含有所述R单体基因表达盒或所述L单体基因表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pRSFDuet-1载体。

X13)所述重组载体具体可为pRSFDuet-1-SGS，所述pRSFDuet-1-SGS为将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2的第12-1360位所示的DNA分子得到的重组载体。所述pRSFDuet-1-SGS能表达序列1所示的所述R单体与His-tag的融合蛋白质。

X23)所述重组载体具体可为pRSFDuet-1-SGP，所述pRSFDuet-1-SGP为将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6的第12-1162位所示的DNA分子得到的重组载体。所述pRSFDuet-1-SGP能表达序列5所示的所述L单体与His-tag的融合蛋白质。

所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，所述细菌可为大肠杆菌。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测生物分子间是否具有相互作用的方法，所述生物分子为名称分别为X与X_L的两种生物分子，所述方法包括：

将溶液A、溶液B与溶液C混合，得到待测液，所述溶液A为含有所述A的溶液；所述溶液B为含有所述B的溶液；所述溶液C为含有所述C的溶液；所述待测液中所述A中的R与所述B中的L互作发生相变产生相变液滴；根据所述待测液中相变液滴中是否具有所述甲的信号确定所述X与所述X_L间是否具有相互作用：如所述待测液中相变液滴中含有所述甲的信号，所述X与所述X_L间具有或候选具有相互作用；如所述待测液中相变液滴中不含有所述甲的信号，所述X与所述X_L间不具有或候选不具有相互作用。

其中，所述待测液中相变液滴中是否具有所述甲的信号是指所述待测液中所述甲的信号是否在相变液滴中得到了富集，以使相变液滴中所述甲的信号高于所述待测液中非相变液滴部分。具体的，所述根据所述待测液中相变液滴中是否具有所述甲的信号确定所述X与所述X_L间是否具有相互作用可包括：如所述待测液中相变液滴中所述甲的信号得到了富集，所述X与所述X_L间具有或候选具有相互作用；如所述待测液中相变液滴中所述甲的信号没有得到富集，所述X与所述X_L间不具有或候选不具有相互作用。

所述溶液A可由所述A与溶剂组成，所述溶液B可由所述B与所述溶剂组成，所述溶液C可由所述C与所述溶剂组成，所述溶剂能溶解所述A、所述B和所述C。

在本发明的一个实施例中，所述溶剂为KMEI buffer，KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl₂,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7。

在本发明的一个实施例中，采用将蛋白质与已知的多价酵母蛋白SmF进行融合表达实现靶蛋白的多聚化，即试剂A和试剂B的多价化。所述R单体为SGS(SGS为融合蛋白SmF-GFP-SH3的缩写)，所述L单体为SGP(SGP为融合蛋白SmF-GFP-PRMH的缩写)，SH3和PRMH互作引起多价蛋白SGS和SGP的互作进而发生相变产生相变液滴。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定生物分子间调控因子的方法，所述生物分子为名称分别为X与X_L的两种生物分子，所述X与所述X_L间具有相互作用，所述方法包括：

将所述溶液A、所述溶液B、所述溶液C与待测调控因子混合，得到待测液；将所述溶液A、所述溶液B和所述溶液C混合，得到对照液；所述待测液和所述对照液中所述A中的R与所述B中的L互作发生相变产生相变液滴；比较所述待测液和所述对照液相变液滴中所述甲的信号强度确定所述待测调控因子对所述X与所述X_L间的相互作用是否具有调控作用：如所述待测液相变液滴中所述甲的信号强于所述对照液相变液滴中所述甲的信号，所述调控因子对所述X与所述X_L间的相互作用具有或候选具有促进作用；如所述待测液相变液滴中所述甲的信号弱于所述对照液相变液滴中所述甲的信号，所述调控因子对所述X与所述X_L间的相互作用具有或候选具有抑制作用；如所述待测液和所述对照液相变液滴中所述甲的信号强度相同，所述调控因子对所述X与所述X_L间的相互作用不具有或候选不具有调控作用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂1或所述成套试剂2的下述任一应用：

Z1)在检测或辅助检测生物分子间是否具有相互作用中的应用；

Z2)在筛选生物分子间相互作用调控因子中的应用；

Z3)在鉴定或辅助鉴定生物分子间相互作用调控因子中的应用；

Z4)在检测物质对生物分子间相互作用的影响中的应用；

Z5)在制备检测生物分子间是否具有相互作用产品中的应用；

Z6)在制备筛选生物分子间相互作用调控因子产品中的应用；

Z7)在制备鉴定生物分子间相互作用调控因子产品中的应用。

上述应用中，所述产品可为试剂盒。

所述筛选生物分子间相互作用调控因子可进行高通量筛选，所述鉴定生物分子间相互作用调控因子也可进行高通量鉴定。

本发明基于相变制备了一套可以用于检测生物分子间相互作用的成套试剂，试剂A中的R可以与试剂B中的L互作进而发生相变，产生相变液滴，其中，R与L中一个为多价分子，一个为对应的多价配体，试剂A中的X在与试剂C中的X_L互作后可将试剂C招募至相变液滴中，通过观测相变液滴中试剂C中与X_L相连的荧光报告基团甲的荧光信号进而可以确定X与X_L间是否互作。另外，通过向该反应体系中添加调控因子可以确定调控因子对X与X_L间的互作的影响，可以进一步筛选生物分子间互作的调控因子。

本发明通过将微观的蛋白互作及其调控等生化过程转化为直观的荧光信号强度变化，可视性强；操作过程简单易行且成本低廉；由于相变蛋白的浓度接近体内蛋白浓度，因而可最大程度的模拟真实生命环境；此外，该方法还具有灵敏度高、适用性广等特点，为高通量筛选蛋白互作调控因子提供了一个新的思路和方法。

附图说明

图1为P53与MDM2间相互作用的检测。A为体系3的相变液滴形态观察，右图为左图框选区域的放大图像；B为体系1-11的激光共聚焦高内涵显微成像分析。标尺＝50μm。

图2为抑制剂对P53与MDM2间相互作用的影响。A为荧光信号检测结果，B为相变液滴中红色荧光信号的量化分析。标尺＝20μm。

图3为雷帕霉素对FKBP与FRB间相互作用的影响。A为荧光信号检测结果，B为相变液滴中红色荧光信号的量化分析。标尺＝100μm。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明提供了用于检测生物分子X与X_L间相互作用的成套试剂，该成套试剂由试剂A、试剂B和试剂C组成；

试剂A由生物分子R和生物分子X连接而成，R为由R单体形成的多聚体，R单体均相同，每个单体均含有mr、荧光报告基团乙、结合区1或含有结合区1的生物分子、生物分子X，每个单体各部分之间通过连接区或化学键相连，其中，大于等于2个的mr能形成多聚体；

试剂B含有生物分子L，L为由L单体形成的多聚体，L单体均相同，每个单体均含有ml、荧光报告基团丙、结合区2或含有结合区2的生物分子，每个单体各部分之间通过连接区或化学键相连，其中，大于等于2个的ml能形成多聚体；

试剂C由荧光报告基团甲与生物分子X_L连接而成；

R与L相同或不同且二者间具有相互作用，R与L间的相互作用通过R的结合区1和L的结合区2进行，R中结合区1和L中结合区2的个数均大于等于2，R与L相互作用后发生相变；

X与X_L为蛋白质、核酸或多糖；R与L为蛋白质、核酸或多糖。

下面以R与L均为蛋白质为例来阐述本发明的成套试剂在检测蛋白质间相互作用中的应用，具体的，mr和ml均为SmF，荧光报告基团乙和荧光报告基团丙均为GFP，含有结合区1的生物分子为SH3，含有结合区2的生物分子为PRMH，将SmF、GFP和SH3的融合蛋白质记为SGS(即R单体)，将SmF、GFP和PRMH的融合蛋白质记为SGP(即L单体)，荧光报告基团甲为mCherry。

实施例1、P53与MDM2间相互作用及抑制剂对其影响的检测

本实施例中的X为P53，X_L为MDM2。

一、重组载体的制备

1、表达SGS与P53的融合蛋白的重组载体

将pRSFDuet-1载体(Merck公司旗下Novagen产品)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列2的第12-1360位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS，pRSFDuet-1-SGS能表达序列1所示的蛋白质(SGS融合His-tag，即R单体，记为His-SGS)。

其中，序列2的第14-1354位所示的DNA分子编码序列1所示的His-SGS，序列2的第1344-1349位和第1355-1360位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列1的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列1的第17-102位为SmF的氨基酸序列，序列1的第109-349位为GFP的氨基酸序列，序列1的第364-431位为SH3的氨基酸序列，序列1的第103-108位、第350-363位和第432-444位为连接区的氨基酸序列。His-SGS能通过SmF的作用形成十四聚体。

将pRSFDuet-1-SGS的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列4的第5-66位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS-P53，pRSFDuet-1-SGS-P53表达序列表中序列1所示的His-SGS与序列3所示的P53的融合蛋白(记为SGS-P53)。

其中，序列4的第13-57位编码序列3所示的P53。SGS-P53能通过SmF的作用形成十四聚体。

2、表达SGP的重组载体

将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列6的第12-1162位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGP，pRSFDuet-1-SGP能表达序列5所示的蛋白质(SGP融合His-tag，记为His-SGP，也即L单体)。

其中，序列6的第14-1156位所示的DNA分子编码序列5所示的His-SGP，序列5的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列5的第17-102位为SmF的氨基酸序列，序列5的第109-349位为GFP的氨基酸序列，序列5的第366-380位为PRMH的氨基酸序列，序列5的第103-108位和第350-365位为连接区的氨基酸序列。His-SGP能通过SmF的作用形成十四聚体。

3、表达MDM2与mCherry的融合蛋白(试剂C)的重组载体

将pRSFDuet-1载体的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列8的第11-831位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-mCherry，pRSFDuet-1-mCherry能表达序列7所示的蛋白质(mCherry融合His-tag，记为His-mCherry)。

其中，序列8的第13-825位编码序列7所示的His-mCherry，序列8的第815-820位和第826-831位分别为NcoI和XhoI的识别序列，序列7的第3-8位为His-tag的氨基酸序列，序列7的第17-254位为mCherry的氨基酸序列，序列7的第255-270位为连接区的氨基酸序列。

将pRSFDuet-1-mCherry的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列10的第5-324位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-mCherry-MDM2，pRSFDuet-1-mCherry-MDM2表达mCherry与序列9所示的MDM2的融合蛋白质(即试剂C，记为mCherry-MDM2，含有His标签)。

其中，序列10的第7-315位编码序列9所示的MDM2。

将pRSFDuet-1-mCherry的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列16的第1-35位所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-mCherry-N，pRSFDuet-1-mCherry-N表达mCherry与序列15所示蛋白质的融合蛋白质(将该融合蛋白质记为mCherry-N，含有His标签)。

二、融合蛋白表达与纯化

将步骤一的pRSFDuet-1-SGS、pRSFDuet-1-SGS-P53、pRSFDuet-1-SGP、pRSFDuet-1-mCherry、pRSFDuet-1-mCherry-MDM2和pRSFDuet-1-mCherry-N载体分别导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)，得到重组菌株BL21-pRSFDuet-1-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-P53、BL21-pRSFDuet-1-SGP、BL21-pRSFDuet-1-mCherry、BL21-pRSFDuet-1-mCherry-MDM2和BL21-pRSFDuet-1-mCherry-N。

按照下述方法，对重组菌株BL21-pRSFDuet-1-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-P53、BL21-pRSFDuet-1-SGP、BL21-pRSFDuet-1-mCherry、BL21-pRSFDuet-1-mCherry-MDM2和BL21-pRSFDuet-1-mCherry-N表达的含有His标签的融合蛋白进行纯化：

(1)细菌培养和蛋白诱导表达：将上述重组菌株接种到1L LB培养基中。37℃，200rpm培养至OD600约0.8-1(约8-9hr)。将菌液转移至18℃降温1hr，加IPTG至终浓度为0.5mM诱导蛋白表达过夜(16hr左右)，得到培养液。

(2)菌体重悬与破碎：将步骤(1)得到的培养液离心，弃上清液，用40mLbindingbuffer(40mM Tris-Cl，500mM NaCl,pH 8.0或7.4)重悬菌体沉淀并进行超声破碎，将破碎产物超速离心20000rpm，1hr，收集上清液(含有目的融合蛋白)。

(3)Ni柱纯化：预先准备好Ni柱，并用binding buffer平衡。将步骤(2)得到的上清液倒入Ni柱。待液体快流干时，加入wash buffer洗2-3个柱体积，然后加入elution buffer进行目的融合蛋白的洗脱，收集流出液。

wash buffer：40mM Tris-HCl,500mM NaCl,40mM咪唑，pH同binding buffer。

elution buffer：40mM Tris-HCl,500mM NaCl,500mM咪唑，pH同binding buffer。

(4)离子交换纯化：根据蛋白的等电点，选择合适的离子交换柱。用40mM的Tris-Cl缓冲液稀释步骤(3)的流出液以降低离子浓度，得到蛋白稀释液。安装离子交换柱至ATKA蛋白质纯化系统(GE公司)并完成蛋白稀释液的上样。采用逐步提高盐离子浓度的方式对结合在柱子上的蛋白进行洗脱并收集目的融合蛋白。洗脱所用洗脱液由A液和B液组成，二者间的配比根据具体情况调整：A液：40mM Tris-Cl，pH同binding buffer；B液：40mM Tris-Cl，2M NaCl，pH同binding buffer。

(5)凝胶过滤纯化：将步骤(4)得到的目的融合蛋白超滤浓缩后，用预设的分子筛程序对其进行分离纯化，得到进一步纯化的目的融合蛋白。

柱平衡及洗脱所用KMEI buffer由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：150mM KCl,1mM MgCl₂,1mM EGTA,10mM imidazole,1mM DTT，pH＝7。

(6)检测并保存纯化的蛋白：利用SDS-PAGE对上述步骤纯化得到的BL21-pRSFDuet-1-SGS表达的His-SGS、BL21-pRSFDuet-1-SGS-P53表达的SGS-P53、BL21-pRSFDuet-1-SGP表达的His-SGP、BL21-pRSFDuet-1-mCherry表达的His-mCherry、BL21-pRSFDuet-1-mCherry-MDM2表达的mCherry-MDM2和BL21-pRSFDuet-1-mCherry-N表达的mCherry-N进行检测，在确定上述融合蛋白大小均符合预期后将蛋白浓缩冻存于-80℃备用。

三、P53与MDM2间相互作用的检测

将步骤二得到的His-SGS、SGS-P53、His-SGP、His-mCherry和mCherry-MDM2的溶液(溶剂均为KMEI buffer)分别按照如下体系分装于384微孔板中，每孔一种体系，体系中His-SGS、His-SGP、His-mCherry、SGS-P53、mCherry-MDM2和mCherry-N在相应体系中的浓度均为0.5μM：

体系1：His-SGS的溶液；

体系2：His-SGP的溶液；

体系3：His-SGS与His-SGP的溶液；

体系4：His-mCherry的溶液；

体系5：His-SGS、His-mCherry与His-SGP的溶液；

体系6：SGS-P53的溶液；

体系7：SGS-P53与His-SGP的溶液；

体系8：SGS-P53、His-mCherry与His-SGP的溶液；

体系9：SGS-P53、mCherry-MDM2与His-SGP的溶液；

体系10：His-SGS、mCherry-MDM2与His-SGP的溶液；

体系11：SGS-P53、mCherry-N与His-SGP的溶液。

将上述各体系于4℃静置孵育直至发生相变的体系中的相变液滴完全沉降到孔板底部，用激光共聚焦高内涵成像显微镜进行图像采集，结果(图1中B)显示，体系1和体系2中溶液均未发生变化，未发现荧光信号聚集区域；体系3中溶液产生相变液滴，绿色荧光信号(GFP发出的荧光信号)聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度(图1中A)；体系4中溶液未发生变化，未发现荧光信号聚集区域；体系5中溶液产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，同时并未发现液滴中有红色荧光信号聚集；体系6中溶液未发生变化，未发现荧光信号聚集区域；体系7溶液产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度；体系8溶液产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中，且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，同时并未发现液滴中有红色荧光信号聚集；体系9溶液产生相变液滴，绿色荧光信号和红色荧光信号(mCherry发出的荧光信号)均聚集于相变液滴中，且其信号强度均远远高于溶液中的信号强度；体系10和11中溶液产生相变液滴，绿色荧光信号聚集于相变液滴中且其信号强度远远高于溶液中的信号强度，同时并未发现液滴中有红色荧光信号聚集。以上结果说明，SGS可以与SGP结合产生相变液滴，该相变液滴可以用GFP发出的荧光来标示，当相变液滴中含有MDM2的互作蛋白P53时，P53可通过与MDM2的互作将mCherry-MDM2招募至相变液滴中，进而使红色荧光信号聚集于相变液滴中。而在体系组分缺失或加入与P53无互作关系的蛋白的情况下，均检测不到红色荧光信号的聚集。表明，利用SGS-P53、mCherry-MDM2与His-SGP可以检测P53与MDM2间的相互作用。

四、MI-773抑制P53与MDM2间相互作用的验证

选用已知的对P53与MDM2间相互作用具有抑制作用的化合物MI-773，按照如下体系利用本发明的方法验证其对P53与MDM2间相互作用的影响，利用氨苄霉素(Ampicillin)作为对照：

将SGS-P53的溶液、mCherry-MDM2的溶液、His-SGP的溶液以及氨苄霉素溶液混匀后取20μL混合液移入384微孔板中，得到氨苄霉素对照体系，氨苄霉素对照体系中SGS-P53、mCherry-MDM2和His-SGP的浓度均为0.5μM，氨苄霉素的浓度为25μM；

按照上述体系，将SGS-P53的溶液、mCherry-MDM2的溶液、His-SGP的溶液以及MI-773溶液混匀后取20μL混合液移入384微孔板中，设置不同MI-773浓度，得到不同MI-773浓度的实验体系，MI-773在各实验体系中的浓度分别为0(即KMEI buffer)、1.25、2.5、5、10、15和25μM，每孔一种浓度，各实验体系中SGS-P53、mCherry-MDM2和His-SGP的浓度均为0.5μM。

将上述各体系于4℃静置孵育直至发生相变的体系中的相变液滴完全沉降到孔板底部，用激光共聚焦高内涵成像显微镜采集各体系图像，并对每个孔板里相变液滴中红色荧光信号强度进行数据统计和分析。结果(图2)显示，加入抑制剂MI-773后，相变液滴中的红色荧光信号显著低于不含MI-773及含有氨苄霉素的体系，表明，氨苄霉素并不影响P53与MDM2间的互作，MI-773可明显抑制P53与MDM2间相互作用，这与已知的MI-773对P53与MDM2间相互作用具有抑制作用一致。表明，可利用SGS-P53、mCherry-MDM2与His-SGP检测调控因子对P53与MDM2间的相互作用的影响。

实施例2、雷帕霉素促进FKBP与FRB间相互作用的验证

本实施例中的X为FKBP，X_L为FRB。

一、重组载体的构建

将实施例1的pRSFDuet-1-SGS的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段(包含NcoI和XhoI的识别序列)替换为序列表中序列12所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-SGS-FKBP，pRSFDuet-1-SGS-FKBP表达序列表中序列1所示的SGS与序列11所示的FKBP的融合蛋白(记为SGS-FKBP)。

其中，序列12的第3-332位编码序列11所示的FKBP。

将实施例1的pRSFDuet-1-mCherry的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列14所示的DNA分子，得到重组载体pRSFDuet-1-mCherry-FRB，pRSFDuet-1-mCherry-FRB表达mCherry与序列13所示的FRB的融合蛋白质(即试剂C，记为mCherry-FRB，含有His标签)。

其中，序列14的第3-293位编码序列13所示的FRB。

二、融合蛋白表达与纯化

按照实施例1步骤一的方法，将pRSFDuet-1-SGS-FKBP和pRSFDuet-1-mCherry-FRB分别导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后，进行SGS-FKBP和mCherry-FRB的表达与纯化，得到均处于KMEI buffer中的SGS-FKBP溶液和mCherry-FRB溶液。

三、雷帕霉素对FKBP与FRB间相互作用的影响

利用本发明的方法按照如下体系验证雷帕霉素(rapamycin)对FKBP与FRB间相互作用的影响，利用氨苄霉素(ampicillin)作为对照：

将SGS-FKBP溶液、mCherry-FRB溶液、His-SGP的溶液以及氨苄霉素溶液混匀后取20μL混合液移入384微孔板中，得到氨苄霉素对照体系，氨苄霉素对照体系中SGS-FKBP、mCherry-FRB、His-SGP和氨苄霉素的浓度均为1μM；

按照上述体系，将SGS-FKBP溶液、mCherry-FRB溶液、His-SGP的溶液以及雷帕霉素溶液混匀后取20μL混合液移入384微孔板中，设置不同雷帕霉素浓度，得到不同雷帕霉素浓度的实验体系，雷帕霉素在各实验体系中的浓度分别为0(即KMEI buffer)、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μM，每孔一种浓度，各实验体系中SGS-FKBP、mCherry-FRB和His-SGP的浓度均为1μM。

将上述各体系于4℃静置孵育直至发生相变的体系中的相变液滴完全沉降到孔板底部，用激光共聚焦高内涵成像显微镜采集各体系图像，并对每个孔板里相变液滴中红色荧光信号强度进行数据统计和分析。结果(图3)显示，加入雷帕霉素的体系中，相变液滴中的红色荧光信号均显著高于不含雷帕霉素及含有氨苄霉素的体系，并且相变液滴中的红色荧光信号强度随雷帕霉素浓度的增加而增强，表明，氨苄霉素并不影响FRB与FKBP间的互作，雷帕霉素可以促进FRB与FKBP间的相互作用，并且该促进作用具有剂量效应，这与已知的雷帕霉素对FKBP与FRB间相互作用具有促进作用一致。表明，可利用SGS-FKBP、mCherry-FRB与His-SGP检测调控因子对FRB与FKBP间的相互作用的影响。

<110> 清华大学

<120> 检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly

1 5 10 15

Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys

20 25 30

Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys

35 40 45

Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr

50 55 60

Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser

65 70 75 80

His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr

85 90 95

Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Val Ser

100 105 110

Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu

115 120 125

Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu

130 135 140

Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr

145 150 155 160

Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr

165 170 175

Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Lys Gln His Asp

180 185 190

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile

195 200 205

Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

210 215 220

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn

245 250 255

Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys

260 265 270

Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu

275 280 285

Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu

290 295 300

Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala

325 330 335

Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Met Lys Gly

340 345 350

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Ser Gly His Met

355 360 365

Asp Leu Asn Met Pro Ala Tyr Val Lys Phe Asn Tyr Met Ala Glu Arg

370 375 380

Glu Asp Glu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Thr Lys Val Ile Val Met Glu

385 390 395 400

Lys Ser Ser Asp Gly Trp Trp Arg Gly Ser Tyr Asn Gly Gln Val Gly

405 410 415

Trp Phe Pro Ser Asn Tyr Val Thr Glu Glu Gly Asp Ser Pro Leu Gly

420 425 430

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Met Gly

435 440 445

<210> 2

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggagatat accatgaaac atcatcatca tcatcacgaa aacctgtatt ttcagggcgg 60

catgagcgaa agcagcgata ttagcgcgat gcagccggtg aacccgaaac cgtttctgaa 120

aggcctggtg aaccatcgcg tgggcgtgaa actgaaattt aacagcaccg aatatcgcgg 180

caccctggtg agcaccgata actattttaa cctgcaactg aacgaagcgg aagaatttgt 240

ggcgggcgtg agccacggca ccctgggcga aatttttatt cgcagcaaca acgtgctgta 300

tattcgcgaa ctgccgaacg gcggttccgg cggttccatg aaagtgagca agggcgagga 360

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 420

gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac ggcaagctga ccctgaagtt 480

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 540

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ctacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 600

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatctcc ttcaaggacg acggcaccta 660

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 720

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaacttcaa 780

cagccacaac gtctatatca cggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg cgaacttcaa 840

gatccgccac aacgtcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 900

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccaa 960

gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1020

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagacc atgaaaggcg gtagcggtgg 1080

cagcggtggt agcggcggct ccatgagcgg ccatatggac ctcaacatgc ccgcttatgt 1140

gaaatttaac tacatggctg agagagagga tgaattatca ttgataaagg ggacaaaggt 1200

gatcgtcatg gagaaaagca gtgatgggtg gtggcgtggt agctacaatg gacaagttgg 1260

atggttccct tcaaactatg taactgaaga aggtgacagt cctttgggtg gcagtggcgg 1320

tagcggtggc agcggtggca gctccatggg ctaactcgag tctggtaaag aaac 1374

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn

1 5 10 15

<210> 4

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaaccatgg gcagccagga aacctttagc gatctgtgga aactgctgcc ggaaaactaa 60

ctcgagaagg 70

<210> 5

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly

1 5 10 15

Met Ser Glu Ser Ser Asp Ile Ser Ala Met Gln Pro Val Asn Pro Lys

20 25 30

Pro Phe Leu Lys Gly Leu Val Asn His Arg Val Gly Val Lys Leu Lys

35 40 45

Phe Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Gly Thr Leu Val Ser Thr Asp Asn Tyr

50 55 60

Phe Asn Leu Gln Leu Asn Glu Ala Glu Glu Phe Val Ala Gly Val Ser

65 70 75 80

His Gly Thr Leu Gly Glu Ile Phe Ile Arg Ser Asn Asn Val Leu Tyr

85 90 95

Ile Arg Glu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Val Ser

100 105 110

Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu

115 120 125

Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu

130 135 140

Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr

145 150 155 160

Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr

165 170 175

Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Lys Gln His Asp

180 185 190

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile

195 200 205

Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

210 215 220

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn

245 250 255

Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys

260 265 270

Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu

275 280 285

Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu

290 295 300

Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp

305 310 315 320

Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala

325 330 335

Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Met Lys Gly

340 345 350

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Ser Ser Lys Lys

355 360 365

Thr Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Thr Thr Ser Lys

370 375 380

<210> 6

<211> 1183

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggagatat accatgaaac atcatcatca tcatcacgaa aacctgtatt ttcagggcgg 60

catgagcgaa agcagcgata ttagcgcgat gcagccggtg aacccgaaac cgtttctgaa 120

aggcctggtg aaccatcgcg tgggcgtgaa actgaaattt aacagcaccg aatatcgcgg 180

caccctggtg agcaccgata actattttaa cctgcaactg aacgaagcgg aagaatttgt 240

ggcgggcgtg agccacggca ccctgggcga aatttttatt cgcagcaaca acgtgctgta 300

tattcgcgaa ctgccgaacg gcggttccgg cggttccatg aaagtgagca agggcgagga 360

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 420

gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac ggcaagctga ccctgaagtt 480

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 540

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ctacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 600

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatctcc ttcaaggacg acggcaccta 660

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 720

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaacttcaa 780

cagccacaac gtctatatca cggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg cgaacttcaa 840

gatccgccac aacgtcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 900

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccaa 960

gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1020

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagacc atgaaaggcg gtagcggtgg 1080

cagcggtggt agcggcggct ccatgagcag caaaaaaacc ccgccgccgg tgccgccgcg 1140

caccaccagc aaataactcg agtctggtaa agaaaccgct gct 1183

<210> 7

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly

1 5 10 15

Met Lys Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu

20 25 30

Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu

35 40 45

Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln

50 55 60

Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp

65 70 75 80

Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys

85 90 95

His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly

100 105 110

Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr

115 120 125

Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val

130 135 140

Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys

145 150 155 160

Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp

165 170 175

Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly

180 185 190

Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro

195 200 205

Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr

210 215 220

Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu

225 230 235 240

Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Met Lys

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Gly

260 265 270

<210> 8

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggagatata ccatgaaaca tcatcatcat catcacgaaa acctgtattt tcagggcggc 60

atgaaagtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca tcaaggagtt catgcgcttc 120

aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag 180

ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg tggccccctg 240

cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg gctccaaggc ctacgtgaag 300

caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag 360

cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc ctccctccag 420

gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgtggcacca acttcccctc cgacggcccc 480

gtaatgcaga agaagacaat gggctgggag gcctcctccg agcggatgta ccccgaggac 540

ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga aggacggcgg ccactacgac 600

gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg cgcctacaac 660

gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac 720

gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg agctgtacaa gaccatgaaa 780

ggcggtagcg gtggcagcgg tggtagcggc ggctccatgg gctaactcga gtctggtaaa 840

gaaacc 846

<210> 9

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln

1 5 10 15

Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser

20 25 30

Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr

35 40 45

Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln

50 55 60

His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr

85 90 95

Arg Asn Leu Val Val Val Asn

100

<210> 10

<211> 328

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggaatcatga ctgatggtgc tgtaaccacc agccagattc cggcgagcga acaggaaacc 60

ctggtgcgcc cgaaaccgct gctgctgaaa ctgctgaaaa gcgtgggcgc gcagaaagat 120

acctatacca tgaaagaagt gctgttttat ctgggccagt atattatgac caaacgcctg 180

tatgatgaaa aacagcagca tattgtgtat tgcagcaacg atctgctggg cgatctgttt 240

ggcgtgccga gctttagcgt gaaagaacat cgcaaaattt ataccatgat ttatcgcaac 300

ctggtggtgg tgaactaact cgagaagg 328

<210> 11

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Gly Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr

1 5 10 15

Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu

20 25 30

Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe

35 40 45

Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly

50 55 60

Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His

85 90 95

Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 12

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccatgggggg cgtgcaggtg gaaaccatta gcccgggcga tggccgcacc tttccgaaac 60

gcggccagac ctgcgtggtg cattataccg gtatgctgga agatggcaaa aaatttgata 120

gcagccgcga tcgcaacaaa ccgtttaaat ttatgctggg caaacaggaa gtgattcgcg 180

gctgggaaga aggcgtggcg cagatgagcg tgggccagcg cgcgaaactg accattagcc 240

cggattatgc gtatggcgcg accggccatc cgggcattat tccgccgcac gcgaccctgg 300

tgtttgatgt ggaactgctg aaactggaat aactcgag 338

<210> 13

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Glu Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu

1 5 10 15

Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met

20 25 30

Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln

35 40 45

Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met

50 55 60

Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys

65 70 75 80

Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile

85 90 95

<210> 14

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccatggaacg cgtggcgatt ctgtggcatg aaatgtggca tgaaggcctg gaagaagcga 60

gccgcctgta ttttggcgaa cgcaacgtga aaggcatgtt tgaagtgctg gaaccgctgc 120

acgcgatgat ggaacgcggc ccgcagaccc tgaaagaaac cagctttaac caggcgtatg 180

gccgcgatct gatggaagcg caggaatggt gccgcaaata tatgaaaagc ggcaacgtga 240

aagatctgac ccaggcgtgg gatctgtatt atcatgtgtt tcgccgcatt taactcgag 299

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Lys Lys Glu Thr Pro Val

1 5

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccatgggcaa gaaagaaacc ccggtgtaac tcgag 35

Claims

1.成套试剂，由名称分别为A、B和C的三种试剂组成；

所述A由名称为R的生物分子和名称为X的生物分子连接而成；

所述B含有名称为L的生物分子；

2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述X与所述X_L间是否具有相互作用未知，所述成套试剂用于检测或辅助检测所述X与所述X_L间是否具有相互作用。

3.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述X与所述X_L间具有相互作用，所述成套试剂用于鉴定或辅助鉴定所述X与所述X_L间相互作用的调控因子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述R含有名称为结合区1的结合区；所述L含有名称为结合区2的结合区；所述R与所述L间的相互作用通过所述结合区1和所述结合区2进行，所述R中所述结合区1和所述L中所述结合区2的个数均大于等于2。

5.根据权利要求1-4中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述R为蛋白质、核酸或多糖；和/或，所述L为蛋白质、核酸或多糖。

6.根据权利要求1-5中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述A中还连接有名称为乙的报告基团；

和/或，所述B中还连接有名称为丙的报告基团。

7.根据权利要求6所述的成套试剂，其特征在于：所述乙和所述丙相同或不同；

和/或，所述甲不同于所述乙和所述丙。

8.根据权利要求6或7所述的成套试剂，其特征在于：所述甲、所述乙和所述丙均为荧光报告基团；

和/或，所述甲、所述乙和所述丙均为荧光蛋白质。

9.根据权利要求1-8中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述A中所述X和所述R的个数比为大于等于1的整数。

10.根据权利要求1-9中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述R为由R单体形成的多聚体，所述R单体均含有名称为mr的单体，大于等于两个的所述mr能形成多聚体；

和/或，所述L为由L单体形成的多聚体，所述L单体均含有名称为ml的单体，大于等于两个的所述ml能形成多聚体；

所述mr与所述ml相同或不同。

11.根据权利要求10所述的成套试剂，其特征在于：

所述R中至少有一个单体含有所述结合区1；

和/或，所述L中至少有一个单体含有所述结合区2。

12.根据权利要求10或11所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体均含有所述mr和所述结合区1；

和/或，所述L单体均含有所述ml和所述结合区2。

13.根据权利要求12所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体中，所述mr与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子通过连接区或化学键相连；

和/或，所述L单体中，所述ml与所述结合区2或含有所述结合区1的生物分子通过所述连接区或化学键相连。

14.根据权利要求12或13所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体均还含有所述乙；

和/或，所述L单体均还含有所述丙。

15.根据权利要求14所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体中，所述mr、所述乙与所述结合区1或含有所述结合区1的生物分子通过所述连接区或化学键相连；

和/或，所述L单体中，所述ml、所述丙与所述结合区2或含有所述结合区2的生物分子通过所述连接区或化学键相连。

16.根据权利要求10-15中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体均相同，所述L单体均相同；

和/或，所述mr与所述ml均为酵母蛋白SmF；

和/或，所述结合区1为序列1的第364-431位所示的SH3中与序列5的第366-380位所示的PRMH结合的区域；所述结合区2为序列5的第366-380位所示的PRMH中与序列1的第364-431位所示的SH3结合的区域；

和/或，所述连接区为(Gly-Gly-Ser)_n或含有(Gly-Gly-Ser)_n的多肽，n为大于等于2的自然数；

和/或，所述甲为红色荧光蛋白；

和/或，所述乙和所述丙为绿色荧光蛋白。

17.根据权利要求13-16中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述mr与所述ml均为序列1的第17-102位所示的酵母SmF；

和/或，所述含有所述结合区1的生物分子为序列1的第364-431位所示的SH3；

和/或，所述含有所述结合区2的生物分子为序列5的第366-380位所示的PRMH。

18.根据权利要求10-17中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述R单体为H1)或H2)或H3)：

H1)氨基酸序列是序列1的第17-431位所示的蛋白质；

H3)在H1)或H2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

和/或，所述L单体为I1)或I2)或I3)：

I1)氨基酸序列是序列5的第17-380位所示的蛋白质；

I3)在I1)或I2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

19.成套试剂，由下述X1)和X2)组成：

X1)与权利要求16-18中任一所述R单体相关的生物材料，为下述X11)至X14)中的任一种：

X11)编码权利要求16-18中任一所述R单体的核酸分子；

X12)含有X11)所述核酸分子的表达盒；

X2)与权利要求16-18中任一所述L单体相关的生物材料，为下述X21)至X24)中的任一种：

X21)编码权利要求16-18中任一所述L单体的核酸分子；

X22)含有X21)所述核酸分子的表达盒；

20.根据权利要求19所述的成套试剂，其特征在于：X11)所述核酸分子为如下x11)或x12)或x13)：

x12)与x11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求16-18中任一所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子；

x13)在严格条件下与x11)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求16-18中任一所述R单体的cDNA分子或基因组DNA分子；

和/或，X21)所述核酸分子为如下x21)或x22)或x23)：

x22)与x21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求16-18中任一所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子；

x23)在严格条件下与x21)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求16-18中任一所述L单体的cDNA分子或基因组DNA分子。

21.检测生物分子间是否具有相互作用的方法，所述生物分子为名称分别为X与X_L的两种生物分子，所述方法包括：

将溶液A、溶液B与溶液C混合，得到待测液，所述溶液A为含有权利要求1-18中任一所述A的溶液；所述溶液B为含有权利要求1-18中任一所述B的溶液；所述溶液C为含有权利要求1-16中任一所述C的溶液；所述待测液中所述A中的R与所述B中的L互作发生相变产生相变液滴；根据所述待测液中相变液滴中是否含有所述甲的信号确定所述X与所述X_L间是否具有相互作用。

22.鉴定生物分子间调控因子的方法，所述生物分子为名称分别为X与X_L的两种生物分子，所述X与所述X_L间具有相互作用，所述方法包括：

将溶液A、溶液B、溶液C与待测调控因子混合，得到待测液；将所述溶液A、所述溶液B和所述溶液C混合，得到对照液；所述待测液和所述对照液中所述A中的R与所述B中的L互作发生相变产生相变液滴；比较所述待测液和所述对照液相变液滴中所述甲的信号强度确定所述待测调控因子对所述X与所述X_L间的相互作用是否具有调控作用；

所述溶液A为含有权利要求2-18中任一所述A的溶液；所述溶液B为含有权利要求2-18中任一所述B的溶液；所述溶液C为含有权利要求2-16中任一所述C的溶液。

23.权利要求1-20中任一所述成套试剂的下述任一应用：

Z2)在筛选生物分子间相互作用调控因子中的应用；

Z4)在检测物质对生物分子间相互作用的影响中的应用；

Z5)在制备检测生物分子间是否具有相互作用产品中的应用；

Z6)在制备筛选生物分子间相互作用调控因子产品中的应用；

Z7)在制备鉴定生物分子间相互作用调控因子产品中的应用。