CN109735492A - 一种造血干细胞提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种造血干细胞提取方法，属于干细胞提取技术领域。该方法用生理盐水从外部冲洗胎盘并在室温下注入30mL抗凝血剂/血管舒张剂溶液；将灌注液针头一端插入胎盘脐动脉中，另一端插入灌注容器中；回流液针头一端插入胎盘脐静脉中，另一端也插入灌注容器中，形成灌注回路；用细胞灌洗液以5滴每分钟的流速，进行6小时长期灌洗，收集第一次灌洗液；再用细胞灌洗液以5滴每分钟的流速，灌洗30分钟，收集第二次灌洗液；混合第一次灌洗液和第二次灌洗液，收集细胞，加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。本发明的方法提取的造血干细胞活率高，CD34+细胞数所占比例高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞提取技术领域，具体涉及一种造血干细胞提取方法。
背景技术
随着造血干细胞的研究进展，造血干细胞移植已成为恶性血液病和某些实体瘤病人的一种有效治疗手段。研究表明自怀孕6周至妊娠结束，胎盘中均含有造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)，且细胞数量大。从胎盘中获取造血干细胞，具有获取便捷，使用过程中不存在伦理问题等优点。脐带血（UCB）移植更广泛临床应用的主要障碍是其限制细胞含量。经研究发现，人胎盘中CD34+细胞含量远高于脐带血，能提供比典型UCB收获物高几倍的细胞产量。基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和其受体（CXCR4）属于造血干细胞动员的“滞留因子”，参与调节细胞的增殖和迁移。应用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的健康供者MMP-9蛋白质及mRNA 的表达增强，升高的MMP-9 可通过对SDF-1/CXCR4 的调节实现动员，SDF-1/CXCR4 和MMP-9 信号通路在G-CSF 造血动员中起到关键作用。G-CSF 破坏VLA-4 和VCAM1 黏附因子和SDF-1/CXCR4 化学吸引因子的相互作用，便会引起造血动员。G-CSF 对SDF-1/CXCR4 的作用影响着造血动员的进程，也影响着造血干细胞的分化、增殖和凋亡。血管内皮生长因子（VEGF）能促进血管内皮细胞的增殖，对血管内皮细胞有高特异性。VEGF 能加快造血干细胞动员，在造血动员中起着重要作用。本实验应用G-CSF联合CXCR4拮抗剂AMD3100促进CD34+细胞释放，从而提高CD34+细胞收获率。
目前胎盘源造血干细胞的提取方式多采用酶消化法和机械破碎法，机械破碎法和酶消化操作简单，处理时间短，但CD34+细胞数得率普遍较低，细胞活性不稳定。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供了一种造血干细胞提取方法，可有效解决造血干细胞在提取过程中细胞活性不稳定，细胞存活率低、CD34+细胞数低的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种造血干细胞提取方法，包括以下步骤：
（1）胎盘采集；在经产妇知情同意后，从医院进行采集胎盘；
（2）胎盘预处理：用生理盐水从外部冲洗胎盘并在室温下注入30mL抗凝血剂/血管舒张剂溶液；随后将灌注液针头一端插入胎盘脐动脉中，另一端插入灌注容器中；回流液针头一端插入胎盘脐静脉中，另一端也插入灌注容器中，形成灌注回路；
（3）脐带血清除：灌注容器中装入300mL Hank’s液，以Hank’s液灌注胎盘以清除残留在胎盘组织中的脐带血，当流出液体透明时停止清除；
（4）第一次灌洗：换入装有细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第一次长期灌注，之后将灌注液针头转入装有200mL Hank’s液中的灌注容器，当200mL Hank’s液全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第一次灌洗液；
（5）第二次灌洗：先将胎盘内的Hank’s液排出100mL，后换入装有细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第二次灌注，之后将灌注液针头转入装有200mL Hank’s液中的灌注容器，当200ml Hank’s液全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第二次灌洗液；
（6）细胞收集：混合第一次灌洗液和第二次灌洗液，500g离心10分钟，弃上清，收集细胞，加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。
上述步骤（2）中抗凝血剂/血管舒张剂溶液的组成为：含终浓度为20U/ mL肝素钠和终浓度1mg / mL酚妥拉明的混合液。
上述步骤（4）、（5）中细胞灌洗液的组成为：含100ug/mL的AMD3100和/或10ug/mL的C-GSF，10U / mL肝素钠，0.1mg / mL酚妥拉明和500mg/L维生素C的alfa-MEM培养基。
上述步骤（4）第一次灌注为：用500-1000mL细胞灌洗液，以5滴每分钟的流速，进行6小时长期灌洗。
上述步骤（5）第二次灌注为：再用500mL的细胞灌洗液以5滴每分钟的流速，灌洗30分钟。
上述步骤（6）中所收集细胞与DMSO和右旋糖酐细胞冻存液的体积比为4：1。
本发明的优点在于：
本发明提供的造血干细胞提取方法中细胞灌洗液由AMD3100、C-GSF、维生素C、酚妥拉明、肝素钠；通过用细胞灌洗液对胎盘组织进行反复洗涤，应用G-CSF联合CXCR4拮抗剂AMD3100促进CD34+细胞释放，从而提高CD34+细胞收获率。没有进行机械破碎，也没有使用任何的生物酶类对胎盘进行酶解，使细胞活性更加稳定。使用本发明的方法提取造血干细胞有核细胞数达12.6 X 108，细胞活率为97.99%，CD34+细胞数达9.25 X 106，CD34+细胞的比例可达到0.73%。
附图说明
图1通过流式抗体CD34+标记标记检测细胞存活率的检测结果。A：实施例1提取的造血干细胞；B：对比例提取的造血干细胞。
图2 通过流式抗体7-AAD标记检测造血干/祖细胞数量的结果图。A：实施例1提取的造血干细胞；B：对比例提取的造血干细胞。
图3造血干细胞CFU-GM集落生长能力图。A：实施例1提取的造血干细胞；B：对比例提取的造血干细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实验，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
具体实施例中所用试剂为：肝素钠（上海源叶生物）、酚妥拉明（sigma）、alfa-MEM（Gibco）、Hank’s（Gibco）维生素C注射液（海南制药厂）、AMD3100（Sigma）、DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液 CryoSure-DEX40 （德国WAK）。
实施例1
实施时间：2018.04.07；
胎盘采集地点：南京军区福州总院；
地点：福建省海西细胞生物工程有限公司实验中心。
一种造血干细胞提取方法，包括以下步骤：
选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书后，从医院进行胎盘采集。用盐水从外部冲洗胎盘并在室温下注入30mL抗凝血剂/血管舒张剂溶液（肝素钠20U/ mL，酚妥拉明1mg / mL）。随后将灌注液针头一端插入胎盘脐动脉中，另一端插入灌注容器中；回流液针头一端插入胎盘脐静脉中，另一端也插入灌注容器放中，形成灌注回路。首先灌注容器中装入300mL Hank’s液，以Hank’s液灌注胎盘以清除残留在胎盘组织中的UCB。换装有用500mL细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第一次长期灌注，流速为5滴每分钟，6小时后将灌注液针头转移到装有200mLHank’s液中的灌注容器，当200mLHank’s液全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第一次灌洗液A1。然后先将胎盘内的Hank’s液排出100mL，之后换装有500mL细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第二次灌注，流速为5滴每分钟，30分钟后将灌注液针头转移到装有200mL Hank’s液的灌注容器，中，当200mL全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第二次灌洗液A2。混合第一次灌洗液A1和第二次灌洗液A2，500g离心10分钟，弃上清，收集细胞，按照4：1的体积比加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。
所述细胞灌洗液的组成为：含100ug/mL的AMD3100，10U / mL肝素钠，0.1mg / mL酚妥拉明和500mg/L维生素C的alfa-MEM培养基。
实施例2
本实施例的实施时间：2018.05.01；
胎盘采集地点：南京军区福州总院
地点：福建省海西细胞生物工程有限公司实验中心；
一种造血干细胞提取方法，包括以下步骤：
选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书后，从医院进行采集胎盘。用盐水从外部冲洗胎盘并在室温下注入30mL抗凝血剂/血管舒张剂溶液（肝素20U / mL，酚妥拉明1mg / mL）。随后将灌注液针头一端插入胎盘脐动脉中，另一端插入灌注容中；回流液针头一端插入胎盘脐静脉中，另一端也插入灌注容器中，形成灌注回路。首先灌注容器中装入300mL Hank’s液，以Hank’s液灌注胎盘以清除残留在胎盘组织中的UCB。换装有1000mL细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第一次长期灌注，流速为5滴每分钟，6小时后将灌注液针头转移到装有200mL Hank’s液的灌注容器中，当200mL全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第一次灌洗液B1。然后先将胎盘内的Hank’s液排出100mL，之后换装有500mL细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第二次灌注，流速为5滴每分钟，30分钟后将灌注液针头转移到装有200mL Hank’s液的灌注容器中，当200mL全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第二次灌洗液B2。混合第一次灌洗液B1和第二次灌洗液B2，500g离心10分钟收集细胞，弃上清，按照4：1的体积比加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。
所述细胞灌洗液的组成为：含10ug/mL的C-GSF，10U / mL肝素钠，0.1mg / mL酚妥拉明和500mg/L维生素C的alfa-MEM培养基。
实施例3
本实施例的实施时间：2018.05.06；
胎盘采集地点：南京军区福州总院
地点： 福建省海西细胞生物工程有限公司实验中心 。
一种造血干细胞提取方法，包括以下步骤：
选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书后，从医院进行采集胎盘。用盐水从外部冲洗胎盘并在室温下注入30mL抗凝血剂/血管舒张剂溶液（肝素20U / mL，酚妥拉明，1mg / mL）。随后将灌注液针头一端插入胎盘脐动脉中，另一端插入灌注容器中；回流液针头一端插入胎盘脐静脉中，另一端也插入灌注容器中，形成灌注回路。首先灌注容器中装入300mL Hank’s液，以Hank’s液灌注胎盘以清除残留在胎盘组织中的UCB。换装有750mL细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第一次长期灌注，流速为5滴每分钟，6小时后将灌注液针头转移到装有200mL Hank’s液灌注容器中，当200mL全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第一次灌洗液C1。然后先将胎盘内的Hank’s液排出100mL，之后换装有500mL细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第二次灌注，流速为5滴每分钟，30分钟后将灌注液针头转移到装有200mL Hank’s液的灌注容器中，当200mL全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第二次灌洗液C2。混合第一次灌洗液C1和第二次灌洗液C2，500g离心10分钟，弃上清，收集细胞，按照4：1的体积比加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。
所述细胞灌洗液的组成为：含100ug/mL的AMD3100，10ug/mL的C-GSF，10U / mL肝素钠，0.1mg / mL酚妥拉明和500mg/L维生素C的alfa-MEM培养基。
对比例
选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书后，从医院进行采集胎盘。用盐水从外部冲洗胎盘并在室温下剪成1-3cm³小块，转移至数支50mL离心管中再剪碎到米粒大小，再用5倍体积的无菌生理盐水冲洗，混合冲洗液并且过100目细胞筛，收集滤液到250mL离心管中，800g离心10分钟收集细胞，弃上清，当上清液位高于底部沉淀5cm时停止。混合剩余细胞到1支250mL离心管中500g离心10分钟,弃上清，收集细胞，按照4：1的体积比加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。
检测结果：
用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测。胎盘造血干细胞有核细胞数和CD34+细胞数及细胞活率检测结果见表1，实施例1及对比例流式抗体CD34+标记检测细胞存活率的检测结果见图1。流式细胞仪检测CD34+细胞的比例可达到0.60%-0.73%；实施例1及对比例流式抗体7-AAD标记检测造血干/祖细胞数量的结果见图2。
表1
取5 X 104个细胞悬液，加入1mL甲基纤维素培养基（stemcell），并充分混匀后接种到培养板上，放置37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养14天后观察，胎盘造血干细胞集落形成数目见表2。实施例1及对比例造血干细胞CFU-GM集落生长能力见图3。
表2
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种造血干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）胎盘采集；在经产妇知情同意后，从医院进行采集胎盘；
（2）胎盘预处理：用生理盐水从外部冲洗胎盘并在室温下注入30mL抗凝血剂/血管舒张剂溶液；随后将灌注液针头一端插入胎盘脐动脉中，另一端插入灌注容器中；回流液针头一端插入胎盘脐静脉中，另一端也插入灌注容器中，形成灌注回路；
（3）脐带血清除：灌注容器中装入300mL Hank’s液，以Hank’s液灌注胎盘以清除残留在胎盘组织中的脐带血，当流出液体透明时停止清除；
（4）第一次灌洗：换入装有细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第一次长期灌注，之后将灌注液针头转入装有200mL Hank’s液中的灌注容器，当200mL Hank’s液全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第一次灌洗液；
（5）第二次灌洗：先将胎盘内的Hank’s液排出100mL，后换入装有细胞灌洗液的灌注容器，以细胞灌洗液进行第二次灌注，之后将灌注液针头转入装有200mL Hank’s液中的灌注容器，当200ml Hank’s液全部注入时，暂停注入，避免进入空气，收集灌注容器中的细胞灌洗液为第二次灌洗液；
（6）细胞收集：混合第一次灌洗液和第二次灌洗液，500g离心10分钟，弃上清，收集细胞，加入DMSO和右旋糖酐细胞冻存液混合后进行冻存。
2.根据权利要求1所述的一种造血干细胞提取方法，其特征在于：步骤（2）中抗凝血剂/血管舒张剂溶液的组成包含：含终浓度20U/ mL肝素钠和终浓度1mg / mL酚妥拉明的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种造血干细胞提取方法，其特征在于：步骤（4）、（5）中细胞灌洗液的组成为：含100ug/mL的AMD3100和/或10ug/mL的C-GSF，10U / mL肝素钠，0.1mg /mL酚妥拉明和500mg/L维生素C的alfa-MEM培养基。
4.根据权利要求1所述的一种造血干细胞提取方法，其特征在于：步骤（4）第一次灌注为：用500-1000mL细胞灌洗液，以5滴每分钟的流速，进行6小时长期灌洗。
5.根据权利要求1所述的一种造血干细胞提取方法，其特征在于：步骤（5）第二次灌注为：再用500mL的细胞灌洗液以5滴每分钟的流速，灌洗30分钟。
6.根据权利要求1所述的一种造血干细胞提取方法，其特征在于：步骤（6）中所收集细胞与DMSO和右旋糖酐细胞冻存液的体积比为4：1。
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