CN109734517A - 一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，包括以下步骤：(1)制备发酵菌液、(2)制备菌肥、(3)施用底肥、(4)浇灌发酵菌液；本发明利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)制备发酵菌液和菌肥，并且采用将菌液和菌肥联合用药的方法，使短小芽孢杆菌以固态和液态的形式施用，促进短小芽孢杆菌在土壤中定植并最终形成优势菌群，二者有机结合从而对根结线虫病起到较好的防效。本发明减少了化学肥料和化学农药的使用，保护和促进了烟草的生长，促进环境友好。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)生产的菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫虫害的发生。
背景技术
烟草根结线虫病是我国烟草主要病害之一，不仅直接危害烟草，造成烟株萎蔫黄化，发育迟缓，甚至整株死亡，而且还会导致烟草黑胫病、青枯病等病害发生，降低烟草品种的抗性。我国云南、河南、山东等13个主要产烟区都有发生，局部地区危害严重，损失较重。烟草作为吸食品，其农药残留问题已经引起重视。化学杀线剂会造成烟叶中农药残留的增加，致使烟叶农药残留超标，从而成为我国烟草生产贸易中的一个难题，而且应用化学杀线剂对环境污染严重，使用过程中对人畜不安全，对环境有着极大的威胁，难以保证烟叶生产的可持续性发展和安全性，所以，一些原本效果很好的杀线剂已经停止生产或在部分地区禁用。而生物防治作为一种安全、有效的方法而越来越受到重视。
根结线虫生物防治天敌资源在世界不同国家和地区被广泛调查和筛选，其涉及的真菌按功能区分包括捕食真菌、内寄生真菌、机会真菌和产毒真菌。此外，专性寄生细菌以及根际的研究也成为根结线虫生物防治研究的热点之一。目前采用的主要方法就是将拮抗菌制成浓缩液体制剂、纯孢子粉剂或者复合固体粉剂，然后在烟苗移栽前施用。这些方法较为单一，由于生防菌株受到复杂土壤生态因子的影响，生防菌剂防效的稳定性得不到保证，防效不明显。而本项专利所采用的是“联合用药”的方法，使生防菌能够在土壤中定植并最终形成优势菌群，从而对根结线虫病起到较好的防效。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有采用单一拮抗菌剂(液)防治根结线虫病技术的不足。提供一种将该病害拮抗菌肥与拮抗菌剂联合防控病害的新技术。通过联合作用能够提高拮抗菌在土壤中的定植能力，有效提高其对的该病害的抗性。对改善烟田微环境，促进生物防治技术的发展具有重要意义。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
1、制备发酵菌液
将固体保存的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)采用改良产芽孢液体培养基进行发酵培养，得到发酵菌液。所述发酵菌液中有效活菌数≥1.0亿/g(cfu)。所述改良产芽孢液体培养基成分如下：葡萄糖1.5％、黄豆饼粉3.0％、蛋白胨0.2％、NaCl0.1％、(NH4)2SO41.0g、CaCO30.6％、MgSO4·7H2O 0.6％、ZnSO4·7H2O 0.02％，CuCl2·2H2O 0.005％，H2O1000m1。
所述液体培养基和发酵菌液通过以下方法制备：分别称取上述组分并溶于1L蒸馏水中，待溶解后用pH计调节pH至6.8～7.2，将上述溶液装于三角瓶中放在灭菌锅中于121℃灭菌20分钟，待培养基冷却后用接种环沾取1ml短小芽孢杆菌转接到该培养基中，于37℃摇床100rpm振荡培养48hr。
2、制备菌肥
利用双次堆捂发酵的方法制备含有所述短小芽孢杆菌的生物菌肥，双次堆捂发酵的方法为：第一次发酵：以质量百分比计，取40～50％的泥碳、10～20％的油枯、10～15％的花渣、20～25％的碳氨水以及1～5％的含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，先混合均匀泥碳、油枯、花渣、碳氨水，加入总体积10％的水，每隔5天进行一次翻堆，堆捂时间为40天；第二次发酵：第一次发酵完成后，加入含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，每隔5天进行一次翻堆，以利于通氧和水分蒸发，二次发酵时间为15天，堆捂发酵结束后，各项指标达到国家有机肥标准NY525-2011。所述生物菌肥有效活性菌≥0.5亿/g(cfu)。
3、施用底肥
将步骤2所述含有该短小芽孢杆菌的生物菌肥作为底肥施用，每塘施用90克，每亩施用100公斤。
4、浇灌发酵菌液
进行步骤3的同时将步骤1所述的短小芽孢杆菌发酵菌液按照5000倍稀释，用以浇灌烟株。
浇灌烟株的具体方法为：待烟株移栽后浇灌烟株根部，每亩用量为10kg。在烟株生长幼苗期，比较稀疏时采用浇灌，待烟株生长后期，烟叶茂密时采用喷灌。使用喷灌系统喷施在烟株叶面上，叶部以及根部每次喷施均要浸透，每15天喷施1次，每个月喷施2次。
在烟草的种植中，发明人研究发现施用本发明中的短小芽孢杆菌菌肥可以减少化肥的用量，短小芽孢杆菌经再增殖后含有大量的固氮菌，可以大大提高土壤中的中微量元素含量，减少氮磷钾和其它中微量元素的施用量；同时含有多种高效活性有益微生物菌，增加土壤有机质，加速有机质降解转化为作物能吸收的营养物质，大大提高土壤肥力，减少化肥用量。改善烟草的品质，使烟草增收。还可重构健康的土壤，提高烟草抵抗病虫害，同时无毒、无害、无污染。
此外，短小芽孢杆菌发酵液对根结线虫病也可以起到较好的防效，可以减少烟草种植中根结线虫病的发生。
本发明采用双次堆捂发酵的方法，第一次堆捂发酵会发生部分物料无法全部腐熟的情况，进行第一次发酵后，加入发酵菌液，菌更好的作用于未完全腐熟的物料中，可快速繁殖使物料达到无害化处理(杀灭病菌、虫卵、杂草种子)。充分腐熟物料，使菌肥具有更多营养物质。
第二次堆捂发酵添加发酵菌液能够杀灭物料中的病毒、病菌、虫卵、杂草种子等，有效遏制土壤中的病虫害发生。经过发酵菌液充分发酵后的物料无异臭味，不烧根苗，并且固氮能力强，可增加土壤养分有效性，促进植物吸收。增加土壤有益微生物活动，使其产生生物调节物质刺激根系生长和促进养分吸收，有效的提高营养物质的吸收利用率。
而本项发明所采用的是“联合用药”的方法，使短小芽孢杆菌以固态和液态的形式施用，促进短小芽孢杆菌在土壤中定植并最终形成优势菌群，二者有机结合从而对根结线虫病起到较好的防效。本发明减少了化学肥料和化学农药的使用，保护和促进了烟草的生长，不造成烟草积累有害物质，对生态环境无不良影响，同时还可以逐步改良种植土壤的生态环境，对全球环境友好。
附图说明
图1为本发明中短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌落图；
图2为本发明中短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)细胞形态图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
本发明中的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)具有以下生物学特性：菌体呈短杆状,菌体大小0.58×2.1um，具内生芽孢，革兰氏染色呈阳性。见图1、图2。
1、制备发酵菌液
将固体保存的短小芽孢杆菌采用改良产芽孢液体培养基进行发酵培养，得到发酵菌液。所述发酵菌液中有效活菌数≥1亿/g(cfu)。所述改良产芽孢液体培养基成分如下：葡萄糖1.5％、黄豆饼粉3.0％、蛋白胨0.2％、NaCl0.1％、(NH4)2SO41.0g、CaCO30.6％、MgSO4·7H2O 0.6％、ZnSO4·7H2O 0.02％，CuCl2·2H2O 0.005％，H2O 1000m1。
所述液体培养基及发酵菌液通过以下方法制备：分别称取上述组分并溶于1L蒸馏水中，待溶解后用pH计调节pH至6.8，将上述溶液装于三角瓶中放在灭菌锅中于121℃灭菌20分钟，待培养基冷却后用接种环沾取1ml短小芽孢杆菌转接到该培养基中，于37℃摇床100rpm振荡培养48hr。
2、制备菌肥
利用双次堆捂发酵的方法制备含有所述短小芽孢杆菌的生物菌肥，双次堆捂发酵的方法为：第一次发酵：以质量百分比计，取40％的泥碳、20％的油枯、15％的花渣、23％的碳氨水以及2％的含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，先混合均匀泥碳、油枯、花渣、碳氨水，加入总体积10％的水，每隔5天进行一次翻堆，堆捂时间为40天；第二次发酵：第一次发酵完成后，加入含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，每隔5天进行一次翻堆，二次发酵时间为15天，堆捂发酵结束后，各项指标达到国家有机肥标准NY525-2011。所述生物菌肥有效活性菌≥0.5亿/g(cfu)。
3、施用底肥
将步骤2所述含有该短小芽孢杆菌的生物菌肥作为底肥施用，每塘施用90克，每亩施用100公斤。
4、浇灌发酵菌液
进行步骤3的同时将步骤1所述的短小芽孢杆菌发酵菌液按照5000倍稀释，用以浇灌烟株。
浇灌烟株的具体方法为：待烟株移栽后浇灌烟株根部，每亩用量为10kg。在烟株生长幼苗期，比较稀疏时采用浇灌，待烟株生长后期，烟叶茂密时采用喷灌。使用喷灌系统喷施在烟株叶面上，叶部以及根部每次喷施均要浸透，每15天喷施1次，每个月喷施2次。
实施例2
1、制备发酵菌液
将固体保存的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)采用改良产芽孢液体培养基进行发酵培养，得到发酵菌液。所述发酵菌液中有效活菌数≥1.0亿/g(cfu)。所述改良产芽孢液体培养基成分如下：葡萄糖1.5％、黄豆饼粉3.0％、蛋白胨0.2％、NaCl0.1％、(NH4)2SO41.0g、CaCO30.6％、MgSO4·7H2O 0.6％、ZnSO4·7H2O 0.02％，CuCl2·2H2O 0.005％，H2O1000m1。
所述液体培养基以及发酵菌液通过以下方法制备：分别称取上述组分并溶于1L蒸馏水中，待溶解后用pH计调节pH至7.1，将上述溶液装于三角瓶中放在灭菌锅中于121℃灭菌20分钟，待培养基冷却后用接种环沾取1ml短小芽孢杆菌转接到该培养基中，于37℃摇床100rpm振荡培养48hr。
2、制备菌肥
利用双次堆捂发酵的方法制备含有所述短小芽孢杆菌的生物菌肥，双次堆捂发酵的方法为：第一次发酵：以质量百分比计，取50％的泥碳、19％的油枯、10％的花渣、20％的碳氨水以及1％的含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，先混合均匀泥碳、油枯、花渣、碳氨水，加入总体积10％的水，每隔5天进行一次翻堆，堆捂时间为40天；第二次发酵：第一次发酵完成后，加入含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，每隔5天进行一次翻堆，二次发酵时间为15天，堆捂发酵结束后，各项指标达到国家有机肥标准NY525-2011。所述生物菌肥有效活性菌≥0.5亿/g(cfu)。
3、施用底肥
将步骤2所述含有该短小芽孢杆菌的生物菌肥作为底肥施用，每塘施用90克，每亩施用100公斤。
4、浇灌发酵菌液
进行步骤3的同时将步骤1所述的短小芽孢杆菌发酵菌液按照5000倍稀释，用以浇灌烟株。
浇灌烟株的具体方法为：待烟株移栽后浇灌烟株根部，每亩用量为10kg。在烟株生长幼苗期，比较稀疏时采用浇灌，待烟株生长后期，烟叶茂密时采用喷灌。使用喷灌系统喷施在烟株叶面上，叶部以及根部每次喷施均要浸透，每15天喷施1次，每个月喷施2次。
实施例3
1、制备发酵菌液
将固体保存的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)采用改良产芽孢液体培养基进行发酵培养，得到发酵菌液。所述发酵菌液中有效活菌数≥1.0亿/g(cfu)。所述改良产芽孢液体培养基成分如下：葡萄糖1.5％、黄豆饼粉3.0％、蛋白胨0.2％、NaCl0.1％、(NH4)2SO41.0g、CaCO30.6％、MgSO4·7H2O 0.6％、ZnSO4·7H2O 0.02％，CuCl2·2H2O 0.005％，H2O1000m1。
所述液体培养基以及发酵菌液通过以下方法制备：分别称取上述组分并溶于1L蒸馏水中，待溶解后用pH计调节pH至7.2，将上述溶液装于三角瓶中放在灭菌锅中于121℃灭菌20分钟，待培养基冷却后用接种环沾取1ml短小芽孢杆菌转接到该培养基中，于37℃摇床100rpm振荡培养48hr。
2、制备菌肥
利用双次堆捂发酵的方法制备含有所述短小芽孢杆菌的生物菌肥，双次堆捂发酵的方法为：第一次发酵：以质量百分比计，取48％的泥碳、10％的油枯、12％的花渣、25％的碳氨水以及5％的含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，先混合均匀泥碳、油枯、花渣、碳氨水，加入总体积10％的水，每隔5天进行一次翻堆，堆捂时间为40天；第二次发酵：第一次发酵完成后，加入含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，每隔5天进行一次翻堆，二次发酵时间为15天，堆捂发酵结束后，各项指标达到国家有机肥标准NY525-2011。所述生物菌肥有效活性菌≥0.5亿/g(cfu)。
3、施用底肥
将步骤2所述含有该短小芽孢杆菌的生物菌肥作为底肥施用，每塘施用90克，每亩施用100公斤。
4、浇灌发酵菌液
进行步骤3的同时将步骤1所述的短小芽孢杆菌发酵菌液按照5000倍稀释，用以浇灌烟株。
浇灌烟株的具体方法为：待烟株移栽后浇灌烟株根部，每亩用量为10kg。在烟株生长幼苗期，比较稀疏时采用浇灌，待烟株生长后期，烟叶茂密时采用喷灌。使用喷灌系统喷施在烟株叶面上，叶部以及根部每次喷施均要浸透，每15天喷施1次，每个月喷施2次。
实验例
在云南楚雄南华县开展了根结线虫病防效试验，试验品种是云烟87。试验面积为4.5亩，设3个处理和对照组CK，分别为化学药剂处理、淡紫拟青霉处理、本发明方法处理(采用实施例2中所使用的方法)，每个处理0.5亩，每处理重复3次。采烤后对根结线虫病进行调查，结果表明化学农药处理烟草根结线虫病发病率为85.83％，病指为52.77；对照组CK烟草根结线虫病发病率为71.67％，病指为42.03；淡紫拟青霉(生物农药)处理烟草根结线虫病发病率为66.67％，病指为32.06；采用本发明处理后烟草根结线虫病发病率为53.33％，病指为23.25。统计分析结果表明各处理之间差异不显著，但该技术应用效果优于其它处理，见表1。
表1不同处理根结线虫病害调查结果
Claims (7)
1.一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征包括以下步骤：
(1)制备发酵菌液：将固体保存的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)采用改良产芽孢液体培养基进行发酵培养，得到含有短小芽孢杆菌的发酵菌液；
(2)制备菌肥：利用双次堆捂发酵的方法制备含有短小芽孢杆菌的生物菌肥；
(3)施用底肥：将步骤2所述含有该短小芽孢杆菌的生物菌肥作为底肥施用，每塘施用90克，每亩施用100公斤；
(4)浇灌发酵菌液：进行步骤(3)的同时将步骤(1)所述的短小芽孢杆菌发酵菌液按照5000倍稀释，浇灌烟株。
2.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征在于：步骤(1)中发酵菌液中有效活菌数≥1.0亿/g(cfu)。
3.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征在于：步骤(1)中改良产芽孢液体培养基成分如下：葡萄糖1.5％、黄豆饼粉3.0％、蛋白胨0.2％、NaCl0.1％、(NH4)2SO41.0g、CaCO30.6％、MgSO4·7H2O 0.6％、ZnSO4·7H2O 0.02％，CuCl2·2H2O 0.005％，H2O 1000m1。
4.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征在于：步骤(2)中生物菌肥有效活性菌≥0.5亿/g(cfu)。
5.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征在于：步骤(2)中双次堆捂发酵的方法为：第一次发酵：以质量百分比计，取40～50％的泥碳、10～20％的油枯、10～15％的花渣、20～25％的碳氨水以及1～5％的含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，先混合均匀泥碳、油枯、花渣、碳氨水，加入总体积10％的水，每隔5天进行一次翻堆，堆捂时间为40天；第二次发酵：第一次发酵完成后，加入含有短小芽孢杆菌的发酵菌液，每隔5天进行一次翻堆，二次发酵时间为15天，堆捂发酵结束后，各项指标达到国家有机肥标准NY525-2011。
6.根据权利要求1所述的一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征在于：步骤(4)中浇灌烟株的具体方法为：待烟株移栽后浇灌烟株根部，每亩用量为10kg；在烟株生长幼苗期，比较稀疏时采用浇灌，待烟株生长后期，烟叶茂密时采用喷灌，使用喷灌系统喷施在烟株叶面上，叶部以及根部每次喷施均要浸透，每15天喷施1次，每个月喷施2次。
7.根据权利要求3所述的一种微生物菌肥联合该菌发酵液抑制根结线虫的方法，其特征在于：所述液体培养基及发酵菌液通过以下方法制备：分别称取上述组分并溶于1L蒸馏水中，待溶解后用pH计调节pH至6.8～7.2，将上述溶液装于三角瓶中放在灭菌锅中于121℃灭菌20分钟，待培养基冷却后用接种环沾取1ml短小芽孢杆菌转接到该培养基中，于37℃摇床100rpm振荡培养48hr。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190510 |