CN109721510B

CN109721510B - 神经酰胺类似物b及其制备方法、应用

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Publication number: CN109721510B
Application number: CN201811625087.6A
Authority: CN
Inventors: 崔艳丽; 尹利明; 毛旸易; 牟晓洲; 毛建卫
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109721510A

Abstract

新神经酰胺类似物B及其制备方法、应用，属于药物技术领域。本发明一方面提供了一种新神经酰胺类似物B，另一方面提供了该新神经酰胺类似物B的制备方法和应用。本发明的新神经酰胺类似物B的合成条件温和，容易控制，收率适中，易产业化。本发明得到的新神经酰胺类似物B与酶更易结合，不但能抑制肿瘤细胞增殖，还对白血病肿瘤细胞的分化与周期有明显的影响，有利多途径抗肿瘤。

Description

神经酰胺类似物B及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及新神经酰胺类似物B及其制备方法、应用。

背景技术

当前癌症仍以化疗为主要手段。虽说此法能取得一定效果，但因副作用明显，进而导致大部分病患因化疗无效死亡。最近寻找低毒、有效的抗癌先导分子已成为目前的热点。具有生物活性的鞘脂类在调节和影响许多重要的生物进程中的作用越来越明确，这些脂类和癌症发病机理和治疗存在紧密联系。越来越多的研究表明，神经酰胺含量的异常和一些鞘脂代谢过程中的酶的表达与癌症的产生、发展、增值、入侵和转移都有一定的关系，因此使用小分子神经酰胺类似物或神经酰胺代谢酶抑制剂是癌症治疗的新方法。神经酰胺被认为是一种可以抑制肿瘤细胞的脂质。最近的研究发现，放疗和化疗可以诱导细胞内神经酰胺的合成，从而促进细胞凋亡。神经酰胺类似物具有膜渗透性的，其优点在于可以对某一具体区域的癌细胞发起攻击，杀灭区域明确，且不会使健康细胞受到损伤。如C6神经酰胺类似物，通常能够直接激活神经酰胺的作用靶点如神经酰胺活化的蛋白磷酸酶，诱导多种癌症类型的细胞死亡。

诱导分化(Induction of differentiation)是指恶性肿瘤细胞在体内外分化诱导剂作用下，向正常或接近正常细胞方向分化逆转的现象。是未来癌症治疗的新趋势。本发明合成的神经酰胺类似物B，不但能够抑制癌细胞的增殖，还能够诱导白血病细胞向多系分化，调节白血病细胞的细胞周期重新分布。

C6-神经酰胺化学合成存在瓶颈，活性有待提高，为其生物应用造成障碍。所以获得抑制肿瘤细胞增殖多靶点的神经酰胺类似物成为低毒、有效抗癌的方向。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种新神经酰胺类似物B及其制备方法、应用的技术方案。

所述的一种如式（1）所示的新神经酰胺类似物B：

式（1）

式（1）中：

R1为1到18碳的烃基，或烃基末端带卤族，或烃基末端带苯基，R1优选为末端一氯乙基；

R2为C1-C13的烃基，R2链上包括不定位的1-6个双键、或三键、或末端取代基R3，R2优选为C₁₃H₂₇；

A为O，S，CHR3，其中R3为H或烃基，A优选为O(氧)；

B为OR3， SR3，NHR3，其中R3为H或烃基，B优选为OH；

C为OR3， SR3，NHR3，其中R3为H或烃基，C优选为OH；

D为OR3，SR3，NHR3，其中R3为H或烃基，D优选为OH；

式（1）中碳2绝对构型为R，S；碳3绝对构型为R，S；碳2，碳3，碳4构型优选为2S，3R，4R构型；

R3为1-哌啶基；1-吡啶基；1-吡咯基；1-叔胺（1-3碳烃基）。

所述的新神经酰胺类似物B在抑制人源肿瘤细胞增殖药物中的应用。

所述的应用，其特征在于所述的人源肿瘤细胞为白血病细胞、胰腺癌细胞，肠腺癌细胞，优选为人源慢性髓原白血病细胞K562、人源单核细胞白血病细胞SHI-1、人源结直肠癌细胞LS174T、结肠癌细胞SW480、结肠癌细胞SW620、原位胰腺癌细胞BxPC-3、胰腺癌细胞PANC-1和胰腺癌细胞SW1990。

所述的新神经酰胺类似物B在诱导白血病细胞向多系分化药物中的应用。

所述的应用，其特征在于所述的白血病细胞为K562细胞和SHI-1细胞。

所述的新神经酰胺类似物B在调节白血病细胞的细胞周期重新分布药物中的应用。

所述的新神经酰胺类似物B在治疗肿瘤药物中的应用。

所述的新神经酰胺类似物B的制备方法，其特征在于鞘氨醇与异氰酸酯在氯仿溶剂中常温下反应，反应原料鞘氨醇消失后，结束实验，旋转蒸发浓缩，经过硅胶柱层析，获得新神经酰胺类似物B。

所述的制备方法，其特征在于所述的鞘氨醇与异氰酸酯的摩尔比为1:1～1.3。

本发明的有益效果为：

1.新神经酰胺类似物B的合成条件温和，容易控制，收率适中，易产业化。2.新神经酰胺类似物B的结构引入两个氨基，提高其中间的羰基电负性，并且末端引入卤素，使新神经酰胺类似物与酶更易结合。3.新神经酰胺类似物不但能抑制肿瘤细胞增殖，还对白血病肿瘤细胞的分化与周期有明显的影响，有利多途径抗肿瘤。4.新神经酰胺类似物B2抑制白血病细胞表现计量低、在抑制肿瘤细胞的增殖、刺激分化与影响细胞周期等比已知的C6都有优越，显示其具有药物先导分子的特征。5.新神经酰胺类似物B2抑制白血病细胞K562和SHI-1增殖，还能够诱导其分化和调节其细胞周期重新分布。相比较，新神经酰胺类似物B2对白血病细胞K562有一定靶向性。

附图说明

图1为新神经酰胺B1-B4结构以及C6的结构；

图2为新神经酰胺类似物B抑制人源结直肠癌细胞LS174T增殖（纵坐标，%）随浓度变化（横坐标，μM）；

图3为新神经酰胺类似物B抑制人源结肠癌细胞SW480增殖（纵坐标，%）随浓度变化（横坐标，μM）；

图4为新神经酰胺类似物B抑制人源结肠癌细胞SW620增殖（纵坐标，%）随浓度变化（横坐标，μM）；

图5为新神经酰胺类似物B抑制人源原位胰腺腺癌细胞BxPC-3增殖（纵坐标，%）随浓度变化（横坐标，μM）；

图6为新神经酰胺类似物B抑制人源胰腺癌细胞PANC-1增殖（纵坐标，%）随浓度变化（横坐标，μM）；

图7为新神经酰胺类似物B抑制人源胰腺癌细胞SW1990增殖（纵坐标，%）随浓度变化（横坐标，μM）；

图8为B2、C6抑制白血病K562细胞；

图9为B2、C6抑制白血病SHI-1细胞；

图10为B2提高K562细胞分化抗原表达阳性的细胞率；

图11为B2提高SHI-1细胞分化抗原表达阳性的细胞率；

图12为B2、C6调节K562细胞周期重新分布；

图13为B2、C6调节SHI-1细胞周期重新分布。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1

新神经酰胺类似物B合成

1）1克(2S,3R,4R)-2-氨基-1,3,4-十八烷三醇（鞘氨醇B制备参见APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2003, 69(2): 812–819）溶于60毫升氯仿中，40°C溶解，降到室温后，滴加0.432克异氰酸-2-氯乙酯，室温搅拌，薄层层析反应跟踪，反应原料鞘氨醇消失后，结束实验，旋转蒸发浓缩，经过硅胶柱层析，流动相为三氯甲烷/甲醇=20：1，获得新神经酰胺类似物0.959克（B2），白色固体，收率72.3%。经过核磁共振与质谱对其结构鉴定。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N) δ 4.94 (s, 1H), 4.47 (d, J = 20.9 Hz, 2H), 4.28 (s,2H), 3.77 (s, 3H), 2.16 (s, 1H), 1.89 (s, 1H), 1.67 (s, 1H), 1.33 (d, J =65.1 Hz, 20H), 0.87 (t, 3H).¹³C NMR (101 MHz, C₅D₅N) δ159.94, 77.78, 73.57,63.07, 54.74, 45.83, 43.18, 34.92, 32.59, 30.76, 30.58, 30.46, 30.45, 30.39,30.08, 27.04, 23.41, 14.75.

ESI-MS. 423.2990[M]⁺

2）1克 (2S,3R,4R)-2-氨基-1,3,4-十八烷三醇（鞘氨醇B制备参见APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2003, 69(2): 812–819）溶于60毫升氯仿中，40°C溶解，降到室温后，滴加0.291克异氰酸乙酯，室温搅拌，薄层层析反应跟踪，反应原料鞘氨醇消失后，结束实验，旋转蒸发浓缩，经过硅胶柱层析，流动相为三氯甲烷/甲醇=20：1，获得新神经酰胺类似物0.905克（B1），收率74.1%。经过核磁共振与质谱对其结构鉴定。

B1 白色固体。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N) δ 6.84 (dd, J = 71.7, 37.0 Hz,2H), 6.04 (s, 3H), 4.96 (t, J = 16.9 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 10.7, 4.5 Hz,1H), 4.39 (dd, J = 21.5, 16.6 Hz, 1H), 4.31 – 4.15 (m, 2H), 3.58 – 3.37 (m,2H), 2.48 – 2.14 (m, 1H), 1.97 – 1.79 (m, 2H), 1.72 – 1.43 (m, 2H), 1.45 –1.16 (m, 20H), 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).¹³C NMR(101 MHz, C₅D₅N) δ 160.23, 77.94, 73.63, 63.23, 54.92, 35.82, 35.01, 32.59,30.76, 30.57, 30.45, 30.39, 30.08, 27.02, 23.40, 16.50, 14.75.

ESI-MS.389.3381 [M + H]⁺

3）1克 (2S,3R,4R)-2-氨基-1,3,4-十八烷三醇（鞘氨醇B制备参见APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2003, 69(2): 812–819）溶于60毫升氯仿中，40°C溶解，降到室温后，滴加0.406克异氰酸丁酯，室温搅拌，薄层层析反应跟踪，反应原料鞘氨醇消失后，结束实验，旋转蒸发浓缩，经过硅胶柱层析，流动相为三氯甲烷/甲醇=20：1，获得新神经酰胺类似物0.983克（B3），收率75.2%。经过核磁共振与质谱对其结构鉴定。

B3 白色固体。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N) δ 4.81 – 4.37 (m, 3H), 4.29 (s,2H), 3.45 (s, 2H), 2.22 (s, 1H), 1.93 (s, 1H), 1.49 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.43– 1.20 (m, 22H), 0.81 (dd, J = 18.5, 11.1 Hz, 6H).¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N) δ4.93, 4.63, 4.53, 4.43, 4.29, 3.45, 2.22, 1.93, 1.68, 1.50, 1.48, 1.33, 1.27,1.25, 0.85, 0.82, 0.80, 0.78. ESI-MS. 417.3696[M + H]⁺

4）1克(2S,3R,4R)-2-氨基-1,3,4-十八烷三醇（鞘氨醇B制备参见APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2003, 69(2): 812–819）溶于60毫升氯仿中，40°C溶解，降到室温后，滴加0.603克异氰酸苯乙酯，室温搅拌，薄层层析反应跟踪，反应原料鞘氨醇消失后，结束实验，旋转蒸发浓缩，经过硅胶柱层析，流动相为三氯甲烷/甲醇=20：1，获得新神经酰胺类似物0.995克（B4），收率68.0%。经过核磁共振与质谱对其结构鉴定。

B4 白色固体。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N)δ 7.60 – 7.44 (m, 2H), 7.37 (td, J= 14.7, 7.2 Hz, 1H), 7.28 – 7.23 (m, 3H), 7.23 – 7.17 (m, 3H), 6.93 (d, J =9.2 Hz, 1H), 6.08 (d, J = 74.9 Hz, 3H), 5.69 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.45 (d, J= 11.2 Hz, 1H), 5.09 – 4.83 (m, 1H), 4.73 – 4.57 (m, 1H), 4.52 – 4.33 (m,2H), 4.34 – 4.19 (m, 2H), 3.79 – 3.53 (m, 2H), 2.93 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 2.36– 2.13 (m, 1H), 2.02 – 1.53 (m, 2H), 1.52 – 1.08 (m, 19H), 0.96 – 0.76 (m,3H).¹³C NMR (101 MHz, C₅D₅N) δ 160.25, 129.74, 129.30, 129.25, 129.04, 128.89,128.55, 128.31, 126.90, 77.88, 74.12, 73.61, 63.22, 54.79, 42.67, 37.72,34.96, 32.59, 30.78, 30.59, 30.47, 30.45, 30.39, 30.09, 27.05, 23.41, 14.76.

ESI-MS. 465.3696[M + H]⁺

新神经酰胺B1-B4结构以及C6的结构，如图1所示。

实施例2

新神经酰胺类似物B抑制人源胰腺癌细胞，人源肠癌细胞增殖。

生物实验所采用均为人源癌细胞，分别为结直肠癌细胞LS174T、结肠癌细胞SW480、结肠癌细胞SW620；原位胰腺癌细胞BxPC-3、胰腺癌细胞PANC-1、胰腺癌细胞SW1990。培养体系均为DMEM培养液，内含10%的胎牛血清，然后置于37℃、5% CO₂、饱和湿度下培养。含新神经酰胺类似物B（B1、B2、B3、B4）以及对照物C6(购买)用DMSO分别配制成5μM、10μM、15μM、20μM的母液，所有样品均需充分溶解。

（1）选取处于对数生长期的肿瘤细胞制成单细胞悬液，分别接种在不同的96孔平面培养板中，调整细胞数目使一致，每个孔的细胞数为3000个，悬液200μL。

（2）将培养板置于37℃、5% CO₂、饱和湿度下培养24 h，随后分为实验孔、阳性对照孔和空白对照孔。实验孔分别加入体积为2μL的浓度为5μM、10μM、15μM、20μM的样品母液；阳性对照孔为2组，加入同浓度、同体积的C6母液；空白对照孔只加相同体积的DMSO，每组分别设置4个平行孔。

（3）在此环境下继续培养72h，在每孔中分别加入相同体积的配制好的MTT溶液（5mg/mL），继续培养4h，随后，停止反应，小心吸弃上清液，再在每孔中分别加入相同体积的DMSO，待紫蓝色结晶体完全溶解后用酶标仪490nm的波长测出各个孔的吸光度值。

细胞抑制率的计算方法：细胞抑制率＝（1-实验组平均吸光度值／空白对照组平均吸光度值）×100%

不同底物、不同剂量对细胞的增殖活性有不同的影响，不同细胞对同一化合物的敏感性也不完全一致。抑制作用较强的化合物可直接引起培养细胞凋亡坏死而脱壁悬浮。

在图2-7中针对两大类癌细胞，新神经酰胺类似物B系列抑制增殖活性比阳性对照物C6活性强的分别是：B4对人结肠癌细胞SW620抑制（10μM，B4, C6抑制率分别为80%，45%）；B2对人胰腺癌细胞SW1990抑制（20μM，B2, C6抑制率分别为70%，66%）。

分别针对结直肠癌细胞LS174T、结肠癌细胞SW480、结肠癌细胞SW620；原位胰腺癌细胞BxPC-3、胰腺癌细胞PANC-1、胰腺癌细胞SW1990新神经酰胺抑制表现最好的分别为（20μM）：B1（60%抑制率，C6 70%抑制率），B4 (86%抑制率, C6 86%抑制率)，B4 (49%抑制率, C660%抑制率)，B2 （50%抑制率, C6 79%抑制率），B2（70%抑制率, C6 66%抑制率）。

B1，B2与C6对以上癌细胞都表现有普遍抑制增殖，随浓度增加有利抑制作用。

实施例3

新神经酰胺类似物B2抑制人慢性髓原白血病细胞K562，人单核细胞白血病细胞SHI-1增殖。

白血病细胞株的培养

K562和SHI-1白血病细胞分别接种于含10％和15％新生牛血清以及青霉素和链霉素各100U/L的IMDM培养液，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中悬浮培养，每2～3d换液，实验时取对数生长期的细胞。

处理白血病细胞

分别取对数生长期的K562和SHI-1白血病细胞，调整细胞浓度致10⁵/ml，B2和C6终浓度均为10mg/L，分别接种于培养瓶中。上述培养体系置37℃、5％CO₂及饱和湿度的恒温箱中，隔天换液。分别取出细胞，计数并调整细胞浓度为10⁶/ml，备用。

MTT法分析白血病细胞增殖活力

取对数生长K562细胞或SHI-1细胞，调整细胞浓度至10⁸/L，分别加入不同浓度B2和C6，分别接种于96孔培养板，含1×10⁴细胞/200µl/孔，复种6孔。B2和C6终浓度分别为2.5-20µg/ml。上述培养体系置37℃、5％CO₂及饱和湿度的恒温箱中，培养72h后，加入5g/LMTT 20μl，在相同条件下继续孵育4h。离心弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl/孔，微量振荡器振荡5min，使结晶完全溶解，酶标仪检测490nm区的吸光度值（A490），计算各实验组细胞生长的抑制率。该实验重复3次。细胞抑制率(％)＝（对照组吸光度—实验组吸光度）/对照组吸光度×100％。

B2、C6分别处理白血病K562细胞和SHI-1细胞，图8和9显示，随着药物浓度增加，OD值逐渐降低，呈剂量依赖关系。10µg/ml B2对K562细胞的抑制率明显高于10µg/ml C6；10µg/ml B2对SHI-1细胞的抑制率也明显高于10µg/ml C6，表明B2抑制白血病细胞增殖的作用比C6大。另外B2抑制K562细胞的作用大于SHI-1细胞，提示B2对K562细胞具有靶向作用。

实施例4

新神经酰胺类似物B2诱导K562细胞和SHI-1细胞向多系分化。

流式细胞术检测白血病细胞分化相关抗原。

B2、C6处理的白血病细胞7d，取各组细胞分别与白血病细胞分化相关抗体孵育，10⁵/管，避光孵育，4℃，30min。用于检测分化的抗体有：鼠抗人的CD11b-PE和鼠抗人的CD42b-PE。每种抗体设置同型对照。PBS洗涤一次，100μlPBS重悬细胞，采用BeckmanCoulter Navios流式细胞仪检测白血病细胞分化相关抗原阳性细胞的率。

B2、C6诱导白血病细胞分化

10µg/ml B2诱导白血病K562细胞7d，流式细胞术检测粒-单核系分化抗原CD11b和巨核系分化抗原CD42b表达阳性的细胞率。结果显示，10µg/ml的B2明显提高CD11b和CD42b表达阳性的细胞率，分别为22.3±4.21和53.5±13.20，明显高于对照的4.1±0.2和5.3±2.4（P均<0.05），提示B2能够诱导白血病细胞向多系分化（见表1，图10）。

表1 B2提高K562细胞分化抗原表达阳性的细胞率（%）

10µg/ml的B2诱导白血病SHI-1细胞7d，流式细胞术检测单核系分化抗原CD15表达阳性的细胞率。结果显示，10µg/ml的B2处理SHI-1细胞，CD15表达阳性的细胞率为82.4±7.8，高于对照64.8±5.6（P<0.05）（见表2，图11）。

表2 B2提高SHI-1细胞分化抗原表达阳性的细胞率（%）

实施例5

新神经酰胺类似物B2调节K562细胞和SHI-1细胞的细胞周期重新分布。

流式细胞术分析白血病细胞周期。

取对数生长K562和SHI-1细胞，调整细胞浓度至10⁸/L，分别加入不同浓度B2和C6，分别接种于培养瓶，取药物处理的2×10⁵个白血病细胞，冷PBS洗涤一次，离心去上清，加入0.5ml含PI和RNAase A的DNA染液，室温避光孵育30min，采用Beckman Coulter Navios流式细胞仪分析白血病细胞DNA含量，以PI荧光强度为横坐标，以细胞数量为纵坐标绘制曲线图，调整G0/1期、S期和G2/M期细胞位置，排除粘连细胞后分析目的细胞DNA表达情况。使用multicycle 软件分析，并计算亚二倍体峰的百分率，同时计算细胞增殖指数＝（S+G2/M）/（G0/G1＋S+G2/M）。

B2、C6分别处理K562细胞（见表3，图12）和SHI-1细胞（见表4，图13），G2/M期细胞的比例显著高于对照组，同时S期细胞比例也有升高。表明B2、C6能够调节细胞周期重新分布，G2/M期细胞比例明显增多，提示细胞周期阻滞在G2/M期。

表3 B2、C6调节K562细胞的细胞周期重新分布

与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

表4 B2、C6调节SHI-1细胞的细胞周期重新分布

与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

B2能够抑制白血病细胞增殖，还能够诱导白血病细胞分化和调节细胞周期重新分布。在这三个方面都比阳性C6对照物表现突出。

以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

项目资助：国家自然科学基金30870553；国家国际科技合作项目2010DFA34370；浙江省国际科技合作专项2013C14012；浙江省自然科学基金LQY18B060002。

Claims

1.一种如式（1）所示的神经酰胺类似物B1-B4：

。

2.如权利要求1所述的神经酰胺类似物B1-B4在制备抑制人源肿瘤细胞增殖药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的人源肿瘤细胞为白血病细胞、胰腺癌细胞，肠癌细胞。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的人源肿瘤细胞为人源慢性髓原白血病细胞K562、人源单核细胞白血病细胞SHI-1、人源结直肠癌细胞LS174T、结肠癌细胞SW480、结肠癌细胞SW620、原位胰腺癌细胞BxPC-3、胰腺癌细胞PANC-1和胰腺癌细胞SW1990。

5.如权利要求1所述的神经酰胺类似物B1-B4在制备诱导白血病细胞向多系分化药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的白血病细胞为K562细胞和SHI-1细胞。

7.如权利要求1所述的神经酰胺类似物B1-B4在制备调节白血病细胞的细胞周期重新分布药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的白血病细胞为K562细胞和SHI-1细胞。

9.如权利要求1所述的神经酰胺类似物B1-B4在制备治疗肿瘤药物中的应用。