CN109715174A - 用于t细胞免疫治疗的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

公开了用于治疗诸如癌症和感染性疾病等疾病的遗传修饰的组合物，诸如腺病毒载体和T细胞。还公开了制备和使用所述遗传修饰的组合物治疗诸如癌症和感染性疾病等疾病的方法。

Description

用于T细胞免疫治疗的方法和组合物

交叉引用

本申请要求于2016年1月15日提交的美国临时专利申请号62/279,275的权益，该临时专利申请的全文通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及基于T细胞的免疫治疗和在免疫治疗如癌症治疗中使用该治疗的方法。

背景技术

使用T细胞作为抗癌治疗剂是基于肿瘤特异性细胞可以被生成和离体扩充并重新注入患者体内的前提，Wang,X和Riviere,I,Cancer Gene Ther.,2015,22,85-94。嵌合抗原受体(CAR)是抗原的重组受体，其在单个分子中重新定向T细胞和其他免疫细胞的特异性和功能。它们在癌症免疫治疗中使用的一般前提是快速生成靶向肿瘤的T细胞，绕过主动免疫的障碍。一旦在细胞中表达，CAR修饰的T细胞就可以在患者中发挥即时和长期的作用。

逆转录病毒和慢病毒仍然是T细胞中CAR转导的主要机制。尽管在早期基因治疗试验中观察到与干细胞中的插入诱变相关的严重并发症，但逆转录病毒已广泛用于终末分化的T细胞而没有这样的并发症。然而，最初的数据表明，与T细胞的较为分化的对应物相比，较不成熟的T细胞或中枢记忆T细胞更可能在患者中增殖并持续更长时间。与逆转录病毒和慢病毒不同，腺病毒基因组在染色体外维持，因此绕过宿主基因组的插入位点依赖性作用，并将腺病毒转导的益处扩展到T细胞治疗平台。本发明的目的是解决安全递送转基因的需求而没有向原代细胞中插入诱变的风险。

援引并入

此处的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在本文的术语与并入的参考文献中的术语之间有冲突的情况下，以本文的术语为准。

发明内容

在多个方面，本发明提供了一种细胞，其包含：(a)至少一种工程化受体；以及(b)至少一个染色体外腺病毒基因组；其中所述腺病毒基因组在腺病毒基因区域中具有至少一个缺失并编码所述工程化受体。

在一些方面，所述工程化受体为嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)或其衍生物。在其他方面，所述工程化受体为嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，所述CAR为第一代CAR。在其他方面，所述CAR为第二代CAR。在又一个方面，所述CAR为第三代CAR。

在一些方面，所述CAR包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分。在一些方面，所述细胞内部分包含至少一个T细胞共刺激结构域。在一些方面，所述T细胞共刺激结构域选自CD27、CD28、TNFRS9(4-1BB)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF8(CD30)、CD40LG(CD40L)、ICOS、ITGB2(LFA-1)、CD2、CD7、KLRC2(NKG2C)、TNFRS18(GITR)、TNFRSF14(HVEM)或其任意组合。

在一些方面，所述工程化受体结合靶标。在一些方面，所述结合是不依赖MHC的。

在其他方面，所述结合是依赖MHC的。在一些方面，所述结合对疾病相关靶标是特异性的。在一些方面，所述疾病为癌症。在进一步的方面，所述癌症为实体瘤。在其他方面，所述癌症为液体瘤。

在一些方面，所述受体结合靶抗原。在一些方面，所述靶抗原为肿瘤细胞新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、促分裂原或其组合。

在进一步的方面，所述靶抗原选自癌胚抗原(CEA)、人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、人乳头瘤病毒(HPV)、粘蛋白1(MUC1)、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、Brachyury、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、BRCA1、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα或TEL/AML1，或其修饰变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂或组合。

在一些方面，所述受体结合肿瘤相关细胞。在一些方面，所述肿瘤相关细胞选自成纤维细胞、癌症干细胞、周细胞和基质细胞。

在进一步的方面，所述细胞还包含次级受体。在一些方面，所述次级受体为柯萨奇腺病毒受体。在一些方面，所述染色体外腺病毒基因组为腺病毒血清型5(Ad5)。

在一些方面，所述腺病毒基因区域中的缺失为早期区域1(E1)基因区域中的缺失、早期区域2b(E2b)基因中的缺失、早期区域3(E3)基因中的缺失或其组合。在一些方面，所述腺病毒基因区域中的缺失为早期区域2b(E2b)基因区域中的缺失。在一些方面，所述腺病毒基因区域中的缺失为早期区域1(E1)基因、早期区域2b(E2b)基因和早期区域3(E3)基因中的缺失。

在进一步的方面，所述细胞还包含外源基因。在一些方面，所述外源基因选自自杀基因、细胞因子基因、抗血管生成基因、代谢基因或缺氧基因。在一些方面，所述细胞还包含内源基因缺失。

在一些方面，所述细胞为免疫细胞。在一些方面，所述免疫细胞为T细胞。在其他方面，所述T细胞为效应(T_EFF)细胞、效应记忆(T_EM)细胞、中枢记忆(T_CM)细胞、T记忆干(T_SCM)细胞、幼稚(T_N)细胞或者CD4+或CD8+细胞。在一些方面，所述细胞为灵长类动物细胞。在进一步的方面，所述细胞为人细胞。

在一些方面，所述细胞离体扩充。在一些方面，所述细胞被配制为药物组合物。在一些方面，所述细胞是用于治疗有需要的受试者的联合治疗的一部分。在一些方面，所述工程化受体被整合到有需要的受试者的基因组中。

在多个方面，本发明提供了制备细胞的方法，其包括使细胞与包含至少一种外源受体序列的至少一种工程化染色体外载体离体接触。在一些方面，所述染色体外载体为腺病毒载体。在一些方面，所述腺病毒载体为腺病毒血清型5(Ad5)。在一些方面，所述载体具有至少一个基因缺失。

在一些方面，所述缺失为早期区域1(E1)基因和早期区域3(E3)基因的区域中的缺失。在一些方面，所述缺失为早期区域2b(E2b)基因中的缺失、早期区域3(E3)基因中的缺失或其组合。在其他方面，所述载体包含早期区域1(E1)基因、早期区域2b(E2b)基因和早期区域3(E3)基因中的缺失。

在一些方面，所述载体不是无内容载体。在进一步的方面，所述方法还包括在所述外源受体之前引入至少一种次级受体。在一些方面，所述次级受体为柯萨奇腺病毒受体。在一些方面，所述外源受体序列选自嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)或其衍生物。

在其他方面，所述外源受体序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，所述载体还包含第二外源基因序列。在一些方面，所述外源基因序列选自自杀基因、细胞因子基因、抗血管生成基因、代谢基因和缺氧基因。

在一些方面，所述第二外源基因序列包含诱导型自杀基因序列。在进一步的方面，所述诱导型自杀基因序列为诱导型胱天蛋白酶9基因序列或EGF受体R序列的一部分。

在一些方面，所述外源受体序列经由至少一种载体被引入所述细胞内。在一些方面，所述细胞被离体活化。在其他方面，所述活化发生于引入所述外源受体序列之前。在一些方面，所述活化是用抗CD3(OKT3)、抗CD28、至少一种细胞因子或其任意组合进行的。

在进一步的方面，所述细胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、白介素-21(IL-21)或其任意组合。

在一些方面，所述方法还包括扩充所述细胞。在一些方面，所述细胞对于有需要的受试者而言是自体的。在其他方面，所述细胞对于有需要的受试者而言是同种异体的。在一些方面，所述有需要的受试者具有针对所述腺病毒载体的预先存在的免疫力。

在一些方面，所述细胞是与优质生产规范(GMP)相容的试剂。在一些方面，所述试剂是用于治疗癌症的联合治疗的一部分。

在多个方面，本发明提供了药物组合物，其包含以上描述中的任一项的细胞或根据以上所述的任一方法制备的细胞。

在多个方面，本发明提供了治疗有需要的受试者中的病况的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的以上所述的药物组合物。在一些方面，静脉内施用所述药物组合物。在其他方面，所述药物组合物局部施用于肿瘤。在一些方面，所述方法还包括施用一种或多种额外的治疗剂或用一种或多种额外的疗法治疗所述受试者。

在一些方面，所述用一种或多种额外的疗法治疗所述受试者包括移植。在其他方面，所述用一种或多种额外的疗法治疗所述受试者包括免疫治疗。在一些方面，所述药物组合物对于所述受试者而言是自体的。在其他方面，所述药物组合物对于所述受试者而言是同种异体的。

在一些方面，所述方法还包括向所述受试者施用包含工程化天然杀伤(NK)细胞群体的药物组合物。在一些方面，所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制受体)表达的NK细胞、一种或多种已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞和一种或多种已被修饰以表达一种或多种CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞或其任意组合。在一些方面，所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰为基本上缺乏KIR表达的NK细胞。

在其他方面，所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。在一些方面，所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰以表达一种或多种CAR的NK细胞。在一些方面，所述CAR为肿瘤新抗原、肿瘤新表位、HPV、PSA、PSMA、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER1、HER2/neu、HER3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任意组合的CAR。

在本文所述方法和/或组合物的上下文中所讨论的实施方案可用于本文所述的任何其他方法或组合物。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可应用于其他方法和组合物。

其他目标、特征和优点根据以下详细描述将会变得显而易见。然而，应当理解的是，该详细描述和具体实施例尽管说明了特定实施方案，但仅以说明性方式给出，基于该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言将会变得显而易见。

附图说明

图1示出了所提出的制备和生产嵌合抗原受体(CAR)T细胞和CAR自然杀伤(NK)细胞的示意图。

图1A示出了所提出的使用Ad5[E1-，E2b-]平台制备和生产CAR T细胞的示意图。T细胞选自经洗涤的单采血液成分术收集的患者产物，并使用CD3/28Dynabeads和ClinExVivo磁性颗粒集中仪(MPC)活化。用基于CAR Ad5[E1-，E2b-]的载体来转导活化的T细胞。转导的CAR T细胞在细胞生物反应器中扩充。使用MPC从细胞中去除CD3/28Dynabeads。在该过程结束时，配制CAR T细胞以供输注。

图1B示出了所提出的使用Ad5[E1-，E2b-]平台制备和生产CAR NK细胞的示意图。用基于CAR Ad5[E1-，E2b-]的载体来转导活化的NK细胞。转导的CAR-NK细胞在细胞生物反应器中扩充。在该过程结束时，配制CAR-NK细胞以供输注。

图2示出了经基于CAR的Ad5[E1-，E2b-]平台转染后CAR T细胞表达的表示，嵌合抗原受体(CAR)由三个区域组成，每个区域均显示出功能。CAR的细胞外区域通常由单链可变区片段(scFv)组成。其靶标衍生自特别构建的抗体的融合可变重链和轻链。CAR的跨膜区域通过“间隔区”与scFv连接，并提供细胞外抗体部分的柔性和稳定表达。CAR的细胞内信号传导结构域通常衍生自T细胞受体(TCR)-CD3复合物的CD3ζ链，其介导CAR T细胞的活化。

图3示出了用于插入Ad5[E1-，E2b-]平台中的各种CAR载体的示意图。

图3A示出了含有CD3-ζ信号传导结构域的第一代CAR。

图3B示出了两种可能的第二代CAR，其编码CD28和CD3ζ信号传导结构域，以及编码4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的第二载体。

图3C示出了两种可能的第三代CAR，其编码CD28、4-1BB和CD3ζ，以及编码CD28、OX40和CD3ζ的第二CAR。

图3D示出了编码胱天蛋白酶-9自杀基因和第三代CAR的多顺反子CAR。

具体实施方式

如本文所用，除非另有说明，否则冠词“一个”意指一个或多个，除非另有明确规定。如本文所用，除非另有说明，否则诸如“含有”、“含”、“包括”等术语意指“包含”。如本文所用，除非另有说明，否则术语“或”可以是结合性的或分离性的。如本文所用，除非另有说明，否则任何实施方案可与任何其他实施方案相组合。如本文所用的短语“至少一个”可意指“至少一个”或“多个”。

如本文所用，除非另有说明，否则本文的一些发明实施方案涉及数值范围。本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值，如同明确写出的那样。例如，范围的描述如1至6应被视为具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何这均适用。当范围存在时，该范围包括范围端点或由此衍生的任何范围。

如本文所用的术语“活化”及其语法等同语可指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可包括对抗原的应答、迁移和/或表型或遗传变化至功能活性状态。例如，术语“活化”可指T细胞活化的逐步过程。例如，T细胞可能需要至少两个信号以变得完全活化。第一信号可在TCR被抗原-MHC复合物接合后出现，而第二信号可通过共刺激分子(例如，表2中所示的共刺激分子)的参与而出现。在体外，抗CD3可模拟第一信号，抗CD28可模拟第二信号。例如，工程化T细胞可被表达的CAR活化。如本文所用，“T细胞活化”或“T细胞触发”可指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞状态。

术语“腺病毒”或“Ad”是指来自腺病毒科的一组无包膜DNA病毒。除人类宿主之外，这些病毒还可见于但不限于禽类、牛、猪和犬的物种中。某些方面考虑使用来自腺病毒科(例如，禽腺病毒属(Aviadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、腺嘌呤-胸腺嘧啶富集性腺病毒属(Atadenovirus)和唾液酸酶同源性腺病毒属(Siadenovirus))这四个属中的任何属的任何腺病毒作为E2b缺失型病毒载体或含有本文所述其他缺失的载体的基础。此外，在各个物种中均发现了数种血清型。Ad还涉及这些病毒血清型中任一种的遗传衍生物，包括但不限于同源或异源DNA序列的遗传突变、缺失或者转座。

如本文所用的术语“抗原”或“Ag”及其语法等同语可指引起免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将会理解，包括几乎所有蛋白质或肽在内的任何大分子都可用作抗原。如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”可指起抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为嵌合抗原受体或抗原受体。这类蛋白质中包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE，其中IgG是最常见的循环抗体。它是凝集、补体结合和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面很重要。例如，肿瘤细胞抗原可被CAR识别。

如本文所用的术语“自体的”及其语法等同语可指来源于同一生物。例如，样品(例如，细胞)可经移除、处理，并在稍后的时间返回给同一受试者(例如，患者)。自体过程不同于同种异体过程，其中供体和接受者是不同的受试者。

“辅助腺病毒”或“辅助病毒”是指可提供特定宿主细胞不能提供(该宿主可提供Ad基因产物如E1蛋白)的病毒功能的Ad。该病毒用于以反式方式提供第二种病毒或辅助依赖性病毒(例如，无内容(gutted)或无内容物(gutless)病毒，或特定区域如E2b或如本文所述的其他区域缺失的病毒)所缺乏的功能(例如，蛋白质)；第一个复制缺陷型病毒被认为“帮助”第二个辅助依赖性病毒，从而允许细胞中第二个病毒基因组的产生。

如本文所用的术语“5型腺病毒空壳(adenovirus 5null)(Ad5-空壳(Ad5-null))”是指不包含用于表达的任何异源核酸序列的非复制型Ad。

如本文所用的术语“第一代腺病毒”是指具有早期区域1(E1)缺失的Ad。在另外的情况下，非必要的早期区域3(E3)也可能缺失。

如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化分子，其在被T细胞表达时，重定向T细胞以用人工受体指示的特异性杀死靶细胞。最常见的是，CAR的细胞外结合结构域衍生自鼠、人源化的或完全人类的单克隆抗体。

如本文所用的术语“表位”及其语法等同语可指可被抗体、B细胞、T细胞或工程化细胞识别的抗原的一部分。例如，表位可以是被TCR识别的癌症表位。还可识别抗原内的多个表位。表位还可发生突变。

如本文所用的术语“工程化”及其语法等同语可指核酸(例如，生物体基因组内的核酸)的一种或多种改变。术语“工程化”可指基因的改变、添加和/或缺失。工程化细胞还可指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。

如本文使用的术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法等同语可指人或非人动物来源的细胞。在某些方面，工程化细胞还可指CAR表达细胞。

如本文所用的术语“优质生产规范”(GMP)及其语法等同语可指根据FDA的安全、有效或纯的产品。GMP有时也可称为“cGMP”。“c”代表“当前”。产品制造商可采用最新的技术和系统，以遵守GMP产品的法规。GMP相容性产品可用于与研究环境相反的临床环境。

如本文所用的术语“无内容(Gutted)”或“无内容物(gutless)”是指所有的病毒编码区均缺失的Ad载体。

如本文所用的术语“转染”是指将外来核酸引入真核细胞中。转染可由本领域已知的多种手段来完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物射弹术(biolistics)。

术语“稳定的转染”或“稳定转染的”是指将外来核酸、DNA或RNA引入并整合到被转染细胞的基因组中。术语“稳定的转染子”是指已将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。

术语“报告基因”表示编码报告分子(包括酶)的核苷酸序列。“报告分子”可在多种检测系统中的任一种中检测，该检测系统包括但不限于基于酶的检测分析(例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。在一个实施方案中，可采用大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶基因(可从Pharmacia Biotech,Pistacataway,N.J.获得)、绿色荧光蛋白(GFP)基因(可从Clontech,Palo Alto,Calif.商购获得)、人胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因或本领域已知的其他报告基因。

如本文所用的术语“编码核酸分子”、“编码DNA序列”和“编码DNA”是指脱氧核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了氨基酸沿着多肽(蛋白质)链的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。

如本文所用的术语“异源核酸序列”是指与核酸序列连接或被操作以变成与该核酸序列连接的核苷酸序列，该核苷酸序列本质上不与该核酸序列连接或本质上在不同位置处与该核酸序列连接。异源核酸可包括在其被引入的细胞中天然可见的核苷酸序列，或者异源核酸可含有相对于天然存在的序列的一些修饰。

术语“转基因”是指被引入到测试受试者的细胞或基因组中的任何基因编码区(天然或异源的核酸序列或者融合的同源或异源核酸序列)。在本发明中，转基因被携带在用于将转基因引入受试者的细胞中的任何病毒载体上。

如本文所用的术语“第二代腺病毒”是指具有E1、E2、E3的全部或部分的Ad，并且在某些实施方案中，从该病毒中删除(去除)E4 DNA基因序列。

如本文所用的术语“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋类动物。受试者包括但不限于人类、非人灵长类动物(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何类型的家禽。

如本文所用的术语“外周血淋巴细胞”(PBL)及其语法等同语可指在血液(例如，外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可指并非定位于器官的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可包含T细胞、NK细胞、B细胞或其任意组合。

如本文使用的术语“接受者”及其语法等同语可指人或非人动物。接受者也可以是有需要者。

如本文所用的术语“T细胞”及其语法等同语可指来自任何来源的T细胞。例如，T细胞可以是原代T细胞，例如，自体T细胞、细胞系等。T细胞也可以是人或非人的。

如本文所用的术语“T细胞活化”或“T细胞触发”及其语法等同语可指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞状态。在本发明的背景下，“完全T细胞活化”类似于触发T细胞的细胞毒性。可以使用本领域已知的各种测定来测量T细胞活化。测定可以是用于测量细胞因子分泌的ELISA、ELISPOT、用于测量细胞内细胞因子表达(CD107)的流式细胞术测定、用于测量增殖的流式细胞术测定和用于确定靶细胞消除的细胞毒性测定(51Cr释放测定)。测定通常使用对照(非工程化细胞)以与工程化细胞(CAR T)进行比较来确定工程化细胞相比于与对照的相对活化。另外，测定可比较与不表达靶抗原的靶细胞一起温育或接触的工程化细胞。例如，可比较与不表达CD19的靶细胞一起温育的CD19-CAR T细胞。

如本文所用的术语“序列”及其语法等同语可指核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线性的、环状的或分支的；并且可以是单链或双链的。序列可以是突变的。序列可具有任何长度，例如，长度为2至1,000,000个或更多个核苷酸(或其间或之上的任何整数值)，例如，约100个至约10,000个核苷酸或约200个至约500个核苷酸。

组合物和方法

本文公开了可用于遗传修饰细胞和核酸以供治疗应用的组合物和方法。全文描述的组合物和方法可使用核酸介导的遗传工程过程来进行肿瘤特异性CAR表达。有效的基于过继细胞转移的免疫治疗(ACT)可用于治疗癌症(例如，转移性癌症)患者。例如，自体外周血淋巴细胞(PBL)可使用非病毒或病毒方法来修饰以表达识别癌细胞上的独特抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并且可用于所公开的组合物和方法中。某些方面针对使用人或人源化嵌合抗原受体的免疫治疗(包括但不限于癌症)的组合物和方法(图1)。该嵌合抗原受体利用人或人源化嵌合抗原受体构建体。该人或人源化嵌合抗原受体可与CD8或CD28跨膜部分或其功能等同物，以及与共刺激结构域融合的控制T细胞活化的信号传导区进行组合。

细胞可在维持其免疫原和抗肿瘤效力的条件下生长和扩充，并且可进一步施用于患者以进行癌症治疗。细胞也可以在一经施用于患者即可改善其性能的条件下生长和扩充。可选择细胞。例如，在细胞扩充和工程化之前，可通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可从许多非限制性来源获得，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。例如，可使用任何T细胞系。或者，细胞可源自健康供体，源自诊断为患有癌症的患者，或源自诊断为患有感染的患者。在另一个实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特性的混合细胞群体的一部分。还可根据前述方法从转化的T细胞获得细胞系。还可从细胞治疗库获得细胞。可通过本文所述的任何方法获得对免疫抑制治疗具有抗性的修饰细胞。还可在修饰前选择期望的细胞群体。还可在修饰后选择工程化细胞群体。工程化细胞可用于自体移植。或者，细胞可用于同种异体移植。在一些情形下，将细胞施用于其样品被用于鉴定癌症相关靶序列的同一患者。在其他情形下，将细胞施用于与其样品被用于鉴定癌症相关靶序列的患者不同的患者。

可将一种或多种细胞因子引入细胞内。细胞因子可用于增加转移的细胞(包括过继转移的肿瘤特异性细胞)以在肿瘤微环境内扩充。在一些情况下，IL-2可用于促进本文所述细胞的扩充。还可采用细胞因子如IL-15。还可使用免疫治疗领域中的其他相关细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12和L-21，或其任意组合。在一些情况下，使用重组细胞因子。

这些组合物和方法可提供具有许多优点的癌症疗法。在具体方面，本文可提供修饰T细胞以使细胞基本上不依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的存在或活性的方法。

在进一步的方面，本文可提供编码工程化嵌合抗原受体的本文所述的多核酸。

在更进一步的方面，本文可提供制备细胞的方法。

在某一方面，本文可提供使用本文所述细胞治疗有需要的患者的方法。

细胞工程化

编码转基因序列的核酸(例如，DNA)可随机插入细胞的染色体中。随机整合可由将核酸(例如，DNA)引入细胞中的任何方法产生。例如，所述方法可以是但不限于电穿孔，声孔效应，基因枪的使用，脂质转染，磷酸钙转染，树状聚体的使用，显微注射，以及包括腺病毒、AAV和逆转录病毒载体在内的病毒载体的使用，和/或II族核酶。

编码转基因的DNA还可设计成包含报告基因，以便可经由报告基因的活化来检测转基因或其表达产物的存在。可使用任何报告基因，如上文公开的那些。通过在细胞培养物中选择其中报告基因已被激活的细胞，可选择含有转基因的细胞。

待插入的转基因的两侧可以是与基因组中的靶向双链断裂位点类似的工程化位点，以便从多核酸切除转基因，从而可以将其插入双链断裂区域。

可经由电穿孔将编码转基因的DNA引入细胞中。还可经由脂质转染、感染或转化将DNA引入细胞中。电穿孔和/或脂质转染可用于转染原代细胞。电穿孔和/或脂质转染可用于转染原代造血细胞。还可在不使用同源重组的情况下将DNA引入细胞基因组中。在一些情况下，DNA的两侧可以是与基因组中的靶向双链断裂区域互补的工程化位点。在一些情况下，可从多核酸切除DNA，使得其可在无同源重组的情况下插入双链断裂区域。

可通过表达测定(例如qPCR)或通过测量RNA水平来验证CAR的表达。表达水平还可指示拷贝数。例如，如果表达水平非常高，则这可指示CAR的多于一个拷贝整合到基因组中。或者，高表达可指示转基因整合于高转录区域中，例如，在高度表达的启动子附近。还可通过测量蛋白质水平如通过Western印迹法来验证表达。

在一些情况下，包含编码免疫球蛋白α链和β链的核酸的转基因构建体与包含信号传导复合物的单独的转基因构建体共表达。在一些情况下，免疫球蛋白转基因和信号传导复合物转基因可存在于同一表达载体上。在一些情况下，免疫球蛋白转基因和信号传导复合物转基因可存在于不同的表达载体上。在后一种情况下，可将两种表达载体同时或依次引入细胞。在一些情况下，在引入载体之前激活细胞。在一些情况下，使用抗CD3和抗CD28激活细胞。在一些情况下，还使用细胞因子激活细胞。

在一些情况下，可使用两种不同的方法引入编码包含CAR和信号传导复合物的转基因的载体。在一些情况下，一种载体以病毒方式引入，另一种以非病毒方式引入。在一些情况下，随机引入一种载体，并使用靶向技术引入第二种。在一些情况下，载体可修复基因组中的双链断裂。

转基因可用于以比没有转基因的情况下更高的水平表达(例如过表达)内源基因。另外，转基因可用于以比背景(即，未用转基因转染的细胞)更高的水平表达外源基因。转基因还可包括其他类型的基因，例如，显性失活基因。

可以以产生转基因产物的方式将转基因置于生物体、细胞、组织或器官中。多核酸可包含转基因。

T细胞可包含一种或多种转基因。一种或多种转基因可表达CAR蛋白，该CAR蛋白识别并结合抗原上的至少一个表位(例如，癌症表位)或结合抗原上的突变表位。CAR可以是功能性CAR。T细胞还可包含一个或多个CAR。T细胞还可包含单一CAR和次级工程化受体。

本发明的功能性CAR蛋白可针对任何呈递的表位。本发明的功能性CAR融合蛋白还可具有基于肽或肽指导的功能以靶向抗原。本发明的功能性CAR可进行连接，例如，本发明的功能性TCR可与2A序列连接。本发明的功能性CAR也可与2A序列连接。本发明的功能性CAR还可含有哺乳动物组分。例如，本发明的功能性CAR可包含小鼠恒定区。在一些情况下，本发明的功能性CAR还可包含人恒定区。肽指导的功能原则上可通过将肽序列引入CAR中并通过用这些肽序列靶向肿瘤来实现。这些肽可来源于噬菌体展示或合成肽文库(参见例如，Arap,W.等人,“Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculaturein a Mouse Model,”Science,279,377-380(1998)；Scott,C.P.等人,“Structuralrequirements for the biosynthesis of backbone cyclic peptide libraries,”8:801–815(2001))。尤其是，对乳腺癌、前列腺癌和结肠癌具有特异性的肽以及对新脉管系统具有特异性的肽已被成功分离并可以使用(Samoylova,T.I.等人,“Peptide PhageDisplay:Opportunities for Development of Personalized Anti-CancerStrategies,”Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry,6(1):9-17(9)(2006))。本发明的功能性CAR蛋白可针对突变的癌表位或突变的癌抗原。

可使用并且具体考虑的转基因可包括与本文公开的基因例如CAR基因表现出某种同一性和/或同源性的那些基因。因此，设想如果基因表现出至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性(在核酸或蛋白质水平)，其可用作转基因。还设想表现出至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(在核酸或蛋白质水平)的基因可用作转基因。在一些情况下，所述转基因可以是功能性的。

转基因可并入细胞中。例如，转基因可并入生物体的种系中。当插入细胞中时，转基因可以是互补DNA(cDNA)区段(其为信使RNA(mRNA)的拷贝)或位于其基因组DNA的原始区域(含有或不含内含子)的基因本身。蛋白X的转基因可指包含编码蛋白X的核苷酸序列的转基因。如本文所用，在一些情况下，编码蛋白X的转基因可以是编码蛋白X的100％或约100％的氨基酸序列的转基因。在其他情况下，编码蛋白X的转基因可以是编码蛋白X的至少或至少约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的氨基酸序列的转基因。转基因的表达可最终产生功能性蛋白质，例如，部分、完全或过度功能性蛋白质。如上所讨论的，如果表达部分序列，则最终结果可以是非功能性蛋白质或显性失活蛋白质。非功能性蛋白质或显性失活蛋白质还可与功能性(内源或外源)蛋白质竞争。转基因还可编码RNA(例如，mRNA、shRNA、siRNA或微小RNA)。在一些情况下，当转基因编码mRNA时，这转而可被翻译成多肽(例如，蛋白质)。因此，预计转基因可编码蛋白质。在一些情形下，转基因可编码蛋白质或蛋白质的一部分。此外，与野生型多肽相比，蛋白质可具有一个或多个突变(例如，缺失、插入、氨基酸置换或重排)。蛋白质可以是天然多肽或人工多肽(例如，重组多肽)。转基因可编码由两个或更多个多肽形成的融合蛋白。T细胞可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个转基因。例如，T细胞可包含一个或多个包含CAR基因的转基因。

T细胞可包含一个或多个被中断的基因和一个或多个转基因。例如，一个或多个其表达被中断的基因可包括CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA和/或其任意组合中的任一个。例如，仅为了说明各种组合，一个或多个其表达被中断的基因可包括PD-1，并且一个或多个转基因包括TCR。在另一个实例中，一个或多个其表达被中断的基因还可包括CTLA-4，并且一个或多个转基因包括TCR。

T细胞可包含一个或多个被抑制的基因和一个或多个转基因。例如，一个或多个表达被抑制的基因可包括CD27、CD40、CD122、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA和/或其任意组合中的任一个。例如，仅为了说明各种组合，一个或多个其表达被抑制的基因可包括PD-1，并且一个或多个转基因包括CAR。在另一个实例中，一个或多个其表达被抑制的基因还可包括CTLA-4，并且一个或多个转基因可包括任意工程化受体。

转基因可以是自杀基因。如在癌症患者中的许多有效治疗中所证实的，响应于CART的目标肿瘤消退可伴有毒性。在一些情况下，当靶向抗原在肿瘤与正常组织之间共享时，CAR T细胞可能无法区分肿瘤与正常组织(“中靶/脱靶”毒性)。在其他情况下，可发生免疫系统的全身性扰动，其被称为细胞因子释放综合征(CRS)。CRS可包括全身性炎性反应综合征或细胞因子风暴，这可能是CAR T细胞的快速体内扩充的结果。CRS是一种以发热和低血压为特征的病况，其在严重的情况下可导致多器官衰竭。在一些情况下，毒性可与输注的CAR T细胞的体内扩充相关，其可引起免疫系统的普遍扰动，并释放高水平的促炎性细胞因子，如TNFα和IL-6。

在一些情况下，可生成靶向与正常组织共享的抗原的CAR T细胞，使得它们例如在编码受体的mRNA的电穿孔后瞬时表达CAR。此外，对于通过包括安全性开关(safetyswitch)来进一步工程化CAR T细胞进行了巨大努力，这些安全性开关可允许在严重中靶毒性的情况下显著消除CAR T细胞。可使用其中CAR与安全性开关组合的载体，该安全性开关例如是诱导型胱天蛋白酶-9基因(由二聚化的化学诱导剂激活)或截短形式的EGF受体R(由单克隆抗体西妥昔单抗激活)。

CAR T细胞可编码自杀基因转基因。转基因还可包括CAR受体或另一种相似受体。自杀基因可诱导CAR T细胞的消除。自杀基因可以是诱导CAR T细胞凋亡的任何基因。可将自杀基因与CAR一起在腺病毒载体转基因内进行编码。

一个或多个转基因可来自不同的物种。例如，一个或多个转基因可包括人基因、小鼠基因、大鼠基因、猪基因、牛基因、狗基因、猫基因、猴基因、黑猩猩基因或其任意组合。例如，转基因可来自人类，其具有人类基因序列。一个或多个转基因可包括人类基因。在一些情况下，一个或多个转基因不是腺病毒基因。

如上所述，转基因可以以随机或位点特异性方式插入T细胞的基因组中。例如，转基因可插入T细胞基因组中的随机基因座中。这些转基因可以是功能性的，例如，如果插入基因组中的任何位置，则这些转基因是全功能性的。例如，转基因可编码其自身的启动子，或者可插入其处于内源启动子控制下的位置中。或者，转基因可插入基因中，如基因的内含子或基因的外显子、启动子或非编码区。可插入转基因使得该插入中断基因，例如内源性免疫检查点。

有时，转基因的多于一个拷贝可插入基因组中的多于一个随机基因座中。例如，多个拷贝可插入基因组中的随机基因座中。与转基因随机插入一次相比，这可导致整体表达增加。或者，转基因的一个拷贝可插入基因中，且转基因的另一个拷贝可插入不同的基因中。转基因可被靶向，以使其可插入T细胞基因组中的特定基因座。

转基因的表达可由一个或多个启动子控制。启动子可以是普遍存在的、组成型(不受调节的启动子，其允许连续转录相关基因)、组织特异性启动子或诱导型启动子。可调节在启动子附近或周围插入的转基因的表达。例如，转基因可插入到普遍存在的启动子周围或与其相邻。一些普遍存在的启动子可以是CAGGS启动子、hCMV启动子、PGK启动子、SV40启动子或ROSA26启动子。

启动子可以是内源的或外源的。例如，一个或多个转基因可插入到内源或外源ROSA26启动子的附近或周围。此外，启动子可对T细胞具有特异性。例如，一个或多个转基因可插入到猪ROSA26启动子的附近或周围。

组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用来控制表达的位置。例如，一个或多个转基因可插入到组织特异性启动子的附近或周围。组织特异性启动子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子或Col2A启动子。

组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用来控制表达的位置。例如，一个或多个转基因可插入到组织特异性启动子的附近或周围。组织特异性启动子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子或Col2A启动子。

也可以使用诱导型启动子。在需要时，可通过添加或去除诱导剂类来开启和关闭这些诱导型启动子。预期诱导型启动子可以是但不限于Lac、tac、trc、trp、araBAD、phoA、recA、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、PL、cspA、T7、VHB、Mx和/或Trex。

工程化受体

工程化受体可在本文所述的细胞、组合物或方法中使用，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)，或其衍生物。

在某些方面，嵌合抗原受体可包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和控制T细胞活化的信号传导区域。细胞外抗原识别结构域可衍生自鼠、人源化或完全人类的单克隆抗体。具体而言，细胞外抗原识别结构域包含单克隆抗体的重链和轻链的可变区，该单克隆抗体以单链可变区片段(scFv)的形式克隆并通过铰链和跨膜结构域与T细胞受体(TCR)复合物的细胞内信号传导分子和至少一个共刺激分子连接。在一些情况下，不使用共刺激结构域。

CAR可存在于真核细胞例如哺乳动物细胞的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括但不限于细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的后代、祖细胞、祖细胞的后代和NK细胞。当存在于真核细胞的质膜中时，CAR可在其结合靶标的存在下具有活性。靶标可在膜上表达。靶标还可以是可溶的(例如，不与细胞结合)。靶标可存在于细胞如靶细胞的表面上。靶标可呈现于固体表面如脂双层上；等等。靶标可以是可溶的，诸如可溶性抗原。靶标可以是抗原。抗原可存在于细胞如靶细胞的表面上。抗原可呈现于固体表面如脂双层上；等等。在一些情况下，靶标可以是抗原的表位。

细胞外结合区。在某些方面，嵌合抗原受体可具有细胞外抗原识别结构域。在一个实施方案中，细胞外抗原识别结构域可以是完全人类的。在其他情况下，细胞外抗原识别结构域可以是人源化的。在其他情况下，细胞外抗原识别结构域可以是鼠类的。在一些情况下，细胞外抗原识别结构域可以是非人的。用于结合抗原的部分可分为三大类：衍生自抗体的单链可变片段(scFv)、选自文库的片段抗原结合区(Fab)或与其同源受体接合的天然配体。结合区可包括scFv、Fab或天然配体，以及它们的任意衍生物。

scFv可以是确定其抗原特异性的CAR的部分。scFv可与任何互补靶标结合。所使用的scFv可衍生自可变区序列已知的抗体。所使用的scFv可衍生自从可获得的小鼠杂交瘤获得的抗体序列。所使用的scFv可从肿瘤细胞或原代细胞的全外显子组测序获得。

通过采用基因工程化，可以以多种方式修饰scFv。在一些情况下，scFv可发生突变，从而可以针对与其靶标的更高亲和力选择scFv。在一些情况下，scFv对其靶标的亲和力可针对可以在正常组织上以低水平表达的靶标进行优化。可进行该优化以使潜在的毒性最小化。在其他情况下，针对靶标的膜结合形式具有更高亲和力的scFv的克隆可优于其可溶形式对应物。可进行这种修饰，因为有一些靶标也可以以不同水平的可溶形式检测到，并且它们的靶向可引起非预期的毒性。

铰链或间隔区。在某些方面，本文使用的CAR可包含铰链。铰链也可称为间隔区。在某些方面，铰链可以被认为是用于向scFv提供柔性的CAR的一部分。在一些情况下，铰链可用于检测细胞的细胞表面上的CAR，特别是当检测scFv的抗体不起作用或不可得时。例如，衍生自免疫球蛋白的铰链的长度可能需要优化，这取决于scFv所靶向的靶标上表位的位置。

在一些情况下，铰链可能不属于免疫球蛋白，而是属于另一分子，如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可含有已知在CD8共同受体与MHC分子的相互作用中起作用的半胱氨酸和脯氨酸残基。半胱氨酸和脯氨酸残基可影响CAR的性能。

CAR铰链可以是大小可调的，并且可以在一定程度上进行补偿以使CAR T细胞与靶细胞之间的正交突触距离标准化。T细胞与靶细胞之间的免疫突触的这种形貌也定义了由于细胞表面靶分子上的膜远侧表位而不能被CAR功能性桥连的距离，即使使用短铰链CAR，也不能使突触距离接近以达到信号传导。同样，已经描述了膜近端的CAR靶抗原表位，其中仅在长铰链CAR的背景下观察到信号输出。可根据所使用的单链可变片段区调整铰链。铰链可具有任何长度。

跨膜区。在某些方面，跨膜基序可将CAR锚定到细胞的质膜上。CD28的天然跨膜部分可在CAR中使用。在其他情况下，CD8α的天然跨膜部分也可在CAR中使用。

细胞内信号传导区。本文使用的CAR的信号传导结构域可负责激活其中已经放置有CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。CAR可诱导T细胞的效应子功能，例如，可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子分泌。因此，术语“信号传导结构域”可指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可采用整个信号传导结构域，但在许多情况下无须使用整个链。在一些情况下，使用细胞内信号传导结构域的截短部分。在一些情况下，术语信号传导结构域因此意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。用于CAR的信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和共同受体(共同起作用以在靶标-受体接合后启动信号转导)的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体，以及具有相同功能性能力的任何合成序列。

在某些方面，CAR的设计可包括简单地并入ζ-链(第一代CAR)以并入单个共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB)(第二代)或者并入两个共刺激内部结构域(CD28/OX40或CD28/4-1BB)(第三代)。与共同受体如CD8一起，这些信号传导部分产生支持基因转录和功能性细胞应答的激酶途径的下游激活。CAR的共刺激内部结构域可激活与CD28(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶)或4-1BB/OX40(TNF-受体相关因子衔接蛋白)途径以及MAPK和Akt活化相关的近端信号传导蛋白。

在一些情况下，信号传导结构域可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。含有细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。然而，在优选的实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自CD3ζ链。

包含一个或多个ITAM基序的T细胞信号传导结构域的实例为CD3ζ结构域，其也被称为T细胞受体T3ζ链或CD247。该结构域是T细胞受体-CD3复合物的一部分，并且在将抗原识别与几种细胞内信号转导途径(具有T细胞的初级效应子活化)偶联中起重要作用。如本文所用，CD3ζ主要针对人CD3ζ及其同种型(如从Swissprot entry P20963所知)，包括具有基本相同序列的蛋白质。作为嵌合抗原受体的一部分，同样不需要完整的T细胞受体T3ζ链，并且包含T细胞受体T3ζ链的信号传导结构域的任何衍生物在某些方面都适合于所述方法，包括其任何功能等同物。

在一些情况下，通过CAR生成的信号可与次级或共刺激信号复合。关于共刺激信号传导结构域，可将嵌合抗原受体样复合物设计为包含几个可能的共刺激信号传导结构域。如本领域公知的，在幼稚T细胞中，仅有T细胞受体参与不足以诱导T细胞完全活化为细胞毒性T细胞。完全有效的T细胞活化需要第二共刺激信号。已报告给T细胞活化提供共刺激的几种受体包括但不限于CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB。这些共刺激分子利用的信号传导途径具有与初级T细胞受体激活信号协同作用的共同特性。这些共刺激信号传导区提供与初级效应子激活信号协同的信号，其源自一个或多个ITAM基序，例如CD3ζ信号传导结构域，并且可以完成激活T细胞的需求。

在某些方面，向嵌合抗原受体样复合物添加共刺激结构域可增强工程化细胞的功效和耐久性。

在另一个实施方案中，T细胞信号传导结构域和共刺激结构域彼此融合，从而组成信号传导区。

CAR功能。在一些情况下，当CAR存在于细胞的质膜上时，并且当通过结合其靶标而激活时，可导致细胞对靶标的细胞毒活性，该靶标在其细胞表面上表达CAR的结合结构域所结合的抗原。例如，在一些情况下，细胞可以是细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)，本发明的CAR当存在于细胞的质膜中时，并且当通过结合其靶标而激活时，可增加细胞毒性细胞对靶细胞的细胞毒活性，该靶细胞在其细胞表面上表达CAR结合结构域所结合的抗原。例如，在一些情况下，细胞可以是NK细胞或T淋巴细胞，本发明的CAR当存在于细胞的质膜中时，并且当通过结合其靶标而激活时，与不存在结合靶标时细胞的细胞毒活性相比，可使细胞的细胞毒活性增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍。

在一些情况下，当通过结合其靶标而激活时，CAR可导致其他CAR活化相关事件，诸如增殖和扩充(由于增加的细胞分裂或抗细胞凋亡反应)。在一些情况下，当通过结合其靶标而激活时，CAR可导致其他CAR活化相关事件，诸如细胞内信号传导调节、细胞分化或细胞死亡。

结合区还可包含单链可变片段(scFv)。示例性CAR的细胞外结构域或胞外结构域由来自单克隆抗体的抗原结合位点的scFv组成，从而连接V_H和V_L结构域。scFv与柔性跨膜结构域连接，随后是一个或多个胞内结构域，胞内结构域可包括基于酪氨酸的活化基序，如来自CD3ζ的活化基序。在所谓的第二代和第三代CAR中，包括来自共刺激分子如CD28和CD137(4-1BB)的额外激活结构域，其用于增强T细胞存活和增殖。

近期的一些进展集中于鉴定在一些情况下引发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变。例如，可使用全外显子测序方法鉴定这些内源性突变。Tran E等人,“Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+T cells in a patient withepithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。因此，CAR可由靶向肿瘤特异性突变的scFv组成。

一种方法可使用体外测定(例如，全外显子测序)从获自癌症患者的样品中鉴定癌症相关靶序列。一种方法可进一步从识别靶序列的第一T细胞来鉴定TCR转基因。可从相同患者或不同患者的样品中获得癌症相关靶序列和TCR转基因。癌症相关靶序列可在CAR转基因上编码，以使CAR对靶序列有特异性。一种方法可有效地将包含CAR转基因的核酸递送穿过T细胞的膜。在一些情况下，第一和第二T细胞可从同一患者获得。在其他情况下，第一和第二T细胞可从不同患者获得。在其他情况下，第一和第二T细胞可从不同患者获得。该方法可使用非病毒整合或病毒整合系统安全并有效地将CAR转基因整合到T细胞的基因组中以生成工程化T细胞，因此，CAR转基因可在工程化T细胞中可靠地表达。

癌症靶标

在某些方面，细胞或工程化受体可结合靶抗原。工程化细胞可靶向抗原。工程化细胞还可靶向表位。

靶抗原可以是肿瘤细胞新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、促分裂原或其组合。抗原可以是肿瘤细胞抗原。表位可以是肿瘤细胞表位。这样的肿瘤细胞表位可衍生自多种肿瘤抗原，如由突变引起的肿瘤的抗原、共有的肿瘤特异性抗原、分化抗原和在肿瘤中过表达的抗原。例如，这类抗原可衍生自新抗原、新抗原表位、叶酸受体α、WT1、p53、Brachyury、brachyury(TIVS7-2，多态性)、brachyury(IVS7T/C多态性)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、HPV E6、HPV E7、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSMA、PSCA、STEAP、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、HER1、HER2/neu、HER3、HER4、hTERT、hTRT、iCE、粘蛋白1(MUC1)、MUC1(VNTR多态性)、MUC1-c、MUC1-n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、癌胚抗原(CEA)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人乳头瘤病毒(HPV)、MUC1、前列腺特异性抗原(PSA)、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1融合蛋白或SYT-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、丙糖磷酸异构酶、BAGE-1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、Gage 3、Gage 4、Gage 5、Gage 6、Gage 7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、粘蛋白k、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL13Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活蛋白、端粒酶、VEGF、BRCA1，或其修饰变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂或任意组合，等等。肿瘤相关抗原可以是由宿主非正常表达的抗原；它们可以是由宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或其他异常表现；它们可与正常表达但以异常高水平表达的分子相同；或者它们可在异常的背景或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其他生物分子或其任意组合。

其他靶标

表位可以是基质表位。这样的表位可位于肿瘤微环境的基质上。抗原可以是基质抗原。这样的抗原可位于肿瘤微环境的基质上。例如，这些抗原和这些表位可存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤脉管系统、肿瘤成纤维细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间充质细胞中，等等。例如，这些抗原可包括CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和/或生腱蛋白。

此外，虽然不是表达所需的，但外源序列还可包括转录或翻译调节序列，例如，启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或多腺苷酸化信号。

在一些情况下，外源序列(例如，转基因)包括感兴趣的蛋白质与作为其融合配偶体的膜蛋白的细胞外结构域的融合物，这使融合蛋白位于该细胞的表面。在一些情况下，转基因编码CAR，其中CAR编码序列插入安全港(safe harbor)中，使得TCR得到表达。在一些情况下，CAR编码序列插入PD1和/或CTLA-4基因座中。在其他情况下，CAR在慢病毒中递送至细胞以供随机插入，而PD1或CTLA-4特异性核酸酶可作为mRNA来提供。在一些情况下，CAR通过病毒载体系统如逆转录病毒、AAV或腺病毒与编码对安全港(例如，AAVS1、CCR5、白蛋白或HPRT)特异的核酸酶的mRNA一起来递送。还可用编码PD1和/或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA处理该细胞。在一些情况下，编码CAR的多核苷酸通过病毒递送系统与编码HPRT特异性核酸酶和PD1或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA一起来提供。在某些方面，可与所述方法和组合物一起使用的CAR包括所有类型的这类嵌合蛋白，包括第一代、第二代和第三代设计。包含衍生自抗体的特异性结构域的CAR可能是特别有用的，尽管还可设想衍生自受体、配体和工程化多肽的特异性结构域。细胞间信号传导结构域可衍生自TCR链，如ζ和CD3复合物的其他成员，如γ和E链。在一些情况下，CAR可包含额外的共刺激结构域，如来自CD28、CD137(也称为4-1BB)或CD134的细胞间结构域。在更进一步的情况下，可同时使用两种类型的共刺激结构域(例如，CD3ζ与CD28+CD137一起使用)。

在一些情况下，工程化细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择蛋白)、CD27+、CD28+和/或IL-7Rα+组成的干记忆T_SCM细胞。干记忆细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和/或LFA-1，并且显示出不同于干记忆细胞的许多功能属性。工程化细胞还可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中枢记忆T_CM细胞，其中中枢记忆细胞可分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。工程化细胞还可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应记忆T_EM细胞，并产生例如效应细胞因子，如IFNγ和IL-4。

载体向细胞膜中的递送

可通过任何合适的手段将核酸酶和转录因子、其编码多核苷酸和/或任何转基因多核苷酸以及包含本文所述蛋白质和/或多核苷酸的组合物递送至靶细胞。

载体系统。已经开发了许多基于病毒的系统以将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装于逆转录病毒颗粒中。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合及其在子细胞中的繁殖。相对于衍生自致癌-逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体，慢病毒载体具有额外优势，因为它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。腺病毒载体具有不整合到靶细胞的基因组中的优势，从而避免负面的整合相关事件。

构建第一代或E1缺失型腺病毒载体Ad5[E1-]，使得转基因仅替换基因的E1区。例如，约90％的野生型Ad5基因组保留在载体中。Ad5[E1-]载体在感染不表达Ad5E1基因的细胞后具有降低的复制能力并且无法产生感染性病毒。重组Ad5[E1-]载体在允许Ad5[E1-]载体复制和包装的人类细胞(例如，293细胞，但还可使用其他适当的细胞)中繁殖。Ad5[E1-]载体具有许多积极的特性；其中之一是它们相对易于扩大规模和cGMP产生。此外，Ad5载体不整合；它们的基因组可保持游离基因型。通常，对于不整合到宿主基因组中的载体，与基于逆转病毒和慢病毒的系统相比相比，插入诱变和/或种系传播的风险是非常低的，即使发生的话。常规的Ad5[E1-]载体具有接近7kb的承载容量。

Ad5[E1-，E2b-]平台具有扩充的克隆能力，其可允许包含多个基因(Hartigan-O'Connor等人,2002,Methods Enzymol,346,224-246)。与Ad5[E1-]载体的7kb容量相比，Ad5[E1-,E2b-]载体具有最高达约12kb的基因承载容量，从而为多个基因提供空间(如有需要)。在一些实施方案中，将多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11kb的插入片段引入到Ad5载体中，如Ad5[E1-,E2b-]载体中。E2b区的缺失赋予Ad5载体有利的免疫特性，通常引发对靶转基因抗原的有效免疫应答，同时使得对Ad病毒蛋白的免疫应答最小化。

某些方面可考虑使用E2b缺失的腺病毒载体，该腺病毒载体利用表达缺失的E2b基因产物的细胞系。某些方面还可提供这样的包装细胞系；例如，衍生自HEK-203细胞系的E.C7(正式称为C-7)，Amalfitano,等人,Proc Natl Acad Sci USA,1996,93,3352-3356；Amalfitano等人,Gene Ther,1997,4,258-263。

E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白可在E.C7或类似的合适的细胞中与E1基因产物一起组成型表达。基因区段从Ad基因组到生产细胞系的转移可具有如下优点：承载容量增加；以及有复制能力的Ad生成潜力降低，这可能需要两个或更多个独立重组事件来生成有复制能力的Ad。所使用的表达E1、Ad DNA聚合酶和/或前末端蛋白的细胞系可在不需要污染性辅助病毒的情况下使承载容量接近13kb的腺病毒载体能够繁殖，Mitani等人,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.,92,3854；Hodges等人,2000,J Gene Med,2,250-259。

在某些情况下，当对病毒生命周期至关重要的基因(例如，E2b基因)被删除时，出现Ad复制或表达其他病毒基因蛋白的进一步削弱。这可以减少病毒感染细胞的免疫识别，并延长外来转基因表达的持续时间。

如本文所述的转录因子和核酸酶可使用载体递送，该载体例如含有编码一种或多种蛋白质的序列。编码多核苷酸的转基因可类似地递送。可使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。此外，这些载体中的任一种可包含一种或多种转录因子、核酸酶和/或转基因。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于在细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码工程化CRISPR/Cas、TALEN、基于转座子的、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸。这样的方法还可用于将编码CRISPR/Cas、TALEN、基于转座子的、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸在体外施用于细胞。在一些实例中，可施用编码CRISPR/Cas、TALEN、基于转座子的、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子和/或转基因的核酸以用于体内或离体免疫治疗用途。非病毒载体递送系统可包括DNA质粒、裸核酸以及与递送载体如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统可包括DNA和RNA病毒，这些病毒在递送至细胞后具有附加型或整合的基因组。

核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、核转染、金纳米颗粒递送、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质；核酸缀合物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒子和药剂增强的DNA摄取。还可使用采用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声孔效应来递送核酸。

包括含有编码工程化CRISPR/Cas、TALEN、基于转座子的、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子、转座子和/或转基因的核酸的病毒和非病毒载体在内的载体还可直接施用于生物体以供体内细胞转导。或者，可施用裸DNA或mRNA。通过通常用于将分子引入以与血液或组织细胞进行最终接触的任何途径进行施用，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。可使用多于一种途径来施用特定组合物。药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法来确定。

载体可用于表达基因，例如转基因，或感兴趣的基因的一部分。可通过使用任何方法插入基因的一部分或基因。例如，方法可以是基于限制酶的技术。

如下所述，通过向个体患者全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部施用来体内递送载体。或者，可将载体离体递送至细胞，如从个体患者中移出的细胞(例如，淋巴细胞、T细胞、骨髓抽吸物、组织活检物)，然后通常在选择已并入载体的细胞后将细胞重新植入患者体内。细胞可在选择之前或之后进行扩充。

合适的细胞

在细胞的扩充和遗传修饰之前，可从受试者获得细胞来源。在一些情况下，可获得T细胞。可从许多来源获得T细胞，包括PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织；以及来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

在某些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的任意数量的技术如Ficoll^TM分离技术从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。在一个实施方案中，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物可含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。

所使用的CAR T产物的T细胞亚群的组成可以是非常不均匀的。在优选的实施方案中，所使用的细胞可主要由比例不一的CD4和CD8T细胞组成。CD4和CD8细胞可具有循环效应T细胞的表型特征。CD4和CD8细胞还可具有效应记忆细胞的表型特征。在另一个实施方案中，细胞可以是中枢记忆细胞。

合适的细胞可包括但不限于真核细胞和原核细胞和/或细胞系。这类细胞或由这类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞；以及昆虫细胞如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)细胞；或真菌细胞，如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的细胞。在一些情况下，该细胞系为CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。在一些情况下，合适的原代细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群，诸如但不限于T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况下，该细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞，如肿瘤浸润细胞(TIL)，如CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞，或任何其他类型的T细胞。该T细胞还可包括记忆T细胞、记忆干T细胞或效应T细胞。

T细胞还可选自混合(bulk)群体，例如，从全血中选择T细胞。T细胞还可从混合群体扩充。T细胞还可偏向于特定的群体和表型。例如，T细胞可以倾向于在表型上包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。

可选择合适的细胞，其包含选自以下所列出的一种或多种标志物：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。

合适的细胞还包括干细胞，举例而言，如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。合适的细胞可包含任意数量的原代细胞，如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。合适的细胞可以是祖细胞。合适的细胞可来自待治疗的受试者(例如，患者)。合适的细胞可衍生自人类供体。

合适的细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择蛋白)、CD27+、CD28+和/或IL-7Rα+组成的干记忆T_SCM细胞，干记忆细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并且显示出与干记忆细胞不同的许多功能属性。

合适的细胞可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中枢记忆T_CM细胞，中枢记忆细胞可分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。合适的细胞还可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应记忆T_EM细胞，并产生例如效应细胞因子，如IFNγ和IL-4。

获得合适细胞的方法可包括选择细胞。在一些情况下，细胞可包含可针对细胞进行选择的标志物。例如，这样的该标志物可包括GFP、抗性基因、细胞表面标志物或内源性标签。可使用任何内源性标志物选择细胞。可使用任何技术选择合适的细胞。这样的技术可包括流式细胞术和/或磁柱。随后可将选定的细胞输注到受试者体内。所选定的细胞还可扩充到庞大数目。所选定的细胞可在输注前扩充。

药物组合物和制剂

全文描述的组合物可配制成药物，并用于治疗经诊断患有疾病例如癌症的有需要的人或哺乳动物。这些药物可与一种或多种T细胞(例如，工程化T细胞)以及一种或多种化疗剂或化疗化合物一起共同施用于人或哺乳动物。

可使用本领域技术人员已知的技术配制CAR T细胞群体以供施用于受试者。包含CAR T细胞群体的制剂可包含药学上可接受的赋形剂。包含在制剂中的赋形剂将具有不同的目的，这取决于例如所用T细胞的亚群和给药模式。通常所使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合；稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲液和防腐剂、张度剂、膨胀剂和润滑剂。包含CAR T细胞群体的制剂可在不存在任何非人组分如动物血清的情况下制备和培养。制剂可包含一个CAR T细胞群体，或者多于一个，如两个、三个、四个、五个、六个或更多个CAR T细胞群体。

可使用本领域技术人员已知的模式和技术将包含CAR T细胞群体的制剂施用于受试者。示例性的模式包括但不限于静脉内注射。其他模式包括但不限于肿瘤内、皮内、皮下(S.C.，s.q.，sub-Q，Hypo)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可用于肠胃外注射或输注制剂的任何已知装置可用于实现这样的施用。

施用于受试者的包含CAR T细胞群体的制剂包含对于治疗和/或预防特定适应症或疾病有效的许多CAR T细胞。因此，将治疗上有效的CAR T细胞群体施用于受试者。通常，施用包含约1x 10⁴至约1x 10¹⁰个CAR T细胞的制剂。在大多数情况下，该制剂将包含约1x10⁵至约1x 10⁹个CAR T细胞、约5x 10⁵至约5x 10⁸个CAR T细胞或约1x 10⁶至约1x 10⁷个CART细胞。然而，施用于受试者的CAR T细胞的数目将会在宽范围内变化，这取决于癌症的位置、来源、身份、程度和严重程度，待治疗个体的年龄和状况，等等。医生将最终确定待使用的适当剂量。

在施用CAR T细胞之前或同时或之后将肿瘤靶向分子施用于受试者。肿瘤靶向分子通过与肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原缔合而与受试者中的靶细胞结合。可使用本领域技术人员已知的技术配制肿瘤靶向分子以供施用于受试者。肿瘤靶向分子的制剂可包含药学上可接受的赋形剂。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合；稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲液和防腐剂、张度剂、膨胀剂和润滑剂。

可使用本领域技术人员已知的模式和技术将肿瘤靶向分子施用于受试者。示例性的模式包括但不限于静脉内、腹膜内和肿瘤内注射。其他模式包括但不限于皮内、皮下(S.C.，s.q.，sub-Q，Hypo)、肌肉内(im)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可用于肠胃外注射或输注制剂的任何已知装置可用于实现这样的施用。

将包含肿瘤靶向分子的制剂以有效治疗和/或预防特定适应症或疾病的量施用于受试者。通常，将包含至少约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重的肿瘤靶向分子的制剂施用于需要治疗的受试者。在大多数情况下，考虑到施用途径、症状等，剂量为每天约1mg/kg体重至约100mg/kg体重的标记蛋白质。医生将确定待使用的适当剂量。

在一个实施方案中，嵌合抗原受体用于刺激T细胞介导的免疫应答。T细胞介导的免疫应答是涉及T细胞活化的免疫应答。活化的抗原特异性细胞毒性T细胞能够在靶细胞中诱导凋亡，该靶细胞在其表面上展示外源抗原的表位，例如展示肿瘤抗原的癌细胞。

在另一个实施方案中，使用嵌合抗原受体在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫。由于T细胞介导的免疫应答，受试者将会发生抗肿瘤免疫。

可提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向需要治疗的受试者施用一种或多种肿瘤靶向分子的制剂，其中这些分子与癌细胞结合，并且包括施用一种或多种治疗上有效的CAR T细胞群体，其中CAR T细胞与肿瘤靶向分子结合并诱导癌细胞死亡。

另一个实施方案涉及治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向需要治疗的受试者施用一种或多种治疗上有效的CAR T细胞群体，其中CAR T细胞与癌细胞结合，从而诱导癌细胞死亡。

包含CAR T细胞和CAR T细胞联合肿瘤靶向分子的两种制剂的施用频率将根据包括所治疗的疾病、包含CAR T细胞和肿瘤靶向分子的元件和施用模式等因素而变化。每种制剂可独立施用每天4次、3次、2次或1次；每隔一天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每八天一次、每九天一次、每十天一次、每两周一次、每月一次和每两个月一次。

如本文所用的“化疗剂”或“化疗化合物”及其语法等同语可以是在癌症治疗中有用的化学化合物。可与所公开的T细胞联合使用的癌症化疗剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱、长春地辛和Navelbine^TM(长春瑞滨，5'-去甲脱水长春碱)。在另外其他的实施方案中，癌症化疗剂包括拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物。如本文所用，“喜树碱化合物”包括Camptosar^TM(盐酸伊立替康)、Hycamtin^TM(盐酸拓扑替康)和衍生自喜树碱及其类似物的其他化合物。可在本文公开的方法和组合物中使用的另一类癌症化疗剂为鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷、替尼泊苷和米托鬼臼肼。本发明还包括被称为烷化剂的其他癌症化疗剂，其将肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。本发明包括抗代谢物作为化疗剂。这些类型的药剂的实例包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。可在本文公开的方法和组合物中使用的另一类癌症化疗剂包括抗生素。实例包括但不限于多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。针对这些化合物存在可市售获得的许多脂质体制剂。本发明还包括其他癌症化疗剂，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。

本文公开的细胞可与其他抗肿瘤剂，包括细胞毒性剂/抗肿瘤剂和抗血管生成剂联合施用。细胞毒性剂/抗肿瘤剂可定义为攻击并杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。其他细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是抗生素，例如多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在这些化合物的可商购的许多脂质体制剂。其他的细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些抑制剂包括长春花新碱、长春碱和依托泊苷。各种细胞毒性剂/抗肿瘤剂包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。

还可使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他的血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑制素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2(TIMP-1和TIMP-2)的组织抑制剂。还可使用小分子，包括拓扑异构酶如雷佐生、具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。

可与所公开的T细胞联合使用的其他抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿可达佐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；安维汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟乌氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸依达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星(mitocarcin)；米托孔星(mitocromin)；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；斯帕磷酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫卟吩；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春花新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogeneticprotein-1)；抗雄激素；前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮络氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；CAR/ABL拮抗剂；苯并二氢扑酚；苯甲酰基星状孢菌素；β-内酰胺衍生物；β-alethine；βclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；双曲群A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；塞匹霉素；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢泰素；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；度卡霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘代多柔比星；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑；异高软海绵素B；伊他司琼；加斯普拉诺利得(jasplakinolide)；卡哈拉里德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；雷波斯他汀；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦辛；曼诺他汀A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；阿伏瑞林；蛋氨酸酶(methioninase)；胃复安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福星；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥子抗癌剂；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；泊泽尼普定；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊糖多硫酸钠；喷司他丁；喷曲唑；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；紫菜霉素；强的松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白质A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；甲氧基吡唑啉吖啶；吡哆基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；铼Re186依替膦酸盐；根霉素；核糖酶；RII异维A酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑素1(spongistatin1)；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；溶基质蛋白酶抑制剂；sulfinosine；强效血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基锡初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯化二茂钛(titanocene bichloride)；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西瑞宾；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统；红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；威科萨汀(vinxaltine)；vitaxin；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；和净司他丁斯酯。在一个实施方案中，抗癌药物是5-氟尿嘧啶、紫杉酚或甲酰四氢叶酸。

在一些情况下，例如，在用于治疗癌症的组合物、制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况下，所施用的组合物或制剂的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。

在一些情况下，可提供包含T细胞的药物组合物，其可以单独施用或与药学上可接受的载体或赋形剂一起通过任何途径施用，并且这样的施用可以以单剂量和多剂量进行。更具体地，所述药物组合物可与片剂、胶囊、锭剂、糖锭、硬糖(hand candy)、粉末、喷雾剂、水性悬浮剂、可注射溶液、酏剂、糖浆等形式的各种药学上可接受的惰性载体组合。这样的载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，可借助通常用于此类目的的各种类型的试剂将这样的口服药物制剂适当地变甜和/或调味。

例如，可以将细胞与任意数量的相关治疗方式一起(例如，之前、同时或之后)施用于患者，相关治疗方式包括但不限于用诸如抗病毒治疗、西多福韦和白介素-2或者阿糖胞苷(也称为ARA-C)等药剂治疗。在一些情况下，工程化细胞可与化疗、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射联合使用。工程化细胞组合物还可协同骨髓移植以及使用化疗剂如氟达拉滨、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH(例如，之前、同时或之后)的T细胞消融疗法施用于患者。

在一些情况下，工程化细胞组合物可在B细胞消融治疗后施用，该B细胞消融治疗例如是与CD20反应的药剂，例如美罗华(Rituxan)。例如，受试者可经受高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者可接受工程化细胞如扩充的工程化细胞的输注。另外，扩充的工程化细胞可在手术之前或之后施用。通过本文所述的任一种方法获得的工程化细胞可在特定方面用于针对宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)治疗有需要的患者。

因此，可提供针对抗宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)治疗有需要的患者的方法，其包括通过向患者施用有效量的包含灭活的TCRα和/或TCRβ基因的工程化细胞来治疗患者。

联合治疗

包含如本文所述的CAR T细胞免疫治疗组合物的组合物可配制成药物，并用于治疗有需要或经诊断患有疾病例如癌症的人或哺乳动物。这些药物可与一种或多种额外的疫苗或其他癌症疗法共同施用于人或哺乳动物。

自然杀伤(NK)细胞

在某些实施方案中，可提供天然或工程化NK细胞以与如本文所述的细胞免疫治疗联合施用于有需要的受试者。

免疫系统是多样性免疫细胞家族的综合系统，每个免疫细胞在保护免受感染和疾病方面具有其自己独特的作用。在这些免疫细胞中，自然杀伤细胞或NK细胞是身体的第一道防线。NK细胞具有快速寻找并破坏异常细胞如癌细胞或病毒感染的细胞的天生能力，而无需事先暴露或被其他支持分子激活。与适应性免疫细胞如T细胞相反，NK细胞已经在1期临床试验中用作基于细胞的“现成”治疗，并且已经证明了其针对癌症的肿瘤杀伤能力。

aNK细胞。除了天然NK细胞之外，可提供NK细胞以供施用于不表达杀伤抑制受体(KIR)的患者，其中病变细胞经常利用该机制来逃避NK细胞的杀伤功能。这种独特的活化的NK或aNK细胞缺乏这些抑制性受体，同时保留了能够选择性靶向并杀伤病变细胞的广泛的一批活化受体。aNK细胞还携带更大有效负载量的颗粒酶和含有穿孔蛋白的颗粒，从而使它们能够将非常大的有效负载量的致死酶递送至多个靶标。

taNK细胞。嵌合抗原受体(CAR)技术是当前正在开发的最新的癌症治疗方法之一。CAR是允许免疫效应细胞靶向显示特异性表面抗原的癌细胞的蛋白质(靶标激活的自然杀伤物)是其中aNK细胞经一种或多种CAR工程化以靶向在癌症上发现的蛋白质并然后与广谱CAR进行整合的平台。与使用患者或供体来源的效应细胞如自体T细胞的其他CAR方法相比，该策略具有多个优势，尤其是在可扩展性、质量控制和一致性方面。

大部分癌细胞杀伤依赖于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，由此效应免疫细胞附着于抗体，而抗体又与靶癌细胞结合，从而促进效应细胞杀伤癌症。NK细胞是针对ADCC的体内的关键效应细胞，并利用特化的受体(CD16)结合抗体。

haNK细胞。研究表明，可能仅有20％的人群一致地表达CD16的“高亲和力”变体，与具有“低亲和力”CD16的患者相比，“高亲和力”变体与更有利的治疗结果密切相关。另外，许多癌症患者由于化疗、疾病本身或其他因素而具有严重削弱的免疫系统。

在某些方面，修饰haNK细胞以表达高亲和力CD16。因此，haNK细胞可增强针对癌细胞的广谱抗体的治疗功效。

共刺激分子

在产生抗原特异性CAR T细胞或CAR NK细胞的过程中，可将共刺激分子并入培养物中，以便增强所得CAR T细胞或CAR NK细胞免疫治疗组合物的免疫原性。共刺激结构域还可融合到嵌合抗原受体样复合物中并引入工程化细胞中。免疫应答的启动需要至少两个信号用于由APC激活幼稚T细胞(Damle等人.J Immunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人.Blood 84:3261-82(1994)；Hellstrom等人Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44(1996)；Hodge等人.Cancer Res 39:5800-07(1999))。经由肽/主要组织相容性复合物(MHC)通过T细胞受体(TCR)递送抗原特异性第一信号，该信号使T细胞进入细胞周期。可递送第二种或共刺激信号以用于细胞因子产生和增殖。

据报告，通常在专职抗原呈递细胞(APC)表面上发现的至少三种不同分子能够提供对T细胞活化至关重要的第二信号：B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(人CD58)(Damle等人.J Immunol 148:1985–92(1992)；Guinan等人.Blood 84:3261–82(1994)；Wingren等人.Crit Rev Immunol 15:235–53(1995)；Parra等人.Scand.J Immunol 38:508–14(1993)；Hellstrom等人.Ann NY Acad Sci 690:225–30(1993)；Parra等人.J Immunol158:637–42(1997)；Sperling等人.J Immunol 157:3909–17(1996)；Dubey等人.J Immunol155:45–57(1995)；Cavallo等人.Eur J Immunol 25:1154–62(1995))。

这些共刺激分子具有不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1β2整联蛋白)复合物相互作用，LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作用。因此，在优选的实施方案中，期望具有分别含有B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当其在与嵌合抗原受体融合以靶向抗原或抗原表位时，增强所得工程化细胞的免疫原性。实施例3中示出的表2提供了共刺激结构域的非限制性实例，其可与嵌合抗原受体融合以产生本发明的工程化细胞。

免疫途径检查点调节剂

在某些实施方案中，免疫途径检查点抑制剂与包含如本文公开的CAR T细胞免疫治疗的组合物组合。在某些实施方案中，患者接受免疫途径检查点抑制剂以及本文所述的疫苗或药物组合物。在进一步的实施方案中，组合物与一种或多种免疫途径检查点调节剂一起施用。激活与抑制信号之间的平衡调节T淋巴细胞与病变细胞之间的相互作用，其中通过T细胞受体(TCR)的抗原识别来启动T细胞应答。将抑制途径和信号称为免疫途径检查点。在正常情况下，免疫途径检查点在控制和防止自身免疫方面发挥关键作用，并且也保护免受响应于病原性感染而产生的组织损伤。

某些实施方案提供了用于预防和/或治疗癌症和感染性疾病的联合免疫治疗，该联合免疫治疗包括调节免疫途径检查点抑制途径的CAR T细胞免疫治疗组合物。在一些实施方案中，调节可以是增加基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，调节可以是降低基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，调节可影响基因或蛋白质家族。

通常，免疫抑制途径由配体-受体相互作用所启动。目前清楚的是，在疾病中，该疾病可指定免疫检查点途径作为诱导受试者的免疫抗性的机制。

可通过已知调节一种或多种免疫抑制途径的分子组合物如siRNA、反义小分子、模拟物、重组形式的配体、受体或蛋白质，或抗体(其可以是Ig融合蛋白)来阻断通过给定疾病诱导的受试者的免疫抗性或免疫抑制途径。例如，采用免疫检查点蛋白，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的阻断剂的初步临床发现已经显示出增强抗肿瘤免疫力的前景。

因为病变细胞可表达多种抑制性配体，并且疾病浸润淋巴细胞表达多种抑制性受体，所以免疫途径检查点蛋白的双重或三重阻断可增强抗疾病免疫力。本文提供的联合免疫治疗可包括一种或多种组合物，该组合物包含靶向一种或多种以下免疫检查点蛋白的免疫途径检查点调节剂：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为B7-S1、B7x和VCTN1)、BTLA(也称为CD272)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(也称为CD223)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(也称为HAVcr2)、GAL9、A2aR和腺苷。

在一些实施方案中，分子组合物包含siRNA。在一些实施方案中，分子组合物包含小分子。在一些实施方案中，分子组合物包含重组形式的配体。在一些实施方案中，分子组合物包含重组形式的受体。在一些实施方案中，分子组合物包含抗体。在一些实施方案中，联合治疗包括多于一种分子组合物和/或多于一种类型的分子组合物。如本领域技术人员将会理解的，未来发现的免疫检查点抑制途径的蛋白质也被设想为本发明所涵盖。

在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节CTLA4的分子组合物。在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节PD1的分子组合物。在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节PDL1的分子组合物。在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节LAG3的分子组合物。在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节B7-H3的分子组合物。在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节B7-H4的分子组合物。在一些实施方案中，联合免疫治疗包括用于调节TIM3的分子组合物。在一些实施方案中，调节是表达的增加或增强。在其他实施方案中，调节是表达的降低或缺失。

两种非限制性的示例性免疫途径检查点抑制剂包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)。CTLA-4只可在T细胞上表达，在T细胞中，CTLA-4调节T细胞活化的早期阶段。CTLA-4与共刺激性T细胞受体CD28相互作用，这可导致抑制T细胞活性的信号传导。一旦发生TCR抗原识别，CD28信号传导即可增强TCR信号传导，从而在一些情况下产生活化的T细胞，并且CTLA-4抑制CD28的信号传导活性。本发明提供了用于预防和/或治疗癌症和感染性疾病的与抗CTLA-4单克隆抗体组合的如本文所提供的免疫治疗。本发明提供了用于预防和/或治疗癌症和感染性疾病的与CTLA-4分子组合物组合的如本文所提供的疫苗或免疫治疗。

程序性死亡细胞蛋白配体-1(PDL1)是B7家族的成员，并且分布在各种组织和细胞类型中。PDL1可与PD1相互作用，从而抑制T细胞活化以及CTL介导的裂解。已经在各种人类肿瘤中证实了PDL1的显著表达，并且PDL1表达是肿瘤逃避宿主抗肿瘤免疫应答的关键机制之一。程序性死亡配体1(PDL1)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)作为免疫途径检查点相互作用。这种相互作用可以是导致抗肿瘤免疫应答钝化和随后的肿瘤进展的主要耐受机制。PD1存在于活化的T细胞上，而PD1的主要配体PDL1往往在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)以及包括B细胞在内的其他细胞上表达。PDL1在T细胞上与PD1相互作用，从而抑制T细胞活化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解。本发明提供了用于预防和/或治疗癌症和感染性疾病的与抗PD1或抗PDL1单克隆抗体组合的如本文所提供的免疫治疗。

某些实施方案可提供用于预防和/或治疗癌症和感染性疾病的与PD1或抗PDL1分子组合物组合的如本文所提供的免疫治疗。某些实施方案可提供用于预防和/或治疗癌症和感染性疾病的与抗CTLA-4以及抗PD1单克隆抗体组合的如本文所提供的免疫治疗。某些实施方案可提供与抗CTLA-4以及PDL1单克隆抗体组合的如本文所提供的免疫治疗。某些实施方案可提供用于治疗癌症和感染性疾病的与抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1单克隆抗体或其组合相组合的如本文所提供的疫苗或免疫治疗。

免疫途径检查点分子可由T细胞表达。免疫途径检查点分子可有效地充当“制动器(brake)”来下调或抑制免疫应答。免疫途径检查点分子包括但不限于直接抑制免疫细胞的程序性死亡蛋白1(PD1或PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，GenBank登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)、Tim3(也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，GenBank登录号：JX049979.1)、B和T淋巴细胞相关(BTLA)(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160，GenBank登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为IVSTM3，登录号：NM_173799)、LAIR1(也称为CD305，GenBank登录号：CR542051.1)、SIGLECIO(GenBank登录号：AY358337.1)、自然杀伤细胞受体2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIFl、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3。例如，PD1可与CAR T细胞免疫治疗组合物组合以治疗有需要的患者。

可靶向的其他免疫途径检查点可以是腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含有T细胞活化抑制因子1的V-组结构域(VTCN1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三结构域、长胞质尾1(KIR3DL1)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制物(VISTA)、含细胞因子诱导型SH2的蛋白质(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(CC基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)，或其任意组合。

表1以未详尽列举的方式示出了可被灭活以改善如本文所述的CAR T细胞免疫治疗组合物的效率的示例性免疫途径检查点基因。免疫途径检查点基因可选自表1中列出的这些基因以及涉及共抑制受体功能、细胞死亡、细胞因子信号传导、精氨酸色氨酸饥饿、TCR信号传导、诱导的T-reg抑制、控制转录因子的耗尽或无反应以及缺氧介导的耐受的其他基因。

表1-免疫途径检查点基因的实例

与单独的任一种药剂相比，基于腺病毒的组合物与免疫途径检查点调节剂的组合可导致治疗的患者的疾病的感染、进展或症状的减少。在另一个实施方案中，与单独的任一种药剂相比，基于腺病毒的组合物与免疫途径检查点调节剂的组合可导致治疗的患者的改善的总存活期。在一些情况下，与单独的任一种药剂相比，基于腺病毒的组合物与免疫途径检查点调节剂的组合可增加治疗的患者中疾病特异性T细胞应答的频率或强度。

某些实施方案还可提供免疫途径检查点抑制在改善CAR T细胞免疫治疗组合物的性能中的用途。某些免疫途径检查点抑制剂可在施用CAR T细胞免疫治疗组合物时施用。某些免疫途径检查点抑制剂还可在施用CAR T细胞免疫治疗组合物后施用。免疫途径检查点抑制可与腺病毒疫苗施用同时进行。免疫途径检查点抑制可在疫苗接种后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或60分钟进行。免疫途径检查点抑制还可在CAR T细胞免疫疗法组合物施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时进行。在一些情况下，免疫抑制可在疫苗接种后1、2、3、4、5、6或7天进行。免疫途径检查点抑制可在CAR T细胞免疫治疗组合物施用之前或之后的任何时间进行。

在另一个方面，提供了涉及包含一种或多种编码抗原和免疫途径检查点调节剂的核酸的疫苗的方法。例如，提供了用于治疗具有将受益于受试者细胞上的免疫途径检查点(例如，PD1或PDL1)及其天然结合配偶体下调的病况的受试者的方法。

免疫途径检查点调节剂可与包含编码任何抗原的一种或多种核酸的CAR T细胞免疫治疗组合物组合。例如，抗原可以是肿瘤抗原，如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位，或者本文所述的任何抗原。

当与CAR T细胞免疫治疗组合物如疫苗组合时，免疫途径检查点调节剂可产生协同效应。当与CAR T细胞免疫治疗组合物组合时，免疫途径检查点调节剂还可产生有益效应。

使用方法

如本文所述，可从人体提取细胞。细胞可经离体遗传性地改变并被相应地使用。这些细胞可用于基于细胞的治疗。这些细胞可用于治疗接受者(例如，人)中的疾病。例如，这些细胞可用于治疗癌症。

本文描述了治疗接受者中的疾病(例如，癌症)的方法，其包括将包含工程化细胞的一种或多种细胞(包括器官和/或组织)移植到接受者。本文公开的方法可用于治疗或预防疾病，包括但不限于癌症、心血管疾病、肺疾病、肝脏疾病、皮肤疾病或神经疾病。

在一个实施方案中，可提供用于施用表达嵌合抗原受体样复合物的经遗传修饰的T细胞的方法，用于使用淋巴细胞输注治疗患有癌症或有患癌风险的患者。优选地，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者收集自体外周血单核细胞(PBMC)，并使用本文所述和本领域已知的方法激活和扩充T细胞，然后将其输注回患者体内。可配制CAR T细胞群体以供施用；并且其中使用本领域技术人员已知的技术施用于受试者。或者，可使用同种异体淋巴细胞输注。

在一些情况下，可使用本领域技术人员已知的技术配制工程化细胞群体以供施用于受试者。包含工程化细胞群体的制剂包含药学上可接受的赋形剂。包含在制剂中的赋形剂将会具有不同的目的，这取决于例如所用T细胞的亚群和施用模式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合；稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲液和防腐剂、张度剂、膨胀剂和润滑剂。包含工程化细胞群体的制剂可在不存在任何非人组分如动物血清的情况下制备和培养。

制剂可包含一个工程化细胞群体或多于一个，如两个、三个、四个、五个、六个或更多个工程化细胞群体。可使用本领域技术人员已知的模式和技术将包含工程化细胞群体的制剂施用于受试者。示例性的模式包括但不限于静脉内注射。其他模式包括但不限于肿瘤内、皮内、皮下(S.C.，s.q.，sub-Q，Hypo)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可用于肠胃外注射或输注制剂的任何已知装置可用于实现这样的施用。

包含施用于受试者的工程化细胞群体的制剂可包含针对治疗和/或预防特定适应症或疾病有效的许多工程化细胞。因此，可将治疗上有效的工程化细胞群体施用于受试者。

通常，可施用包含约1x 10⁴至约1x 10¹⁰个工程化细胞的制剂。在大多数情况下，该制剂将包含约1x 10⁵至约1x 10⁹个工程化细胞、约5x 10⁵至约5x 10⁸个工程化细胞或约1x10⁶至约1x 10⁷个工程化细胞。然而，施用于受试者的工程化细胞的数目可在宽范围内变化，这取决于癌症的位置、来源、身份、程度和严重程度，待治疗个体的年龄和状况，等等。医生可最终确定待使用的适当剂量。

可在施用工程化细胞之前或同时或之后将肿瘤靶向分子施用于受试者。肿瘤靶向分子可通过与肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原缔合而与受试者中的靶细胞结合。可使用本领域技术人员已知的技术配制肿瘤靶向分子以供施用于受试者。肿瘤靶向分子的制剂可包含药学上可接受的赋形剂。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合；稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲液和防腐剂、张度剂、膨胀剂和润滑剂。可使用本领域技术人员已知的模式和技术将肿瘤靶向分子施用于受试者。示例性的模式包括但不限于静脉内、腹膜内和肿瘤内注射。其他模式包括但不限于皮内、皮下(S.C.，s.q.，sub-Q，Hypo)、肌肉内(im)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可用于肠胃外注射或输注制剂的任何已知装置可用于实现这样的施用。

将包含肿瘤靶向分子的制剂以有效治疗和/或预防特定适应症或疾病的量施用于受试者。通常，将包含至少约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重的肿瘤靶向分子的制剂施用于需要治疗的受试者。在大多数情况下，考虑到施用途径、症状等，剂量为每天约1mg/kg体重至约100mg/kg体重的标记蛋白质。医生可确定待使用的适当剂量。

移植可以是任何类型的移植。部位可包括但不限于肝被膜下空间、脾被膜下空间、肾被膜下空间、网膜、胃或肠粘膜下层、小肠血管节段、静脉囊、睾丸、脑、脾或角膜。例如，移植可以是被膜下移植。移植还可以是肌内移植。移植可以是门静脉内移植。

移植可以是来自人的一种或多种细胞的移植。例如，所述一种或多种细胞可来自器官，该器官可以是脑、心脏、肺、眼、胃、胰腺、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指甲、耳、腺体、鼻、嘴、唇、脾、牙龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃体、咽、食管、大肠、小肠、直肠、肛门、甲状腺、胸腺、骨骼、软骨、腱、韧带、肾上囊、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结或淋巴管。所述一种或多种细胞还可来自脑、心脏、肝、皮肤、肠、肺、肾、眼、小肠或胰腺。所述一种或多种细胞可来自胰腺、肾、眼、肝、小肠、肺或心脏。所述一种或多种细胞可来自胰腺。所述一种或多种细胞可以是胰岛细胞，例如，胰腺β细胞。所述一种或多种细胞可以是任何血细胞，如外周血单个核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。所述一种或多种细胞可以是任何免疫细胞，如淋巴细胞、B细胞或T细胞。

本文公开的方法还可包括移植一种或多种细胞，其中所述一种或多种细胞可以是任何类型的细胞。例如，所述一种或多种细胞可以是上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其他肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血细胞、血液前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原始干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星形细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、枯否细胞、平滑肌细胞、施旺细胞(Schwann cell)和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、莱迪希细胞(leydig cell)、管周细胞、塞托利细胞(sertoli cell)、黄体细胞、宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、滤泡细胞、黏液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、多巴胺能细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。此外，所述一种或多种细胞可以是胰岛细胞和/或细胞簇等，包括但不限于胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺F细胞(例如，PP细胞)或胰腺ε细胞。在一个实例中，所述一种或多种细胞可以是胰腺α细胞。在另一个实例中，所述一种或多种细胞可以是胰腺β细胞。

供体可处于任何发育阶段，包括但不限于胎儿期、新生儿期、幼年期和成年期。例如，可从成年人分离供体T细胞。供体人T细胞可以为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁以下的年龄。例如，可从6岁以下的人分离T细胞。还可从3岁以下的人分离T细胞。供体可以大于10岁。

本文公开的方法可包括移植。移植可以是自体移植、同种异体移植、异种移植或任何其他移植。例如，移植可以是异种移植。移植还可以是同种异体移植。

如本文所用的“异种移植”及其语法等同语可包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序，其中接受者和供体是不同的物种。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于异种移植至人体内。异种移植包括但不限于血管化异种移植、部分血管化异种移植、非血管化异种移植、异种覆盖物(xenodressing)、异种绷带(xenobandage)和异种结构。

如本文所用的“同种异体移植”及其语法等同语(例如，同种异体的移植)可包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序，其中接受者和供体是相同的物种但为不同个体。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于同种异体移植至人体内。同种异体移植包括但不限于血管化同种异体移植、部分血管化同种异体移植、非血管化同种异体移植、同种异体覆盖物(allodressing)、同种异体绷带(allobandage)和同种异体结构。

如本文所用的“自体移植”及其语法等同语(例如，自体的移植)可包括涉及将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序，其中接受者和供体是同一个体。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于进入自体移植至人体内。自体移植包括但不限于血管化自体移植、部分血管化自体移植、非血管化自体移植、自体覆盖物(autodressing)、自体绷带(autobandage)和自体结构。

治疗(例如，如本文所公开的任何治疗)后，相比于将一种或多种野生型细胞移植到接受者中，移植排斥反应可得到改善。例如，移植排斥可以是超急性排斥。移植排斥还可以是急性排斥。其他类型的排斥可包括慢性排斥。移植排斥还可以是细胞介导的排斥或T细胞介导的排斥。移植排斥还可以是自然杀伤细胞介导的排斥。

如本文所用的“改善”及其语法等同语可意指本领域技术人员所认识到的任何改善。例如，改善移植可意指减轻超急性排斥，其可包括不良作用或症状的减少、减轻或削弱。

移植后，所移植的细胞可在接受者中是功能性的。在一些情况下，功能性可确定移植是否成功。例如，移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天是功能性的。这可指示移植是成功的。这还可指示所移植的细胞、组织和/或器官没有排斥。

在某些情况下，所移植的细胞可以至少1天是功能性的。所移植的细胞还可以至少7天是功能性的。所移植的细胞可以至少14天是功能性的。所移植的细胞可以至少21天是功能性的。所移植的细胞可以至少28天是功能性的。所移植的细胞可以至少60天是功能性的。

成功移植的另一指示可以是接受者不需要免疫抑制治疗的天数。例如，在本文提供的治疗(例如，移植)之后，接受者可以至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天不需要免疫抑制治疗。这可指示移植是成功的。这还可指示所移植的细胞、组织和/或器官没有排斥。

在一些情况下，接受者可以至少1天不需要免疫抑制治疗。接受者还可以至少7天不需要免疫抑制治疗。接受者可以至少14天不需要免疫抑制治疗。接受者可以至少21天不需要免疫抑制治疗。接受者可以至少28天不需要免疫抑制治疗。接受者可以至少60天不需要免疫抑制治疗。此外，接受者可以至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年不需要免疫抑制治疗。

成功移植的另一指示可以是接受者需要减少免疫抑制治疗的天数。例如，在本文提供的治疗之后，接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。这可指示移植是成功的。这还可指示所移植的细胞、组织和/或器官没有排斥或具有最小的排斥反应。

例如，接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少1天。接受者还可以需要减少免疫抑制治疗至少7天。接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少14天。接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少21天。接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少28天。接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少60天。此外，接受者可以需要减少免疫抑制治疗至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。

如本文所用的“减少的”及其语法等同语可指与将一种或多种野生型细胞移植到接受者中时所需的免疫抑制治疗相比更少的免疫抑制治疗。

免疫抑制治疗可包括抑制免疫系统的任何治疗。免疫抑制治疗可帮助缓解、最大限度减少或消除接受者中的移植排斥。例如，免疫抑制治疗可包括免疫抑制药物。可在移植之前、期间和/或之后使用的免疫抑制药物不限于MMF(霉酚酸酯(Cellcept))、ATG(抗胸腺细胞球蛋白)、抗CD154(CD4OL)、抗-CD40(2C10、ASKP1240、CCFZ533X2201)、阿仑珠单抗(Campath)、抗CD20(利妥昔单抗)、抗IL-6R抗体(托珠单抗，Actemra)、抗IL-6抗体(sarilumab，olokizumab)、CTLA4-Ig(阿巴西普/Orencia)、贝拉西普(LEA29Y)、西罗莫司(Rapimune)、依维莫司、他克莫司(Prograf)、达利珠单抗(Ze-napax)、巴利昔单抗(Simulect)、英夫利昔单抗(Remicade)、环孢菌素、脱氧精胍菌素、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒因子、补体抑素(compstatin)、抗C5抗体(依库珠单抗/Soliris)、甲基强的松龙、FTY720、依维莫司、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，一种或多于一种免疫抑制剂/药物可一起使用或依次使用。一种或多于一种免疫抑制剂/药物可用于诱导治疗或用于维持治疗。可在诱导和维持阶段使用相同或不同的药物。在一些情况下，达利珠单抗(Zenapax)可用于诱导治疗，而他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。达利珠单抗(Zenapax)还可用于诱导治疗，而低剂量的他克莫司(Prograf)和低剂量的西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。还可使用非药物方案来实现免疫抑制，其包括但不限于全身照射、胸腺照射和全部和/或部分脾切除术。这些技术还可与一种或多种免疫抑制药物联合使用。

离体细胞转染还可用于诊断、研究或基因疗法(例如，通过将转染的细胞再输注到宿主生物体内)。在一些情况下，从受试生物体分离细胞，用核酸(例如，基因或cDNA)转染，并再输注回受试生物体(例如，患者)内。

在移植之前、之后和/或期间的细胞(例如，工程化细胞或工程化原代T细胞)可以是功能性的。例如，所移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100天是功能性的。所移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月是功能性的。所移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30年是功能性的。在一些情况下，所移植的细胞可以在最长接受者的一生中是功能性的。

此外，所移植的细胞可发挥其正常预期作用的100％的功能。移植的细胞还可发挥其正常预期作用的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能。

所移植的细胞还可发挥其正常预期作用的超过100％的功能。例如，移植的细胞可发挥其正常预期作用的110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高百分比的功能。

实施例

通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。所提供的这些实施例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不意在限制性。因此，本发明绝不应当被解释为限于以下实施例，而应当被解释为涵盖由于本文所提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

实施例1

CEA特异性CAR T细胞的生成和功能性表征

本实施例描述了CEA特异性CAR的生成及其在人T细胞中的功能性表达。特别地，设计携带CD28/CD3ζ信号传导结构域的CEA特异性CAR并进行功能性评价。

载体设计。如前所述构建并制备Ad5[E1-，E2b-]。由用培养的人结肠癌细胞进行免疫的BALB/c小鼠来生成CEA杂交瘤。从杂交瘤中分离出scFv CEA，然后与人IgG1-CH2CH3结构域、CD28共刺激胞内结构域和CD3ζ链框内克隆到Ad5[E1-，E2b-]骨架中(Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR)。

病毒上清液的产生。对于腺病毒的产生，将合适的包装细胞(E.C7细胞)以每皿1.2×10⁶个细胞接种到10-cm培养皿中。24小时后，用10μg腺病毒载体DNA使用转染试剂(例如，FuGENE 9Promega或X-treme gene 9Roche Diagnostics)转染细胞，并在37.0℃下温育72小时。然后将来自这些细胞的条件培养基(病毒上清液)通过超速离心(Millipore)纯化，并分离高滴度的病毒上清液。

Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR在T细胞中的表达。为了产生CEA特异性T细胞，将原代人T细胞从人外周血单个核细胞(PBMC)分离出并激活。特别地，使用人T细胞扩充的珠子(LifeTechnologies)从PBMC物质中选择CD3⁺细胞，并在具有100IU ml^-1rh-IL-2的24孔板中每孔激活1.5×10⁶个CD3⁺细胞。48小时后，将0.2×10⁶至0.5×10⁶个活化的CD3⁺细胞重新悬浮于0.5ml的收获的逆转录病毒上清液和0.5ml的补充有rh-IL-2(100IU ml^-1终浓度)的培养基中，并转移至Retronectin(Takara)包被的板中。将板以430g离心90分钟。转导后48小时，收集细胞并重新接种到具有0.5×10⁶/ml的100IU ml^-1rh-IL-2的24孔板中。

Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR在T细胞中的检测。使用缀合的CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L和CCR7mAb(BDBiosciences)鉴定表达Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR的T淋巴细胞。使用识别人IgG1-CH2CH3片段的抗体(Jackson ImmunoResearch)来评估T淋巴细胞中的CAR表达。使用BDFACs CellQuestPro软件(BD Biosciences)在FACsCaliber流式细胞仪上进行分析。

细胞和细胞系。对于下文描述的所有测定，使用效应细胞、靶细胞和阴性对照细胞。效应细胞通常是指用Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR转导的T细胞。靶细胞通常是自然表达CAR所针对的靶标(CEA抗原)的肿瘤细胞。阴性对照细胞通常是不表达CAR所针对的靶标(CEA阴性)的细胞。

实施例2

表达Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR的T细胞的功能性表征

细胞内IFN-γ染色

本实施例描述了通过细胞内IFN-γ染色对表达Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR的T细胞的功能性表征。为了评估转导的T细胞的潜在细胞毒效应，进行不同的细胞毒性测定。测试了表达Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR的T细胞识别人结肠癌细胞及其随后活化的能力。通常，表达CAR的T细胞的活化可通过用同源抗原(例如，CEA)刺激后的IFN-γ(或相当的细胞因子)产生来测量。1×10⁵个CAR转导的T细胞与表达CAR的同源抗原的1×10⁵个CEA+肿瘤细胞一起温育(在本实施例中，CEA+肿瘤细胞与抗CEA特异性CAR一起)。在37℃下在1μl ml^{- 1}Golgiplug(BD Biosciences)的存在下温育16小时后，将细胞洗涤并用针对CD3、CD8(均来自BD Biosciences)的抗体和合适的活/死细胞染料(IR染料，Life Technologies)来染色。随后根据制造商的说明，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)和抗IFN-γ抗体(BD Biosciences)，通过流式细胞术在单细胞基础上测定IFN-γ的细胞内水平。通过将用识别人IgG1-CH2CH3片段的抗体(Jackson ImmunoResearch)所测量的Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR CD8⁺T细胞的频率校正IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的百分比来对数据进行归一化。

ELISA。此外，使用ELISA来测量用Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR转导并用CEA+细胞和CEA-(对照细胞)刺激的T细胞的培养上清液中的IFN-γ水平。

⁵¹铬释放测定细胞毒性测定。为了评估转导的T细胞的潜在细胞毒效应，进行不同的细胞毒性测定。在用于细胞介导的细胞毒性的⁵¹铬释放测定中，将靶细胞用100μCu ⁵¹Cr标记过夜，并与转导的T细胞以在30:1与0.3:1之间变化的5种不同的效应物-靶标比(E:T)温育4-5h。特异性裂解的百分比如下计算：(实验cpm-基础cpm)/(最大cpm-基础cpm)×100，在5％triton的存在下测定最大裂解，并在不存在效应细胞的情况下测定基础裂解。

CMTMR细胞毒性测定。在另一个细胞毒性测定中，将CEA阴性对照细胞以1.5x10⁶个细胞/mL的浓度悬浮于培养基中，并添加5μM浓度的荧光染料5-(和6-)-(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基)四甲基罗丹明(CMTMR)(Invitrogen)。将细胞混合，然后在37℃下温育30分钟。然后将细胞洗涤并悬浮于细胞毒性培养基中。接下来，将CEA阴性对照细胞在37℃下温育60分钟。然后将细胞洗涤两次并悬浮于细胞毒性培养基中。将靶细胞(CEA+)以1x10⁶个细胞/mL悬浮于PBS+0.1％BSA中。将荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen)以1μM的浓度添加至该细胞悬浮液中。将细胞在37℃下温育10分钟。温育后，通过添加与细胞悬浮液体积相等体积的FBS来终止标记反应，并将细胞在室温下温育2分钟。将细胞洗涤并悬浮于细胞毒性培养基中。

随后，将效应T细胞(Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR)洗涤并以5x10^6个细胞/mL悬浮于细胞毒性培养基中。在所有实验中，将Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR T细胞的细胞毒性与来自用阴性对照CAR T(Ad5[E1-，E2b-]-CD19.CAR)转导的同一患者的阴性对照效应T细胞或未转导的细胞的细胞毒性进行比较。对于效应T细胞和阴性对照效应T细胞，在无菌5mL试管(BDBiosciences)中以下列T细胞:靶细胞比例一式两份建立培养物：10:1、3:1和1:1。靶细胞为来自CEA+患者的50,000个。每个培养物还含有50,000个阴性对照细胞。此外，建立仅包含靶细胞加上阴性对照细胞的试管。将培养物在37℃下温育4小时。培养后立即按制造商的推荐添加7AAD(7-氨基放线菌素D)(BD Pharmingen)，并且将用BD FacsCanto II(BDBiosciences)进行流式细胞术采集。用FlowJo(Treestar，Inc.Ashland，OR)进行分析。对7AAD-阴性(活)细胞的分析进行门控，并确定每种T细胞+靶细胞培养物的活靶细胞和活阴性对照细胞的百分比。对于每种T细胞+靶细胞培养物，通过将活靶细胞百分比除以活阴性对照细胞百分比来确定靶细胞的存活百分比。

通过将每个T细胞+靶细胞培养物中靶细胞的存活百分比除以仅含有靶细胞和阴性对照细胞而无任何效应T细胞的管中靶细胞百分比:阴性对照细胞百分比的比率来计算靶细胞的校正存活百分比。该校正对于解释起始细胞数和自发靶细胞死亡的变化是必要的。如下计算细胞毒性：靶细胞的细胞毒性百分比＝100-校正的靶细胞存活百分比。对于所有效应物：靶标比率，一式两份测定细胞毒性，并将结果取平均值。

增殖测定。通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯稀释测定(Hudecek M,Lupo-Stanghellini MT,Kosasih PL,Sommermeyer D,Jensen MC,Rader C等人)来确定暴露于靶细胞(CEA+)后的Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR T细胞的增殖。

转导后一周，将对照(Ad5[E1-，E2b-]-CD19.CAR)和Ad5[E1-，E2b-]-CEA.CAR⁺T淋巴细胞用1.5μmol/L羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen)标记，并与经照射的肿瘤靶标(CEA阳性和CEA阴性系)以5:1的效应物-靶标(E:T)比率一起接种。在共培养的第4天，通过流式细胞术对CD4⁺和CD8⁺T细胞测量CFSE稀释。

实施例3

CEA特异性CAR T细胞的临床扩充

本实施例描述了CEA特异性CAR T细胞的临床扩充。为了产生大量转导的T细胞，使用快速扩充方案(REP)诱导细胞增殖。如上所述，在用于REP之前，将T细胞与抗CD3、抗CD28和IL-2一起开始培养，并在培养开始后第二天进行转导。将细胞在75cm²烧瓶中在37℃和5％CO₂下培养。每两天对细胞进行计数并以0.5×10⁶个细胞/mL的浓度悬浮于含300IU/mL的IL-2的新鲜T细胞培养基中，其余时间将其保持于培养物中。

包括表2中所示的任何分子在内的共刺激结构域包括于以上所述的CEA载体中，以增强所得CEA特异性CAR T细胞的免疫原性。

表2共刺激结构域

Claims (81)

1.一种细胞，其包含：

(a)至少一种工程化受体；以及

(b)至少一个染色体外腺病毒基因组；

其中所述腺病毒基因组在腺病毒基因区域中具有至少一个缺失并编码所述工程化受体。

2.如权利要求1所述的细胞，其中所述工程化受体为嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)或其衍生物。

3.如权利要求1和2所述的细胞，其中所述工程化受体为嵌合抗原受体(CAR)。

4.如权利要求2和3所述的细胞，其中所述CAR为第一代CAR。

5.如权利要求2和3所述的细胞，其中所述CAR为第二代CAR。

6.如权利要求2和3所述的细胞，其中所述CAR为第三代CAR。

7.如权利要求2至6中任一项所述的细胞，其中所述CAR包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分。

8.如权利要求7所述的细胞，其中所述细胞内部分包含至少一个T细胞共刺激结构域。

9.如权利要求8所述的细胞，其中所述T细胞共刺激结构域选自CD27、CD28、TNFRS9(4-1BB)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF8(CD30)、CD40LG(CD40L)、ICOS、ITGB2(LFA-1)、CD2、CD7、KLRC2(NKG2C)、TNFRS18(GITR)、TNFRSF14(HVEM)或其任意组合。

10.如权利要求1至9中任一项所述的细胞，其中所述工程化受体结合靶标。

11.如权利要求10所述的细胞，其中所述结合是不依赖MHC的。

12.如权利要求10所述的细胞，其中所述结合是依赖MHC的。

13.如权利要求10至12所述的细胞，其中所述结合对疾病相关靶标是特异性的。

14.如权利要求13所述的细胞，其中所述疾病为癌症。

15.如权利要求14所述的细胞，其中所述癌症为实体瘤。

16.如权利要求14所述的细胞，其中所述癌症为液体瘤。

17.如权利要求1至16中任一项所述的细胞，其中所述受体结合靶抗原。

18.如权利要求17所述的细胞，其中所述靶抗原为肿瘤细胞新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、促分裂原或其组合。

19.如权利要求17至18中任一项所述的细胞，其中所述靶抗原选自癌胚抗原(CEA)、人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、人乳头瘤病毒(HPV)、粘蛋白1(MUC1)、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、Brachyury、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、BRCA1、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7 T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα或TEL/AML1，或其修饰变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂或组合。

20.如权利要求1至19中任一项所述的细胞，其中所述受体结合肿瘤相关细胞。

21.如权利要求20所述的细胞，其中所述肿瘤相关细胞选自成纤维细胞、癌症干细胞、周细胞和基质细胞。

22.如权利要求1至21中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含次级受体。

23.如权利要求22所述的细胞，其中所述次级受体为柯萨奇腺病毒受体。

24.如权利要求1至23中任一项所述的细胞，其中所述染色体外腺病毒基因组为腺病毒血清型5(Ad5)。

25.如权利要求1至24中任一项所述的细胞，其中所述腺病毒基因区域中的缺失为早期区域1(E1)基因区域中的缺失、早期区域2b(E2b)基因中的缺失、早期区域3(E3)基因中的缺失或其组合。

26.如权利要求1至25中任一项所述的细胞，其中所述腺病毒基因区域中的缺失为早期区域2b(E2b)基因区域中的缺失。

27.如权利要求1至26中任一项所述的细胞，其中所述腺病毒基因区域中的缺失为早期区域1(E1)基因、早期区域2b(E2b)基因和早期区域3(E3)基因中的缺失。

28.如权利要求1至27中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含外源基因。

29.如权利要求28所述的细胞，其中所述外源基因选自自杀基因、细胞因子基因、抗血管生成基因、代谢基因或缺氧基因。

30.如权利要求1至29中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含内源基因缺失。

31.如权利要求1至30中任一项所述的细胞，其中所述细胞为免疫细胞。

32.如权利要求31所述的细胞，其中所述免疫细胞为T细胞。

33.如权利要求32所述的细胞，其中所述T细胞为效应(T_EFF)细胞、效应记忆(T_EM)细胞、中枢记忆(T_CM)细胞、T记忆干(T_SCM)细胞、幼稚(T_N)细胞或者CD4+或CD8+细胞。

34.如权利要求1至33中任一项所述的细胞，其中所述细胞为灵长类动物细胞。

35.如权利要求1至34中任一项所述的细胞，其中所述细胞为人细胞。

36.如权利要求1至35中任一项所述的细胞，其中离体扩充所述细胞。

37.如权利要求1至36中任一项所述的细胞，其中所述细胞被配制为药物组合物。

38.如权利要求1至37中任一项所述的细胞，其中所述细胞是用于治疗有需要的受试者的联合治疗的一部分。

39.如权利要求1至38中任一项所述的细胞，其中所述工程化受体被整合到所述有需要的受试者的基因组中。

40.一种制备细胞的方法，其包括使细胞与包含至少一种外源受体序列的至少一种工程化染色体外载体离体接触。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述染色体外载体为腺病毒载体。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述腺病毒载体为腺病毒血清型5(Ad5)。

43.如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述载体具有至少一个基因缺失。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述缺失为早期区域1(E1)基因和早期区域3(E3)基因的区域中的缺失。

45.如权利要求43所述的方法，其中所述缺失为早期区域2b(E2b)基因中的缺失、早期区域3(E3)基因中的缺失或其组合。

46.如权利要求40至45中任一项所述的方法，其中所述载体包含早期区域1(E1)基因、早期区域2b(E2b)基因和早期区域3(E3)基因中的缺失。

47.如权利要求40至46中任一项所述的方法，其中所述载体不是无内容载体。

48.如权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述外源受体之前引入至少一种次级受体。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述次级受体为柯萨奇腺病毒受体。

50.如权利要求40至49中任一项所述的方法，其中所述外源受体序列选自嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)或其衍生物。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述外源受体序列编码嵌合抗原受体(CAR)。

52.如权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述载体还包含第二外源基因序列。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述外源基因序列选自自杀基因、细胞因子基因、抗血管生成基因、代谢基因和缺氧基因。

54.如权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述第二外源基因序列包含诱导型自杀基因序列。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述诱导型自杀基因序列为诱导型胱天蛋白酶9基因序列或EGF受体R序列的一部分。

56.如权利要求40至55中任一项所述的方法，其中所述外源受体序列经由至少一种载体被引入所述细胞内。

57.如权利要求40至56中任一项所述的方法，其中所述细胞被离体活化。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述活化在引入所述外源受体序列之前发生。

59.如权利要求57至58中任一项所述的方法，其中用抗CD3(OKT3)、抗CD28、至少一种细胞因子或其任意组合进行所述活化。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述细胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、白介素-21(IL-21)或其任意组合。

61.如权利要求40至60所述的方法，还包括扩充所述细胞。

62.如权利要求40至61中任一项所述的方法，其中所述细胞对于有需要的受试者而言是自体的。

63.如权利要求40至61中任一项所述的方法，其中所述细胞对于有需要的受试者而言是同种异体的。

64.如权利要求62至63中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者对所述腺病毒载体具有预先存在的免疫力。

65.如权利要求40至64中任一项所述的方法，其中所述细胞是与优质生产规范(GMP)相容的试剂。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述试剂是用于治疗癌症的联合治疗的一部分。

67.一种药物组合物，其包含如权利要求1至39中任一项所述的细胞或根据权利要求40至66中任一项制备的细胞。

68.一种治疗有需要的受试者中的病况的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求67所述的药物组合物。

69.如权利要求68所述的方法，其中静脉内施用所述药物组合物。

70.如权利要求68所述的方法，其中所述药物组合物局部施用于肿瘤。

71.如权利要求68至70中任一项所述的方法，还包括施用一种或多种额外的治疗剂或用一种或多种额外的疗法治疗所述受试者。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述用一种或多种额外的疗法治疗所述受试者包括移植。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述用一种或多种额外的疗法治疗所述受试者包括免疫治疗。

74.如权利要求68至73中任一项所述的方法，其中所述药物组合物对于所述受试者而言是自体的。

75.如权利要求68至74中任一项所述的方法，其中所述药物组合物对于所述受试者而言是同种异体的。

76.如权利要求68至75中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用包含工程化天然杀伤(NK)细胞群体的药物组合物。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制受体)表达的NK细胞，一种或多种已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及一种或多种已被修饰以表达一种或多种CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞，或其任意组合。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰为基本上缺乏KIR表达的NK细胞。

79.如权利要求77所述的方法，其中所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。

80.如权利要求77所述的方法，其中所述工程化NK细胞包括一种或多种已被修饰以表达一种或多种CAR的NK细胞。

81.如权利要求77或80所述的方法，其中所述CAR为肿瘤新抗原、肿瘤新表位、HPV、PSA、PSMA、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER1、HER2/neu、HER3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任意组合的CAR。