CN109706223B - 一种基于纳流控的MicroRNA检测方法 - Google Patents

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本发明公开了一种基于纳流控的MicroRNA检测方法，采用多孔阳极氧化铝模板，在电渗流的作用下驱使MicroRNA分子到达多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面，在纳流控系统中对MicroRNA分子进行电化学定量检测；所述多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面修饰有ssDNA分子探针。该方法通过纳流控系统固有优势和特殊的物质传输性质，无需额外的标记过程，在一个简单的纳流控通道的离子通道外表面上实现生物分子识别的无标记、快速、高灵敏的检测，特别适用于珍贵生物样品的检测。

Description

一种基于纳流控的MicroRNA检测方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用纳流控实现MicroRNA高灵敏检测的方法。
背景技术
MicroRNAs (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。研究表明miRNA 表达失调或过度表达与一系列的疾病直接相关，尤其是癌症、心脏病和糖尿病。因此，miRNA 在癌症的诊断和治疗中被认为是重要的肿瘤标记物。因此，发展一种超灵敏度的miRNA的检测方法在临床中具有重要的意义。目前，检测miRNA方法很多，包括分子印迹法、荧光法、电化学法、表面等离子体共振法、和表面增强拉曼光谱法等。虽然这些方法在推动miRNA检测的研究中至关重要，但它们需要大量的样本和繁琐的实验过程，阻碍了它们在实际诊断中的实际应用。
纳米通道或纳米孔作为一门新兴学科，具有独特的尺寸效应和显著的纳米限域空间结构。基于纳米孔/通道的纳米流体作为检测平台，在化学和生物医学领域有着广泛的应用。这些有趣的观察将为纳米流体平台在生物传感和分析中的应用带来新的方法。
相比于单纳米孔/通道，多孔阳极氧化铝膜通道阵列具有优异的化学和机械稳定性、高孔密度和大小尺寸可调性，可以由几个数量级的离子电流的放大，同时减少背景噪音干扰，使检测更灵敏。利用多孔阳极氧化铝膜通道阵列已实现包括蛋白质、DNA，金属离子，肿瘤标志物和淀粉样β聚集动力学的检测。这种新的纳米孔道阵列提供了一种简单的、无标记的、超灵敏的分子/离子检测和分子识别过程的监测的平台。但是，以前使用的多孔阳极氧化铝膜通道阵列多为多孔层的纳米通道，最近，证实了多孔阳极氧化铝膜通道阵列的障碍层存在离子通道，其尺寸大小在0～0.8nm，从而实现蛋白质富集，这种纳米通道-离子通道复合结构的潜在应用，有望给传感、能量转换和净化技术的发展带来新的机会。
发明内容
本发明的目的是解决现有MicroRNA检测方法的不足，提供一种基于纳流控系统的简单、快速、高灵敏无标记检测MicroRNA的新方法。该方法通过纳流控系统固有优势和特殊的物质传输性质，无需额外的标记过程，在一个简单的纳流控通道的离子通道外表面上实现生物分子识别的无标记、快速、高灵敏的检测，特别适用于珍贵生物样品的检测。
为了实现上述发明目的，采用以下技术方案：
一种基于纳流控的MicroRNA检测方法，采用多孔阳极氧化铝模板，在电渗流的作用下驱使MicroRNA分子到达多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面，在纳流控系统中对MicroRNA分子进行电化学定量检测；
所述多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面修饰有ssDNA分子探针。
进一步地，所述多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面修饰有ssDNA分子探针是先将多孔阳极氧化铝模板进行氨基化修饰，然后ssDNA分子探针的羧基与氨基发生缩合。
进一步地，所述氨基化修饰是采用硅烷化试剂进行。
进一步地，所述硅烷化试剂为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷或γ-氨丙基三乙氧硅烷。
与现有生物分子识别检测技术相比，本发明的优点是：
1、多阳极氧化铝模板通过二次氧化法制备得到，制备过程简单，成本低。
2、纳流控通道的独特的尺寸效应和显著的纳米限域空间结构，实现对ssDNA分子探针的化学固定。
3、纳流控通道的高度不对称特性导致一个独特的离子整流现象，实现独特的物质传输使整个miRNA检测限降低，检测灵敏显著提高；
4、该法是一种结合电化学技术的无标记、超灵敏的miRNA纳流控新方法，特别适用于对皮克和飞克级生物样品的检测。
附图说明
图1为本发明的检测方法用于检测miRNA-10b的原理示意图。
图2为本发明中检测miRNA所用的电化学检测装置。
图3为实施例1制得的多孔阳极氧化铝模板的扫描电镜照片，A是多孔阳极氧化铝模板下表面的离子通道一侧，B是多孔阳极氧化铝模板上表面的多孔层一侧，C是多孔阳极氧化铝模板的横截面图，D是多孔阳极氧化铝模板的侧面。
图4为实施例1中ssDNA分子探针固定在离子通道后的XPS图，a为固定的烷基化试剂APTMS中的硅元素的XPS曲线，b为 ssDNA探针分子中的磷元素的XPS表征。
图5为实施例1中ssDNA探针修饰的离子通道的红外光谱图。
图6为实施例1中在pH 7.4条件下不同miRNA-10b浓度的电流-电压关系图。
图7为实施例1中在+1.0 V电压下，不同miRNA-10b浓度自然对数值（logC）-电流关系图。
图8为实施例2中检测不同microRNA的电流-电压关系图。
图9为实施例3中采用RNase H酶多次处理前后的电流变化结果。
图10为实施例4中不同浓度的细胞与电流值关系柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
如图1所示，本发明公开了一种实现microRNA高灵敏检测的纳流控新方法，基于纳流控通道独特的物质传输性质和尺寸效应，实现了ssDNA分子探针的化学固定和miRNA的超灵敏检测。
所述的纳流控是为多孔阳极氧化铝，采用二次氧化法制备，包括多孔层和障碍层。所述的多孔层存在纳米通道；所述的障碍层存在离子通道，在离子通道外表面有ssDNA分子探针构筑功能化纳流控系统，该系统结合电化学装置的固有优势和纳米管道的独特性质，从而用于miRNA的高灵敏检测。
所述的ssDNA分子探针通过化学方法固定在离子通道外表面，且ssDNA分子探针尺寸大于离子通道。具体地，在离子通道外表面有羟基，先采用带有氨基的硅烷化试剂与离子通道表面的羟基形成-Si-O-键，然后带有羧基的ssDNA分子探针与硅烷化试剂的氨基发生缩合。
如图2所示，所述的miRNA分子通过电化学工作站实现定量检测。在电渗流的作用下，驱使miRNA分子到达离子通道外表面，探针分子与miRNA杂交，从而实现在纳流控系统中对miRNA分子进行电化学定量检测。
所述miRNA为能与所述ssDNA发生杂交的任意miRNA。在本发明的一个实施例中采用miRNA-10b。
实施例1
（1）多孔阳极氧化铝模板的制作。采用二次阳极氧化法制备多孔阳极氧化铝模板，多孔阳极氧化铝模板的纳米通道的直径和深度通过温度、电压和氧化时间调控。最后通过多步化学固定使探针分子固定在多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面。
具体方法为：
（1-1）采用阳极氧化法制备多孔阳极氧化铝模板；
（1-2）对步骤（1-1）所得产物用过氧化氢煮沸，再用水清洗；
（1-3）将经过步骤（1-2）得到的多孔阳极氧化铝模板的离子通道一侧放入丙酮与3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（体积比为8-9:1-2）的混合溶液中浸泡8-24h、烘干；
（1-4）将经过步骤（1-3）得到的多孔阳极氧化铝模板的离子通道一侧加入ssDNA溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS（体积比为1-2:8:8）的混合溶液，在4℃下浸泡8-24h。
所述的ssDNA为任意的DNA，其溶液的溶剂为PBS溶剂，其中ssDNA的浓度为100nM~100μM。所述ssDNA溶液需先和EDC反应10-30分钟，体积比为1-2：8，然后加入与EDC相同体积的NHS，所述EDC的浓度为0.8-1.0mg/mL，所述的NHS的浓度为0.7-0.9 mg/mL。
图3是制备的多孔阳极氧化铝模板的扫描电镜的表征，A是多孔阳极氧化铝模板的下表面的离子通道一侧，可以看出明显的六边形；B是多孔阳极氧化铝模板上表面的多孔层一侧，可以看出，孔道尺寸大约为40nm左右；C多孔阳极氧化铝模板的横截面图，可以看出通道相互平行排列；D是多孔阳极氧化铝模板的厚度，大约是50μm。
通过化学固定修饰上ssDNA探针，由上述 （1-3）和（1-4）可知，硅烷化试剂-3-氨丙基三甲氧基硅氧烷与ssDNA通过-NH2和-COOH酯化相连。图4采用XPS的方法对修饰上的3-氨丙基三甲氧基硅氧烷APTMS和ssDNA进行表征，a为固定的烷基化试剂APTMS中的硅元素的XPS曲线，b为 ssDNA探针分子中的磷元素的XPS表征，可以证明ssDNA成功固定在离子通道表面。
图5对-NH2和-COOH酯化形成的酰胺键进一步红外表征。由上述表征可以得出，ssDNA成功固定在多阳极氧化铝模板上。
（2）采用纳流控系统检测miRNA-10b。适体探针修饰后，采用Ag/AgCl电极获得了跨膜电位从而测定经纳流控系统的离子电流进行电化学检测，不同浓度的miRNA-10b溶液分别加入离子通道一侧，在电渗流条件下，到达外表面，与适体发生分子识别，得到不同条件下的电流-电压关系曲线，如图6所示。提取不同浓度对应的电流值，构建miRNA-10b与之相对应浓度梯度的标准曲线，如图7所示，线性关系良好。由图可知，本发明的检测可以实现miRNA-10b的超灵敏检测，检测限低至15.4 aM。
实施例2
选择性实验
本实施例所采用的多孔阳极氧化铝模板制备方法同实施例1，其中步骤2中miRNA-10b换成不同的microRNA，在其它条件不变情况下，进行电化学检测。
图8是不同microRNA的电流改变值，可以看出，本发明提出的纳流控系统对miRNA-10b有高的选择性。
实施例3
可逆性实验
本实施例制备方法同实施例1，纳流控系统的可逆性加入RNase H酶得到，如图9所示，在pH 7条件下，miRNA与ssDNA杂交，用RNase H酶的溶液处理后电流又恢复到杂交状态，这个循环至少可以达到6次，说明miRNA特异性的纳流控通道复合结构可以循环使用，减少了资源的浪费。
实施例4
实际样品中miRNA-10b检测
本实施例制备方法同实施例1，其中步骤2中的miRNA-10b溶液换为实际细胞样品中的miRNA-10b溶液，在其它条件不变情况下，同样得到电流-电压关系曲线，如图10所示，可以看出，该纳流控系统能检测出实际细胞样品中的miRNA-10b分子。

Claims (1)

1.一种基于纳流控的MicroRNA检测方法，其特征在于：
采用多孔阳极氧化铝模板，在电渗流的作用下驱使MicroRNA分子到达多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面，在纳流控系统中对MicroRNA分子进行电化学定量检测；
所述多孔阳极氧化铝模板的离子通道外表面修饰有ssDNA分子探针，具体是先将多孔阳极氧化铝模板进行氨基化修饰，然后ssDNA分子探针的羧基与氨基发生缩合；
所述氨基化修饰是采用硅烷化试剂进行，所述硅烷化试剂为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷或γ-氨丙基三乙氧硅烷。
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