CN109694403A - 大豆铁代谢相关基因GmIMD的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供大豆铁代谢相关基因GmIMD的应用，所述应用至少包括提高植物对铁元素的利用率以及提高植物叶片叶绿素含量。本发明首次揭示了GmIMD基因的生物学功能，该基因是植物中参与铁代谢过程的一个基因，特别是在大豆发育过程中涉及铁含量调控。本发明为推动植物铁代谢的深入研究，以及培育铁高效利用优质大豆新品种提供宝贵的基因资源。

Description

大豆铁代谢相关基因GmIMD的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物遗传育种领域，具体地说，涉及大豆铁代谢相关基因GmIMD的应用。

背景技术

铁在生物体的生命过程中起着很重要的作用，是生物体生存所必需的矿物质元素。虽然铁在地壳中含量丰富，但被生物体利用效率却非常低。豆科作物如大豆最易缺铁，因为铁是豆血红素和固氮酶的成分，植株缺铁使根瘤菌的固氮作用减弱，植株矮小，上部叶片脉间黄化，并有轻度卷曲，严重时新叶呈黄白色，叶缘附近出现许多褐色斑点，进而坏死。由于植物吸收和利用外源施加铁元素效率低的问题，为此目前还不能通过施肥来解决，只能靠植物自身吸收利用铁能力的提高来解决。因此，研究铁代谢与植物铁营养一直是目前农业界上一直讨论的热点而未有突破的问题。植物要完成正常的生长发育不仅需要从环境中吸收充足的铁，更需要铁在植物体内的高效转运和在各个器官中的合理分配从而使产量和品质得以提升，因此铁代谢相关基因的挖掘显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供大豆铁代谢相关基因GmIMD的应用。

本发明中，通过筛选大豆突变体库找到了一个与铁代谢相关的黄化突变体，经粗定位和精细定位最后将突变体目标基因定位在2号染色体的7.29Mb-7.46Mb之间，经测序分析获得了目标基因，将其命名为GmIMD(Glycine max iron metabolic disorder)。通过氨基酸同源性分析，该基因与拟南芥AtMFL1铁转运蛋白的氨基酸序列具有一定相似性。因此，推测GmIMD基因可能是一个铁转运蛋白。

基因GmIMD编码的蛋白质为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

为了实现本发明目的，本发明提供大豆铁代谢相关基因GmIMD的以下任一应用：

1)提高植物对铁元素利用率中的应用；

2)提高植物叶片叶绿素含量中的应用；

3)在植物育种中的应用。

前述的应用包括：

i)使植物包含基因GmIMD；或者，

ii)使植物表达基因GmIMD。

本发明所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选大豆。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次揭示了GmIMD基因的生物学功能，该基因是植物中参与铁代谢过程的一个基因，特别是在大豆发育过程中涉及铁含量调控。本发明为推动植物铁代谢的深入研究，以及培育铁高效利用优质大豆新品种提供宝贵的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型‘菏豆12’(HD12)叶片与Gmimd突变体叶片表型比较。

图2为本发明实施例2中Gmimd基因在大豆2号染色体上的定位结果。

图3为本发明实施例3中野生型‘菏豆12’叶片与Gmimd突变体叶片叶绿素含量比较。其中：Ca：叶绿素a；Cb：叶绿素b；Ca+b：叶绿素a+叶绿素b。

图4为本发明实施例4中野生型‘菏豆12’与Gmimd突变体叶片中含铁量比较结果。

图5为本发明实施例5中pCAMBIA3301-GmIMD植物过表达载体PCR检测结果。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-4：GmIMD基因PCR产物。

图6为本发明实施例2中“菏豆12”与Gmimd突变体的GmIMD基因序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 Gmimd突变体群体的构建及表型分析

通过筛选“菏豆12”大豆伽玛辐射诱变突变体库，经过4代突变体种植、表型观察及统计分析获得了稳定遗传、符合孟德尔遗传定律(3：1分离比)的Gmimd突变体。通过与远源品种Williams82杂交构建了用于图位克隆的F2分离群体。表型观察结果表明，与野生型‘菏豆12’相比，Gmimd突变体的叶片明显呈现出边缘黄化、白化和斑点失绿的表型变化(图1)。

实施例2大豆铁代谢相关基因GmIMD的定位

用Gmimd与Williams82的F2分离群体进行基因定位。粗定位结果表明，突变位点位于2号染色体5.2Mb-11.4Mb之间。为进一步确定Gmimd突变体基因的位置，在2号染色体5.2Mb-11.4Mb之间区域设计新的Indel分子标记和SNP分子标记对突变体单株进行精细定位，最后将Gmimd突变体的基因定位在2号染色体的7.29Mb-7.46Mb之间170kb区间(图2)。此170kb区间内，共有20个候选基因，通过对Gmimd突变体的全基因组重测序发现，除了GmIMD基因存在碱基突变外，其它基因的基因组序列与原基因组序列完全一致。因此，我们推断致使Gmimd突变体的叶片明显呈现出边缘黄化、白化和斑点失绿的表型是由GmIMD基因突变所导致的。“菏豆12”与Gmimd突变体的GmIMD基因序列比对结果见图6。

实施例3 Gmimd突变体叶绿素含量的测定

通过测定野生型‘菏豆12’与Gmimd突变体叶片叶绿素含量发现：野生型‘菏豆12’与Gmimd突变体的叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素含量之间均存在显著差异。突变体较野生型叶绿a，叶绿素b，总叶绿素含量分别减少了60.91％，54.93％，59.63％(图3)。因此，我们推测该基因的突变可能导致大豆叶片叶绿素合成受阻，致使大豆突变体叶片叶绿素含量下降。

实施例4 Gmimd突变体叶片中铁含量的测定

通过测定野生型‘菏豆12’与Gmimd突变体的叶片铁含量，结果表明，Gmimd突变体叶片铁含量较野生型‘菏豆12’叶片铁含量显著性增高(图4)。前期通过对Gmimd突变体进行图位克隆获得的基因与拟南芥AtMFL1基因具有一定的同源性，在拟南芥中AtMFL1基因定位在叶绿体上，可能参与铁转运进入叶绿体。因此，推测在大豆中GmIMD基因可能是一个铁转运蛋白，它的突变可能导致植物从体外吸收的铁大部分处于无效铁状态或无法正常转运到叶绿体中，这样就使铁不能正常运输到植物体的其它组织、器官或细胞中，从而导致铁在叶片质外体中大量积累，致使大豆突变体的叶片铁的含量增高。

实施例5 GmIMD基因的克隆

通过RT-PCR扩增(引物为OL4989:AGGACCTCGAGAATTCATGGAGGCCAGGGTCTCAT和OL4990:CGTGGTTGTAAAGCTTTCAACCAGAGGAGACAGAGACTTC)得到GmIMD基因，并利用Clontech公司的In-Fusion HD系统将其成功构建到植物表达载体pCAMBIA3301中(图5)，为后期大豆遗传转化和研究基因功能奠定基础。

‘菏豆12’野生型大豆的基因GmIMD CDS序列如SEQ ID NO:1所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120> 大豆铁代谢相关基因GmIMD的应用

<130> KHP191110263.4

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atggaggcca gggtctcatc ttctctcggc ctcccttccc ccaaacccca ccaattctca 60

gtctcaaacc tcaccgattt cccttctctc ttcacacaca cccccactct ccccttcgcc 120

tccacctcca aatgggcccg gcccacccca aagcccaacc caaagcccct cctcaaaacc 180

ctctccgtcc tcgaccgcgc cctcatcggc gccgccgcgg gcggcctcgc cggcgccttc 240

acttacgtct gcctcctccc cctcgatgcc atcaaaacca agatgcagac caagggcgcg 300

gcacagattt acaaaaacac cctcgacgca atcgtgaaaa ccttccagtc cgaaggcatc 360

ctcggcttct acagcggcgt gtccgcggtc gtcgtcggct ctaccgcctc ctccgccgta 420

tacttcggca cctgcgagtt cggaaaatcg ttcctctcca agctcgaagc gttccccgcc 480

gtgcttatcc ctcccaccgc cggcgccatg gggaacatca tgtcttcggc gatcatggtc 540

ccgaaggagc tcatcacgca gcgaatgcag gccggcgcga agggccgctc gtggcaagtg 600

tttgctgaaa ttattcaaaa cgacggcgtg atgggcctct atgctggtta ctccgcgaca 660

ttgctgagaa acttacccgc gggagttctg agttactctt ctttcgagta tttgaaagcc 720

gcggtgcttc agaagactaa gcagagttac atggaaccgg tgcagagtgt tctgtgtggg 780

gccctcgccg gggcgatatc ggcgtcgctc acgacgccgt tggatgtggt gaagacgagg 840

ttgatgacgc aggttcgggg cgagggggtg agcaaggttg ctgcggttat gtacgacggg 900

gtttcggcca cggtgaagca gattttgaag gaggaagggt gggtagggct tacccgtgga 960

atggggcccc gggtcctgca tagtgcttgt ttttcggcgt tgggctattt tgctttcgag 1020

acggccaggc tttccatttt gcgggagtat cttaggagta aggagttgcg tgaagtctct 1080

gtctcctctg gttga 1095

<210> 2

<211> 364

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Glu Ala Arg Val Ser Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ser Pro Lys Pro

1 5 10 15

His Gln Phe Ser Val Ser Asn Leu Thr Asp Phe Pro Ser Leu Phe Thr

20 25 30

His Thr Pro Thr Leu Pro Phe Ala Ser Thr Ser Lys Trp Ala Arg Pro

35 40 45

Thr Pro Lys Pro Asn Pro Lys Pro Leu Leu Lys Thr Leu Ser Val Leu

50 55 60

Asp Arg Ala Leu Ile Gly Ala Ala Ala Gly Gly Leu Ala Gly Ala Phe

65 70 75 80

Thr Tyr Val Cys Leu Leu Pro Leu Asp Ala Ile Lys Thr Lys Met Gln

85 90 95

Thr Lys Gly Ala Ala Gln Ile Tyr Lys Asn Thr Leu Asp Ala Ile Val

100 105 110

Lys Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ile Leu Gly Phe Tyr Ser Gly Val Ser

115 120 125

Ala Val Val Val Gly Ser Thr Ala Ser Ser Ala Val Tyr Phe Gly Thr

130 135 140

Cys Glu Phe Gly Lys Ser Phe Leu Ser Lys Leu Glu Ala Phe Pro Ala

145 150 155 160

Val Leu Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ala Met Gly Asn Ile Met Ser Ser

165 170 175

Ala Ile Met Val Pro Lys Glu Leu Ile Thr Gln Arg Met Gln Ala Gly

180 185 190

Ala Lys Gly Arg Ser Trp Gln Val Phe Ala Glu Ile Ile Gln Asn Asp

195 200 205

Gly Val Met Gly Leu Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Thr Leu Leu Arg Asn

210 215 220

Leu Pro Ala Gly Val Leu Ser Tyr Ser Ser Phe Glu Tyr Leu Lys Ala

225 230 235 240

Ala Val Leu Gln Lys Thr Lys Gln Ser Tyr Met Glu Pro Val Gln Ser

245 250 255

Val Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ser Ala Ser Leu Thr Thr

260 265 270

Pro Leu Asp Val Val Lys Thr Arg Leu Met Thr Gln Val Arg Gly Glu

275 280 285

Gly Val Ser Lys Val Ala Ala Val Met Tyr Asp Gly Val Ser Ala Thr

290 295 300

Val Lys Gln Ile Leu Lys Glu Glu Gly Trp Val Gly Leu Thr Arg Gly

305 310 315 320

Met Gly Pro Arg Val Leu His Ser Ala Cys Phe Ser Ala Leu Gly Tyr

325 330 335

Phe Ala Phe Glu Thr Ala Arg Leu Ser Ile Leu Arg Glu Tyr Leu Arg

340 345 350

Ser Lys Glu Leu Arg Glu Val Ser Val Ser Ser Gly

355 360

Claims (4)

1.大豆铁代谢相关基因GmIMD的以下任一应用：

1)提高植物对铁元素利用率中的应用；

2)提高植物叶片叶绿素含量中的应用；

3)在植物育种中的应用；

其中，基因GmIMD编码的蛋白质为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

i)使植物包含基因GmIMD；或者，

ii)使植物表达基因GmIMD。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆。