CN109694397A - 环状二核苷酸化合物、其制备方法和应用 - Google Patents

环状二核苷酸化合物、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了环状二核苷酸化合物、其制备方法和应用，具体涉及一种式(I)所示的化合物，其药学上可接受的盐，其制备方法以及其在制备用于治疗和/或预防与激活STING蛋白相关的疾病的药物中的应用或作为疫苗佐剂的应用。所述与激活STING蛋白相关的疾病包括病毒感染，细菌感染，癌症，免疫系统相关疾病等。

Description

环状二核苷酸化合物、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及核苷类似物，具体涉及一类环状二核苷酸化合物、其制备方法、包含所述化合物的药物组合物，以及其用于制备STING(干扰素基因的刺激因子)调节剂的用途和用于制备治疗感染性疾病(特别是乙型肝炎)，自身免疫性疾病，癌症，癌前综合征的药物的用途和作为疫苗佐剂的用途。
发明背景
乙型病毒性肝炎是指由B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染而引起的肝细胞坏死和炎症反应，可分为急性肝炎和慢性肝炎，并能引起一系列的并发症，如肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。其中，慢性乙型肝炎(CHB)是指能够检测出至少连续6个月的乙肝表面抗原(hepatitisB surface antigen，HBsAg)和/或HBVDNA阳性。
全球曾感染HBV约20亿人，其中CHB感染者为3.4亿人，每年约有78.6万人死于HBV感染所致的并发症。世界卫生组织对肝癌统计显示中国的新发病例数和死亡病例数均占全球的50％以上，且不断上升。全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为30％和45％。乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内发病率和死亡率均较高。
尽管已广泛接种疫苗，但中国仍是世界上HBV感染率最高的国家之一。由此引发的慢性乙型肝炎是中国一个沉重的健康负担。据估计，在中国共有9300万人感染了HBV，其中包括20万慢性乙型肝炎患者。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别高达60％和80％。中国经过20多年的乙型肝炎疫苗免疫接种实施和近些年抗病毒治疗的广泛应用，使得我国婴幼儿HBV的感染率大幅下降，急性HBV发生明显减少，但已经感染乙肝病毒的人口逐渐老龄化，近年HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的所占比例也不断上升。
由于乙型肝炎病毒(HBV)感染成为世界范围内严重的公共安全和医疗问题，世界范围内的科学家，企业，研究机构都为寻找控制疾病进程，彻底治愈乙型肝炎的方法而努力。
自1992美国食品药品管理局批准a-2b干扰素以来，相继又有7种药物获批，1998年拉米夫定，2002年阿德福韦酯，2005年批准的恩替卡韦，长效干扰素(a-2a)；2006年批准的替比夫定，2008年批准的替诺福韦酯，2016年批准的tenofovir alafenamide，该药是已上市药物替诺福韦酯TDF的新型前药；总共8种药品即2种干扰素类和6种核苷类药物。其中干扰素类因其有固定疗程，具有调节免疫和诱导细胞合成多种抗病毒蛋白的双重功效被美国食品监督管理局最先批准用来治疗乙肝。长效干扰素干扰素-α(a-2a)较普通干扰素(a-2b)能取得更高的HBeAg血清学转换率、HBV DNA转阴率，ALT(alanine transaminase)复常率等。但因为干扰素类药物不良反应多，还有禁忌人群范围比较广，经济负担大，所以限制了它的广泛使用。核苷类药物的作用机理都是抑制乙肝病毒DNA合成，从而发挥抗乙肝病毒的疗效，但因化学结构不同，影响病毒DNA复制的不同环节而在疗效和耐药上有所区别。
核苷类药物因其有效性、易行性，安全性的优点已经被大家所认可，也是近年来抗病毒药物应用和研究的热点。通过多年的临床使用和评价，恩替卡韦和替诺福韦酯在慢性乙肝治疗中的疗效(HBV DNA转阴率)，病毒学应答率和耐药发生率都较其它核苷类药物有着突出的优势，故2015年中国的《慢性乙型肝炎防治指南》和亚太肝脏研究学会的《乙肝管理的临床实践指南》以及世界卫生组织的《慢性乙型肝炎防治护理指南》都把恩替卡韦和替诺福韦酯作为初治患者优选的抗慢性乙型肝炎病毒的药物，同时也可联用无交叉耐药位点的首选药物。
恩替卡韦为鸟嘌呤核苷类似物，对乙肝病毒(HBV)多聚酶具有抑制作用。它能够通过磷酸化成为具有活性的三磷酸盐，三磷酸盐在细胞内的半衰期为15小时。通过与HBV多聚酶的天然底物三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷竞争，恩替卡韦三磷酸盐能抑制病毒多聚酶(逆转录酶)的所有三种活性：⑴HBV多聚酶的启动；⑵前基因组mRNA逆转录负链的形成；⑶HBV DNA正链的合成。恩替卡韦三磷酸盐对HBV DNA多聚酶的抑制常数(Ki)为0.0012μM。替诺福韦为腺嘌呤核苷类似，它在体内转化成活性成分替诺福韦双磷酸盐可通过直接竞争性地与天然脱氧核糖底物相结合而抑制病毒聚合酶，及通过插入病毒DNA中终止DNA链扩增，从而抑制病毒复制。
恩替卡韦和替诺福韦是目前推荐治疗慢性乙肝的一线口服药物。大量研究表明，恩替卡韦和替诺福韦对慢性乙型肝炎患者来说是一种有效且耐受性良好的药物。恩替卡韦和替诺福韦可快速降低乙型肝炎患者血液的HBV DNA水平，治疗12周降低超过4log拷贝/mL。48周可使75％的患者HBV DNA水平下降到检测水平以下。同时，以恩替卡韦和替诺福韦作为核苷类抗病毒药物首次治疗乙肝的患者中很少出现耐药性。这表明恩替卡韦和替诺福韦可以作为长期治疗的首选。而对于其它核苷类药物出现耐药的乙肝患者，如对于拉米夫定，替比夫定，阿德福韦酯等核苷类药物耐药的患者，使用恩替卡韦和替诺福韦治疗均能显著降低患者的HBV DNA水平，发挥抗病毒作用。肝移植是可治疗HBV相关终末期肝病的唯一治疗手段，乙肝复发是其常见并发症，复发率可高达12％。使用恩替卡韦和替诺福韦抗病毒治疗，单用或与乙肝免疫球蛋白联合使用，可防止肝移植术后的乙肝复发。
尽管通过长期核苷类似物治疗或通过有限持续时间的聚乙二醇化α干扰素(IFN-)治疗持续抑制病毒复制，降低肝脏HBV DNA载量和改善肝脏疾病状态，并可改善肝组织炎症坏死和纤维化，预防肝脏代偿失调和降低肝衰竭和肝细胞癌发病率和降低疾病死亡率。然而，目前的治疗方法很少实现肝功能正常化，HBV表面抗原(HBsAg)血清学转换和HBV复制的持久免疫控制的“功能治疗”。但是包括恩替卡韦和替诺福韦在内的核苷类药物仍无法清除肝细胞内的乙肝病毒的cccDNA，也不能消除乙肝病毒复制，这要求终生服用核苷类药物抗病毒药物。对于HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者，核苷类药物停用后一年内复发率高达90％，而复发患者病情可加剧和发生肝硬化等代偿性病变。鉴于核苷类药物治疗时HBsAg水平下降非常有限，如何帮助经核苷类药物治疗后未获得HBeAg清除/获得HBeAg血清学转换，实现停药后持久的免疫学应答成为了目前研究的热点之一。
虽有报告使用Peg-IFN进行短期治疗可导致治疗应答患者者中接近三分之一的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清学清除，患者中接近30％患者的感染获得持续免疫控制。但是，这种策略的广泛采用却耐受性差，副作用大，长期效率低下。上述缺点导致研究人员设想核苷类药物和Peg-IFN联合治疗乙型肝炎的策略，这一治疗策略假设干扰素能够提高治疗病毒学和血清学反应，核苷类药物的直接抗病毒活性可以改善PegIFN的免疫调节作用，反之亦然。在患者和人源化小鼠的上的研究表明，通过核苷类药物抑制HBV复制和通过干扰素抑制共价闭合环状DNA(cccDNA)的转录可能引发显着的乙型肝炎病毒的HBeAg和HBsAg的下降。(Thimme R,Dandri M.Dissecting the divergent effects of interferon-alphaon immune cells:time to rethink combination therapy in chronic hepatitisB.J.Hepatol 2013；58:205–9.)
在最近的一个研究中表明，(Brouwer W P,Xie Q,Sonneveld MJ,et al.Addingpeginterferon to entecavir for HBeAg-positive chronic hepatitis B:amulticentre randomized trial(ARESstudy).Hepatology 2015；61:1512-22)，应用恩替卡韦治疗24周后，采用恩替卡韦+干扰素(Peg-IFN)联合治疗再治疗24周，对比于一直用恩替卡韦治疗组来讲，联合治疗组的HBV DNA<200IU/mL伴随HBeAg消失的患者达到19％，而单独恩替卡韦治疗组为10％，联合治疗组显著改善病毒学和血清学指标。在另一项中国回顾性研究中(Li G.Y.Yu,S.Chen,P.Fan,W.Zhang.Sequential combination therapy withNUC and Peg-IFN in HBeAg positive CHB patients with prior longterm exposureto NUC.Antimicrob Agents Chemother 2015；59:4121–8.)，对192名HBeAg阳性且用核苷类药物治疗至少2年未达到HBeAg消失或血清转换的患者，接受为期48周Peg-IFN与核苷药物的联合治疗(n＝83)或一直维持核苷药物单药治疗(n＝109)。与核苷药物单药治疗相比，联合治疗组更多的患者达到HBeAg血清学转换(44％vs.6％)和HBsAg消失(4％vs.0％)。第12周和第24周HBsAg达到基线水平是联合治疗应答反应的有力证明。HBsAg<1000IU/mL基线的所有患者均达到完全应答，其中91％达到HBsAg消失。
众多的研究表明，HBV慢性感染是机体抗感染免疫应答能力低于HBV免疫逃逸及诱导宿主发生免疫耐受的能力，造成机体抗感染不力的结果。免疫应答低效性的根本原因，与HBV诱导机体的特异性免疫耐受相关。因此，恢复宿主先天免疫应答和对HBV特别的适应性免疫应答对于慢性HBV感染的功能治愈至关重要。干扰素是人体固有免疫的重要组成部分，I型干扰素不仅可以抑制HBV转录复制，还可以激活增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，促进DC成熟和CTL活化，诱导一系列干扰素激活基因的转录，发挥抗HBV作用。研究表明，INF-α/β在肝细胞中诱导三结构域蛋白(TREM22)分子上调表达，而TREM22通过抑制核心抗原启动子区域转录活性，可以特异性抑制HBV转录和复制功能。核苷类抗病毒药物与扰素(Peg-IFN)联合治疗取得更好疗效的临床试验证明增强固有免疫和适应性免疫应答并联合直接抗病毒药物可能是治愈乙型肝炎的有效方案。
干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene，STING)是先天免疫系统中最重要的衔接蛋白之一，于2008年被多个研究小组先后发现，也被命名为干扰素调节因子3活化调节分子(Mediated of IRF3 activation,MITA)，内质网干扰素刺激分子(Endoplasmic reticulum IFN stimulator,ERIS)，也称为跨膜蛋白173(TMEM173)和MPYS，是一个多结构域的跨膜蛋白，定位于内质网膜和/或线粒体外膜。在人类中由TMEM173基因编码，为细胞质中核酸先天免疫应答的中心信号分子(lshikaw H.and Barber G.N.,Nature,2008：455,674-678；WO2013/1666000)，其在免疫细胞(例如树突细胞，巨噬细胞和B细胞)和内皮细胞等中广泛表达。STING还作为模式识别受体对细胞质中核酸配体，特别是双链DNA(dsDNA)和称为“环状二核苷酸”(cyclic di-nucleotide,CDN)的特殊核酸的固有免疫反应起重要作用[郑洋，邢雅玲，陈晓娟，杨星星，王凯，陈忠斌.STING在宿主天然免疫信号通路中的调节作用[J].生物化学与生物物理进展，2013，40:5-14]。STING在细胞中形成对称的二聚体并处于自我抑制状态。当STING受到配体(比如CDN)的刺激后分子构型发生变化并被激活，招募细胞质中的TANK结合激酶1(TANK-binding&kinase 1,TBK1)，介导TBK1对IRF3的磷酸化，以驱动IFN-β和其他基因的转录，诱导产生I型干扰素如IFN-α和IFN-β和其它细胞因子(cytokines)，从而导致抗病毒反应和对细胞内病原体的固有免疫应答，IFNβ的产生是STING活化的标志。另外，当某些细菌和寄生虫感染后，哺乳动物细胞因感染导致DNA进入细胞溶质被环状GMP-AMP合酶(cGAS，MB21D1)所检测到，从而催化三磷酸鸟苷(GTP)和三磷酸腺苷(ATP)合成环状GMP-AMP(cGAMP)。cGAMP同样可以结合并激活STING信号途径并启动固有免疫应答。
自从2008年发现以来，STING已被广泛地作为传染病，癌症和自身免疫等疾病领域潜在的药物靶标而引起人们越来越多的关注。已经证明小分子化合物诱导STING产生干扰素等细胞因子并在巨噬细胞中诱导强有力的细胞因子反应，减少细胞质中乙肝病毒核衣壳的数量，有效抑制在小鼠肝细胞中HBV复制。证明了小分STING激动剂作为治疗慢性乙型肝炎的潜在可能性。(Fang Guo,Yanxing Han,et.al.,2015 Antimicrob.AgentsChemother._2015_59_1273)。两项独立研究已经证明STING在使用唑氧甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)的诱导型结肠癌模型中的保护作用(Zhu Q,Man S M,Gurung P,Liu Z,Vogel P,Lamkanfi M,et al.,Cutting edge:STING mediates protection against colorectaltumorigenesis by governing the magnitude of intestinal inflammation.J Immunol2014；193:4779-82)。虽然在发现STING配体的作用之前，CDN也被用作有效的疫苗佐剂(Karaolis D K,Means T K,Yang D,Takahashi M,Yoshimura T,Muraille E,etal.Bacterial c-di-GMP is an immunostimulatory molecule.J Immunol 2007；178:2171-81)。然而，CDN的抗肿瘤治疗作用最近才被测试，腹膜内注射环状GMP(cGMP)可以抑制预先建立的4T1乳腺肿瘤的生长(Chandra D,Quispe-Tintaya W,Jahangir A,Asafu-AdjeiD,Ramos I,Sintim HO,et al.STING ligand c-di-GMP improves cancer vaccinationagainst metastatic breast cancer.Cancer Immunol Res 2014；2:901-10.)。
然而，天然的CDN分子并不适合临床开发，一方面由于容易在体内被水解而失去活性，另一方面由于非常低的渗透性导致难于进入细胞内产生药效作用，因而人们开始对其进行结构修饰以获得成药性更高的化合物。如用肌苷代替鸟苷，用非天然的碱基替代天然的碱基，由非天然的核糖，甚至非糖化合物取代天然的核糖，或是用硫代磷酸酯替代磷酸酯等等变化以器期望改变CDN的成药性(Thierry Lioux，et.al,J.Med.Chem.2016,59,10253-10267；WO2014093936A1；US20150056224；WO2016145102A1；Clin Cancer Res.2015November 1；21(21):4774–4779)。其中，以两个硫原子替换磷酸酯中非桥接氧原子,以2'-5'和3'-5'通过磷酸酯桥结构连接的环状二核苷酸MLRR-S2CDA不仅显示了更好稳定性和亲脂性特征，在体外内测试中能够同时激活鼠源STING和人源STING变体的能力(Corrales L,Glickman LH,Mc Whirter SM,Kanne DB,Sivick KE,Katibah GE,et al.Directactivation of STING in the tumor microenvironment leads to potent andsystemic tumor regression and immunity.Cell Rep 2015；11:1018-30)。将MLRR-S2CDA注射到B16黑色素瘤、CT26直肠癌、和4T1乳腺癌肿块，不仅导致明显的肿瘤抑制作用直至肿瘤消失，同时也诱导免疫系统持久的抗原特异性T细胞免疫，造成动物其它部位未注射药物的肿瘤生长也受到抑制。与DMXXA类似，肿瘤内注射ML RR-S2CDA到B16黑色素瘤中导致大多数治疗小鼠肿瘤完全消除，并诱导持久的全身抗原特异性CD8+T细胞免疫。经肿瘤内注射后，约50％的治疗动物无肿瘤并存活超过150天。此外，他们完全受到保护而免受第二次肿瘤重新攻击。在4T-1乳腺癌和MC26结肠癌模型中也有类似的结果。这些临床前研究表明，必需肿瘤内注射MLRR-S2CDA才能实现最大治疗效果。尽管这限制该化合物适用于可直接注射的肿瘤治疗，但研究已经表明，肿瘤局部治疗诱导的全身免疫能有效诱导远端肿瘤消退。因此，间接作用可促进全身性抗肿瘤活性(Leticia Corrales et al.,2015,Cell Reports11,1018-1030)。MLRR-S2 CDA显示更高的抗肿瘤抑制率和更高的小鼠总生存期，因此，MLRR-S2 CDA单药治疗不同实体瘤作为第一个STING激动剂进入了I期临床试验(Corrales,L.；McWhirter,S.M.；Dubensky,T.W.,Jr.；Gajewski,T.F.The host STING pathway atthe interface of cancer and immunity.J.Clin.Invest.2016,126(7),2404-2411)。
发明内容
本发明所提供的新一代环状二核苷酸，以取代或非取代2-亚甲基环戊基代替五碳糖呋喃环而形成的核苷类似物(如恩替卡韦，2'-氟-6'-亚甲基碳环腺苷)与其它核苷化合物所形成的环状二核苷酸，不仅极大的改善了其渗透性和成药性，在体内强烈诱导干扰素基因刺激因子(STING)，产生内源性干扰素，增强机体固有免疫系统，而且其在体内的水解产物包括核苷和磷酸盐中间体也抑制乙肝病毒复制而发挥直接的抗病毒活性。因而能够比现有药物如恩替卡韦或聚乙醇干扰素更高效率的清除乙肝病毒。本发明的某些化合物已经显示出通过STING途径在与人PBMC孵育时诱导I型干扰素和其它细胞因子的产生。本发明的化合物通过STING途径使机体产生内源性干扰素，从而可以调节机体固有免疫系统，增强机体免疫反应，加速抗原清除而达到疾病的治疗或预防，包括治疗乙型肝炎等感染性疾病，自身免疫性疾病，癌症和作为疫苗佐剂。
本发明公开了一类环状二核苷酸化合物，其制备方法和药物组合物。所述环状二核苷酸化合物可以用作STING(干扰素基因的刺激因子)蛋白调节剂，可以用于制备治疗感染性疾病(特别是乙型肝炎)，自身免疫性疾病，癌症，癌前综合征的药物，也可以用作疫苗佐剂。
本发明一方面提供了一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，Base1和Base2各自独立地选自以下结构：
W选自O，S，-(C＝CH2)-，-CH2-，-CHF-和CF2-；优选为O，S，-CHF-或-CF2-；更优选为O或S；
X和X1各自独立地选自O，NH和S；优选选自O和S；
Y和Y1各自独立地选自OR9，SR9和NHR9，优选选自OR9和SR9，更优选选自O–，S–，OH和SH；
Z和Z1各自独立地选自O，S，NH和-CH2-；优选选自O和S；
R’和R”各自独立地选自H，D，F和Me和Et；优选选自H和F；
R1，R2，R3，R4各自独立地选自H，D，OH，卤素，CN，N3，NH2，取代或未取代的C1-C4烷基，取代或未取代的C2-C4烯基，取代或未取代的C2-C4炔基，取代或未取代的-O-(C1-C4)烷基，取代或未取代的-O-(C2-C4)烯基，取代或未取代的-O-(C2-C4)炔基，和取代或未取代的(C3-C7)环烷基；优选选自H，OH，F，Cl，CN，N3和NH2；更优选选自H，OH和F；所述取代是指被1-3个选自氘，卤素，羟基，羧基，NH2，硝基，氰基，叠氮基，巯基，酰基，磺酰基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基的基团所取代；或者
R1和R2也可以连接起来形成3-7元饱和环烃或杂环烃；R3和R4也可以连接起来形成3-7元饱和环烃或杂环烃；
R9独立地选自H，取代或未取代的C1-C9烷基，取代或未取代的酰基-COR10，取代或未取代的C3-C10的单环烷基，取代或未取代的非芳香性杂环基，取代或未取代的C6-C10的单环或双环芳香基，取代或未取代的C5-C10的芳杂环基，所述取代是指被1至2个独立地选自下列的取代基所取代：OH，-O-(C1-C20)烷基，-S-C(O)-(C1-C6)烷基和-C(＝O)O-(C1-C6)烷基；-C(＝O)NH-(C1-C6)烷基，-NH-(C1-C6)烷基；
R10选自H和C1-C9烷基。
在进一步的优选实施方案中，其中Base1和Base2各自独立地选自以下结构：
优选自以下结构：
在进一步的优选实施方案中，式(I)的化合物是式(Ia)的化合物，
其中，W、Z、Z1、Y、Y1、R9、R10、R’、R”、R1、R2、R3、R4、Base1和Base2与上述定义相同。
在进一步的优选实施方案中，式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，
其中，R5和R6各自独立地选自H，OH和F；
W、Z、Z1、Y、Y1、R9、R10、Base1和Base2与上述定义相同。
更优选地，W选自O或S；
Z和Z1各自独立地选自O或S；
Y和Y1各自独立地选自O–，S–，OH，SH；
R5和R6各自独立地选自H，OH和F；
Base1和Base2各自独立地选自以下碱基：
在进一步的优选实施方案中，式(I)的化合物选自如下具体化合物：
本发明还提供了式(I)所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i通过氧化水解，脱氰乙基，去保护，得到中间体G1；
(2)中间体G1与(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i发生偶联反应，得到中间体G2；
(3)中间体G2发生氧化反应，得到中间体G3；
(4)中间体G3去保护，得到中间体G4；
(5)中间体G4发生关环反应，得到中间体G5；
(6)中间体G5发生氧化反应，得到中间体G6；
(7)中间体G6通过去除所有的保护基得到式(I)所示化合物，
其中，W、Z、Z1、Y、Y1、X、X1、R’、R”、R1、R2、R3、R4、Base1和Base2与上述定义相同；
Rp代表保护基；pBase1代表有保护基的碱基Base1；pBase2代表有保护基的碱基Base2。
所述保护基为本领域常用的保护基，如Bz(苯甲酰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、Cbz(苄氧羰基)、Bn(苄基)等。
在上述制备方法中，步骤(1)中，所述(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i可以通过保护的核苷或类似物与2-氰乙基-N，N，N'，N'-四异丙基亚磷酰二胺反应得到。
步骤(2)中，所述(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i可以通过相应的亚甲基环戊基核苷类似物制备得到。
在步骤(3)中，将三价磷原子氧化成五价磷原子的过程中，如果用DDTT，PADS等将亚膦化合物变成含硫磷酸化合物，则其中的磷原子具有手性，则最终得到的式(I)所示化合物将有多个手性异构体。本发明在某些实施例中虽进行了分离，但并非一一表述或表征。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐。所述药物组合物可以用于人或动物疾病的预防或治疗。在所述药物组合物中，除了本发明的活性成分之外，还可以含有一种或多种可以协同使用的活性成分。在所述药物组合物中，除了活性成分之外，还可以含有药用辅料。这些药用辅料可以由所属领域技术人员根据需要从公知的药用辅料中选取。此外，可以将所述药物组合物制成任意适宜的剂型，包括，但不限于，针剂，口服制剂，皮肤或肌肉注射制剂，眼用制剂，全身或局部施用的剂型。
另一方面，本发明提供了一种STING(干扰素基因的刺激因子)蛋白调节剂，其包含治疗有效量的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
另一方面，本发明提供了一种疫苗佐剂，其包含治疗有效量的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
另一方面，本发明提供了根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为疫苗佐剂的应用。
另一方面，本发明提供了根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防一种或者多种与激活STING蛋白相关的疾病的药物中的应用。
另一方面，本发明提供了治疗和/或预防一种或者多种与激活STING蛋白相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或药物组合物。
所述与激活STING蛋白相关的疾病可以为病毒感染疾病，细菌感染疾病，癌症，免疫系统相关疾病。
所述病毒感染疾病可以为病毒性肝炎或其他病毒感染疾病。所述病毒性肝炎，包括，但不限于，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，戊型肝炎。所述其他病毒感染疾病包括艾滋病，流感，登革热，手足口病，疱疹，冠状病毒感染等。
所述细菌感染疾病包括，但不限于，由大肠杆菌，结核杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌、肺炎球菌，绿脓杆菌、肺炎杆菌、表皮葡萄球菌，厌氧菌及各种真菌，革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌等感染导致的疾病。
所述癌症包括，但不限于，肺癌，胃癌，乳腺癌，膀胱癌，胰腺癌，直肠癌，肝癌，血液瘤等。所述血液瘤包括，但不限于，各种白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。
所述免疫系统相关疾病包括，但不限于，类风湿关节炎，银屑病，银屑病关节炎，多发性硬化，红斑狼疮等疾病。
另外，本发明提供了根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防急性乙肝，慢性乙肝，重型乙肝，或由乙肝病毒引起的肝功能损伤，肝纤维化，肝癌等的药物的应用。
另一方面，本发明提供了治疗和/或预防急性乙肝，慢性乙肝，重型乙肝，或由乙肝病毒引起的肝功能损伤，肝纤维化，肝癌的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或药物组合物。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以单独用于上述疾病的治疗和/或预防，也可以与其他药物(如生物大分子药物等)联合应用。
所述生物大分子药物，包括各种抗体，酶，蛋白和核酸药物或制剂。
在本发明的另一方面，本发明提供了诱导STING依赖性1型干扰素和相关细胞因子产生的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或药物组合物。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以存在为其水合物，溶剂化物或前药的形式。因此，本发明化合物或其药学上可接受的盐的水合物，溶剂化物或前药也包括在本发明的范围内。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐(即药学上可接受的盐)，实例包括无机酸盐以及有机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；所述有机酸包括如苯甲酸、2-羟基乙磺酸、氨基磺酸、苯磺酸、苯乙酸、扁桃酸、丙二酸、丙酸、草酸、对氨基苯磺酸、对甲苯磺酸、多聚半乳糖醛、反丁烯二酸、泛酸、富马酸、谷氨酸、琥珀酸、甲烷磺酸、酒石酸、抗坏血酸、邻苯二甲酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、葡庚糖、葡糖酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、双羟萘酸、水杨酸、辛二酸、亚磷酸等；亚乙酸、依地酸、乙醇酸、乙酸、乙烷磺酸、异丁酸、硬脂酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of PharmaceuticalScience 66:1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。酮取代不会发生在芳香基上。术语“任选被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
除非另有规定，“环”表示被取代或未被取代的环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、环炔基、杂环炔基、芳基或杂芳基。所谓的环包括单环、联环、螺环、并环或桥环。环上原子的数目通常被定义为环的元数，例如，“5～7元环”是指环绕排列5～7个原子。除非另有规定，该环任选地包含1～3个杂原子。因此，“5～7元环”包括例如苯基、吡啶和哌啶基；另一方面，术语“5～7元杂环烷基环”包括吡啶基和哌啶基，但不包括苯基。术语“环”还包括含有至少一个环的环系，其中的每一个“环”均独立地符合上述定义。
除非另有规定，术语“杂环”或“杂环基”意指稳定的含杂原子或杂原子团的单环、双环或三环，它们可以是饱和的、部分不饱和的或不饱和的(芳族的)，它们包含碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的环杂原子，其中上述任意杂环可以稠合到一个苯环上形成双环。氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)p，p是1或2)。氮原子可以是被取代的或未取代的(即N或NR，其中R是H或本文已经定义过的其他取代基)。该杂环可以附着到任何杂原子或碳原子的侧基上从而形成稳定的结构。如果产生的化合物是稳定的，本文所述的杂环可以发生碳位或氮位上的取代。杂环中的氮原子任选地被季铵化。桥环也包含在杂环的定义中。当一个或多个原子(即C、O、N或S)连接两个不相邻的碳原子或氮原子时形成桥环。优选的桥环包括但不限于：一个碳原子、两个碳原子、一个氮原子、两个氮原子和一个碳-氮基。值得注意的是，一个桥总是将单环转换成三环。桥环中，环上的取代基也可以出现在桥上。
杂环化合物的实例包括但不限于：吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并巯基呋喃基、苯并巯基苯基、苯并恶唑基、苯并恶唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异恶唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、色烯、噌啉基十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃基、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异恶唑基、亚甲二氧基苯基、吗啉基、萘啶基，八氢异喹啉基、恶二唑基、1,2,3-恶二唑基、1,2,4-恶二唑基、1,2,5-恶二唑基、1,3,4-恶二唑基、恶唑烷基、恶唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪、吩噻嗪、苯并黄嘌呤基、酚恶嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并恶唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基，6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、异噻唑基噻吩基、噻吩并恶唑基、噻吩并噻唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基、三嗪基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,5-三唑基、1,3,4-三唑基和呫吨基。还包括稠环和螺环化合物。
除非另有规定，术语“烷基”用于表示直链或支链的饱和烃基，可以是单取代(如-CH2F)或多取代的(如-CF3)，可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。烷基的例子包括甲基(Me)，乙基(Et)，丙基(如，n-丙基和异丙基)，丁基(如，n-丁基，异丁基，s-丁基，t-丁基)，戊基(如，n-戊基，异戊基，新戊基)等。
除非另有规定，术语“卤素”本身或作为另一取代基的一部分表示氟、氯、溴或碘原子。
“烷氧基”代表通过氧桥连接的具有特定数目碳原子的上述烷基，除非另有规定，C1-6烷氧基包括C1、C2、C3、C4、C5和C6的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基和S-戊氧基。
除非另有规定，术语“芳基”表示多不饱和的芳族烃取代基，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价，它可以是单环或多环(比如1至3个环；其中至少一个环是芳族的)，它们稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指含有一至四个杂原子的芳基(或环)。在一个示范性实例中，杂原子选自B、N、O和S，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接到分子的其余部分。芳基或杂芳基的非限制性实施例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述任意一个芳基和杂芳基环系的取代基选自下文所述的可接受的取代基。
除非另有规定，芳基在与其他术语联合使用时(例如芳氧基、芳硫基、芳烷基)包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括芳基附着于烷基的那些原子团(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亚甲基)已经被例如氧原子代替的那些烷基，例如苯氧基甲基、2-吡啶氧甲基3-(1-萘氧基)丙基等。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：
1H-NMR代表质子核磁共振光谱；
13C-NMR代表13C核磁共振光谱；
19F-NMR代表19F核磁共振光谱；
1Ci＝3.70×1010Bq，其中Bq为贝克勒，放射性的SI单位相当于每秒1次崩解(dps))；
31p-NMR代表31p核磁共振光谱；
aq.代表水溶液；
Ar代表氩；
ABz 6-N-苯甲酰腺嘌呤；
BH3-Me2S代表硼烷甲基硫醚；
Boc2O代表二-叔丁基二碳酸酯；
BOC代表叔丁基羰基；
BSA代表牛血清蛋白；
Bz代表苯甲酰；
CBz代表苄氧羰基，是一种胺保护基团；
CD3OD代表氘甲醇；
CDI代表羰基二咪唑；
CHCl3代表三氯甲烷；
Ci代表居里(非标准放射性单位)；
CS2代表二硫化碳；
d代表双峰；
D2O代表氘代水；
DCA代表二氯乙酸；
DCE代表二氯乙烷；
DCM，CH2Cl2，代表二氯甲烷；
DDTT代表(E)-N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒；
DIAD代表偶氮二羧酸二异丙酯；
DIPEA代表二异丙基乙基胺；
DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；
DMOCP代表2-氯-5,5-二甲基-1,3-二氧杂磷杂环戊烷2-氧化物；
DMSO代表二甲基亚砜；
DMTr代表4,4'-二甲氧基三苯甲基；
DMTrCl代表4,4'-二甲氧基三苯甲基氯；
DPPF代表1,1'-双二苯基磷二茂铁；
DPPP代表1,3-双(二苯基膦)丙烷；
dq代表双四重峰；
EA代表乙酸乙酯；
EC50代表半数有效浓度(在指定暴露时间后,药物，抗体或毒物诱发反应在基线和最大值之间一半的有效浓度)；
eq代表当量、等量；
Et代表乙基；
Et2O代表二乙醚；
Et3N代表三乙胺；
Et3SiH代表三乙基硅烷；
EtOAc代表乙酸乙酯；
EtOH代表乙醇；
Et代表乙基；Me代表甲基；
g代表克；
Hex代表己烷；
HF-Pyr代表氟化氢-吡啶络合物；
HOAc代表乙酸；
HPLC代表高效液相色谱；
Hz代表赫兹；
iPrOH代表2-丙醇；
mp代表熔点；
ITP代表肌苷5'-三磷酸；
J代表NMR偶联常数；
KHMDS代表六甲基二硅基胺基钾
LCMS代表液相色谱-质谱；
LDA代表二异丙基胺基锂；
m代表多重峰；
M代表摩尔每升；
mCi代表毫居里；
m-CPBA代表3-氯过氧苯甲酸；
MeCN代表乙腈；
MeI代表碘甲烷；
MeNH2甲胺；
MeOH代表甲醇；
Me代表甲基；
mM代表毫摩尔每升；
mmol代表毫摩尔；
MMTrCl代表单4-甲氧基三苯甲基氯
MOI代表感染的多重性；
MTBE代表甲基叔丁基醚；
NaCNBH3代表氰基硼氢化钠；
n-Bu4NF代表氟化四丁基铵；
NCS代表1-氯吡咯烷-2,5-二酮；
NFSI代表N-氟-N-(苯磺酰基)苯磺酰胺；
nL代表纳升；
nM代表纳摩尔每升；
O/N代表过夜；
PADS代表苯乙酰二硫
Pd(OAc)2代表醋酸钯；
PE代表石油醚；
PY代表吡啶；
q代表四重峰
r.t.代表室温；
RPM，rpm代表转速每分钟；
RT,rt代表室温，约25℃；
s代表单峰；
sat代表饱和的；
SOCl2代表氯化亚砜；
TBS叔丁基二甲基；
TCEP代表三(2-羧乙基)膦；
TEA，Et3N代表三乙胺；
TFA代表三氟乙酸；
THF代表四氢呋喃；
TLC代表薄层色谱；
TMA代表三甲胺；
TMSCHN2代表三甲基硅烷化重氮甲烷；
TMSCl代表三甲基氯硅烷；
TR代表保留时间；
TrisCl代表三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐；
TsOH代表对甲苯磺酸；
t代表三重峰；
v/v代表体积/体积；
μg代表微克；
化合物经手工或者软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
作为新型的STING调节剂(激动剂或拮抗剂)，本发明的化合物具有显著的体外活性，相对于30μM浓度的2',3'-cGAMP，能更有效地使细胞产生干扰素，而在体内，实施例化合物也能显著降低HBV DNA载量。
附图说明
图1为几种化合物对动物的HBV DNA拷贝数/ml数的影响散点图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明不限于下述实施例。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。中间体制备
中间体B1-1：(1R,3R,5R)-3-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇
第一步:(+)-(6aS,6bR,7aR,8R,8aR)-8-氟-2,2,4,4-四异丙基六氢环氧丙烷[2',3':3,4]环戊二烯并[1,2-f][1,3,5,2,4]-三氧二硅杂环辛烷(1-2)
在-20℃下向化合物1-1(11.5g，29.6mmol)的无水二氯甲烷(DCM)中的溶液中缓慢加入二乙基氨基三氟化硫(DAST；19.0mL，118.5mmol)，并将混合物在搅拌下加热至室温30分钟将反应混合物在-20℃下用冰水淬灭，收集有机层，水相用DCM(200mL×2)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，并在减压下除去溶剂。将粗残余物通过快速硅胶柱色谱法(1％EtOAc/99％己烷)纯化，得到1-2(6.1g，53.0％)油状物：LCMS(ES,m/z):391.2[M+H]+.
第二步:(-)-(6aR,8R,9R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-醇(1-3)
在-20℃下向碘化三甲基锍(30.5g，138.4mmol)在THF(150mL)中的悬浮液中加入n-BuLi(2.5M己烷溶液；55.3mL，138.4mmol)30分钟，将环氧化物1-2(6.0g，15.5mmol)在THF(30mL)中的溶液在-20℃下引入，反应混合物在1小时内缓慢升温至0℃，然后将混合物在环境温度下搅拌2小时，用水淬灭，然后用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，减压浓缩，残余物用硅胶柱色谱法(10％EtOAc/90％己烷，v/v)，得到油状的烯丙基醇1-3(5.1g，81％)：LCMS(ES,m/z):405.2[M+H]+.
第三步：(-)-(6aR,8S,9R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-醇(1-4)
在0℃下向搅拌的烯丙基醇1-3(5g，12.3mmol)的溶液中加入Dess-Martin高碘烷试剂7.8g，18.5mmol)。将混合物温热至环境温度并搅拌1小时。然后将混合物用硅藻土过滤，减压浓缩滤液，得到粗制烯丙基酮，将其不经进一步纯化即可直接用于下一步骤。将粗酮(4.5g，11.1mmol)溶于无水甲醇中，将溶液冷却至-78℃，在-78℃下加入CeCl3·7H2O(5.5g，14.7mmol)，然后在10分钟后搅拌，一次加入NaBH4(0.54g，14.3mmol)。在-78℃下搅拌15分钟后，将反应混合物升温至0℃，加入饱和氯化铵溶液(30mL)和10％乙酸水溶液，然后将混合物搅拌1小时。在减压下除去有机溶剂，残余物用DCM(200mL×2)萃取。将合并的DCM萃取物用盐水(50mL×2)洗涤，干燥(无水Na2SO4)，过滤并减压浓缩。残余物通过快速硅胶柱色谱(5％EtOAc/95％己烷)纯化，得到化合物14(4.3g，86％)，为油状物：LCMS(ES,m/z):405.2[M+H]+.
第四步:(+)-9-[(6aR,8R,9R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]-三氧二硅杂环辛烷-8-基]-6-N，N-二叔丁氧基羰基腺嘌呤(1-5)
在-10℃下向搅拌的三苯基膦(1.4g，5.56mmol)的THF(20mL)溶液中滴加DIAD(1.12mL，5.56mmol)，将反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后加入N，N-二叔丁氧基羰基腺嘌呤(1.5g，4.46mmol)的THF(10mL)溶液；将该混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入化合物1-4(0.75g，1.85mmol)的THF(5mL)溶液，将反应混合物在室温下搅拌3小时。在减压下除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷1/20至1/10，v/v)纯化，得到15(0.87g，65％)，为无色油状物：LCMS(ES,m/z):722.4[M+H]+.
第五步:(+)-9-[(1'R,2’R,3'R,4'R)-2'-氟-3'-羟基-4'-(羟甲基)-5'-亚甲基环戊烷-1'-基]腺嘌呤(B1-1)。
向化合物1-5(1.0g，1.38mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.10mL，1.80mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(1.3mL，1.38mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1，v/v，200mL)的混合物中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.2/10至0.6/10，v/v)，得到1(0.33g，85％)，为白色固体。LCMS(ES,m/z):280.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ2.81(bs,1H),38.1-3.91(m,2H),4.44(dt,J＝3.0,14.0Hz,1H),4.95(s,1H),4.96(dt,J＝2.5,52.5Hz,1H),5.46.(s,1H),5.90(d,J＝25.0Hz,1H),8.10(d,J＝2.5Hz,1H),8.26(s,1H)。
中间体B1-2：2-氨基-9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮
步骤一:(2R,4R,5R)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((苄氧基)甲基)-5-((4-甲氧基苯基)二苯基甲氧基)-3-亚甲基环戊醇(2-2)
将NaH(680mg，60％)和2-氨基-6-氯嘌呤(2.84g)溶解在无水60ml的DMA中，在100-120℃下搅拌15分钟，将2-1(8.47G)溶解在50mL的DMA中缓慢滴加到反应液中，在N2保护下反应12小时。减压除去溶剂，残余物加入800ml二氯甲烷，有机层加入食盐水300ml洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(2-2)2.4g。
步骤二:9-((1R,3R,4R)-3-((苄氧基)甲基)-5-氟-4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲氧基)-2-亚甲基环戊基)-6-氯-9H-嘌呤-9-基-2-胺(2-3)
将2.40g 2-2溶解于250ml无水二氯甲烷中，在0℃下滴加DAST(二乙胺基三氟化硫)，在0℃搅拌4小时。加入NaHCO3水溶液，有机层加入食盐水200ml洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(2-3)2.0g LCMS(ES,m/z):676.2[M+H]+
步骤三:(1R,3R,5R)-3-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(2-4)
将2.0g的2-3溶解于80％的冰醋酸中搅拌16小时，减压除去醋酸溶液，加入200ml无水甲苯，共沸除水，重复共沸除水操作一次，残留物溶解于无水二氯甲烷中，在-70℃下滴加三氯化硼的溶液，搅拌6小时，向反应液滴家甲醇/氨溶液，搅拌30分钟，然后浓缩除去溶剂，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(2-4)0.8g。LCMS(ES,m/z):314.1[M+H]+.
步骤四:2-氨基-9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B1-2)
将0.8g(2-4)溶解于50ml 1,4-二氧六环中，加入6N氢氧化钠溶液5ml，加热回流5小时，冷却到室温，用HCl溶液将pH值调到中性，减压浓缩除去溶剂，残余物加入二氯甲烷，过滤，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯/乙醇梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(2-5)0.51g。
LCMS(ES,m/z):296.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ8.56(s,1H),8.10(d,J＝2.5Hz,1H)；5.24.(dd,14.0Hz 1H),5.14(dd,J＝15.0Hz,1H),4.64(dt,J＝3.0,14.0Hz,1H),3.78-3.65(m,2H),3.50(dt,J＝3.0,11.0Hz,1H),3.38(dt,J＝3.0,8.0Hz,1H)；2.3(m,1H).
中间体B1-3：(1R,3R,5R)-3-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇
步骤一:(6aR,8S,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-甲磺酸酯(3-1)
将二环己醇1-4(600mg，2.36mmol)溶于无水CH2Cl2(20mL)中，在氩气下于0℃，缓慢加入三乙胺(1.10mL，7.89mmol)和甲磺酰氯(MsCl，305μL，3.94mmol)。反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后倒入冰冷的磷酸盐缓冲液(pH7.2，150mL)和Et2O(150mL)。水相用Et2O(2～100mL)萃取，将合并的萃取液干燥(MgSO4)并浓缩。将甲磺酸甲酯6-1用于下一个取代反应，无需进一步纯化(硅胶色谱分离)。
步骤二:(6aR,8R,9aR)-8-叠氮基-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷(3-2)
将甲磺酸酯3-1(810mg，2.36mmol)溶于无水DMF(20mL)中，并在室温下在氩气下一次性加入叠氮化钠(1.70g，23.6mmol)。将混合物加热至60-80℃4小时，然后冷却至室温。将反应物倒入磷酸盐缓冲液(pH7.2，100mL)和Et2O(100mL)的混合物中，水相用Et2O(2mL)萃取。将合并的有机萃取液干燥(MgSO4)并浓缩。在硅胶上快速层析，用含体积分数25-45％EtOAc的己烷溶液洗脱，得到无色油状的叠氮化物3-2(440mg，73％)。LCMS(ES,m/z):430.2[M+H]+。
步骤三：制备：(6aR,8R,9aR)-8氨基-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷(3-3)
将化合物3-2(1.10g，2.56mmol)和Pd/C(20mg)的乙酸乙酯溶液搅拌，氢气氛围下在室温下搅拌12小时。从粗产物中过滤催化剂。减压浓缩得到氨基化合物3-3，直接用于下一个反应步骤。
步骤四：6-氯-N4-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8基)嘧啶-4,5-二胺(3-4)。
将5-氨基-4,6-二氯嘧啶(0.6g，2mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.55g，4.1mmol)的四氢呋喃溶液加入到3-3的溶液中，在50℃下搅拌6小时。真空除去溶剂后，通过快速柱色谱(EtOAc/PE。1:5，v/v)纯化产物，得到3-4黄色粉末。LCMS(ES,m/z):531.2[M+H]+。
步骤五：7-氯-3-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶(3-5)
将从上一步得到化合物3-4溶解于乙酸。然后将水(10mL)加入溶液中。溶液通过冰水浴在5℃以下的温度下反应。将亚硝酸钠(0.07g，0.95mmol)溶于水(5mL)中，然后缓慢加入溶液体系中。溶液体系在5℃以下的温度下反应30分钟，然后在50℃用热水浴加热1小时。混合物用H2O(20mL)和二氯甲烷(3×15mL)萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂后，通过快速柱色谱法(EtOAc/PE，1:5，v/v)纯化产物，得到化合物3-5为淡黄色粉固体。
步骤六:7-氨基-3-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶(3-6)
将3-5(280mg，0.6mmol)加入到饱和氨的异丙醇溶液(10mL)的溶液中，在加热至60℃-70℃下搅拌直至反应完全，冷却，蒸发除去溶剂等挥发物。残余物通过硅胶柱色谱纯化(9％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到3-6(110mg，70％)，为白色固体：mp 206-209℃；LCMS(ES,m/z):523.3[M+H]+
第七步：(1R,3R,5R)-3-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(3)
向化合物3-6(0.8g，1.53mmol)的THF溶液中加入三氟乙酸(0.11mL)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入氟化四丁基铵(TBAF，1M THF溶液)(1.4mL)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1，v/v，200mL)的混合物中，并用食盐水(2×50mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.2/10至0.6/10)，得到化合3(0.33g，85％)，为白色固体。LCMS(ES,m/z):281.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ2.81(bs,1H),3.8-3.91(m,2H),4.44(dt,J＝3.0,14.0Hz,1H),4.95(s,1H),4.96(dt,J＝2.5,52.5Hz,1H),5.46.(s,1H),5.90(d,J＝25.0Hz,1H),8.10(d,J＝2.5Hz,1H),8.26(s,1H)；19F-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-192.93(ddd,J＝14.0,28.0,56.0Hz,1F)；.
中间体B1-4:(1R,3R,5R)-3-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇
步骤一:(2R,4R,5R)-2-(2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-4-((苄氧基)甲基)-5-((4-甲氧基苯基)二苯基甲氧基)-3-亚甲基环戊醇(4-1)
将NaH(1.64g，60％)和2-氨基4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(8.4g，50mmol)溶解在无水500ml的DMA中，在100-120℃下搅拌15分钟，将2-1(25.0g)溶解在300mL的DMA中加入反应液中，在N2保护下反应12小时。减压除去溶剂，将残余物溶解于2000ml二氯甲烷，加入食盐水500ml洗涤三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(4-1)11.70g。
步骤二:7-((1R,3R)-3-((苄氧基)甲基)-5-氟-4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲氧基)-2-亚甲基环戊基)-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺(4-2)
将11.7g化合物4-1溶解于400mL无水二氯甲烷中，在0℃下滴加足量的DAST，在0℃搅拌4小时。加入NaHCO3水溶液，有机层加入食盐水500ml洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(4-2)9.70g。LCMS(ES,m/z):675.2[M+H]+。
步骤三:(3R,5R)-3-(2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(4-3)
将9.7g的4-2溶解于80％的冰醋酸中搅拌16小时，减压除去醋酸溶液，加入250ml无水甲苯，共沸除水，残留物溶解于无水二氯甲烷中，在-70℃下滴加三氯化硼的溶液，搅拌6小时。向反应液滴家甲醇/氨溶液，搅拌30分钟，然后浓缩出去溶剂，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(4-3)3.59g。LCMS(ES,m/z):313.2[M+H]+。
步骤四:2-氨基-7-((1R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4(7H)-酮(4)
将3.59g(4-3)溶解于250ml 1,4-二氧六环中，加入6N氢氧化钠溶液，加热回流5小时，冷却到室温，用HCl溶液将pH值调到中性，减压浓缩除去大量溶剂，残余物加入二氯甲烷，过滤，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯/乙醇梯度洗脱，浓缩得到灰白色产物(4)2.34g。LCMS(ES,m/z):294.1[M+H]+。
中间体B1-5：9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-9H-嘌呤-6-醇
步骤一:6-氯-9-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8基)-9H-嘌呤(5-1)。
在-15℃下向搅拌的三苯基膦(3.9g，15mmol)的THF(40mL)溶液中滴加DIAD(4.5mL，22mmol)，将反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后加入6-氯-9H-嘌呤(2.3g，15mmol)的THF(25mL)溶液；将该混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入化合物1-4(6.1g，15mmol)的THF(100mL)溶液，将反应混合物在室温下搅拌6小时。在减压下除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷1/20至1/10)纯化，得到5-1(4.2g，52％)，为无色油状物：LCMS(ES,m/z):541.2[M+H]+。
步骤二：9-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8-基)-9H-嘌呤-6-醇(5-2)
将5-1(4.0g，7.4mmol)，NaOMe(1M的MeOH溶液)(7.4mL，7.4mmol)，和HSCH2Cl2OH(0.5mL，7.4mmol)溶解于MeOH(100mL)中，混合物在氮气下回流4小时。将反应混合物冷却，用冰醋酸中和反应混合物后，真空蒸发至干。残余物通过硅胶柱色谱法(MeOH/CH2Cl2，v/v，1/9)纯化，得到5-2(2.94g，78％)，为白色固体：LCMS(ES,m/z):523.2[M+H]+。
步骤三：9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-9H-嘌呤-6-醇(B1-5)
向化合物5-2(2.8g，5.4mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(1.2mL)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(12mL，12mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1)的400mL混和溶液中，用水(2×80mL)洗涤。收集有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.2/10至0.6/10，v/v)，得到B1-5(1.20g，80％)，为白色固体：LCMS(ES,m/z):281.1[M+H]+。
中间体B1-6:3-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-醇(B1-6)
步骤一:7-羟基-3-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶(6-1)
将化合物3-5(5.4g)溶解到100ml的1,4-二氧六环中，并加入4N的NaOH溶液15ml，在50℃下搅拌6小时。冷却到0℃，加入适量的4N的HCl溶液将溶液pH值调到7左右，真空除去溶剂后，通过快速柱色谱(EtOAc/PE，1:5，v/v)纯化产物，得到目标产物6-1为白色固体粉末4.18g。LCMS(ES,m/z):524.2[M+H]+。
第二步：(1R,3R,5R)-3-(7-羟基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(B1-6)
向化合物6-1(1.05g，2mmol)的THF溶液中加入三氟乙酸(0.15mL)，并将混合物在室温下搅拌3小时。向该反应混合物中加入氟化四丁基铵(TBAF，1M THF溶液)(1.8mL)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1，v/v)的混合物200mL中，并用食盐水(2×50mL)洗涤。收集有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.2/10至0.6/10，v/v)，得到B1-6(0.45g，81％)，为白色固体。mp 214-217℃,LCMS(ES,m/z):281.1[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ2.81(bs,1H),38.1-3.91(m,2H),4.44(dt,J＝3.0,14.0Hz,1H),4.95(s,1H),4.96(dt,J＝2.5,52.5Hz,1H),5.46.(s,1H),5.90(d,J＝25.0Hz,1H),8.10(d,J＝2.5Hz,1H),8.26(s,1H)；19F-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-192.93(ddd,J＝14.0,28.0,56.0Hz,1F).
中间体B1-7:5-氟-7-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-醇(B1-7)
第一步：4-氯-5-氟-7-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(7-1)
在-20℃下向搅拌的三苯基膦(2.62g，10mmol)的THF(30mL)溶液中滴加DIAD(2.2mL，11mmol)，将反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后加入4-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1.71g，10mmol)的THF(15mL)溶液；将该混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入化合物1-4(4.04g，10mmol)的THF(30mL)溶液，将反应混合物在室温下搅拌3小时。在减压下除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷1/20至1/10，v/v)纯化，得到为无色油状物7-1(3.34g，60％)，LCMS(ES,m/z):558.2[M+H]+。
第二步：4-羟基-5-氟-7-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
将化合物7-1(2.79g，5mmol)，2-巯基乙醇(0.49mL，7.0mmol)和NaOMe(0.38g，7.0mmol)溶解在MeOH(50ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物7-2(2.2g，4.1mmol)。LCMS(ES,m/z):540.2[M+H]+。
第三步：5-氟-7-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-醇(B1-7)
向化合物7-2(2.2g，4.1mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.8mLl)，并将混合物在室温下搅拌10小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(5mL，5mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1)的混合溶液250mL中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM，0.2/10至0.6/10，v/v)，得到白色固体B1-7(1.0g，83％)：LCMS(ES,m/z):298.1[M+H]+。
中间体B1-8:(1R,3R,5R)-3-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(B1-8)
第一步：4-氯-7-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(8-1)
在-10℃下向搅拌的三苯基膦(2.62g，10mmol)的THF(40mL)溶液中滴加DIAD(2.2mL，11mmol)，将反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后加入4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1.53g，10mmol)的THF(10mL)溶液；将该混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入化合物1-4(4.04g，10mmol)的THF(50mL)溶液，将反应混合物在室温下搅拌6小时。在减压下除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷1/20至1/10，v/v)纯化，得到8-1为无色油状物2.9g，54％。LCMS(ES,m/z):540.2[M+H]+。
第二步：4-氨基-7-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
将化合物8-1(2.9g，5.4mmol)加入到饱和氨的异丙醇溶液(50mL)的溶液中，在密闭条件下加热至60℃-70℃下搅拌直至反应完全，冷却，蒸发除去溶剂等挥发物。残余物通过硅胶柱色谱纯化(9％甲醇的二氯甲烷溶液)，得到8-2为白色固体(2.1g，74.7％)。LCMS(ES,m/z):521.3[M+H]+。
第三步：(1R,3R,5R)-3-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(B1-8)
向化合物8-2(1.04g，2mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.2mL，3.6mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(3mL，3mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1)的混合物200mL中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.1/10至0.6/10，v/v)，得到B1-8为白色固体(0.48g，86％)，LCMS(ES,m/z):279.1[M+H]+。
中间体B1-9:1-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4-醇(B1-9)
第一步：4-氯-1-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶(9-1)
在-20℃下向搅拌的三苯基膦(3.93g，15mmol)的THF(60mL)溶液中滴加DIAD(3.3mL，16.7mmol)，将反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后加入4-氯-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶(2.3g，15mmol)的THF(40mL)溶液；将该混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入化合物1-4(6.06g，15mmol)的THF(60mL)溶液，将反应混合物在室温下搅拌6小时。在减压下除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷1/20至1/10，v/v)纯化，得到9-1为无色油状物(5.1g，63％)。LCMS(ES,m/z):540.2[M+H]+。
第二步：1-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4(5H)-酮
将化合物9-1(5.1g，9.5mmol)，2-巯基乙醇(1mL)和NaOMe(0.54g，10mmol)溶解在MeOH(50ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用1％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物9-2(3.96g)。LCMS(ES,m/z):522.2[M+H]+。
第三步：1-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4(5H)-酮(B1-9)
向化合物9-2(3.1g，6mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.4mL)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(6.6mL，6.6mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1，v/v)的混合物250mL中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.2/10至0.6/10，v/v)，得到为白色固体B1-9(1.32g，79％)。LCMS(ES,m/z):280.1[M+H]+。
中间体B1-10:3-氟基-1-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4-醇(B1-10)
第一步：4-氯-3-氟-1-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅环辛烷-8-基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶(10-1)
在-10℃下向搅拌的三苯基膦(2.62g，10mmol)的THF(30mL)溶液中滴加DIAD(2.2mL，11mmol)，将反应混合物在该温度下搅拌30分钟，然后加入4-氯-3-氟-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶(1.7g，10mmol)的THF(30mL)溶液；将该混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入化合物1-4(4.4g，11mmol)的THF(5mL)溶液，将反应混合物在室温下搅拌5小时。在减压下除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱法(EtOAc/己烷1/20至1/10，v/v)纯化，得到10-1为无色油状物(3.34g，60％)LCMS(ES,m/z):557.2[M+H]+。
第二步：3-氟-1-((6aR,8R,9aR)-9-氟-2,2,4,4-四异丙基-7-亚甲基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]氧二硅环辛烷-8基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
将化合物10-1(3.34g，6mmol)，2-巯基乙醇(0.49mL，7mmol)和NaOMe(0.38g，7mmol)溶解在MeOH(50ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物10-2(2.42g，75％)LCMS(ES,m/z):539.2[M+H]+。
第三步：3-氟-1-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟基甲基)-5-亚乙基环戊基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(B1-10)
向化合物10-2(2.42g，4.5mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.40mL，7.2mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(5mL，5mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4：1，v/v)的混合物250mL中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.2/10至0.6/10，v/v)，得到白色固体B1-10(0.99g，74％)，LCMS(ES,m/z):297.1[M+H]+。
中间体B1-11:2-氨基-9-((1R,2R,3R,4R,Z)-2-氟-5-(氟亚甲基)-3-羟基-4-(羟甲基)环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B1-11)
1:第一步:2-氨基-9-((6aR,8R,9S,9aR,Z)-7-(氟亚甲基)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(11-2)
将化合物(Z)-11-1(参照文献制备J.Org.Chem.2016,81,2827-2836)(2.29g，2.82mmol)溶于THF(8mL)和80％HCO2H(30mL)中。将所得混合物在60℃加热4小时。在蒸发所有挥发物后，将残余物与EtOH(约30mL)共蒸发。将其用约30mLNH3/MeOH饱和溶液处理。将残余物蒸发，然后与甲苯(约30mL)共蒸发三次。将所得残余物溶于吡啶(50mL)中。在0℃下向悬浮液中加入TIPDSCl2(933μL，2.96mmol)。将所得悬浮液在相同温度下搅拌20小时。混合物用碎冰处理，加入300mL的CH2Cl2，有机层用饱和NaHCO3洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，残余物用硅胶柱色谱纯化(AcOEt/MeOH＝50/1，含有0.25％H2O)，得到固体状的(Z)-11-2(992mg，64％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.88-1.07(m,27H),2.85-2.86(m,1H),3.16(d,J＝5.2Hz,1H),3.88(t,J＝3.6Hz,1H),4.18-4.22(m,2H),5.00(s,1H),5.45(d,J＝4.4Hz,1H),6.51(br-s,2H),7.18(d,JH,F＝81.6Hz,1H),7.42(s,1H),10.60(br-s,1H)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ12.0,12.6,12.6,12.7,16.8,16.9,16.9,17.0,17.2,17.2,17.3,17.5,43.6,56.4,59.3,71.8,74.8,116.5,118.5(d,JC,F＝6.0Hz),134.3,149.0(d,JC,F＝257.9Hz),150.9,153.7,156.7；19F-NMR(470MHz,DMSO-d6)δ-127.48(d,JH,F＝88.8Hz).LC-MS m/z：554[M+H]+.
第二步：2-氨基-9-((6aR,8R,9R,9aR,Z)-9-氟-7-(氟亚甲基)-2,2,4,4-四异丙基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(11-3)
在0℃下向溶解于50mL无水二氯甲烷的(E)-11-2(552mg)中滴加足量的DAST，在0℃搅拌4小时。加入NaHCO3水溶液，有机层加入食盐水50ml洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到11-3为灰白色产物422mg(76％)，LCMS(ES,m/z):556.2[M+H]+。
第三步:2-氨基-9-((1R,2R,3R,4R,Z)-2-氟-5-(氟亚甲基)-3-羟基-4-(羟甲基)环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(1-11)
向化合物11-3(442mg，0.76mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.1mL，1.8mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(1mL，1mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1，v/v)的混合物200mL中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.1/10至0.6/10)，得到B1-11为白色固体(195g，82％)，LCMS(ES,m/z):314.1[M+H]+。
中间体B1-12：2-氨基-9-((1R,2R,3R,4R,E)-2-氟-5-(氟亚甲基)-3-羟基-4-(羟甲基)环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮
第一步:2-氨基-9-((6aR,8R,9S,9aR,E)-7-(氟亚甲基)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(12-2)
向(E)-12-1(0.8g，1mmol)和H2O(10mL)混合物中加入TFA(0.1L)。将所得黄色悬浮液在室温下搅拌48小时。向混合物中加入EtOH(15mL)，然后蒸发掉所有的挥发物。这种共沸蒸发重复三次。残余物用NH3/MeOH(0℃饱和，50mL)处理。将所得混合物在室温下搅拌15分钟。将混合物蒸发直到大部分MeOH被除去。向残余物中加入DMF(10mL)，然后使用甲苯在共沸条件下蒸发。将所得固体在真空条件下干燥48小时。在0℃下向上述残留物和咪唑(200mg，3mmol)的DMF(20mL)溶液中滴加入1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(TIPDSCl2，426μL，1.36mmol)。将所得混合物在相同温度下再搅拌3小时。向其中加入H2O(60mL)，然后用AcOEt萃取。在蒸发有机层的所有挥发物后，残余物通过硅胶柱色谱纯化(AcOEt/80％MeOH，v/v，30/1)。得到为固体(E)-12-2(356mg，65％)。LC-MS(ES,m/z):554.3[M+H]+
第二步：2-氨基-9-((6aR,8R,9R,9aR,E)-9-氟-7-(氟亚甲基)-2,2,4,4-四异丙基六氢环戊二烯并[f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-8-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(12-3)
在0℃下向溶解于40mL无水二氯甲烷的(E)-12-2(356mg)中滴加足量的DAST，在0℃搅拌4小时。加入NaHCO3水溶液，有机层加入食盐水50ml洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物用硅胶柱分离，用石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，浓缩得到12-3为灰白色产物300mg，LCMS(ES,m/z):556.2[M+H]+。
第三步:2-氨基-9-((1R,2R,3R,4R,E)-2-氟-5-(氟亚甲基)-3-羟基-4-(羟甲基)环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(1-12)
向化合物12-3(1.04g，2mmol)的THF中溶液中加入三氟乙酸(0.2mL，3.6mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。向该反应混合物中加入四丁基氟化铵(TBAF，1M THF溶液)(3mL，3mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。减压除去溶剂；将残余物溶于异丙醇和氯仿(4/1，v/v)的混合物200mL中，用水(2×50mL)洗涤。收集有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化(甲醇/DCM 0.1/10至0.6/10，v/v)，得到B1-12为白色固体(0.48g，86％)，LCMS(ES,m/z):314.1[M+H]+。
中间体B2-1：N-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(B2-1)(WO2017075477A1Adruo)
步骤1:N-(9-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(13-2)
在0-5℃下向2-氨基-9-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,9-二氢-6H-嘌呤-6酮(5.7g，20mmol)的吡啶(60mL)悬浮中加入TMSCl(3.26g，30mmol)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。然后，滴加异丁酸酐(5.0g，31.6mmol)，再搅拌2小时。然后，加入MeOH(10mL)。5分钟后，滴加NH4OH(20.5mL)，继续搅拌60分钟。将反应混合物减压浓缩，向剩余物中加入CH2Cl2(300mL)的MeOH(15mL)溶液。滤出不溶物，浓缩滤液，用1-10％MeOH的CH2Cl2进行快速柱色谱纯化，得到产物13-2为白色固体5.4g。LCMS(ES,m/z)：286.1[M+H]+。
步骤2：N-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺
N-(9-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(3.55g，10mmol)与吡啶(3×20mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(50mL)中。向0-5℃的溶液中加入DMTrCl(4.1g，12mmol)。将其在室温下搅拌3小时，然后减压浓缩。向残余物找那个加入CH2Cl2(200mL，含1％Et3N)，用饱和NaHCO3(15mL)，水(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物为白色固体4.6g(70％))。LCMS(ES,m/z)：656.2[M-H]+
中间体B2-2：N-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺(B2-2)
第一步：((2R,3R,4S,5R)-4-乙酰氧基-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-氟四氢呋喃-2-基)苯甲酸甲酯(14-2)
将6-氯嘌呤(7.7g，50mmol)和(3S,4R,5R)-5-((苯甲酰氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-2,3-二基二乙酸酯(17.0g，50mmol)溶解于500ml无水乙睛中，在0℃下滴加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(25ml，25g，16mmol)，在加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)(35.9ml，44g，20mmol)，加热至60℃，搅拌反应4小时，TCL检测反应完毕。将反应液冷却至0℃，加入饱和NaHCO3溶液和二氯甲烷，萃取，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩，残余物用硅胶柱分离(EA:PE＝1:10-1:3)得14-2为白色固体产品13.0g。LCMS(ES,m/z)：435.1[M+H]+
第二步：(2R,3S,4S,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(12-3)
将((2R,3R,4S,5R)-4-乙酰氧基-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-氟四氢呋喃-2-基)苯甲酸甲酯14-2(13.0g，30mmol)转移到500mL厚壁反应瓶中，加入250mL 12MNH3的甲醇溶液中。在密闭条件下加热至50℃反应16小时。冷却，蒸发溶剂，将残余物用硅胶柱中分离，用0-10％MeOH/CH2Cl2的梯度洗脱，得到14-3为白色固体6.5g(80％)。LCMS(ES,m/z)：270.1[M+H]+
第三步:N-(9-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺(14-4)
向(2R,3S,4S,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-醇(30mL)悬浮中在0-5℃下(6.5g，24mmol)加入TMSCl(3.26g，30mmol)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。然后，滴加异丁酸酐(5.0g，31.6mmol)，再搅拌2小时。然后，加入MeOH(10mL)。5分钟后，滴加NH4OH(20mL)，继续搅拌60分钟。将反应混合物减压浓缩，向剩余物中加入CH2Cl2(300mL)的MeOH(20mL)溶液。滤出不溶物，浓缩滤液，用1-10％MeOH的CH2Cl2进行快速柱色谱纯化，得到产物6.1g(75％)。LCMS(ES,m/z)：340.1[M+H]+。
第四步：N-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺(B2-2)
将14-4(6.1g，18mmol)与吡啶(3×20mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(50mL)中。在0-5℃下向该溶液中加入DMTrCl(7.3g，21.6mmol)。将其在室温下搅拌3小时，然后浓缩。加入CH2Cl2(300mL，含1％Et3N)，用饱和NaHCO3(150mL)，水(150mL)和盐水(150mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-2)。LCMS(ES,m/z)：642.3[M+H]+
中间体B2-3a/B2-3b：N-(3-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺：
第一步:(2R,3R,4R,5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)四氢呋喃-3-,4-二羟基二乙酸酯
向1H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-7-胺(3.4g，25mmol)和(3R,4R,5R)-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-2,3,4-三甲基三乙酸酯(7.95mg，25mmol)的MeCN(200ml)溶液，在5分钟内加入SnCl4(8.8ml，75mmol)，混合物在氩气保护下室温搅拌24小时然后将溶液倒入杯中饱和NaHCO3水溶液(500ml)，滤出沉淀并用H2O(2×10ml)洗涤。合并的滤液和洗涤液用CH2Cl2(4×150ml)萃取。有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发后，得到淡黄色泡沫(8.7g)，用硅胶柱分离分离(用0.2％-10％甲醇的二氯乙烷梯度洗脱，得到15-2为白色固体3.3g(34％)，另一异构体4.0g。LCMS(ES,m/z)：395.1[M+H]+
第二步:(2R,3R,4S,5R)-2-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3-，4二醇(15-3)
将化合物(15-2)(2.0g，5.1mmol)在100mL的MeOH/25％NH3水溶液中搅拌4小时。加热蒸发甲醇后冷却，产物从H2O中结晶，得到1.1g(81％)无色晶体(15-3)。LCMS(ES,m/z)：269.1[M+H]+
第三步：N-(3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-D]嘧啶-7-基)苯甲酰胺15-4
向搅拌的(15-3(536mg，2.0mmol)的吡啶(6.5mL)溶液中，在室温下加入TMSCl(2.62mL，20.5mmol)。将所得溶液搅拌1.5小时，然后加入苯甲酰氯(0.357mL，3.08mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(3mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入0.5mL氨水(28％w/w)。将反应混合物升温至室温并搅拌60分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(30mL)中，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化；0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到15-4。LCMS(ES,m/z)：373.1[M+H]+
第四步：N-(3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺15-5
将15-4(3.72g，10mmol)与吡啶(3×20mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(30mL)中。向0-5℃的溶液中加入DMTrCl(4.24g，12.5mmol)。将其在室温下搅拌3小时，然后浓缩。加入CH2Cl2(120mL，含1％Et3N)，用饱和NaHCO3(15mL)，水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(15-5)，LCMS(ES,m/z)：675.32[M+H]+
第五步：N-(3-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺(15-6)
将15-5(1.35g，2mmol)在吡啶(20mL)中的溶液中加入AgNO3(670mg，4.0mmol)。在室温下避光下搅拌1小时后加入TBDMSCl(450mg，3.0mmol)在THF(15mL)中的溶液，并将整个混合物在相同温度下搅拌。1小时后，加入额外量的AgNO3(400mg，2.4mmol)和TBDMSCl(330mg，2.2mmol)，并将整个混合物在相同温度下再搅拌4.5小时。通过硅藻土过滤出反应混合物的不溶物，滤液用100mL的CHCl3稀释。有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用H2O洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。将残余物与甲苯共蒸发三次，残余物通过中和的硅胶柱纯化，用石油醚/AcOEt(5/1-1/3，v/v)洗脱，得到15-6为白色泡沫(1.02g，65％)，LC-MS m/z789.3[M+H]+；
第六步(2R,3R,4R,5R)-5-(7-苯甲酰氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-3-基三氟甲磺酸酯(15-7)
将15-6(1.02g，1.3mmol)和DMAP(0.35g，2.8mmol)悬浮于无水THF(35mL)，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，1.13mL，6.5mmol)，向得到的混合物中加入N-苯基三氟甲磺酰胺(0.86g，2.6mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌3.5小时，此时将其倒入5％盐水(50mL)中，并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤出干燥剂并真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物15-7，为褐色固体1.0克(85％)；LC-MS m/z 921.3[M+H]+；
第七步(2R,3S,4R,5R)-5-(7-苯甲酰氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-3-基乙酸酯(15-8)
将化合物15-7(1.0g，1.1mmol)，KOAc(0.5g，5mmol)和18-冠醚-6(1,4,7,10,13,16)-六氧杂环十八烷，0.16g，0.6mmol)在甲苯(30mL)的混合物在110℃加热4h。然后将反应混合物冷却至室温，加入硅胶(10g)，真空除去溶剂。将粗物质通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物15-8，为黄褐色固体：0.6g(60％)。LC-MS m/z831.3[M+H]+；
第八步：N-(3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺15-9
将化合物15-8(0.6g，0.7mmol)溶于MeOH(12mL)中，加入2.0M二甲胺的MeOH溶液(2mL，4mmol)。将反应混合物在25-30℃下搅拌17小时。减压浓缩除去溶剂，将残留物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-75％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物15-9，为褐色固体，0.51g(90％)。LC-MS m/z 789.3[M+H]+
第九步：N-(3-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺15-10
将化合物15-9(510mg，0.65mmol)在惰性氮气氛下溶于无水DCM(5mL)中，将溶液冷却至0℃。加入1.0M的DAST溶液(1mL，1.0mmol)，随后将反应在-5℃下搅拌17小时。将容器加热至0℃并加入饱和NaHCO3(2mL)。搅拌30分钟后，将混合物用5％盐水(10mL)稀释，并用EtOAc(2×20mL)萃取。将合并的有机相并用Na2SO4干燥，滤除干燥剂，将硅胶(2g)加入到滤液中，真空除去溶剂。将粗产物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-75％EtOAc/石油醚)，得到非对映异构体15-10a和15-10b的混合物，为褐色固体302mg；主峰为异构体(2R,3S,4S,5R)；LCMS：Rt 1.63分钟；m/z 791.3(M+H]+；次要峰为(2R,3S,4R,5R)；非对映异构体：Rt 1.70分钟；m/z，791.3[M+H]+。
第十步：N-(3-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺B2-3
将非对映异构体15-10a和15-10b的混合物(302mg，0.38mmol)溶于无水THF(20mL)中，并在惰性氮气氛下冷却至-45℃，然后加入1.0M TBAF(0.50mL，0.5mmol)。将反应物搅拌2.5小时，然后用饱和NaHCO 3(20mL)淬灭。除去冷浴，将浆液搅拌10分钟，然后用5％盐水(20mL)稀释混合物，并用DCM(2×50mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，将硅胶(4g)加入到滤液中，真空除去溶剂。将粗物质通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物(B2-3)，为白色固体：141mg；LC-MS m/z 677.3[M+H]+,为一对非对映异构体的混合物。主峰为构型为(2R,3S,4S,5R)的异构体B2-3a；LCMS，Rt 1.47分钟；次要峰为构型(2R,3S,4R,5R)的非对映异构体B2-3b，LCMS，Rt1.42分钟。
中间体B2-4a/B2-4b：N-(7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(B2-4)
第一步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(16-2)
向搅拌的(16-1(5.32g，20mmol)的吡啶(80mL)溶液中，在室温下加入TMSCl(26.2mL，20.5mmol)。将所得溶液搅拌1.5小时，然后加入苯甲酰氯(3.57mL，3.08mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(30mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入5mL氨水(28％w/w)。将反应混合物升温至室温并搅拌60分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(400mL)中，用乙酸乙酯(3×400mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化；0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到16-2，为白色固体5.4g。LCMS(ES,m/z)：371.1[M+H]+
第二步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(16-3)
将16-2(3.70g，10mmol)与吡啶(3×20mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(30mL)中。向0-5℃的溶液中加入DMTrCl(4.24g，12.5mmol)。将其在室温下搅拌3小时，然后浓缩。加入CH2Cl2(120mL，含1％Et3N)，用饱和NaHCO3(15mL)，水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(16-3)。LCMS(ES,m/z)：673.3[M+H]+
第三步：N-(7-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(16-4)
将16-3(1.34g，2mmol)在吡啶(20mL)中的溶液中加入AgNO3(670mg，4.0mmol)。在室温下避光下搅拌1小时后加入TBDMSCl(450mg，3.0mmol)在THF(15mL)中的溶液，并将整个混合物在相同温度下搅拌。1小时后，加入额外量的AgNO3(400mg，2.4mmol)和TBDMSCl(330mg，2.2mmol)，并将整个混合物在相同温度下再搅拌4.5小时。通过硅藻土过滤出反应混合物的不溶物，滤液用100mL的CHC3稀释。有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用H2O洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。将残余物与甲苯共蒸发三次，残余物通过中和的硅胶柱纯化，用石油醚/AcOEt(5/1-1/3，v/v)洗脱，得到16-4为白色泡沫(1.1g，70％)，LC-MS m/z 787.3[M+H]+；
第四步((2R,3R,4R,5R)-5-(4-苯甲酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-3-基三氟甲磺酸酯(16-5)
将16-4(1.10g，1.4mmol)和DMAP(0.35g，2.8mmol)悬浮于无水THF(40mL)，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，1.13mL，6.5mmol)，向得到的混合物中加入N-苯基三氟甲磺酰胺(0.86g，2.6mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌3.5小时，此时将其倒入5％盐水(50mL)中，并用EtOAc(2×110mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤出干燥剂并真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱20-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物16-5，为褐色固体1.08克(84％)；LC-MS m/z 919.3[M+H]+；
第五步(2R,3S,4R,5R)-5-(4-苯甲酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-3-基乙酸酯(16-6)
将化合物16-5(1.08g，1.17mmol)，KOAc(0.5g，5mmol)和18-冠醚-6(1,4,7,10,13,16)-六氧杂环十八烷，0.16g，0.6mmol)在甲苯(35mL)的混合物在110℃加热4h。然后将反应混合物冷却至室温，真空除去溶剂。将粗物质用硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物16-6，为黄色固体：0.66g(68％)；LC-MS m/z 829.3[M+H]+；
第六步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺16-7
将化合物16-6(0.66g，0.8mmol)溶于MeOH(12mL)中，加入2.0M二甲胺的MeOH溶液(2mL，4mmol)。将反应混合物在25-30℃下搅拌16小时。减压浓缩除去溶剂，将残留物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱20-75％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物16-7，为黄色固体：0.53g(85％)；LC-MS m/z 787.3[M+H]+
第七步：N-(7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺16-8
将化合物16-7(530mg，0.67mmol)在惰性氮气氛下溶于无水DCM(5mL)中，将溶液冷却至0℃。加入1.0M的DAST溶液(1mL，1.0mmol)，随后将反应在-5℃下搅拌16小时。将容器加热至0℃并加入饱和NaHCO3(2.5mL)。搅拌40分钟后，将混合物用5％盐水(12mL)稀释，并用EtOAc(2×25mL)萃取。将合并的有机相并用Na2SO4干燥，滤除干燥剂，真空除去溶剂。将粗产物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-75％EtOAc/石油醚)，得到非对映异构体16-8a和16-8b的混合物，为褐色固体280mg；主峰为异构体(2R,3S,4S,5R)；LCMS：Rt 1.68分钟；m/z 789.3(M+H]+；次要峰为(2R,3S,4R,5R)，非对映异构体：Rt 1.81分钟；m/z，789.3[M+H]+。
第八步：N-(7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-7H-吡咯并[2,1，3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺B2-4
将非对映异构体16-8a和16-8b的混合物(280mg，0.36mmol)溶于无水THF(15mL)中，并在惰性氮气氛下冷却至-45℃，然后加入1.0M TBAF(0.50mL，0.5mmol)。将反应物搅拌2.5小时，然后用饱和NaHCO 3(15mL)淬灭。除去冷浴，将浆液搅拌10分钟，然后用5％盐水(18mL)稀释混合物，并用DCM(2×50mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，将硅胶(4g)加入到滤液中，真空除去溶剂。将粗物质通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱15-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物(B2-4)，为白色固体：172mg；LC-MS m/z 677.3[M+H]+,为一对非对映异构体的混合物。主峰为构型为(2R,3S,4S,5R)的异构体B2-4a；LCMS，Rt 1.54分钟；次要峰为构型(2R,3S,4R,5R)的非对映异构体B2-4b,LCMS，Rt1.38分钟。
中间体B2-5a/B2-5b:N-(7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)异丁酰胺(B2-5)
步骤一：7-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-D][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(17-2)。
向含有CCl4(5mL，51mmol)的5-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2,3-O-异亚丙基-D-核糖(9.13g，30mmol)在甲苯(100mL)中的溶液中加入六甲基磷酰胺7.2mL，40mmol)。在0℃下搅拌2.5小时后，将的反应混合物加入到4-氯-5-氟-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶(14-1，3.1g，20mmol)，三(3,6-二氧杂庚基)胺(TDA-1)(3mL，9mmol)和KOH(2.6g，4.5mmol)在甲苯(100mL)中的溶液中，并将整个反应混合物在室温下搅拌24小时。加入饱和NH4Cl水溶液终止反应，将整个混合物转移到分液漏斗中。水层用AcOEt萃取，合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩得到粗产物17-2。LC-MS m/z 458.2[M+H]+,
第二步:(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-3,4-二醇
将得到的上一步产品加入到90％TFA水溶液(120mL)中，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物真空浓缩，所得残余物通过硅胶柱纯化，用MeOH在CH2Cl2(0-8％)中洗脱，得到17-3为淡黄色油状物(3.5g，60％)。LC-MS m/z 303.0[M+H]+。
第三步:(2R,3S,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(4-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)四氢呋喃-3,4-二醇(17-4)
在0℃向15-3(3.5g，11.6mmol)的吡啶(120mL)溶液中加入DMTrCl(4.0g，12mmol)，将反应混合物在室温下搅拌2小时。通过加入冰淬灭反应。向反应混合物中加入200mL乙酸乙酯，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相并用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤除去干燥剂并真空浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用己烷/AcOEt(1-1/3)洗脱，得到(17-4)，为淡黄色泡沫(5.8g，82.6％)。LC-MS m/z 606.2[M+H]+。
第四步:(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(17-5)
将17-4(3.0g，5mmol)加入到饱和的NH3/MeOH(0℃，50mL)溶液中，在密封的不锈钢管中在100-110℃下加热36小时。反应完毕冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残余物通过硅胶柱纯化，用CH2Cl2(0-10％)中的MeOH洗脱，得到(17-5)，为白色固体(2.43g，83％)。LC-MSm/z587.2[M+H]+。
第五步:N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)异丁酰胺(17-6)
将三甲基氯硅烷(3.0mL，23.6mmol)加入到17-5(2.41g，4.1mmol)在吡啶(20mL)中的溶液中，得到混浊的混合物。1小时后，加入异丁酸酐(3.0mL，18.1mmol)。在室温下搅拌6小时后，将混合物冷却至0℃，加入水(4mL)。再过30分钟后，加入浓NH4OH(4mL)搅拌30分钟，并将反应混合物真空浓缩。将所得残余物在CH2Cl2(100mL)和水(100mL)之间分配。水层用CH2Cl2(3×100mL)萃取。将合并的有机萃取液用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，真空浓缩。残留的无色粘稠油状物通过色谱法纯化，用20-80％EtOAc的CH2Cl2溶液作为洗脱液，得到2.26g(84％)的白色泡沫状的17-6。LC-MS m/z657.3[M+H]+。(JOC,2005,vol.70,#11,p.4284-4299)
第六步:N-(7-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)异丁酰胺(17-7)
将17-6(2.2g，3.35mmol)在吡啶(30mL)中的溶液中加入AgNO3(1.17g，6.9mmol)。在室温下除去光后搅拌1小时后，加入TBDMSCl(900mg，6.0mmol)在THF(45mL)中的溶液，并将整个混合物在相同温度下搅拌。2小时后，加入额外量的AgNO3(600mg，3.6mmol)和TBDMSCl(500mg，3.3mmol)，并将整个混合物在相同温度下再搅拌4.5小时。通过硅藻土过滤出反应混合物的不溶物，滤液用CHCl3稀释。有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用H2O洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物与甲苯共蒸发三次，残余物通过硅胶柱纯化，用己烷/AcOEt(3/1-1/3)洗脱，得到白色泡沫状17-7(1.57g，61％)，C-MS m/z 771.3[M+H]+。
第七步(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-5-(5-氟-4-异丁酰胺基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)四氢呋喃-3-基三氟甲磺酸酯(17-8)
将17-7(1.15g，1.5mmol)和DMAP(0.35g，2.8mmol)悬浮于无水THF(30mL)，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，1.13mL，6.5mmol)，向得到的混合物中加入N-苯基三氟甲磺酰胺(0.86g，2.6mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌3.5小时，此时将其倒入5％盐水(50mL)中，并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤出干燥剂并真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱20-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物17-8为褐色固体1.05克(78％)；LC-MS m/z 903.3[M+H]+；
第八步(2R,3S,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-5-(5-氟-4-异丁酰胺基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)四氢呋喃-3-基乙酸酯(17-9)
将化合物17-8(1.0g，1.10mmol)，KOAc(0.4g，4mmol)和18-冠醚-6(1,4,7,10,13,16)-六氧杂环十八烷，0.13g，0.5mmol)在甲苯(30mL)的混合物在110℃加热4h。然后将反应混合物冷却至室温，真空除去溶剂。将粗物质用硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物17-9，为黄色固体：0.54g(61％)；LC-MS m/z 803.3[M+H]+；
第九步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)异丁酰胺17-10
将化合物17-9(0.54g，0.67mmol)溶于MeOH(10mL)中，加入2.0M二甲胺的MeOH溶液(2mL，4mmol)。将反应混合物在25-30℃下搅拌16小时。减压浓缩除去溶剂，将残留物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱20-75％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物17-10，为黄色固体：0.43g(82％)；LC-MS m/z 771.3[M+H]+
第十步:N-(7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基)-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)异丁酰胺(17-11)
将化合物17-10(430mg，0.558mmol)在惰性氮气气氛下溶于无水DCM(7mL)中，将溶液冷却至0℃。加入1.0M的DAST溶液(1.20mL，1.20mmol)，随后将反应在-5℃下搅拌17小时，使用冷冻冷却来控制反应温度。将容器温热至0℃并加入饱和NaHCO3(2mL)。搅拌30分钟后，将混合物用5％盐水(10mL)稀释，并用EtOAc(2×15mL)萃取。将合并的有机物干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，真空除去溶剂。将产品通过硅胶色谱柱纯化(梯度洗脱5-75％EtOAc/庚烷)，得到非对映异构体的混合物(17-11)，为褐色固体：180mg；(2R,3S,4S,5R)非对映异构体LCMS,Rt1.81分钟；m/z 773.4(M+H]+；另一个异构体(2R,3S,4R,5R)的Rt 1.93分钟,；m/z 773.4[M+H]+
第十一步：N-(7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)异丁酰胺(B2-5)
将(17-11)(180mg，2.53mmol)的非对映异构体混合物溶于无水THF(30mL)中，并在惰性氮气氛下冷却至-45℃，然后加入1.0M TBAF(3.0mL，3.0mmol)。将反应物搅拌2.5小时，然后用饱和NaHCO3(15mL)淬灭。除去冷浴，将浆液搅拌10分钟，然后用5％盐水(15mL)稀释混合物，并用DCM(2×50mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，真空除去溶剂。将粗物质通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱15-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物B2-5，为白色固体：130mg；LC-MS m/z 659.3[M+H]+；主峰为构型为(2R，3S，4S，5R)的异构体B2-5a；LCMS，Rt 1.84分钟；次要峰为构型(2R，3S，4R，5R)的非对映异构体B2-5b,LCMS，Rt1.72分钟。
中间体B2-6:9-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B2-6)
Helvetica ChimicaActa,2003,vol.86,#12p.3955-3974；J.Org.Chem.1996,61,7426-7437
第一步：9-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-醇(18-1)
将12-3溶于AcOH/H2O 7:3(560ml)混合溶液中。在r.t.，在5小时内加入5份NaNO2(5×40g，2.9mol)于此混合物中。加入H2O(100ml)，混合物用CHCl3(500ml)萃取。有机相用H2O萃取。用饱和NaHCO3水溶液洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发。从AcOEt(400ml)中重结晶得到18-1(14.94g，78％)。
第二步：9-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B2-6)
常温搅拌下，将吡啶(20mL)加入到18-1(2.7g，10mmol)和4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.4g，13mmol)的无水DMSO(60mL)溶液中。让混合物持续搅拌12小时。将混合物倒入冰中，用CHCl3萃取。合并的有机萃取液依次用饱和NaHCO3水溶液(50mL)，水(30mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤除去干燥剂，用PhMe稀释并真空浓缩。残余物溶于PhMe中，再蒸发。最后，将残留物保持在油泵真空下以除去痕量的PhMe。得到B2-6可以直接用于下一步反应。
中间体B2-7：3-((2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑并[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(B2-7)
步骤1：3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(19-2)
将19-1(2.69g，10mmol)与吡啶(3×30mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(30mL)中。向0-5℃的溶液中加入DMTrCl(4.24g，12.5mmol)。将其在室温下搅拌6小时，然后浓缩。加入CH2Cl2(120mL，含1％Et3N)，用饱和NaHCO3(50mL)，水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(19-2)为白色固体4.28g，LCMS(ES,m/z)：572.2[M+H]+
步骤2：3-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(19-3)
将19-2(3.42g，6mmol)在吡啶(50mL)中的溶液中加入AgNO3(1.35g，8.0mmol)。在室温下避光下搅拌1小时后加入TBDMSCl(0.9g，6mmol)在THF(30mL)中的溶液，并将整个混合物在相同温度下搅拌。2小时后，加入额外量的AgNO3(0.8g，4.8mmol)和TBDMSCl(0.66mg，4.4mmol)，并将整个混合物在相同温度下再搅拌4.5小时。通过硅藻土过滤出反应混合物的不溶物，滤液用200mL的CHCl3稀释。有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用H2O洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。残余物通过中和的硅胶柱纯化，用石油醚/AcOEt(5/1-1/5，v/v)洗脱，得到19-3为白色泡沫(2.96g，72％)，LC-MS m/z 686.3[M+H]+；
第三步:(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-5-(7-氧代-6,7-2,3-二氢-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)四氢呋喃-3-基三氟甲磺酸酯(19-4)
将19-3(2.05g，3mmol)和DMAP(0.7g，5.6mmol)悬浮于无水THF(50mL)，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，2.3mL，13mmol)，向得到的混合物中加入N-苯基三氟甲磺酰胺(1.7g，5.2mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌4.5小时，此时将其倒入5％盐水(100mL)中，并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤出干燥剂并真空浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱20-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物19-4为褐色固体1.50克(61％)；LC-MS m/z 818.2[M+H]+；
第四步(2R,3S,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-5-(7-氧代-6,7-2,3-二氢-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)四氢呋喃-3-基乙酸酯(19-5)
将化合物19-4(1.23g，1.5mmol)，KOAc(0.5g，5mmol)和18-冠醚-6(1,4,7,10,13,16)-六氧杂环十八烷，0.13g，0.5mmol)在甲苯(50mL)的混合物在110℃加热4h。然后将反应混合物冷却至室温，真空除去溶剂。将粗物质用硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物19-5，为黄色固体：0.785g(72％)；LC-MS m/z 728.3[M+H]+；
第五步：3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮19-6
将化合物19-5(0.73g，1mmol)溶于MeOH(10mL)中，加入2.0M二甲胺的MeOH溶液(3mL，6mmol)。将反应混合物在25-30℃下搅拌16小时。减压浓缩除去溶剂，将残留物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-75％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物19-6，为黄色固体：0.585g(90％)。LC-MS m/z 686.3[M+H]+
第六步:3-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(19-7)
将化合物19-6(585mg，0.9mmol)在惰性氮气气氛下溶于无水DCM(7mL)中，将溶液冷却至0℃。加入1.0M的DAST溶液(1.20mL，1.20mmol)，随后将反应在-5℃下搅拌17小时，使用冷冻冷却来控制反应温度。将容器温热至0℃并加入饱和NaHCO3(2mL)。搅拌30分钟后，将混合物用5％盐水(10mL)稀释，并用EtOAc(2×15mL)萃取。将合并的有机物干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，真空除去溶剂。将产品通过硅胶色谱柱纯化(梯度洗脱5-75％EtOAc/庚烷)，得到非对映异构体的混合物(19-7)，为褐色固体：381mg；(2R,3S,4S,5R)非对映异构体，LCMS,Rt1.52分钟；m/z 688.4(M+H]+；另一个异构体(2R,3S,4R,5R)的Rt 1.63分钟；m/z 688.4[M+H]+
第七步：3-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(B2-7)
将(19-7)(381mg，0.553mmol)的非对映异构体混合物溶于无水THF(30mL)中，并在惰性氮气氛下冷却至-45℃，然后加入1.0M TBAF(2.0mL，2.0mmol)。将反应物搅拌2.5小时，然后用饱和NaHCO3(15mL)淬灭。除去冷浴，将浆液搅拌10分钟，然后用5％盐水(15mL)稀释混合物，并用DCM(2×50mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，真空除去溶剂。将粗产品通过硅胶柱色谱纯化(梯度洗脱10-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物B2-7，为白色固体：145mg；LC-MS m/z 573.3[M+H]+,主峰为构型为(2R，3S，4S，5R)的异构体B2-7a；LCMS，Rt 1.34分钟；次要峰为构型(2R，3S，4R，5R)的非对映异构体B2-7b,LCMS，Rt1.45分钟。
中间体B2-7b:3-((2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑并[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(B2-7b)
Journal of theAmerican Chemical Society,2003,vol.125,#36,p.10867-10876
第一步：3-((2R,3S,4R,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-D]嘧啶-7(6H)-酮(20-1)
将5.4g的化合物13-6溶于AcOH/H2O 7:3(120ml)混合溶液中。在r.t.，在5小时内加入5份NaNO2(5×10g)于此混合物中。加入H2O(100ml)，混合物用CHCl3(500ml)萃取。有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤除去干燥剂并减压浓缩，得到产品20-1，为棕色固体(3.35g，62％)。
第二步：3-((2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-咪唑并[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(B2-7b)
常温搅拌下，将吡啶(12mL)加入到20-1(2.7g，10mmol)和4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.0g，11.8mmol)的无水DMSO(50mL)溶液中。让混合物持续搅拌13小时。将混合物倒入冰中，用CHCl3萃取。合并的有机萃取液依次用饱和NaHCO3水溶液(50mL)，水(30mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤除去干燥剂，用PhMe稀释并真空浓缩。残余物溶于PhMe中，再蒸发。最后，将残留物保持在油泵真空下以除去痕量的PhMe，得到B2-7b，可以直接用于下一步反应。
中间体B2-8:7-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-吡咯并[2,13-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-8)
第一步:7-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4(7H)-酮(21-2)
将21-1(2.68g，10mmol)溶于AcOH/H2O 7:3(56ml)混合溶液中。在15℃，在5小时内加入5份NaNO2(5×4g)于此混合物中。加入H2O(100ml)，混合物用CHCl3(300ml)萃取。有机相用水、饱和NaHCO3水溶液洗涤，用干燥MgSO4，过滤除去干燥剂并减压蒸发除去溶剂，得到的粗产品直接用于下一步反应。
第二步：7-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-3H-吡咯并[2,13-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-8)
将上一步的产品溶解到10mL无水DMSO中，加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.0g，1.18mmol)，在搅拌下加入吡啶(4mL)。反应混合物持续搅拌12小时。将混合物倒入冰水中并用CHCl3(50mL)萃取。合并的有机相并依次用饱和NaHCO 3水溶液(15mL)，水(15mL)和盐水(15mL)洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，残余物用硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚洗脱，得到B2-8，为灰白色固体2.4g(两步产率，45％)。LC-MS m/z 572.2[M+H]+
中间体B2-9:1-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4(5H)-酮(B2-9)
第一步：((2R,3R,4S,5R)-4-乙酰氧基-3-氟-5-(4-氧代-4,5-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)四氢呋喃-2-基)苯甲酸甲酯(22-2)
在0℃下和氩气保护下向4-(苄氧基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶(0.675g，3mmol)和(3S,4S,5R)-5-((苯甲酰氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-2,3-二乙酸酯(1.0g，3mmol)在ACN(20mL)和CH2Cl2(10mL)中的混和物加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU，1.2g，8.0mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟。然后，向溶液中加入三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(1.78g，8mmol)，在0℃下搅拌30分钟。然后，加热至80℃搅拌16h。将反应冷却至室温。并加入NaHCO3水溶液(10mL)和水(30mL)。用EtOAc(3×50mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化)，用1至10％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱，得到产物22-2(0.81g)。LC-MS m/z 416.1[M+H]+。
第二步:1-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4(5H)-酮(22-3)
向22-2(0.81g，1.95mmol)的MeOH(10mL)溶液中加入甲醇钠(0.45g，8mmol)。将溶液在室温下搅拌2小时。用AcOH中和，浓缩溶液。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用0至30％甲醇的而；二氯甲烷洗脱，得到产物(22-3)，为白色固体393mg，LCMS(ES,m/z)：270.1[M+H]+。
第三步:1-((2R,3S,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4(5H)-酮(B2-9)
向搅拌的1-((2R,3S,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c](5H)-酮(393mg，1.46mmol)的吡啶(5mL)溶液中加入4,4'-氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(592mg，1.75mmol)搅拌4小时。将混合物减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用1至10％MeOH的CH2Cl2(0.5％Et3N)洗脱，得到产物，B2-9为白色固体0.4g(71％)。LCMS(ES,m/z)：572.2[M+H]+。
中间体B2-10：7-((2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-10)
第一步:(2R,3S,5R)-2-(4-氨基-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-醇(23-1)
将B2-5(1.32g，2mmol)溶于30％的MeNH2乙醇溶液(10mL)，在室温搅拌下反应5小时，减压除去溶剂，将得到的粗产物直接用于下一步反应，LCMS(ES,m/z)：589.2[M+H]+。
第二步:7-((2R,3S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)-5-氟-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-10)
将上一步的粗产品23-1溶于AcOH/H 2O 7:3(50ml)混合溶液中。在冷却条件下(-5-5℃)，在3小时内分批缓慢加入NaNO2(6g)于此混合物中，并在此温度下搅拌2小时。加入50ml水稀释，混合物用CHCl3(100ml)萃取。有机相用水洗涤，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤除去干燥剂并减压浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯，石油醚洗脱，得到B2-10(612g，两步产率，52％)，LCMS(ES,m/z)：590.2[M+H]+。
中间体B2-11：N-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(B2-11)
第一步:((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-3-氟-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢噻吩-2-基)甲基苯甲酸酯(24-2)
向N-(6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(4.4g，20mmol)在ClCH2CH2Cl(100mL)的悬浮液中加入(Z)-三甲基甲硅烷基N-(三甲基甲硅烷基)乙酰亚胺酯(10mL，40mmol)。将悬浮液在70℃搅拌过夜，然后冷却至5-15℃。向该混合物中加入((2R,3S,4R)-5-乙酸基-4-(苯甲酰氧基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯(10g，23.90mmol)，然后加入TMS-OTf(8.64mL，47.8mmol)。将反应混合物在-15℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌5小时，最后在70℃下搅拌80小时。将反应混合物冷却至室温，然后过滤。滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，食盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用0-60％EtOAc/石油醚洗脱。得到产品24-2，为白色固体6.37g,LCMS(ES,m/z)：580.2[M+H]+。
第二步：N-(9-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(24-3)
向((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-3-氟-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢噻吩-2-基)甲基苯甲酸甲酯(5.79g，10mmol)在THF(100mL)/MeOH(100mL)/H2O(10mL)中的溶液中加入2N氢氧化钠(10mL，20mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌60分钟，然后用乙酸(1.2mL，21mmol)中和。加入300ml乙酸乙酯萃取，有机相用Na2SO4干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩得到产品24-3。LCMS(ES,m/z)：372.1[M+H]+。
第三步：N-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(B2-11)
将上一步得到(24-3)溶解于的吡啶90mL中，在0℃下向溶液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(3.7g，11mmol)。将反应混合物继续搅拌4小时。将反应用H2O(4mL)淬灭，并将混合物浓缩。将残余物在300mL乙酸乙酯中稀释，用饱和NaHCO3(200mL)水溶液和盐水(200mL)洗涤。分离的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用含有0.1％Et3N的0-100％EtOAc/己烷洗脱，得到产物B2-11，为白色固体4.71g。LCMS(ES,m/z)：674.2[M+H]+。1H-NMR(400MHz，氯仿-d)δ11.94(S,0H)，8.34(S,0H)，7.69(S,0H)，7.62-7.55(m，1H)，7.49-7.42(m，2H)7.36-7.22(m，1H)，6.91-6.83(m，2H)，5.90(d，J＝8.3Hz，OH)，5.33-5.21(m，1H)，4.13(q，J＝7.1Hz，1H)，3.83-3.66(1m，3H)，3.44(dd，J＝10.2,5.4Hz，0H)，3.33(dd，J＝10.2,5.2Hz，0H)，2.07(d，J＝19.3，2H)，1.32-1.20(m，2H)，1.00(d，J＝6.8Hz，1H)，0.90(d，J＝6.9Hz，1H)。
中间体B2-12：N-(9-((2R,3R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)嘌呤-6-基)苯甲酰胺(B2-12)
第一步:N-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(25-2)
向搅拌的(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢噻吩-3,4-二醇(5.5g，20mmol)的吡啶(70mL)溶液中，在室温下加入TMSCl(3.0mL，23.5mmol)。将所得溶液搅拌2.5小时，然后加入苯甲酰氯(2.85mL，24mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(5mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入氨水(28％w/w)(5mL)。将反应混合物加热至室温并搅拌45分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(100mL)中，用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化(0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到25-2，产品5.88g。LCMS(ES,m/z)：388.1[M+H]+。
第二步:N-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(25-3)
在0℃下向搅拌的25-2(5.8g，15mmol)和吡啶(30mL)的混合物中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯5.57g，16.5mmol)。使反应混合物缓慢加热至室温并搅拌18小时。减压浓缩，将所得残余物溶于甲醇/乙酸乙酯的混合物100/300mL中并加入水300mL。分离各相，水层用乙酸乙酯萃取(200mL×3)。将有机相合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化；将用(0-30％乙酸乙酯，0-10％乙醇的己烷混合溶液洗脱，得到25-3，为白色泡沫状8.26g。LCMS(ES,m/z)：690.2[M+H]+。
第三步:N-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺
在0℃下将叔丁基二甲基氯硅烷(2.32g，15.4mmol)和咪唑(1.69g，24mmol)加入到化合物25-3(8.2g，11.9mmol)的无水CH2Cl2(150mL)溶液中的。将反应混合物温热至室温搅拌4小时。反应混合物用水洗涤。将有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化(正己烷/EtOAc)7:1，v/v)，得到25-4，为无色油状物(7.55g，79％)。LCMS(ES,m/z)：804.3[M+H]+。
第四步：((2R,3S,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢噻吩-3-基三氟甲磺酸酯(25-5)
将25-4(7.5g，9.3mmols)和DMAP(1.74g，14.2mmol)悬浮于无水THF(35mL)，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，6.48mL，37.2mmol)，得到N-苯基三氟甲磺酰胺(5.08g，14.21mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌3.5小时，此时将其倒入5％盐水(120mL)中，并用EtOAc(2×120mL)萃取。将有机相合并，用Na2SO4干燥，滤出干燥剂并真空浓缩，将残余物用硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物25-5，为褐色固体5.78克；LCMS(ES,m/z)：936.3[M+H]+。
第五步:：(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)四氢噻吩-3-基乙酸酯
将化合物25-5(5.6g，5.98mmol)，KOAc(2.93g，29.9mmol)和18-冠醚-6(1,4,7,10,13,16)-六氧杂环十八烷，0.79g，2.99mmol)及甲苯(80mL)的混合物在110℃加热4h。然后将反应混合物冷却至室温，真空除去溶剂。将残余物用硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-100％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物25-6，为黄褐色固体3.5g。LCMS(ES,m/z)：846.3[M+H]+。
第六步:：N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺25-7
将化合物25-6(3.5g，4.13mmol)溶于MeOH(60mL)中，加入2.0M二甲胺的MeOH溶液(10mL，10mmol)。将反应混合物在室温下搅拌17小时。加入硅胶(12g)，真空除去溶剂。将粗物质通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-75％EtOAc/庚烷)，得到所需化合物25-7，为淡黄色固体：2.75g；LCMS(ES,m/z)：804.3[M+H]+。
第七步:：N-(9-((2R,3R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氟四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(25-8)
将化合物25-7(2.75g，3.43mmol)在惰性氮气氛下溶于无水DCM(80mL)中，将溶液冷却至0℃。加入1.0M的DAST溶液(6.9mL，6.90mmol)，随后将反应混合物在-5℃下搅拌17小时，使用冷冻冷却来控制反应温度。将反应加热至0℃并加入饱和NaHCO3(15mL)。搅拌30分钟后，将混合物用5％盐水(60mL)稀释，并用EtOAc(2×80mL)萃取。合并有机相，用Na2SO4干燥，滤除干燥剂，减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱10-75％EtOAc/庚烷)，得到非对映异构体25-8a和25-8b的混合物，为褐色固体，1.8g。(2R,3S,4S,5R)非对映异构体LCMS，Rt 1.57分钟；m/z 790.4(M+H]+；次要(2R,3S,4R,5R)非对映异构体，Rt1.69分钟；LCMS(ES,m/z)：806.3[M+H]+。
第八步：N-(9-((2R,3R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺
将25-8a和25-8b(1.8g，2.23mmol)的非对映异构体混合物溶于无水THF(80mL)中，并在惰性氮气氛下冷却至-45℃，然后加入1.0M TBAF(3.80mL，3.80mmol)。将反应物搅拌2.5小时，然后用饱和NaHCO3(20mL)淬灭。除去冷浴，将浆液搅拌10分钟，然后用5％盐水(150mL)稀释混合物，并用DCM(2×100mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)，滤除干燥剂，将硅胶(4g)加入到滤液中，真空除去溶剂。将粗物质通过硅胶色谱纯化(梯度洗脱25-100％EtOAc/石油醚)，得到所需化合物(B2-12)，为白色固体，1.27g。LCMS(ES,m/z)：692.3[M+H]+。主峰为构型为(2R,3S,4S,5R)的异构体B2-12a；LCMS，Rt 1.65分钟；次要峰为构型(2R,3S,4R,5R)的非对映异构体B2-12b,LCMS，Rt1.52分钟。
中间体B2-13：N-(3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺(B2-13)
第一步：((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-5-(7-氯-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-3-氟代四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯26-1
向7-氯-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶(15.5g，100mmol)在ClCH2CL2Cl(500mL)的悬浮液中加入(Z)-三甲基甲硅烷基N-(三甲基甲硅烷基)乙酰亚胺酯(49mL，200mmol)。将悬浮液在70℃搅拌过夜，然后冷却至5-15℃。向该混合物中加入((2R,3S,4R)-5-乙酸基-4-(苯甲酰氧基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯(100g，239mmol)，然后加入TMS-OTf(72mL，400mmol)。将反应混合物在-15℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌6小时，最后在70℃下搅拌5天。将反应混合物冷却至室温，然后过滤。滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，食盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用0-60％EtOAc/己烷洗脱，得到产品26-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：514.1[M+H]+。
第二步：制备(2R,3R,4S,5R)-2-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇
将26-1(10.2g，20mmol)加入到500mL厚壁反应瓶中，加入200mL 12M NH3的甲醇溶液。在密闭条件下加热至50℃反应10小时。冷却，蒸发溶剂，将残余物用硅胶柱中分离，用0-10％MeOH/CH2Cl2的梯度洗脱，得到26-2，为白色固体4.06g(71％)。LCMS(ES,m/z)：287.1[M+H]+。
第三步：N-(3-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺
向搅拌的(2R,3R,4S,5R)-2-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇(572mg，2.0mmol)的吡啶(6.5mL)溶液中，在室温下加入TMSCl(2.6mL，20mmol)。将所得溶液搅拌1.5小时，然后加入苯甲酰氯(0.357mL，3.08mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(2.15mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入氨水(28％w/w)(0.370mL，4.79mmol)。将反应混合物回流至室温并搅拌45分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(20mL)中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化；0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到26-3。LCMS(ES,m/z)：391.1[M+H]+
第四步N-(3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺(B2-13)
将26-3(7.8g，20mmol)与吡啶(100×10mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(80mL)中。冷却至0-5℃。向反应混合物中加入DMTrCl(7.44g，22mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(300mL)，用饱和NaHCO3(300mL)，水(200mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-13)。LCMS(ES,m/z)：693.2[M+H]+
中间体B2-14：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-7H-吡咯并并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(B2-14)
第一步：((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-5-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯27-1
向4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(15.3g，100mmol)在ClCH2CL2Cl(600mL)的悬浮液中加入(Z)-三甲基甲硅烷基N-(三甲基甲硅烷基)乙酰亚胺酯(49mL，200mmol)。将悬浮液在70℃搅拌过夜，然后冷却至5-15℃。向该混合物中加入((2R,3S,4R)-5-乙酸基-4-(苯甲酰氧基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯(100g，239mmol)，然后加入TMS-OTf(72mL，400mmol)。将反应混合物在-15℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌6小时，最后在70℃下搅拌6天。将反应混合物冷却至室温，然后过滤。滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，食盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用0-60％EtOAc/己烷洗脱，得到产品27-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：512.1[M+H]+。
第二步：制备(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇27-2
将27-1(5.1g，10mmol)加入到250mL厚壁反应瓶中，加入100mL 12M NH3的甲醇溶液。在密闭条件下加热至50℃反应10小时。冷却，蒸发溶剂，将残余物用硅胶柱中分离，用0-10％MeOH/CH2Cl2的梯度洗脱，得到27-2为白色固体2.2g。LCMS(ES,m/z)：287.1[M+H]+。
第三步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺27-3
向搅拌的(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇(1.42g，5.0mmol)的吡啶(30mL)溶液中，在室温下加入TMSCl(5.2mL，40mmol)。将所得溶液搅拌1.5小时，然后加入苯甲酰氯(0.72mL，6.1mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(4mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入氨水(28％w/w)(1.0mL)。将反应混合物回流至室温并搅拌45分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(50mL)中，用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化；0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到27-3。LCMS(ES,m/z)：391.1[M+H]+
第四步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-7H-吡咯并并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(B2-14)
将27-3(3.88g，10mmol)与吡啶(60mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(80mL)中。冷却至0-5℃，向反应混合物中加入DMTrCl(4.0g，12mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(200mL)，用饱和NaHCO3(150mL)，水(150mL)和盐水(150mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-14)。LCMS(ES,m/z)：691.2[M+H]+
中间体B2-15：N-(1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3-氟-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4-基)苯甲酰胺(B2-15)
第一步：((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-5-(4-氯-3-氟-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-1-基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯28-1
向4-氯-5-氟-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(8.55g，50mmol)在ClCH2CL2Cl(300mL)的悬浮液中加入(Z)-三甲基甲硅烷基N-(三甲基甲硅烷基)乙酰亚胺酯(24.5mL，100mmol)。将悬浮液在70℃搅拌过夜，然后冷却至5-15℃。向该混合物中加入((2R,3S,4R)-5-乙酸基-4-(苯甲酰氧基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯(50g，120mmol)，然后加入TMS-OTf(36mL，200mmol)。将反应混合物在-15℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌6小时，最后在70℃下搅拌6天。将反应混合物冷却至室温，然后过滤。滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，食盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用0-60％EtOAc/己烷洗脱，得到产品28-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：529.1[M+H]+。
第二步：制备(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-3-氟-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-1-基)-4-氟-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇(28-2)
将28-1(5.3g，10mmol)加入到250mL厚壁反应瓶中，加入100mL 12M NH3的甲醇溶液。在密闭条件下加热至50℃反应10小时。冷却，蒸发溶剂，将残余物用硅胶柱中分离，用0-10％MeOH/CH2Cl2的梯度洗脱，得到28-2为白色固体2.5g。LCMS(ES,m/z)：302.1[M+H]+。
第三步：N-(3-氟基-1-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-吡咯并[3,2-C]吡啶-4-基)苯甲酰胺(28-3)
向搅拌的28-2(600mg，2.0mmol)的吡啶(20mL)溶液中，在室温下加入TMSCl(1.3mL，10mmol)。将所得溶液搅拌1.5小时，然后加入苯甲酰氯(0.36mL，3mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(2mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入氨水(28％w/w)(1.0mL)。将反应混合物回流至室温并搅拌45分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(30mL)中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化；0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到28-3。LCMS(ES,m/z)：406.1[M+H]+
第四步：N-(7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-7H-吡咯并并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(B2-15)
将28-3(405mg，1mmol)与吡啶(10mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(20mL)中。冷却至0-5℃，向反应混合物中加入DMTrCl(0.4g，1.2mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(20mL)，用饱和NaHCO3(15mL)，水(15mL)和盐水(15mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-15)。LCMS(ES,m/z)：708.2[M+H]+
中间体B2-16：9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B2-16)
第一步：((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-氟四氢噻吩-2-基)甲基苯甲酸酯29-1
向6-氯-9H-嘌呤(1.54g，10mmol)在ClCH2CL2Cl(50mL)的悬浮液中加入(Z)-三甲基甲硅烷基N-(三甲基甲硅烷基)乙酰亚胺酯(5mL，20mmol)。将悬浮液在70℃搅拌过夜，然后冷却至5-15℃。向该混合物中加入((2R,3S,4R)-5-乙酸基-4-(苯甲酰氧基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯(5g，12mmol)，然后加入TMS-OTf(7.2mL，40mmol)。将反应混合物在-15℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌6小时，最后在70℃下搅拌6天。将反应混合物冷却至室温，然后过滤。滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤。食盐水洗涤。然后用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用0-60％EtOAc/己烷洗脱,得到产品29-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：513.1[M+H]+。
第二步：9-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮29-2
将化合物29-1(1.02g，2mmol)，2-巯基乙醇(0.49mL，7mmol)和NaOH(0.38g，7mmol)溶解在MeOH(50ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物29-2为白色固体。LCMS(ES,m/z)：287.0[M+H]+。
第三步：9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B2-16)
将29-2(572mg，2mmol)与吡啶(15mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(20mL)中。冷却至0-5℃,向反应混合物中加入DMTrCl(0.72g，2.2mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(30mL)，用饱和NaHCO3(20mL)，水(20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-16)。LCMS(ES,m/z)：589.2[M+H]+
中间体B2-17：3-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3H-咪唑并[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮(B2-17)
第一步：9-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮30-1
将化合物26-1(513mg，1mmol)，2-巯基乙醇(0.25mL，3.5mmol)和NaOH(0.19g，3.5mmol)溶解在MeOH(25ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物30-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：288.0[M+H]+。
第二步：9-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(B2-17)
将30-1(574mg，2mmol)与吡啶(15mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(20mL)中。冷却至0-5℃，向反应混合物中加入DMTrCl(0.72g，2.2mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(30mL)，用饱和NaHCO3(20mL)，水(20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-17)。LCMS(ES,m/z)：590.2[M+H]+
中间体B2-18：7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3H-吡咯并[2,13-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-18)
第一步：7-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-3H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4(7H)酮31-1
将化合物27-1(511mg，1mmol)，2-巯基乙醇(0.25mL，3.5mmol)和NaOH(0.19g，3.5mmol)溶解在MeOH(25ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物31-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：286.0[M+H]+。
第二步：7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3H-吡咯并[2,13-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-18)
将31-1(572mg，2mmol)与吡啶(15mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(20mL)中。冷却至0-5℃，向反应混合物中加入DMTrCl(0.72g，2.2mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(30mL)，用饱和NaHCO3(20mL)，水(20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-18)。LCMS(ES,m/z)：588.2[M+H]+
中间体B2-19：7-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3H-吡咯并[2,13-d]嘧啶-4(7H)-酮(B2-19)
第一步：((2R,3S,4R,5R)-4-(苯甲酰氧基)-5-(4-氯-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-氟四氢噻吩-2-基)甲基苯甲酸酯(32-1)
向4-氯-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶(1.53g，10mmol)在ClCH2CL2Cl(50mL)的悬浮液中加入(Z)-三甲基甲硅烷基N-(三甲基甲硅烷基)乙酰亚胺酯(5mL，20mmol)。将悬浮液在70℃搅拌过夜，然后冷却至5-15℃。向该混合物中加入((2R,3S,4R)-5-乙酸基-4-(苯甲酰氧基)-3-氟四氢噻吩-2-基)苯甲酸甲酯(5g，12mmol)，然后加入TMS-OTf(7.2mL，40mmol)。将反应混合物在-15℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌6小时，最后在70℃下搅拌6天。将反应混合物冷却至室温，然后过滤。滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤，食盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用0-60％EtOAc/己烷洗脱，得到产品32-1，为白色固体。LCMS(ES,m/z)：512.1[M+H]+。
第二步：1-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4(5H)-酮32-2
将化合物32-1(511mg，1mmol)，2-巯基乙醇(0.25mL，3.5mmol)和NaOH(0.19g，3.5mmol)溶解在MeOH(25ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物31-1，为白色固体。LCMS(ES,m/z)：286.0[M+H]+。
第三步：1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4(5H)-酮(B2-19)
将31-1(570mg，2mmol)与吡啶(15mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(30mL)中。冷却至0-5℃，向反应混合物中加入DMTrCl(0.72g，2.2mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(40mL)，用饱和NaHCO3(30mL)，水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-18)。LCMS(ES,m/z)：588.2[M+H]+
中间体B2-20：1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3-氟代-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮
第二步：3-氟基-1-((2R,3R,4S,5R)-4-氟-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4-(5H)-酮33-1
将化合物28-1(1.06g，2mmol)，2-巯基乙醇(0.59mL，7mmol)和NaOH(0.39g，7mmol)溶解在MeOH(50ml)中的溶液回流6小时。将混合物冷却至室温，用AcOH将反应液调至中性，减压浓缩，并用2％MeOH的CH2Cl2溶液进行柱色谱纯化，得到产物33-1为白色固体。LCMS(ES,m/z)：303.0[M+H]+。
第三步：1-((2R,3R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)-3-氟代-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4(5H)-酮(B2-18)
将33-1(604mg，2mmol)与吡啶(15mL)共蒸发并重新溶解于吡啶(25mL)中。冷却至0-5℃，向反应混合物中加入DMTrCl(0.72g，2.2mmol)。将其在室温下搅拌5小时，然后减压浓缩。向残余物中加入CH2Cl2(40mL)，用饱和NaHCO3(30mL)，水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机溶液干燥(Na2SO4)，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，使用0-10％MeOH的CH2Cl2(1％Et3N)，得到产物(B2-20)。LCMS(ES,m/z)：605.2[M+H]+
中间体B2-21：制备:N-(9-((2R,3R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基四氢噻吩-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(B2-21)
第一步:(3R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-2)
向(6aR,9R,9aS)-2,2,4,4-四异丙基四氢-6H-噻吩并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧二硅杂环辛烷-9-基2,4-二甲氧基苯甲酸甲酯(60g，108mmol)在500mL的THF溶液加入AcOH(13.59g，226mmol)和TBAF的THF溶液(1M，226mL，226mmol)。1小时后，将其减压浓缩，并通过硅胶柱色谱纯化，用0-20％EtOAc的CH2Cl2溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):315.1[M+H]+.
第二步:(3R,4S,5R)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-羟基四氢噻吩-3-基-2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-3)
向(3R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(33g，105mmol)的吡啶(300mL)溶液中加入叔丁基氯二苯基硅烷(43.3g，157mmol)。在室温下搅拌4h。然后，将加入水(300mL)，分离有机层，用CH2Cl2(3×300mL)萃取有机层。将合并的有机相用盐水(300mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩，并通过硅胶柱色谱纯化，用1至10％EtOAc的石油醚溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):575.3[M+Na]+
第三步:(3R,4S,5R)-4-((1H-咪唑-1-甲硫基)氧基)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-4)
在(3R,4S,5R)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-羟基四氢噻吩-3-基-2,4-二甲氧基苯甲酸酯(48g，87mmol)二氯乙烷(500mL)加入二(1H-咪唑-1-基)甲硫酮(20.12g，113mmol)。在N2保护下加热至85℃，搅拌1.5小时。然后，将其浓缩并不经纯化直接用于下一步骤。LCMS(ES,m/z):663.2[M+H]+
第四步:(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基)2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-5)
将(3R,4S,5R)-4-((1H-咪唑-1-甲硫基)氧基)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-4)(粗品，57.6g)溶解在THF(80mL)和甲苯(300mL)的混合溶液中，在室温搅拌下加入三丁基锡烷(139g，478mmol)。再加热至95℃，在30分钟内加入偶氮二异丁腈(14.5g，87mmol)的甲苯(300mL)溶液。搅拌反应2小时后，将所得混合物浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，用0至10％EtOAc的石油醚溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):537.3[M+H]+
第五步:(1R,3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧代四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-6)
在氩气保护下向Ti(OiPr)4(23.29mL，78mmol)的CH2Cl2(160mL)溶液中滴加(L)-酒石酸二乙酯(38.3mL，224mmol)。10分钟后，将混合物冷却至-20℃，然后滴加在癸烷中的TBHP(约5.5M，27.1mL，149mmol)。5分钟后，将(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(40g，74.5mmol)在CH2Cl2(130mL)中的溶液加入到反应体系中，将所得混合物在-20℃下搅拌16小时。缓慢加入冰水(300mL)淬灭，并使其升温至室温。滤出沉淀并用EtOAc(3×300mL)洗涤。滤液用水(3×200mL)洗涤。将水层用EtOAc(400mL×2)萃取。合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩并通过硅胶色谱柱纯化，用0至70％EtOAc的石油醚溶液洗脱，得到产物(两种异构体的混合物)。LCMS(ES,m/z):553.2[M+H]+.
第六步：(3R,5S)-2-乙酰氧基-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-7)
(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧代四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-6)(21g，34.2mmol)在乙酸酐(210mL)溶液中的加热至110℃。搅拌3.5小时后，将反应混合物冷却至室温并浓缩。残余物通过硅胶色谱柱纯化，用0％至20％EtOAc的石油醚溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):535.3[M-OAc]+.
第七步：(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2-(6-氯-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)四氢噻吩-3-基-2,4二甲氧基苯甲酸酯(34-8)
在N-(6-氯-9H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(1.03g，4.29mmol)的甲苯(60ml)溶液中加入N,O-双三甲硅基乙酰胺(2.33g，11.4mmol)。将其在80℃下加热1小时，再次冷却至0℃。然后向反应液中加入(3R,5S)-2-乙酰氧基-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(1.7g，2.86mmol)的甲苯(70mL)溶液和三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(1.91g，8.6mmol)。将其加热至80℃，在氩气保护下搅拌12小时。此时，将反应冷却至室温，并加入饱和NaHCO3水溶液(50mL)。分离有机层，并用EtOAc(4×100mL)萃取水层。将合并的有机相并干燥(Na2SO4)，真空浓缩并通过硅胶色谱柱纯化，用含0％至40％EtOAc的石油醚中溶液洗脱，得到产物(α和β异构体的混合物)。LCMS(ES,m/z):774.3[M+H]+。
第八步：(2R,3R,5S)-2-(6-氯-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢噻吩-3-基-2,4-二甲氧基苯甲酸酯(34-9)
向(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2-(6-氯-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)四氢噻吩-3-基-2,4二甲氧基苯甲酸酯(34-8)(20g，25.8mmol)的THF(200mL)溶液中滴加TBAF(1M，32mL)。室温搅拌3小时，减压浓缩，残余物通过柱色谱纯化，使用1％至10％MeOH的CH2Cl2溶液作为洗脱剂，得到两种异构体的混合物。通过反相(C18)色谱法分离，用10-45％ACN的NH4CO3水溶液(5mM)洗脱得到所要产品。LCMS(ES,m/z):536.2[M+H]+.
第九步：2-氨基-9-((2R,3R,5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(34-10)
向2R,3R,5S)-2-(6-氯-2-异丁酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)四氢噻吩-3-基-2,4-二甲氧基苯甲酸酯(6.0g，11.19mmol)在MeOH(300mL)中的溶液中加入2-巯基乙醇(3.50g，44.8mmol)和NaOMe(11g，61mmol，30％在MeOH中)。将其在60℃下加热16小时，冷却至室温，加入HCl(4mL)中和多余的NaOMe，将所得混合物浓缩，加入水(100mL)和EtOAc(100mL)分离层。将水层用NaHCO3(固体)碱化至～pH 8，并在冷冻下搅拌1小时。过滤沉淀物得到产品。LCMS(ES,m/z):284.1[M+H]+
第十步：N-(9-((2R,3R,5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(34-11)
2-氨基-9-((2R,3R,5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(568mg，2.0mmol)与吡啶(3×20mL)共蒸发，然后再溶解于吡啶(20mL)中。将混合物冷却至0℃，加入三甲基氯硅烷(1.62g，15mmol)。将其升温至室温并搅拌2小时。然后，将反应物再次冷却至0℃，滴加异丁酸酐(486mg，3.07mmol)。加热至室温并搅拌2小时。加入甲醇(5mL)淬灭反应。5分钟后，加入甲醇NH4OH溶液(约29％，10mL)。将混合物在室温下搅拌30分钟。然后将其浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用5％至20％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):354.1[M+H]+。
第十一步：N-(9-((2R,3R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基四氢噻吩-2-基)6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(B2-21)
N-(9-((2R,3R,5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(34-11)(700mg，2mmol)与吡啶(3×10mL)共蒸发，然后重悬于吡啶(10mL)中。向该悬浮液中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(744mg，2.2mmol)，并将混合物在室温下搅拌2小时。此时，将混合物减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用1％至4％MeOH的CH2Cl2(含1％EtN3)洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):656.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.02(s,1H)，7.51-7.43(m，2H)，7.40-7.17(m,7H)，6.91-6.82(m,4H)，5.85-5.84(d,J＝2.3Hz,1H),4.59-4.57(1m,1H),4.02-3.95(m,1H),3.78(s,6H),3.52-3.33(m,3H)，2.72-2.67(m,1H)，1.95-190(m,1H)，1.37(d,J＝6.8Hz,6H)。
中间体B2-22：制备：N-(9-((2R,3R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺(B2-22)
第一步:(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(35-1)
在6-氯-9H-嘌呤(6.16g，40.0mmol)的甲苯(300ml)溶液中加入N,O-双三甲硅基乙酰胺(20.4g，100mmol)。将其在80℃下加热1小时，再次冷却至0℃。然后向反应液中加入(3R,5S)-2-乙酰氧基-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(20.86g，30mmol)的甲苯(500mL)溶液和三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(19.06g，86mmol)。将其加热至80℃，在Ar下搅拌12小时。此时，将反应冷却至室温，并加入饱和NaHCO3水溶液(500mL)。分离有机层，并用EtOAc(4×800mL)萃取水层。合并有机相并用Na2SO4干燥，真空浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，用含0％至40％EtOAc的石油醚中溶液洗脱，得到产物35-1(α和β异构体的混合物)。LCMS(ES,m/z):689.3[M+H]+.
第二步:(2R,3R,5S)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(35-2)
向(3R,5S)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氢噻吩-3-基2,4-二甲氧基苯甲酸酯(35-1)(13.78g，20mmol)的THF(200mL)溶液中滴加TBAF(1M，25mL)。室温搅拌3小时，减压浓缩，残余物通过柱色谱纯化，使用1％至10％MeOH的CH2Cl2溶液作为洗脱剂，得到两种异构体的混合物。通过反相(C18)色谱法分离，用10-45％ACN的NH4CO3水溶液(5mM)洗脱得到所要产品。LCMS(ES,m/z):536.2[M+H]+.
第三步:(2R,3R,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇(35-3)
将28-1(4.5g，10mmol)加入到250mL厚壁反应瓶中，加入100mL 12M NH3的甲醇溶液。在密闭条件下加热至50℃反应10小时。冷却，蒸发溶剂，将残余物用硅胶柱中分离，用0-10％MeOH/CH2Cl2的梯度洗脱，得到35-3为白色固体2.1g。LCMS(ES,m/z)：268.1[M+H]+。
第四步:N-(9-((2R,3R,5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺
(2R,3R,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)四氢噻吩-3-醇(536mg，2.0mmol)溶解于无水吡啶(20mL)中。将混合物冷却至0℃，然后加入用三甲基氯硅烷(1080mg，10mmol)处理。将其升温至室温并搅拌2小时。然后，将反应物再次冷却至0℃，滴加异丁酸酐(474mg，3.0mmol)。加热至室温并搅拌2小时。加入甲醇(5mL)淬灭反应。5分钟后，加入甲醇的NH3溶液(约25％，8mL)。将混合物在室温下搅拌50分钟。然后将其浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，用1％至20％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):338.1[M+H]+。
第五步:N-(9-((2R,3R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺
N-(9-((2R,3R,5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)-9H-嘌呤-6-基)异丁酰胺(337mg，1.0mmol)与吡啶(10mL)共蒸发，然后加入吡啶(5mL)。向该悬浮液中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(400mg，1.18mmol)，并将混合物在室温下搅拌2小时。此时，将混合物减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用1％至4％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱(含1％EtN3)，得到产物。LCMS(ES,m/z):640.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:8.02(s,1H)，7.51-7.43(m，2H)，7.40-7.17(m，7H)，6.91-6.82(m，4H)，5.85-5.84(d,J＝2.3Hz,1H),4.59-4.57(1m，1H),4.02-3.95(m,1H),3.78(s,6H),3.52-3.34(m,3H)，2.72-2.68(m，1H)，1.95-191(m，1H)，1.38(d,J＝6.8Hz，6H)。
中间体P1-1：(1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-亚甲基环戊基-2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺
第一步：向N-(9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟基甲基)-5-亚甲基环戊基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(36-1)
在室温下向搅拌的(1R,3R,5R)-3-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊醇(560mg，2.0mmol)的吡啶(8mL)溶液中加入TMSCl(2.0mL，16mmol)。将该溶液搅拌1.5小时，然后加入苯甲酰氯(0.36mL，3.1mmol)。再搅拌一小时后，向反应混合物中加入水(3mL)，然后搅拌45分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入氨水(28％w/w)(0.5mL)。将反应混合物升温至室温并搅拌45分钟，然后减压浓缩。将所得残余物溶于水(30mL)中，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过硅胶柱纯化；用0-10％甲醇/二氯甲烷洗涤，得到产物36-1。LCMS(ES,m/z)：384.15[M+H]+。
第二步：N-(9-((1R,3R,4R)-3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟-4-羟基-2-亚甲基环戊基)9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺36-2
在0℃下，向N-(9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(192mg，0.5mmol)和4A分子筛的吡啶溶液(5mL)中的加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(253mg，0.745mmol).将反应混合物温热至室温并搅拌18小时。通过过滤除去分子筛子并将滤液减压浓缩。将残余物溶于甲醇/乙醚混合物中并加入水中。分离各相，水层用乙醚萃取(3次)。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。所得残余物通过硅胶柱色谱纯化，用((0-40％(3:1，乙酸乙酯：乙醇，v/v)/己烷)洗脱，得到产物36-2。LCMS(ES,m/z)：686.3[M+H]+。
第三步:(1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-亚甲基环戊基2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(P1-1)
N-(9-((1R,3R,4R)-3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟-4-羟基-2-亚甲基环戊基)9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.1g，1.5μmol)溶解在无水DMF(5mL)中并在50℃下与甲苯(6ml)共蒸发。将混合物冷却至室温，加入2-氰乙基-N，N，N'，N'-四异丙基亚磷酰二胺(0.680g，2.26mmol)和四氮唑(78.8mg，1.24mmol)。搅拌混合物直到所有四唑溶解，加入N-甲基咪唑(0.05mL)，并将混合物在室温下反应5小时。在反应液中加入甲苯(20mL)和己烷(16mL)的混合物，反应物用DMF-水(60:40，v/v，3x4mL)和水(3x2mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，将残余物与乙腈(4mL)在减压下共蒸发，并真空干燥箱中干燥，得到1.0g灰白色状固体P1-1(80％)，LCMS(ES,m/z)：886.3[M+H]+。
中间体P1-2：中间体2：(1R,2R,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟-4-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-吡啶-3-基)-3-亚甲基环戊基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺
第一步:N-(9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(37-1)
2-氨基-9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(850mg，3.0mmol)与吡啶(10mL)共蒸发。将其重悬于吡啶(13mL)中。向该混合物中滴加三甲基氯硅烷(1.69mL，13.2mmol)。将其升温至室温并搅拌2小时。将反应物冷却至0℃，滴加异丁酸酐(0.66mL，4.0mmol)。将其升温至室温并搅拌2小时，然后向反应中加入水(4mL)和浓NH4OH(8mL)。1小时后浓缩。加入甲苯共沸以除去水分，残余物通过快速柱色谱纯化，用0-10％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z):366.1[M+H]+.
第二步：N-(9-((1R,3R,4R)-3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟-4-羟基-2-甲基环戊基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(37-2)
在0℃向N-(9-((1R,3R,4R)-2-氟-3-羟基-4-(羟甲基)-5-亚甲基环戊基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(3.65g，10mmol)的无水吡啶的溶液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.0g，12.0mmol)。除去冰浴，使反应混合物达到20℃，并搅拌12小时。将混合物用EtOAc(400mL)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(200mL)，水(200mL)，盐水洗涤(200mL)，有机层用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶柱纯化，用含有0.1％Et3N的0-00％EtOAc-石油醚洗脱，得到产物37-2。LCMS(ES,m/z)：668.3[M+1]+。
第三步:(1R,2R,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟-4-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-吡啶-3-基)-3-亚甲基环戊基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(P1-2)
将N-(9-((1R,3R,4R)-3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟-4-羟基-2-亚甲基环戊基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(1.33g，2.0mmol)溶解在无水DMF(10mL)中并在50℃下与甲苯(10ml)共蒸发。将混合物冷却至室温，加入2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(0.780g，2.6mmol)和四氮唑(100mg，1.6mmol)。搅拌混合物直到所有四唑溶解，加入N-甲基咪唑(0.05ml)，并将混合物在室温下反应5小时，用CH2Cl2(30mL)稀释，依次用饱和NaHCO 3水溶液洗涤(20mL)和饱和NaCl水溶液(20mL)。将有机溶液用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗固体，通过首先将其溶解于乙醚(1mL)中，然后加入正己烷(80mL)沉淀纯化。将液体倾析并重复操作两次以提供橙色固体的亚磷酰胺P1-2(1.07g，80％产率)。LCMS(ES,m/z)：868.3[M+1]+。
中间体P2-1：制备(2R,3S,5R)-2-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(P2-1)
向烧瓶中加入N-(9-((2R,3R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-3-羟基四氢噻吩-2-基)嘌呤-6-基)苯甲酰胺(5.4g，8mmol)，DCM(100ml)和4,5-二氰基咪唑(2.83g，24.0mmol)，将反应混合物冷却至0℃，在搅拌下入2-氰基乙基N,N,N',N'-四异丙基磷酰二亚胺(8.67mL，24.0mmol)，将混合物在0℃下搅拌50分钟，此后将混合物减压浓缩并通过硅胶色谱柱纯化，使用10-100％EtOAc的己烷溶液梯度洗脱，得到产物(2R,3S,5R)-2-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(P2-1)。LCMS(ES,m/z)：876.4[M+H]+。
中间体P2-2：制备：((2R,3R,5S)-5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-(2-异丁酰胺基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢噻吩-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-2
向烧瓶中加入N-(9-((2R,3R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基四氢噻吩-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(B2-21)(655mg，1mmol)，DCM(20ml)和4,5-二氰基咪唑(0.47g，4.0mmol)，将反应混合物冷却至0℃，在搅拌下入2-氰基乙基N,N,N',N'-四异丙基磷酰二亚胺(1.45mL，4.0mmol)，将混合物在0℃下搅拌50分钟，此后将混合物减压浓缩并通过硅胶色谱柱纯化，使用10-100％EtOAc的己烷溶液梯度洗脱，得到产物P2-2。LCMS(ES,m/z)：856.4[M+H]+。
通过类似的方法，可以把其他保护的或未保护的核苷转变成为相应的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(P1-i或P2-i)以用于具体实施例化合物的合成。
实施例1
第一步:(2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)膦酸酯(C1-1)
向(2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(3g，3.5mmol)在ACN(15mL)中的溶液中加入水(0.126mL，7mmol)和2,2,2-三氟乙酸吡啶盐(0.811mg，4.2mmol)。将所得混合物在室温下搅拌，并通过LCMS/TLC监测反应进程。亚磷酰胺消耗后，将含有产物的反应混合物未经纯化即可用于下一步骤。LCMS(ES,m/z)：775.3[M+H]+
第二步:(2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸叔丁胺盐(C1-2)
向步骤1的反应混合物(假设含有3.5mmol((2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)膦酸酯)的溶液中分批加入叔丁胺(18.0mL，170mmol)，将得到的溶液在室温下搅拌40分钟。将其浓缩，残余物与乙腈(2×20mL)共蒸发，得到产物，将其不经进一步纯化用于下一步骤。LCMS(ES,m/z)：719.22[M-H]-.
第三步:(2R,3S,4R,5R)-4-氟-5-(羟基甲基)-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-膦酸吡啶盐
向搅拌的粗品(2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-膦酸叔丁胺盐(～4.2g，～3.5mmol，步骤2)的CH2Cl2(40mL)溶液中加入水(0.558mL，31.0mmol)和二氯乙酸的CH2Cl2(6％，40mL)溶液。搅拌40分钟。然后加入三乙基硅烷(70mL)，将溶液搅拌1.5小时。将吡啶(5.0mL)加入到反应中。浓缩，残余物用MTBE(60ml)和己烷(70mL)研磨，倾析上清液。这个过程重复了两次。将粗混合物在减压下用P2O5干燥40小时以上，得到含有产物的粗混合物。LCMS(ES,m/z)：419.3[M+H]+
第四步：(2R,3S,4R,5R)-5-((((((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-甲亚基环戊基)氧基)(2-氰基乙氧基)膦基)氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸酯
向(2R,3S,4R,5R)-4-氟-5-(羟基甲基)-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-膦酸吡啶盐(1.20g，粗品，约1.4mmol)的乙腈溶液(10ml)添加活化后的4A分子筛(300mg)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟以上。与((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-甲亚基环戊基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(P1-1)(1.30g，1.47mmol)与ACN(3×6mL)共蒸发，再溶解在ACN(12mL)中，加入活化的4A分子筛(300mg)干燥30分钟后，加入先前制备的含有(2R,3S,4R,5R)-4-氟-5-(羟基甲基)-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-膦酸吡啶盐混合物中。将混合物在室温下搅拌1小时。将含有产物的反应混合物立即用于下一个反应步骤而未进行纯化。LC-MS(ES,m/z)：1203.4[M+H]+。
第五步:(2R,3S,4R,5R)-5-((((((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-亚甲基环戊基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸酯
向含有粗(2R,3S,4R,5R)-5-((((((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-甲亚基环戊基)氧基)(2-氰基乙氧基)膦基)氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸酯(1.3mmol)中加入叔丁基过氧化氢的癸烷溶液(5.5M，0.9mL，4.95mmol)。它在室温下反应1小时。然后将溶液冷却至0℃，缓慢加入NaHSO3(500mg)的水(10mL)溶液。5分钟后，将混合物减压浓缩，残余物通过反相(C18)色谱柱纯化，用2至50％乙腈的水溶液(含0.05％NH4HCO3)洗脱，冷冻干燥得到产物。LC-MS(ES,m/z)：1219.35[M+H]+
第六步:(2R,3S,4R,5R)-5-((((((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸酯
向(2R,3S,4R,5R)-5-((((((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-亚甲基环戊基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸酯(609mg，0.50mmol)的CH2Cl2(8mL)溶液中加入水(100mg，2.47mmol)和二氯乙酸(0.6g)的CH2Cl2(10ml)溶液。在室温下搅拌30分钟。然后加入Et3SiH(10mL)，并将混合物搅拌1.5小时。将吡啶(6mL)加入到反应中，将其浓缩，得到粗产物，将其不经纯化用于下一步骤。LCMS(ES,m/z)：917.7[M+H]+。
第七步:(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-2-(2-氰基乙氧基)-7-[2-(2-异丁酰氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基]-14-{6-[(苯甲酰基)胺基]-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-10-醇盐-2-氧化物
将2R,3S,4R,5R)-5-((((((1R,3R,5R)-3-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-氟-5-(羟甲基)-4-亚甲基环戊基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基膦酸酯(0.78g，约0.5mmol)与吡啶(3×8mL)共蒸发，然后再溶解于吡啶(10mL)中。一次性加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2-氧化物((DMOCP)，320mg，1.73mmol)。将所得混合物在室温下搅拌1.2小时。直接用于下一步反应步骤，无需纯化。LCMS(ES,m/z)：899.3[M+H]+。
第八步：(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-2-(2-氰基乙氧基)-7-[2-(2-异丁酰氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基]-14-{6-[(苯甲酰基)胺基]-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-10-醇盐-2,10-二氧化物
向(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-2-(2-氰基乙氧基)-7-[2-(2-异丁酰氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基]-14-{6-[(苯甲酰基)胺基]-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-10-醇盐-2-氧化物中加入水(320mg，20mmol)和碘(160mg，0.632mmol)。10分钟后，将混合物倒入NaHSO3(120mg)的水(36ml)溶液中，搅拌5分钟。将其冷却至0℃，缓慢加入NaHCO3(0.4g)。5分钟后，加入EtOAc(50mL)和Et2O(50ml)。分离层，并用EtOAc萃取水层(2x30ml)。将有机层合并，浓缩，并通过硅胶柱纯化色谱用0-20％MeOH的CH2Cl2洗脱，得到产物。LCMS(ES,m/z)：915.3[M+H]+。
第九步：(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-7-[2-(2-异丁酰氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基]-14-{6-[(苯甲酰基)胺基]-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-2,10-二醇盐-2,10-二氧化物.
向(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-2-(2-氰基乙氧基)-7-[2-(2-异丁酰氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基]-14-{6-[(苯甲酰基)胺基]-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-10-醇盐-2,10-二氧化物(274mg)的乙腈(5mL)溶液加入丁胺(3.4mL)，再搅拌30分钟后，浓缩，得到粗产物，将其不经纯化用于下一步骤。LCMS(ES,m/z)：861.2[M+H]+。
第十步：(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-7-[2-氨基-6-氧代-1，6-二氢-9H-嘌呤-9-基]-14-{6-氨基-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-2,10-二醇盐-2,10-二氧化物。
粗(5R,7R,8R,12aR,14R,15aS,16R)-7-[2-(2-异丁酰氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基]-14-{6-[(苯甲酰基)胺基]-9H-嘌呤-9-基}-11-亚甲基-15，16-二氟-八氢-12H-5,8-环戊烯[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧杂二磷杂环十四碳烯-2,10-二醇盐-2,10-二氧化物(350mg)溶于MeNH2的EtOH溶液中(30％，6mL)，在室温下搅拌5h。然后，减压除去挥发性成分，得到粗产物用制备HPLC分离,用含甲酸的乙腈/水溶液洗脱得到纯化后的目标产品，为白色固体。LC-MS(ES,m/z)：689.1[M+H]+和687.1[M-H]-。
实施例2-29
实施例2至29根据类似于上述实施例1所描述的方法制备，使用下表中相应的中间体(带保护的核苷)制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i，通过氧化，脱氰乙基，和去保护，并由相应的亚甲基环戊基核苷类似物制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i偶联，再通过氧化，去保护和关环，再氧化，去除所有的保护基，成盐等步骤得到最终产品；
实施例30
第一步:将腺苷亚磷酰胺P1-1(17.7g，20mmol)溶于ACN(200mL)溶液中。向溶液中加入水(0.72mL，40mmol)和吡啶·TFA(4.64g，24mmol)，所得混合物在室温下搅拌25分钟。然后加入叔丁胺，将溶液搅拌15分钟，真空除去溶剂。将残余物溶解到3％DCA的CH2Cl2溶液(150mL)和水(3.6ml)的混合物中搅拌20分钟。用MeOH和吡啶淬灭反应。减压浓缩除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用CH2Cl2/EtOH/MeOH(80/15/5)作为洗脱剂，得到C2-1(7.15g；80％产率)。LC-MS：tR＝4.92min，m/z＝448[M+H]+，m/z＝446[M-H]-。
第二步：在分子筛的存在下，将化合物肌苷亚磷酰胺(7.72g，10mmol)一次加入C2-1(2.24g，5mmol)在含5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(0.1M，ACN中)(100mL，100mmol)的ACN溶液中。将混合物在室温下搅拌50分钟。得到产物C2-2，不需进一步处理直接用于下一步反应。
第三步：向上一步得到的混合物中加入5.5M叔丁基过氧化氢的癸烷溶液(1.6mL，8.8mmol)，将其搅拌50分钟。过滤溶液，用CH2Cl2洗涤分子筛。将滤液真空浓缩。在水(10当量)存在下，将残余物用3％DCA在CH2Cl2(75mL)中处理20分钟。用MeOH和吡啶淬灭反应。真空除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用CH2Cl2/MeOH(5-20％)作为洗脱剂，得到C2-3(3.4g；81.7％产率)。LC-MS：tR＝6.11min，m/z＝832[M+H]+，m/z＝830[M-H]-。
第四步：将化合物C2-3(3.4g，4.08mmol)与无水吡啶共蒸发三次。将残余物悬浮于无水吡啶(85mL)中，向所得溶液中加入5,5-二甲基-2-氧代-2-氯-1,3-二氧杂磷杂环壬烷(DMOCP)(2.1g，11.4mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。然后，向混合物中加入碘(1.30g，5.15mmol)和水(30当量)。10分钟后，加入NaHSO3水溶液(0.15％)(800mL)，直至观察到完全变色，然后加入NaHCO3水溶液。水层用EtOAc/Et2O的1:1(v/v)混合溶液(1000mL)萃取三次。合并有机层，用MgSO4干燥，过滤。真空除去溶剂，得到C2-4(2.95g)。该粗中间体不经进一步纯化用于下一步骤。LC-MS：tR＝6.38min，m/z＝831.15[M+H]+，m/z＝829[M-H]-。
第五步：将化合物C2-4(2.95g，3.55mmol)加入到33％甲胺EtOH(150mL)溶液中，所得混合物在50℃下搅拌5小时。将反应混合物浓缩，并将所得残余物然通过C18柱(30mm×150mm，5μm)制备型HPLC纯化，用具含有NH3HCO3铵/CAN/水洗脱。合并含有所需化合物的组分，将所得溶液浓缩并冻干得到化合物E-O-6-1。也可将铵盐在钠离子Amberlite离子交换树脂柱上交换，得到E-O-6-1的钠盐(0.87g；32％产率)。tR＝6.38min，m/z＝674.1[M+H]+，m/z＝672.1[M-H]-。1H-NMR(D2O，400MHz)δ(ppm):8.95(S,1H)，8.76(S,1H)，8.10(S,1H)，7.84(S,1H)，5.93(S,2H)，5.06-4.79(m，4H)，4.41(m，4H)，4.01(m，2H),3.50(s,1H),3.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.03(br d,J＝6.5Hz,2H),2.92(br d,J＝13.8Hz,1H),2.52(br d,J＝13.3Hz,1H)。
实施例31-61
实施例31至61根据类似于上述实施例30所描述的方法制备，使用下表中相应的中间体(带保护的核苷)制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i，通过氧化，脱氰乙基，和去保护，并由下表中相应的亚甲基环戊基核苷类似物制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i偶联，再通过氧化，去保护和关环，再氧化，去除所有的保护基，成盐等步骤得到
实施例31-61的化合物。
实施例62
第一步:将亚磷酰胺P1-8(17.6g，20mmol)溶于ACN(210mL)溶液中。向溶液中加入水(0.72mL，40mmol)和吡啶·TFA(4.63g，24mmol)，所得混合物在室温下搅拌25分钟。然后加入叔丁胺，将溶液搅拌25分钟，真空除去溶剂。将残余物溶于3％DCA的CH2Cl2溶液(130mL)和水(3.6mL)混合溶液中，搅拌20分钟。用MeOH和吡啶淬灭反应。真空除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用CH2Cl2/EtOH/MeOH(80/15/5)作为洗脱剂，得到C3-1(6.79g；76％产率)。LC-MS：m/z＝447[M+H]+，m/z＝445[M-H]-.
第二步：在分子筛的存在下，将亚磷酰胺P2-16(7.0g，8.89mmol)一次加入C3-1(2.23g，5mmol)在含5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(0.1M，ACN中)(100mL，100mmol)的ACN溶液中。将混合物在室温下搅拌50分钟。得到产物C3-2，不需进一步处理直接用于下一步反应。
第三步:向上一步得到的混合物中加入苯乙酰二硫(PADS)(3.1g，10.0mmol)的无水吡啶(50mL)溶液，将混合物在室温下搅拌45分钟。过滤所得溶液，用CH2Cl2洗涤分子筛。将滤液真空浓缩并与ACN共蒸发三次。在水(10当量)存在下，将残余物加入到3％DCA在CH2Cl2(115mL)中并搅拌25分钟。反应用MeOH和吡啶淬灭反应。真空除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用CH2Cl2/MeOH(3-25％)作为洗脱剂，得到才C3-3(3.45g；79％产率).LC-MS：tR＝5.82和6.02分钟，m/z＝864.1[M+H]+，m/z＝862.1[M-H]-.
第四步：将化合物C3-3(3.45g，4.0mmol)与无水吡啶共蒸发三次。将残余物悬浮于无水吡啶(250mL)中，向该溶液中加入DMOCP(1.85g，10.0mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。然后，加入元素硫(0.5g，15.6mmol)，将混合物在室温下搅拌45分钟。然后，将混合物真空浓缩，与甲苯共蒸发三次，在ACN中沉淀以除去过量的硫。真空除去溶剂，得到C3-4(2.1g；60％产率)。该粗制中间体不经任何进一步纯化用于下一步骤.LC-MS：t R＝5.91和6.12min，m/z＝878.1[M+H]+，m/z＝876.1[M-H]-。
第五步：将化合物C3-4(2.1g，2.4mmol)加入到33％甲胺EtOH(160mL)溶液中，所得混合物在50℃下搅拌5小时。将反应混合物浓缩，并将所得残余物通过制备型HPLC纯化，用具含有NH3HCO3铵/CAN/水洗脱。合并含有所需化合物的组分，将所得溶液浓缩并冻干得到化合物E-S-16-8(0.86g；49％产率)。LC-MS：t R＝3.45min，m/z＝721.1[M+H]+，m/z＝719.1[M-H]-。
实施例63-110
参照实施例62的制备方法，实施例63至110根据类似于上述实施例62所描述的方法制备，使用下表中相应的中间体(带保护的核苷)制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i，通过氧化，脱氰乙基，和去保护，并由相应的亚甲基环戊基核苷类似物制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i偶联，再通过氧化，去保护和关环，再氧化，去除所有的保护基，成盐等步骤得到最终产品。
实施例111
第一步：氮气保护下向化合物B1-13(Entecavir，直接可购买)(500.00mg，1.80mmol，1.00eq)的吡啶(10mL)溶液中滴加三甲基氯硅烷(977.76mg，9.00mmol)，室温下搅拌2小时后，再向其中滴加异丁酰氯(958.95mg，9.00mmol)，然后继续搅拌12小时。LCMS检测反应已完成，将上述反应液冷却至0℃并向其中加入氨水(3.64g，4.00mL)并继续搅拌25分钟。将上述溶液真空浓缩后的粗品经硅胶柱纯化(DCM:MeOH＝50:1to 20：1)得化合物C4-1(350mg，55.9％产率)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：348.1[M+H]+。
第二步：氮气保护下将化合物C4-1(347.0mg,1mmol)，(2R,3R,5S)-2-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(858mg，1mmol)和吡啶三氟乙酸(300mg，1.55mmol)的混合物在真空环境下干燥一段时间，然后加入乙腈(12mL)，室温下搅拌10分钟，然后再加入N,N-二甲基-N'-(5-硫基-1,2,4-二硫唑-3-基)甲咪(308mg，1.5mmol)，室温下再搅拌2.5小时。LCMS检测反应已完成，将反应液减压浓缩。残余物经硅胶柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1:1，DCM:MeOH＝20:1)洗脱得化合物C4-2(680mg，61％产率)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：1136.4[M+H]+。
第三步：向化合物C4-2(680mg，600μmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入二氯乙酸(600mg，4.65mmol)，室温搅拌2小时。向上述反应液中加入饱和NaHCO3水溶液，调至中性并加入水(20mL)，再用二氯甲烷萃取(40mL*3)，用Na2SO4干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩得粗品，该粗品经制备TLC板分离(DCM/MeOH＝20/1)得化合物C4-3(359.0mg，71.8％产率)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：834.25[M+H]+。
第四步：将化合物C4-3(359mg,431μmol)和吡啶三氟乙酸(208mg,1.08mmol)的混合物在P2O5及真空环境下干燥40小时，然后加入乙腈(2mL)和3-双(二异丙胺)磷酸基氧丙腈(169mg，560μmol)然后室温搅拌20分钟后，将N,N-二甲基-N'-(5-硫基-1,2,4-二硫唑-3-基)甲咪(114mg，560μmol)加入，氮气保护下在室温再搅拌3小时。LCMS检测反应已完成，将反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱分离，用3％-20的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到得化合物C4-4为白色固体(184mg，54.2％产率)。LCMS(ES,m/z)：791.1[M+H]+。
第五步：向化合物C4-4(184.0mg，230μmol)的MeOH(4.00mL)溶液中加入甲胺水溶液(2mL，30％纯度)，在密闭容器中加热至50℃反应12小时。LCMS检测反应已完成，将反应液浓缩得粗品化合物E-S-24-13(141mg，90％产率)，该粗品经制备色谱纯化(酸性条件，HCOOH)得目标化合物(三个异构体:E-S-24-13a，E-S-24-13b，E-S-24-13c)(峰1，峰2，峰3分别分离得到18mg，26mg，15mg)，皆为白色固体。LCMS(ES,m/z)：685.1[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ＝9.01(s,1H),8.89(s,1H),8.41(s,1H),6.18(d,J＝2.5Hz,1H),5.54(s,1H),5.28(br s,1H),4.47(br d,J＝6.5Hz,3H),4.17(s,2H),3.50(s,1H),3.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.03(br d,J＝6.5Hz,2H),2.92(br d,J＝13.8Hz,1H),2.52(br d,J＝13.3Hz,1H)。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ＝8.73(s,1H),8.68(s,1H),8.55(s,1H),8.31(br s,4H),6.17(s,1H),6.08(s,2H),5.74(br s,1H),5.56(br s,2H),5.47(br s,1H),5.34(br d,J＝8.3Hz,2H),4.98(br s,1H),4.52-4.44(m,3H),4.38-4.32(m,3H),4.14-4.01(m,5H),2.98(br s,3H),2.87(br s,1H),2.63(br d,J＝8.8Hz,2H),2.41-2.30(m,3H)。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ＝8.58(br s,2H),8.35-8.15(m,1H),6.17(br s,1H),5.64-5.47(m,2H),5.27(br s,1H),4.56(br d,J＝11.3Hz,2H),4.42(br d,J＝9.8Hz,2H),4.32(br s,1H),4.03-3.90(m,2H),2.81(br s,1H),2.56(s,1H),2.14(br s,1H)。
实施例112-134
实施例112-134的化合物根据类似于上述实施例111所描述的方法制备，使用下表中相应的中间体(带保护的核苷)制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i，通过氧化，脱氰乙基，和去保护，并由下表中相应的亚甲基环戊基核苷类似物制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i偶联，再通过氧化，去保护和关环，再氧化，去除所有的保护基，成盐等步骤得到最终产品；
实施例135
第一步：向搅拌的(2R,3S,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-3(2.57g，3.0mmol)的MeCN(15mL)溶液中加入H2O(0.11mL，6.0mmol)和2,2,2-三氟乙酸吡啶鎓盐(0.696g，3.6mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌20分钟。通过LCMS/TLC监测反应进程。当亚磷酰胺反应完全后，向搅拌溶液中加入叔丁胺(15.0mL，142mmol)，并在25℃下搅拌40分钟。将所得溶液真空浓缩。将残余物与干燥的MeCN(两次，每次15mL)共蒸发，得到C5-1不经纯化用于下一步骤。LCMS(ES,m/z):719.2[M-H]-。
第二步:向粗品C5-1的CH2Cl2(37mL)的溶液中逐滴加入H2O(0.558mL，31.0mmol)和含有6％二氯乙酸的CH2Cl2溶液(38mL，32.3mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌40分钟，然后加入Et3SiH(68mL)，将反应混合物搅拌1.5小时。向反应中加入吡啶(5mL)。将所得溶液在25℃下搅拌5分钟，然后真空浓缩。残余物用MTBE/己烷(100mL，v/v，1/1)研磨，倾析倒出上清液。这个过程重复了两次。将最终残余物减压浓缩，粗品C5-2不经纯化用于下一步骤。.LCMS(ES,m/z):419.18[M+H]+。
第三步:在氩气保护下，向上一步的产物(1.50g，3.59mmol)溶解在MeCN(20mL)中，在搅拌下加入活化的4分子筛(800mg)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。将((1R,2S,3R,5R)-3-(7-苯甲酰氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-2-氟-4-亚甲基环戊基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(3.50g，3.95mmol)与干燥的MeCN(15mL)共蒸发两次。加入活性分子筛(600mg)。30分钟后，将此亚磷酰胺混合物溶液加入到C5-2的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌40分钟。向反应混合物中加入(E)-N，N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基))甲酰胺(780mg，3.9mmol)，将混合物在室温下搅拌30分钟。通过TLC/LCMS监测反应进程。当亚磷酸酯反应完全后，将反应混合物浓缩，并通过色谱柱纯化残留物，用1至20％MeCN/乙酸乙酯洗脱。减压浓缩得到产品C5-3为白色固体(2.17g，49.0％产率)LCMS(ES,m/z):1236.32[M+H]+.
第四步：向搅拌的步骤C5-3的产物(1.235g，1mmol)的CH2Cl2(30mL)溶液中加入2,2-二氯乙酸的(20mg，115mmol)和H2O(120mg，6.66mmol)的CH2Cl2混合物,在室温下搅拌20分钟，加入Et3SiH(35mL)。2小时后，加入吡啶(8mL)，将混合物搅拌10分钟。除去挥发物后，加入无水吡啶(每次10mL，三次)共蒸发。然后将产物溶解在无水吡啶(25mL)中，一次加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂磷杂环壬烷-2-氧化物(370mg，2mmol)。将所得混合物搅拌40分钟。通过TLC/LCMS监测反应进程。反应完全后将反应混合物直接用于下一反应步骤。LCMS(ES,m/z):916.2[M+H]+
第五步:搅拌下向第四步的反应混合物中加入H2O(144mg，8mmol)和3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮(269mg，1.6mmol)。将混合物在室温下搅拌40分钟。反应完成后，加入NaHCO3水溶液(0.5g NaHCO3，30mL H2O)中并搅拌5分钟。所得混合物用EtOAc/乙醚(v/v，1/1，3×60mL)萃取。将合并的有机层并干燥(Na2SO4)，通过硅胶色谱法纯化，用0至15％MeOH在CH2Cl2中洗脱，得到产物：非对映异构体C5-5a的混合物(用5.5％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱)；非对映异构体C5-5b的混合物(用含9.8％MeOH的CH2Cl2溶液洗脱).混合物C5-5a:LCMS(ES,m/z):947.16[M+H]+；混合物C5-5b:LCMS(ES,m/z):947.16[M+H]+。
第六步:在室温下氩气保护下，向前一步骤粗产品C5-5a的混合物(310mg，0.328mmol)在MeCN(4mL)悬浮液中加入叔丁胺(4.5mL)。30分钟后，真空除去挥发性成分。在向其中加入30％的MeNH 2(5m％)乙醇溶液。将混合物在室温下搅拌12小时。，通过TLC/LCMS监测反应进程。反应完成后，将在减压浓缩，通过制备型HPLC纯化残余物，用10至50％MeCN/3M的NH4OH水溶液洗脱，得到产物化合物E-S-3-3a和E-S-3-3b。LCMS(ES,m/z):722.06[M+H]+。同样的方法处理C5-5b，得到E-S-3-3c和E-S-3-3d,LCMS(ES,m/z):722.06[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,D2O):δ8.18(s,1H)，8.16(s,1H)，7.77(s,1H)，6.37(d,J＝14.3Hz,1H)，5.88(d,J＝8.4Hz,1H)，5.61-5.54(m,l.5H)，5.43(s,0.5H)，5.27-5.12(m，2H)，4.59(d,J＝3.6Hz,1H)，4.47(t,J＝12.9Hz,2H)，4.36(d,J＝4.8Hz,1H)，4.04(dd,J＝23.2,12.0Hz,2H).31P-NMR(200MHz,D2O):δ55.33(s)，51.54(s).
1H-NMR(400MHz,D2O):δ8.19(s,1H)，8.17(s,1H)，7.74(s,1H)，6.38(d,J＝14.3Hz,1H)，5.86(d,J＝8.4Hz,1H)，5.60-5.54(m,l.5H)，5.41(s,0.5H)，5.25-5.10(m，2H)，4.58(d,J＝3.6Hz,1H)，4.46(t,J＝12.9Hz,2H)，4.35(d,J＝4.8Hz,1H)，4.03(dd,J＝23.2,12.0Hz,2H).31P-NMR(200MHz,D2O):δ55.03(s)，51.02(s).
1H-NMR(400MHz,D2O):δ8.17(s,1H)，8.15(s,1H)，7.76(s,1H)，6.36(d,J＝14.3Hz,1H)，5.85(d,J＝8.4Hz,1H)，5.60-5.54(m,l.5H)，5.43(s,0.5H)，5.27-5.12(m，2H)，4.59(d,J＝3.6Hz,1H)，4.47(t,J＝12.9Hz,2H)，4.36(d,J＝4.8Hz,1H)，4.04(dd,J＝23.2,12.0Hz,2H).31P-NMR(200MHz,D2O):δ55.63(s)，51.55(s).
1H-NMR(400MHz,D2O):δ8.15(s,1H)，8.13(s,1H)，7.76(s,1H)，6.35(d,J＝14.2Hz,1H)，5.86(d,J＝8.3Hz,1H)，5.60-5.52(m,l.5H)，5.41(s,0.5H)，5.26-5.11(m，2H)，4.57(d,J＝3.6Hz,1H)，4.46(t,J＝12.8Hz,2H)，4.35(d,J＝4.8Hz,1H)，4.02(dd,J＝23.0,12.0Hz,2H).31P-NMR(200MHz,D2O):δ55.3(s)，51.4(s).
实施例136-187
实施例136-187的化合物根据类似于上述实施例135所描述的方法制备，使用下表中相应的中间体(带保护的核苷)制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i，通过氧化，脱氰乙基，和去保护，并由下表中相应的亚甲基环戊基核苷类似物制备的(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i偶联，再通过氧化，去保护和关环，再氧化，去除所有的保护基，成盐等步骤得到最终产品；
体外活性测试1:THP1-Blue细胞中激动STING的活性EC50(半数有效浓度)
实验方法
1.稀释化合物
1.1化合物用DMSO稀释至200x最高检测浓度，使用ECHO以3倍梯度稀释8个点，384孔板细胞培养板每孔加入化合物体积150nL。
2.细胞铺板
2.1将正常培养于T150细胞培养瓶的THP1-Blue ISG细胞(美国Invivogen公司)计数后，用新鲜培养液稀释调整到1,000,000细胞/毫升的细胞悬液。将细胞种入384孔细胞培养板，每孔30μL，细胞终密度为30,000细胞/孔，DMSO终浓度为0.5％。将细胞培养板放置在37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
3.检测
384孔板每孔取5μL上清加入45μL QUANTI-Blue，37℃孵育30-45分钟，读取各孔在650nm处的吸光度(OD)值。384孔板每孔加入25μL Cell-Titer Glo，读取化学发光度(RLU)。
4.数据处理
使用GraphPad Prism软件对细胞OD值数据进行非线性拟合分析，得到化合物的EC50值，用以下公式将RLU值转换为细胞活力百分比，细胞活力％＝100*(化合物相应RLU/0.5％DMSO对照孔读值的平均值)，并使用GraphPad Prism软件对细胞活力百分比数据进行非线性拟合分析，得到化合物的CC50值。
表1.THP1-Blue细胞中激动STING的活性EC50(半数有效浓度.)；
体外活性测试2：在THP1细胞中诱导IFN-β分泌的活性
使用人IFN-βAILISA试剂盒(Perkin ElmeR，目录号AL265F)测量化合物刺激THP1细胞分泌干扰素-β的能力。基本试验方法如下：
使用Echo 550分配器将120mL溶解在DMSO中的化合物转移到空的无菌96孔微孔板孔中。将先前冷冻的THP1细胞解冻，并立即将其稀释10倍于37℃测定培养基(RPMI 1640+L-谷氨酰胺&酚红，0.5％热灭活的胎牛血清；1mM丙酮酸钠，1x非必需氨基酸)。使用BeckmanCoulter V-Cell XR细胞计数器确定细胞活力和计数。将细胞悬浮液在室温下以200xg离心5分钟。将细胞以6×105细胞/mL的密度重新悬浮至在37℃培养基中。
通过将40μL制备的细胞悬浮液分配到含有化合物的平板的孔中开始测定。在37℃，5％CO2在潮湿环境中孵育5小时后，将含细胞和化合物的平板在室温下以200xg离心5分钟。从每个孔中，将5μL上清液转移到空白96孔板的相应孔中。向这些含上清液的孔中加入10μL5x抗分析物受体珠Anti-Analyte Acceptorbeads(50μg/mL的A1phaLISA HiBlock缓冲液)，并在室温下振荡温育30分钟。向每个孔中加入10μL 5x生物素化抗体抗分析物(5nM在AlphaLISA HiBlock缓冲液中)，并在轨道板振荡器上在室温下孵育60分钟或在40℃下过夜。向每个孔中加入25μL2×SA-供体珠(80μg/mL，在AlphaLISA HiBlock缓冲液中)，并在室温下在黑暗中孵育30-45分钟，同时在轨道板振荡器上摇动。然后在Perkin ElmerEnvision(λex＝680nm，λem＝570nm)上读取该平板，基于30μM cGAMP阳性对照和0.3％DMSO阴性对照计算每种化合物浓度下的Alpha LISA信号的百分比。对照化合物cGAMP的浓度和试验化合物的浓度分别为30μM和10μM。对本发明公开的化合物在10μM浓度下诱导IFN-β分泌的活性，相对于30μM浓度的2',3'-cGAMP的活化百分比列于表2。
表2.本发明化合物体外筛选试验结果(THP1细胞培养中的IFN-p分泌)
体内动物试验：
本发明公开的环状二核苷酸类化合物在HBV DNA动力学小鼠模型中的抗病毒功效。
十周龄的雌性NOD/SCID小鼠购自Charles River实验动物科技有限公司。对照组包括8只小鼠，治疗组8只小鼠。为建立HBV流体动力学模型，将13.5μg表达1.3mer HBV基因组的pT-MCS-HBV1.3质粒和4.5ug表达睡美人转座酶的pCMV-SB通过尾静脉快速注射到6-9周龄的小鼠体内(Yang PL,Althage A,Chung J,Chisari FV.2002.Hydrodynamicinjection of viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virusinfection.Proc Natl Acad Sci U S A 99:13825–13830)。为了在体内测试本发明化合物抗乙肝的功效，在注射HBV 1.3mer质粒7天后，治疗组用10mg/kg的环状二核苷酸类化合物(在具有7.5％碳酸氢钠的磷酸盐缓冲盐水中)通过腹膜内注射的方式治疗小鼠，对照组给以等体积的磷酸盐缓冲盐水(溶媒)。治疗前和治疗后24h测量个体小鼠的体重，在给药治疗24小时后处死小鼠。肝内HBV核心DNA通过实时PCR检测提取和进行定量分析。用文献方法提取HBV核心DNA，进行Southern印迹杂交和实时PCR检测(Xu C,Guo H,et.al..Interferonsaccelerate decay of replication-competent nucleocapsids of hepatitis Bvirus.JVirol.,2010,84,9332–9340.)。减去输入质粒拷贝数之后，得到每个动物的HBVDNA拷贝数/ml数。结果见图1。
结论：本发明实施例化合物能显著降低HBV DNA载量。
应当理解，本发明的化合物由于可以激活干扰素刺激因子因而可以产生内源性干扰素，因而可以用于替代干扰素，与应用于其它疾病和与其它药物组合，从而应用于免疫相关疾病的治疗，包括细菌、肿瘤、病毒等多种疾病的治疗作用。

Claims (13)

1.一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
Base1和Base2各自独立地选自以下结构：
W选自O，S，-(C＝CH2)-，-CH2-，-CHF-和CF2-；优选为O，S，-CHF-或-CF2-；更优选为O或S；
X和X1各自独立地选自O，NH和S；优选选自O和S；
Y和Y1各自独立地选自OR9，SR9和NHR9，优选选自OR9和SR9，更优选选自O–，S–，OH和SH；
Z和Z1各自独立地选自O，S，NH和-CH2-；优选选自O和S；
R’和R”各自独立地选自H，D，F和Me和Et；优选选自H和F；
R1，R2，R3，R4各自独立地选自H，D，OH，卤素，CN，N3，NH2，取代或未取代的C1-C4烷基，取代或未取代的C2-C4烯基，取代或未取代的C2-C4炔基，取代或未取代的-O-(C1-C4)烷基，取代或未取代的-O-(C2-C4)烯基，取代或未取代的-O-(C2-C4)炔基，和取代或未取代的(C3-C7)环烷基；优选选自H，OH，F，Cl，CN，N3和NH2；更优选选自H，OH和F；所述取代是指被1-3个选自氘，卤素，羟基，羧基，NH2，硝基，氰基，叠氮基，巯基，酰基，磺酰基，(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷氧基的基团所取代；或者
R1和R2连接起来形成3-7元饱和环烃或杂环烃；和/或R3和R4连接起来形成3-7元饱和环烃或杂环烃；
R9独立地选自H，取代或未取代的C1-C9烷基，取代或未取代的酰基-COR10，取代或未取代的C3-C10的单环烷基，取代或未取代的非芳香性杂环基，取代或未取代的C6-C10的单环或双环芳香基，取代或未取代的C5-C10的芳杂环基，所述取代是指被1至2个独立地选自下列的取代基所取代：OH，-O-(C1-C20)烷基，-S-C(O)-(C1-C6)烷基和-C(＝O)O-(C1-C6)烷基；-C(＝O)NH-(C1-C6)烷基，-NH-(C1-C6)烷基；
R10选自H和C1-C9烷基。
2.根据权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：其中Base1和Base2各自独立地选自以下结构：
优选地选自以下结构：
3.根据权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：式(I)的化合物是式(Ia)的化合物，
其中，W、Z、Z1、Y、Y1、R9、R10、R’、R”、R1、R2、R3、R4、Base1和Base2与权利要求1中的定义相同。
4.根据权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：式(I)的化合物是式(Ib)的化合物，
其中，R5和R6各自独立地选自H，OH和F；
W、Z、Z1、Y、Y1、R9、R10、Base1和Base2与权利要求1中的定义相同。
5.根据权利要求4所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
W选自O或S；
Z和Z1各自独立地选自O或S；
Y和Y1各自独立地选自O–，S–，OH，SH；
R5和R6各自独立地选自H，OH和F；
Base1和Base2各自独立地选自以下碱基：
6.根据权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)的化合物选自如下具体化合物：
7.权利要求1-6中任一项所述式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P2-i通过氧化水解，脱氰乙基，去保护，得到中间体G1；
(2)中间体G1与(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺P1-i发生偶联反应，得到中间体G2；
(3)中间体G2发生氧化反应，得到中间体G3；
(4)中间体G3除去保护基，得到中间体G4；
(5)中间体G4发生关环反应，得到中间体G5；
(6)中间体G5发生氧化反应，得到中间体G6；
(7)中间体G6通过去除所有的保护基得到式(I)所示化合物；
其中，W、Z、Z1、Y、Y1、X、X1、R’、R”、R1、R2、R3、R4、Base1和Base2与相应权利要求中的定义相同；Rp代表保护基；pBase1代表有保护基的碱基Base1；pBase2代表有保护基的碱基Base2。
8.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-6中任一项所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐。
9.权利要求1-6中任一项所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐用于制备STING蛋白调节剂或疫苗佐剂的用途。
10.权利要求1-6中任一项所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防一种或者多种与激活STING蛋白相关的疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述与激活STING蛋白相关的疾病包括病毒感染疾病，细菌感染疾病，癌症，免疫系统相关疾病。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：
所述细菌感染疾病包括由大肠杆菌，结核杆菌，金黄色葡萄球菌，链球菌、肺炎球菌，绿脓杆菌、肺炎杆菌、表皮葡萄球菌，厌氧菌及各种真菌，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌感染导致的疾病；
所述癌症包括肺癌，胃癌，乳腺癌，膀胱癌，胰腺癌，直肠癌，肝癌或血液瘤；所述血液瘤包括白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤；
所述免疫系统相关疾病包括类风湿关节炎，银屑病，银屑病关节炎，多发性硬化，红斑狼疮。
13.权利要求1-6中任一项所述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防急性乙肝，慢性乙肝，重型乙肝，或由乙肝病毒引起的肝功能损伤，肝纤维化，肝癌的药物中的应用。
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