CN109680094A

CN109680094A - 玉米Zm-Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用

Info

Publication number: CN109680094A
Application number: CN201910074121.3A
Authority: CN
Inventors: 吴刘记; 陈赞; 王顺喜
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明属于玉米抗性基因技术领域，具体涉及一种玉米Zm‑Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用。提供了一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记及其获得方法，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.6所示的Zm‑Prx5基因。还提供了一种利用所述分子标记构建转基因玉米植株，并用于防治玉米茎腐病的方法。通过检测Zm‑Prx5转基因材料并鉴定其茎腐病抗病性，发现Zm‑Prx5基因可提高玉米对茎腐病的抗性，为玉米茎腐病的抗病性育种提供了基因资源。

Description

玉米Zm-Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用

技术领域

本发明属于玉米抗性基因技术领域，具体涉及一种玉米Zm-Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用。

背景技术

玉米是我国的主要粮食作物，种植面积和总产量仅次于小麦和水稻而居第三位。玉米除食用外，还是发展畜牧业的优良饲料和轻工、医药工业的重要原料。玉米病害的发生可导致巨大的经济损失，尤其是近年来玉米病害发生日益频繁，病害种类日益增多，严重影响了玉米产业的发展。化学农药的使用在一定程度上提高了对玉米病害的控制作用，但是农药的使用不仅污染了环境，长期使用还会使玉米产生耐药性，同时，造成的药物残留对人类的生命安全也有潜在的威胁。因此，在对玉米抗病的研究中，人们致力于寻找既不影响环境又对玉米病害能够有效防治的方法。

Prxs家族是一类分子量20到40kDa的蛋白，作为一种抗氧化酶广泛存在于各种生物体中。1985年，首次从兔子线粒体中分离得到第一个过氧化物还原酶。随着生物技术的不断发展，越来越多的过氧化物还原酶被发现和鉴定，根据其在结构上的差异，将其分为6类，分别命名为Prx1，PrxQ，Prx6，Tpx，AhpE和Prx5，而在植物中只发现有Prx1，PrxQ，Prx6和Prx5四类。近年来，Prxs的重要性日趋被人们所关注，有关Prxs在植物病害中的研究呈上升趋势。在烟草中过表达一个PrxQ的同源基因可以提高植物对真菌的抗性，研究发现在杨树亲和性锈病生理小种侵染的时候，PrxQ呈下调表达的趋势，而在非亲和性生理小种侵染的时候呈现上调表达的趋势。研究发现Prx在病害引起的细胞死亡过程中起着负向调控的作用。研究还发现，在氯化铬处理下，Prx缺失型拟南芥根的生长发育受到明显影响。

玉米茎腐病又称玉米茎基腐病、青枯病，该病害由多种病原菌单独或复合侵染引起，玉米茎腐病是典型的土传病害，致病菌在土壤、肥料、病残体或玉米种子上越冬，病残体及带病玉米种子是主要的初侵染源，病原菌借助风、水、机械及昆虫等进行传播，侵入根部及根茎部伤口，引起植株发病。由于近些年玉米自交系与杂交种在区域间引种频繁，导致茎腐病在玉米种植区大面积传播。相关报道指出，每年茎腐病在玉米主产区的发病率在10％-20％，一些年份更是达到60％，造成产量损失达25％。

特定基因是鉴定植物抗性的有效手段，但是目前尚未发现可以有效鉴定玉米茎腐病的抗性基因，限制了玉米品种的改良。因此，挖掘新的玉米茎腐病抗性基因，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种玉米Zm-Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用，提供了一种有效鉴定玉米茎腐病的抗性基因。

本发明的第一个目的是提供一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记,所述分子标记为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.6所示的Zm-Prx5基因。

本发明的第二个目的是提供一种所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米的总RNA备用；

步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；

步骤3，分子标记的克隆

合成引物：Zm-Prx5F1:5'-AAAACCGGTTGCTATTAGTAC-3'；Zm-Prx5R1:5'-GAAGAAAACAAAATGTCTGC-3'；

用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer 4μl、dNTP 1μl、Zm-Prx5F1 0.5μl、Zm-Prx5R1 0.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H₂O 17μl；

PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收743bp的条带，即获得能够鉴定玉米茎腐病的分子标记。

本发明第三个目的是提供所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种Zm-Prx5基因在玉米茎腐病防治中的应用至少具有以下有益效果：

本发明通过检测Zm-Prx5转基因材料并鉴定其茎腐病抗病性，结果显示在转基因阳性株系中Zm-Prx5的表达量显著高于阴性株系。人工接种茎腐病后，在Zm-Prx5转基因阳性株系中病斑的扩展速度显著小于阴性株系。对病斑大小的统计数据进行差异性分析，结果表明，Zm-Prx5转基因阳性株系中病斑的大小在接种后的各时期均显著小于阴性株系。结合转基因阳性株系和阴性株系的qRT-PCR结果我们可以发现Zm-Prx5基因可提高玉米对茎腐病的抗性，实验结果为进一步探究Zm-Prx5的功能奠定了一定的基础，同时也为玉米茎腐病的抗病性育种提供了基因资源。

利用本发明提供的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记Zm-Prx5基因可有效鉴定玉米品种是否抗病，也可构建转基因植株，以增加原玉米品种的茎腐病抗性，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。

附图说明

图1是本发明玉米总RNA和玉米18S cDNA第一链的电泳图；

图1A是玉米总RNA，1、2泳道均是玉米总RNA；图1B是玉米18S cDNA第一链，M泳道为DL2000，1-4泳道均是玉米18S cDNA第一链；

图2是Zm-Prx5F1、Zm-Prx5R1引物扩增和5个阳性克隆子的检测结果；

图2A是Zm-Prx5F1、Zm-Prx5R1引物扩增结果，其中M号泳道是DL2000，1号泳道是扩增产物；图2B是5个阳性克隆子的检测结果，其中M号泳道是DL2000，1-5号泳道是阳性克隆子；

图3是Zm-Prx5R5、Zm-Prx5F5引物PCR产物电泳结果和pCAMBIA1304-Zm-Prx5-GFP质粒的NcoI和SpeI双酶切检测结果；

图3A是Zm-Prx5R5、Zm-Prx5F5引物PCR产物，其中M号泳道是BM5000，1-2号泳道是PCR产物；图3B是pCAMBIA 1304-Zm-Prx5-GFP质粒的NcoI和SpeI双酶切检测结果，其中M号泳道是DL2000，1-2号泳道是双酶切产物；

图4是T2代转基因玉米植株PCR检测结果；

M号泳道是DL50000，243、241号泳道是阴性株系，其余泳道是阳性株系；

图5是转基因株系的表型鉴定结果；

图5中A、E是接种后5天病斑测量结果，B、F是接种后10天病斑测量结果，C、F是接种后15天病斑测量结果，D、H是接种后20天病斑测量结果,240、242行分别是转基因株系的阳性株系，243、241行分别是阴性株系；

图6是阳性株系和阴性株系病斑的差异性数据统计分析结果。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面各实施例以及上述发明内容中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，所用的材料若无特殊说明均为市售。玉米自交系B73为河南农业大学农学院室保存。大肠杆菌DH5α购自上海北诺生物科技有限公司，RNA提取试剂TRIZOLReagent，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，T载体、PMD18-T载体，Taq酶，质粒提取试剂盒，限制性内切酶，T4连接酶，DEPC水均购自宝生物工程有限公司，测序和引物合成分别在华大和上海生工进行。玉米自交系B73取样方式如下：玉米自交系B73种植后，待四叶一心时取玉米叶片-80℃保存备用。

实施例1本发明提供一种所述Zm-Prx5基因的克隆方法，具体步骤如下：

步骤1，采用RNA提取试剂TRIZOL Reagent提取玉米自交系B73叶片的总RNA，获得玉米总RNA备用。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1A所示，图1A中1、2泳道均包括28S、18S为核糖体的大、小两个亚基，最下面那条条带为5.8S和5S(因为长度差距不大，故5.8S和5S很难在电泳中区分出来)，说明RNA 完整性良好，可以用作后续试验。

步骤2，提取玉米基因组DNA

用植物基因组DNA提取试剂盒(天根)提取玉米基因组DNA，备用。

步骤3，cDNA 第一链的合成和检测

(1)cDNA 第一链的合成

按照反转录试剂盒的说明，将玉米总RNA反转录成cDNA 第一链。

cDNA第一链的合成体系为：步骤1的玉米总RNA 6μl、Oligo(DT)1μl、DEPC水4μl。65℃温浴5min，然后冰上放置2min，再加入如下试剂：RNase抑制剂1μl、M-mlv buffer 4μl、DNTP(25nml)3μl、M-mlv反转录酶1μl；其中，Oligo(DT)的核苷酸序列如下：5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3’。设置反转录PCR程序如下：42℃1h，72℃10min，4℃forever；结束后保存于-20℃。

(2)cDNA 第一链的检测

设计玉米18S基因引物如下：18S R1：5'-CCTGCGGCTTAATTGACTC-3'，如SEQ IDNO.2所示；18S F1：5'-GTTAGCAGGCTGAGGTCTCG-3'，如SEQ ID NO.3所示；目的产物片段174bp。

配置18S cDNA 第一链的PCR检测体系如下：Premix Taq 12.5μl、18S F11μl、18SR1 1μl、cDNA 第一链1μl、ddH₂O 9.5μl。设置PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。PCR结束后取10μl进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。18S cDNA 第一链的检测电泳如图1B所示，从图中可以看出18S目的条带清晰，说明反转录的cDNA 质量良好，可以用作后续试验。

步骤4，Zm-Prx5的克隆

根据步骤3所得的Zm-Prx5基因的cDNA第一链全长序列设计合成引物：

Zm-Prx5F1:5'-AAAACCGGTTGCTATTAGTAC-3'，如SEQ ID NO.4所示；Zm-Prx5R1:5'-GAAGAAAACAAAATGTCTGC-3'，如SEQ ID NO.5所示；目标片段长度743bp。

用步骤3反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer 4μl、dNTP(10mM)1μl、Zm-Prx5F1 0.5μl、Zm-Prx5R10.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H₂O 17μl；

PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。

PCR结束后样品加入5μl loading buffer混匀后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。Zm-Prx5F1、Zm-Prx5R1引物扩增结果如图2A所示，检测得到一条743bp的条带，和目的片段大小一致。将扩增的片段用cDNA凝胶回收试剂盒进行回收，经pMD18-T载体连接转化后，将鉴定正确的阳性克隆送华大公司进行测序，结果证明为743bp。

步骤5，Zm-Prx5基因PCR扩增产物的回收、连接与转化

①无抗性LB液体培养基配方：分别称取Tryptone 10g、Yeast Extract 5g、NaCl10g于三角瓶中；加入800ml蒸馏水，充分搅拌；用NaOH将pH调整为pH＝7；加蒸馏水定容至1L；封口，灭菌后4℃保存。②抗性LB液体培养基配方：无抗性LB液体培养基灭菌后按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml氨苄霉素，制成氨苄霉素液体抗性培养基；或者按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml卡那霉素制成卡那霉素液体抗性培养基。③无抗性LB固体培养基：每升无抗性LB液体培养基中加入15g琼脂。④抗性LB固体培养基配方：LB固体培养基灭菌后按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml的氨苄霉素，倒入培养皿中制成氨苄霉素固体抗性培养基；或者按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml的卡那霉素，倒入培养皿中制成卡那霉素固体抗性培养基。

(1)Zm-Prx5基因PCR扩增产物的回收：利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收步骤4Zm-APX F2/Zm-APX R2引物扩增的目的片段，-20℃保存备用。

(2)目的片段的链接反应：连接体系如下：PMD 18-T载体1μl、无菌去离子水6μl、步骤5(1)目的片段8μl；16℃反应过夜，得连接产物，备用。

(3)大肠杆菌感受态细胞的制备：按照宝生物公司的感受态制备试剂盒制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，液氮速冷后放入-80℃冰箱中保存。

(4)转化：大肠杆菌感受态细胞从-80℃取出冰上融化，将步骤5(2)的连接产物全部加入步骤5(3)大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用移液器缓慢混匀，冰上放置30min后，42℃热击90s,，热击后快速移至冰上放置5min，加入1ml无抗性LB液体培养基，37℃，180rpm震荡培养2h，5000rpm/min离心3min，吸出多余的上清液，留100μl将沉淀的菌体混匀，用高温灭菌后的涂布器将混匀后的菌体均匀的涂布在所述氨苄霉素固体抗性培养基平板上，用封口膜封好，倒置平板于37℃培养箱中静止培养过夜。

第二天从LB固体培养基平板上分别挑取5个单菌落于500μl所述氨苄霉素液体抗性培养基中，分别编号1-5，37℃，180rpm/min震荡培养4h，PCR检测，PCR体系和反应程序同步骤4。5个阳性克隆子的检测结果如图2B所示。挑选2号菌液的PCR扩增产物回收，并连接至pMD18-T载体，阳性克隆送去Takara公司进行测序。测序结果经BioXM 2.6处理得到Zm-Prx5的ORF序列，其中ATG为起始密码子(SEQ ID NO.1下划线碱基)，终止子为TAG(SEQ ID NO.1下划线碱基)，编码区全长486bp，结果如SEQ ID NO.1所示：

ACCACCCCACCCATTCACTCGCGTGCGCTCCCTCGCCGCCCCAGTTCCCCACCCCCTGCTCACCCACCCGTCCCCTCCTGCTCGCCCATGGCTCCCATCGCTGTCGGCGACGCCCTCCCCGACGGCCAGCTCGGGTGGTTCGACGAGAACGACCAGCTGCAGCAGGTCTCCGTCCACGCGCTCGCCGCCGGCAAGAAGGTCATCCTCTTCGGCGTCCCCGGCGCCTTCACCCCGACCTGCAGCAACCAGCATGTGCCAGGCTTCATCACACAGGCTGAGCGGCTCAAAGCCAAGGGTGTAGACGAGATCCTGCTTATCAGCGTTAACGACCCCTTCGTCATGAAGGCGTGGGCGAAGACCTACCCCGAGAACAAGCACGTGAAGTTCCTCGCCGACGGATCTGGAGCGTACACCAAGGCGCTCGACCTCGAGCTCGATCTCACGGACAAAGGGCTGGGCGTGCGCTCGAAGAGGTTCGCTCTCCTGGCCGACGACCTCACGGTCACCGTCGCAAACATCGAGGAAGGCGGGCAGTTCACGATCTCCGGCGCTGAGGAGATCCTGAAGGCGCTTTAGAGGCTCCGTCTCCTCTAGAAGCCGCAGCAACGATCGGTCTATAGTTTGAACTCGCCTTTGAATAACTTGTCGTTGGGCAAGGTCTAGTTCGGTGTTGTGTATGGAACGGTCGTCACTGAGTCATGCACGATTTGGTATCCGTGTTGTTTATGTTCGCCGGTTTGAGT

SEQ ID NO.1对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

为了获得Zm-Prx5的完整DNA序列，我们三对引物对步骤2提取的玉米基因组DNA进行扩增，三对引物序列分别如下：

PRX F1：5’-CCACCCCACCCATTCACTC-3’，SEQ ID NO.7所示，

PRX R1：5’-CCCCTTAACTCTCCCGTACAC-3’，SEQ ID NO.8所示；

PRX F2：5’-TGTCACGTGCACAACAACTA-3’，SEQ ID NO.9所示，

PRX R2：5’-ACTCGGTCGTTCTCTCAGGA-3’，SEQ ID NO.10所示；

PRX F3：5’-GGGATCCAAACGCCCTGTAA-3’，SEQ ID NO.11所示，

PRX R3：5’-CTGCTCAGCCTGTGTGATGA-3’，SEQ ID NO.12所示；

扩增产物经连接、转化、测序、拼接，获得了3386bp的Zm-Prx5的DNA序列，通过和其cDNA序列比对，发现Zm-Prx5基因DNA序列含有3个外显子(SEQ ID NO.6下划线部分)和2个内含子(SEQ ID NO.6非下滑下部分)，结果如SEQ ID NO.6所示。

ATGGCTCCCATCGCTGTCGGCGACGCCCTCCCCGACGGCCAGCTCGGGTGGTTCGACGAGAACGACCAG CTGCAGCAGGTCTCCGTCCACGCGCTCGCCGCCGGCAAGAAGGTCATCCTCTTCGGCGTCCCCGGCGCCTTCACCCC GACCTGCAGGTCCCTACGCCCTGTCCCCTGCCCCGTCTCTTCCTCCCACTCTCTCGGAGATCTCCGAGCCTTTTGGCCCCTGTGTTTTGGGGGAGAACGGTCTCGGTCGGTTCGGCGGGCGGTTATATGGGCTCTCTTGGGATTAGTTCCAGTCCGGATTCGGAATGAATACTAGTGGTTTAGTTTTGAGCAACAGATCTACGAGGAAAAAATTGGGCGGGGGTGGGGGTTGAGTTTTTTTAGCCATGCCAGCTGCGCTTTCTGCTGCAAGTGGGTATCCGGCAGAGAAGAGCAACCATGCTTGTGCGCTGAGAGGATCGTGAAATAGTCTGGCCTTAAATTGCAGCACAACCGGTTCCACCTCCTAGTCAGCGTCATGCGCGTTGCTGGCAGTAAGGAGCGGAACCTCTCAACGTTGGGTCAGCAAGAAAACCACGGCCGTCAAGTGGAGGGAGGGGTCTATGGACGCAGGGGCGGAGCCAGAATTATGTTATATGAGGGGCCCAGCAAATTTATCAAATCCTATAACGCACCGTTTGGATCATTGGAATTGAATTTCATTCTAATAACGCCCCGTTTGGATCACTGGAATTGAATTCCATTCTAATAATAGTAATTTAGGCATATATCAATTAAGCTAATTCACTTTTATACAAAATATATTTGTATACTCTTATTAGCAAGATGTCCTAGATATTTATGTGCTACATTTTTACTATAGAGTAGTAGAACGAAGAGTGTCATGTAAGTTACAGATTAGAAACAAATTCTAATCATGCATAAAATCATTTCCTATCCTCCACCCTATGAATTTGAGATAGGCTTATATCTGAATTTTGGAAAATGGTGGAATGCCAAATTCCAAACTAAATAAGTTACTTTATTGAGTGAATTCCAATTCCTTTAAAATGAAGGGATCCAAACGCCCCGTAATAGTAATTTAGCCATATACCAATTAAGCTAATTCGGTTTTATGCAAAATATGTCTGTATACTATTATTAGCAAGATGTCAGAGATATTTATTTGCTATATTTTTACTATAAAGGAGTGAGTTGAAGAGCGTCCTATAAGTTATAGAGTAGAAACAAATTCTACTAATAAATAAAATTATTTTTCATCTTCCACCCCATGAATTTGTGATAGGCTTATATCTGAACTTTAGAAACTGGTGGAATGTCAAATTCCAAGCTAAATAGGTTACTTTATTAAGTGAATTCAATTCCTCTAAAATAAAGGGATCCAAACGCCCTGTAAGGTACAAAATATAATAGGATATATACACATGTATATACTAATTTGCGTATATCAATAAATTATTAAAAAAAATACTTACACCATATAATTGTAAATTAATTAATTCCAACAGAGATCAAAATAATTAGCCTGTACGATGATCGACCAAATTAAAAGCTTCGATTATATTATGAGTCATAGTTGTCAATTCTATATCAATATAGATCGATGATCAAGTAACTTTACATAAAAACTTTACATAAAATCATCTACCATTTTATTTCGTAGATGTGCTTTGATAAGTTTTGTAGCTAAAAGGCTCTCTCAATGGTTGCAGTTGAGATTAGAAGGGTGATCATTAATCTTAATAATCCGTAAACCATTTGATACATGGAACTTTTACACAATTTAAGATGGTTTTTTACTAAATTGGTAAGTGATCGTAATGTATTTGGCTCTAGATGGTTGTATAATCAAGGTGAAACATCAAATTTGTCACGTGCACAACAACTATTTGGTGACAACATTGGACTGAAATTCGTCGATTTTATTATTAGAAACGAATTTGATGCTTCAAATTTTGCAACAAAATTTTAGTTGGATAGAGAAATTTATTTTAACCAAAGAAACTTTTATGTTTCATAGTATGTGTACGGGAGAGTTAAGGGGGGCCAAGGTCCCTGACCCTTGTCTCTATCTTCTTAATATTTATCTAAAACGCAGTCCTCCTGCGTTTTTCGAGAAAAAAGGCCCCTGCCCCCTTGCTCCGCCCCTGTATTGAGGCGCTATTCTGAACCTCTAAACTACTAATAGTTAGCTGCTAAAATTAGCTGAGTGATTTAGAACATGTCAGCTAATTGTTAGTTATGCCTCTCAAATAGCATAGCTATTAGTTGTTAGCTGCTCCAACCCACCCAAAACCAGCTAATGACTTATTAGTTGACTAACAATTAGGTGTTGTTTGGTTCATATATTTGTAACGTAATGGGTAGCCGATAACTTTACATCATGTTTTTTTAAGTCCAACCATAATCAGATATCACACTAGGGACTAATATCGACATATTCAAAGTTTCAAACTTGTTACCACTGGTACTCGGGTGTGAACCATTTCCATTTACGTTACATTTCGTGAACCAAACAACACCTTAGCTCTAGAGGCTTGGAACAGGTCTTAGTTCGCCCAACTGTACATGCAACTTGAATAAGGACTGCGATTGTTGAGATCTGAGCCTTCAAGCAGCACCCATCCCACAAACGATGGGAAGAGAAAGTGTCGCGCATGTAGAAAGATCCGCATCTTCAGTGGAAACCACGGCCCCCTCCCAATTAATGGATTGTGATTGTGATTGTGTAGGCAGGTCCTTCTTGATTAATTGTCCCTTTACAGACCAGTGTATTTTTCATGCATTGTAGCTTTCCTCTTGTAGCTACTGAATTTTATCTAGTCTAACTACAGCCCATGATTCCAGTTTATAGTGTGAACAAAAGGTATTATCTCTTGTTTTGGTTATTTACGGATCATAGCTAGTTTGAGTTAGTGCTTATTACTCCTCTATTCCAAATTGTAAGCCGTTTTGGGTTTTCTAGGTGCATAGCAAAGGCGCATAGATATACATTATTGTCTATACACGCAGTAAAAAGTAAAAAGTATATGTATATAAAAAGGTCAGAACGGCATACCAATTTTGGAATGAAAAGGGAGTACTAACCTAAAATTGCTTAGCTGCTTTAGTTCGAGAAGCTCAATGGAAAATTGCAAACTACTTAAAATCTAAAAGGATTAGATTTGAAGGTAAATTCCACTAACCGAAGCCAGTAGTTTTGTTGCTTCCTATATCTCTGAAATCTTTCTACTGTTCTGTGAAAAGCTGAAGCACTCATGCTGTCTCTATTCCGTGCGTGTCTTCTATGTTCATAGCA ACCAGCATGTGCCAGGCTTCATCACACAGGCTGAGCAGCTCAAAGCCAAGGGTGTAGACGAGATCCTGCTTATCAGC GGTACGTTTCCAGCATATGTTTGCCTGTCTGTCTTTTTTTTTTTTGCTTATTTCTTCATCGTCAAATGTTTAAAGCTTAAAACAAAAGCAAAATCCTGACCTACTATCCTGTTTTACACGGACTGAATACCATCAGTTTGCCATGTTGCGCGTGTATGGCCTCCTCGACCAAAAGCAGCTAGTAGGCCAGCCAGAGCCAGATCATGACAGAACTTGTTTCCGCTGTGACATGCAGTTAACGACCCCTTCGTCATGAAGGCGTGGGCGAAGACCTACCCCGAGAACAAGCACGTGAAGTTCCTCGCCGA CGGATCTGGAGCGTACACCAAGGCGCTCGACCTCGAGCTCGATCTCACGGACAAAGGGCTGGGCGTGCGCTCGAAGA GGTTCGCTCTCCTGGCCGACGACCTCACGGTCACCGTCGCAAACATCGAGGAAGGCGGGCAGTTCACGATCTCCGGC GCTGAGGAGATCCTGAAGGCGCTT

为了验证Zm-Prx5基因是能够鉴定玉米茎腐病的分子标记，我们进行了如下实验：

实施例2制备Zm-Prx5转基因株系

利用所述分子标记Zm-Prx5基因构建能够稳定表达Zm-Prx5的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米茎腐病抗性的阳性转基因株系。具体步骤如下：

S1，制备农杆菌感受态细胞、Zm-Prx5基因溶液

取农杆菌GV3101(市售)单菌落于3ml的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液2ml接种于100ml YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5-0.8(约3-4h)；4℃，5000rpm/min离心10min，收集菌体；加40ml预冷的50mM CaCl₂溶液，轻轻悬浮农杆菌细胞，4℃，5000rpm/min,离心10min收集沉淀；加40ml预冷的50mM CaCl₂溶液，轻轻悬浮农杆菌细胞，4℃，5000rpm/min,离心10min收集沉淀；加入5ml预冷的含50mM CaCl₂悬浮细胞，加体积分数7％DMSO(350μl)，得到农杆菌感受态细胞；每管200μl分装农杆菌感受态细胞，液氮速冻后于-80℃保存备用。

S2，Zm-Prx5过表达载体的构建

根据实施例1中Zm-Prx5基因的ORF序列(SEQ ID NO.1)设计过表达载体引物，如下：Zm-Prx5R7：5'-ACCCATGGATGGCTCCCATCGCT-3'，如SEQ ID NO.13；Zm-Prx5F7：5'-ACAGATCTCTAAAGCGCCTTCAG-3'，如SEQ ID NO.14。Zm-Prx5R5引物中CCATGG为NcoI酶切位点，AGATCT为BglⅡ，AC为保护碱基。Zm-Prx5F5引物中下划线的是BglⅡ的酶切位点。

以实施例1步骤5(4)阳性克隆子为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：阳性克隆子1μl、2×GC buffer I 12.5μl、dNTP 2.0μl、Zm-Prx5F2 1.0μl、Zm-Prx5R2 1.0μl、LA-Taq0.3μl、ddH₂O 7.2μl；总体积25μl。PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。

PCR结束后，1.5％琼脂糖凝胶检测，回收目的DNA条带，PCR产物电泳结果如图3A所示，扩增出大约为750bp左右的目的条带。

并将回收的目的DNA条带与T载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞、测序，测序正确的菌液提取质粒，得到重组质粒PMD-Zm-Prx5；将重组质粒PMD-Zm-Prx5和质粒载体pCAMBIA3301分别用NcoI和BglⅡ双酶切；酶切体系如下：质粒20μl、K Buffer 6μl、NcoI 2μl、BglⅡ2μl、BSA(牛血清蛋白)1μl、ddH₂O 19μl；37℃酶切6小时后，1.5％琼脂糖凝胶检测，分别回收750bp左右的PMD-Zm-Prx5目的片段和13000bp左右的线性的质粒载体pCAMBIA 3301目的片段。用DNA T4连接酶连接，连接体系如下：质粒载体pCAMBIA 3301目的片段3μl、PMD-Zm-Prx5目的片段10μl、T4-Ligase buffer4μl、BSA 1μl、T4DNA Ligase 2μl；16℃连接过夜(≥12h)，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，双酶切检测，测序。将检测、测序正确的质粒，构建成Zm-Prx5过表达载体，命名为pCAMBIA3301-Zm-Prx5保存备用。图3B为pCAMBIA 1304-Zm-Prx5-GFP质粒的NcoI和SpeI双酶切检测结果。

S3，用pCAMBIA3301-Zm-Prx5转化S1的农杆菌感受态细胞，得转化菌。

S4，转化菌转化玉米植株

用常规农杆菌侵染的方法将S3的转化菌导入到HiⅡ玉米幼胚培养的愈伤组织，后续进行筛选和诱导再生，获得T0代转基因材料，种植T0代转基因材料，在玉米5叶时，进行报告基因Bar基因PCR、除草剂筛选(PPT：200mg/L)结合Bar基因试纸条的方法进行阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的阳性植株，阳性植株自交获得T0代种子；种植获得的T0代转基因玉米株系，在玉米5叶时，按上述方法进行阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T0代阳性植株，阳性和阴性植株分别自交得到T1代种子。T1代种子按上述方法种植和阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T1代阳性植株，T1代阳性植株自交得到T2代种子，种植T2代种子，按上述方法对T2代植株进行阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T2代阳性植株，T2代阳性植株为稳定性高的抗玉米茎腐病植株。

阳性鉴定时，将经过除草剂筛选(PPT：200mg/L)后的转基因株系生长至第4叶时，提取玉米DNA，进行Bar基因PCR检测，Bar基因PCR所用引物如下：BarF9:5'-TGACGCACAATCCCACTATCCTTC-3'，如SEQ ID NO.15所示；BarR9:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCAGT-3'，如SEQ ID NO.16所示。

Bar基因PCR体系如下：玉米DNA 2μl、Premix Taq 12.5μl、BarF6 1μl、BarR6 1μl、ddH₂O 8.5μl。PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。

T2代转基因玉米植株PCR检测结果如图4所示，前两个泳道未检测出Bar基因，后十个泳道均检测出了Bar基因，说明243、241株系为转基因阴性株系，其他株系均为阳性。

实施例3Zm-Prx5基因能够防治玉米茎腐病的验证

步骤1，抗性鉴定所用的菌株为禾谷镰刀菌(Mapping resistance to Southernrust in a tropical by temperate maize recombinant inbred topcross population.(2007Feb；114(4):659-67)，菌株由河南农业大学植物保护学院分离纯化保存。利用PDA培养基活化禾谷镰刀菌菌种，备用；

分别种植实施例2获得的转基因株系243、241、240、242于大田中，待玉米10叶期时，准备接种。

步骤2，接种：玉米10叶期，采用针刺法进行接种，接种位置在土上第三节间，针刺深度1cm，每株注射10μl 1×10⁶的孢子悬浮液。取接种后的玉米茎秆，用工具从中间劈开，在接种后5天、10天、15天、20天分别进行病斑测量。结果如图5所示，图5是转基因株系的表型鉴定结果，第1-4行分别为243、241、240、242转基因株系，第1-4列分别为5天、10天、15天、20天病斑。240和242分别是转基因株系的阳性株系，243和241是阴性株系。从图5中可以看出，随着接种后天数的增加，所有株系的被侵染组织逐渐扩大，就株系之间的差异来说，阴性株系病斑的扩展速度明显比阳性株系大。

对病斑的差异性进行数据统计分析，结果如图6所示，转基因阴性株系和阳性株系间的差异在5天、10天、15天和20天都达到了显著水平。图12中，A、B代表0.01水平上的差异分析。

综上，我们得出如下结论：本发明通过检测Zm-Prx5转基因材料并鉴定其抗病性，结果显示在转基因阳性株系中Zm-Prx5的表达量显著高于阴性株系。人工接种茎腐病后，在Zm-Prx5转基因阳性株系中病斑的扩展速度显著小于阴性株系。对病斑大小的统计数据进行差异性分析，结果表明，Zm-Prx5转基因阳性株系中病斑的大小在接种后的各时期均显著小于阴性株系。结合转基因阳性株系和阴性株系的qRT-PCR结果我们可以发现Zm-Prx5基因可提高玉米对茎腐病的抗性，实验结果为进一步探究Zm-Prx5的功能奠定了一定的基础，同时也为玉米茎腐病的抗病性育种提供了基因资源。

需要说明的是本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 玉米Zm-Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 743

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

accaccccac ccattcactc gcgtgcgctc cctcgccgcc ccagttcccc accccctgct 60

cacccacccg tcccctcctg ctcgcccatg gctcccatcg ctgtcggcga cgccctcccc 120

gacggccagc tcgggtggtt cgacgagaac gaccagctgc agcaggtctc cgtccacgcg 180

ctcgccgccg gcaagaaggt catcctcttc ggcgtccccg gcgccttcac cccgacctgc 240

agcaaccagc atgtgccagg cttcatcaca caggctgagc ggctcaaagc caagggtgta 300

gacgagatcc tgcttatcag cgttaacgac cccttcgtca tgaaggcgtg ggcgaagacc 360

taccccgaga acaagcacgt gaagttcctc gccgacggat ctggagcgta caccaaggcg 420

ctcgacctcg agctcgatct cacggacaaa gggctgggcg tgcgctcgaa gaggttcgct 480

ctcctggccg acgacctcac ggtcaccgtc gcaaacatcg aggaaggcgg gcagttcacg 540

atctccggcg ctgaggagat cctgaaggcg ctttagaggc tccgtctcct ctagaagccg 600

cagcaacgat cggtctatag tttgaactcg cctttgaata acttgtcgtt gggcaaggtc 660

tagttcggtg ttgtgtatgg aacggtcgtc actgagtcat gcacgatttg gtatccgtgt 720

tgtttatgtt cgccggtttg agt 743

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgcggctt aattgactc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttagcaggc tgaggtctcg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaaccggtt gctattagta c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagaaaaca aaatgtctgc 20

<210> 6

<211> 3866

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 6

atggctccca tcgctgtcgg cgacgccctc cccgacggcc agctcgggtg gttcgacgag 60

aacgaccagc tgcagcaggt ctccgtccac gcgctcgccg ccggcaagaa ggtcatcctc 120

ttcggcgtcc ccggcgcctt caccccgacc tgcaggtccc tacgccctgt cccctgcccc 180

gtctcttcct cccactctct cggagatctc cgagcctttt ggcccctgtg ttttggggga 240

gaacggtctc ggtcggttcg gcgggcggtt atatgggctc tcttgggatt agttccagtc 300

cggattcgga atgaatacta gtggtttagt tttgagcaac agatctacga ggaaaaaatt 360

gggcgggggt gggggttgag tttttttagc catgccagct gcgctttctg ctgcaagtgg 420

gtatccggca gagaagagca accatgcttg tgcgctgaga ggatcgtgaa atagtctggc 480

cttaaattgc agcacaaccg gttccacctc ctagtcagcg tcatgcgcgt tgctggcagt 540

aaggagcgga acctctcaac gttgggtcag caagaaaacc acggccgtca agtggaggga 600

ggggtctatg gacgcagggg cggagccaga attatgttat atgaggggcc cagcaaattt 660

atcaaatcct ataacgcacc gtttggatca ttggaattga atttcattct aataacgccc 720

cgtttggatc actggaattg aattccattc taataatagt aatttaggca tatatcaatt 780

aagctaattc acttttatac aaaatatatt tgtatactct tattagcaag atgtcctaga 840

tatttatgtg ctacattttt actatagagt agtagaacga agagtgtcat gtaagttaca 900

gattagaaac aaattctaat catgcataaa atcatttcct atcctccacc ctatgaattt 960

gagataggct tatatctgaa ttttggaaaa tggtggaatg ccaaattcca aactaaataa 1020

gttactttat tgagtgaatt ccaattcctt taaaatgaag ggatccaaac gccccgtaat 1080

agtaatttag ccatatacca attaagctaa ttcggtttta tgcaaaatat gtctgtatac 1140

tattattagc aagatgtcag agatatttat ttgctatatt tttactataa aggagtgagt 1200

tgaagagcgt cctataagtt atagagtaga aacaaattct actaataaat aaaattattt 1260

ttcatcttcc accccatgaa tttgtgatag gcttatatct gaactttaga aactggtgga 1320

atgtcaaatt ccaagctaaa taggttactt tattaagtga attcaattcc tctaaaataa 1380

agggatccaa acgccctgta aggtacaaaa tataatagga tatatacaca tgtatatact 1440

aatttgcgta tatcaataaa ttattaaaaa aaatacttac accatataat tgtaaattaa 1500

ttaattccaa cagagatcaa aataattagc ctgtacgatg atcgaccaaa ttaaaagctt 1560

cgattatatt atgagtcata gttgtcaatt ctatatcaat atagatcgat gatcaagtaa 1620

ctttacataa aaactttaca taaaatcatc taccatttta tttcgtagat gtgctttgat 1680

aagttttgta gctaaaaggc tctctcaatg gttgcagttg agattagaag ggtgatcatt 1740

aatcttaata atccgtaaac catttgatac atggaacttt tacacaattt aagatggttt 1800

tttactaaat tggtaagtga tcgtaatgta tttggctcta gatggttgta taatcaaggt 1860

gaaacatcaa atttgtcacg tgcacaacaa ctatttggtg acaacattgg actgaaattc 1920

gtcgatttta ttattagaaa cgaatttgat gcttcaaatt ttgcaacaaa attttagttg 1980

gatagagaaa tttattttaa ccaaagaaac ttttatgttt catagtatgt gtacgggaga 2040

gttaaggggg gccaaggtcc ctgacccttg tctctatctt cttaatattt atctaaaacg 2100

cagtcctcct gcgtttttcg agaaaaaagg cccctgcccc cttgctccgc ccctgtattg 2160

aggcgctatt ctgaacctct aaactactaa tagttagctg ctaaaattag ctgagtgatt 2220

tagaacatgt cagctaattg ttagttatgc ctctcaaata gcatagctat tagttgttag 2280

ctgctccaac ccacccaaaa ccagctaatg acttattagt tgactaacaa ttaggtgttg 2340

tttggttcat atatttgtaa cgtaatgggt agccgataac tttacatcat gtttttttaa 2400

gtccaaccat aatcagatat cacactaggg actaatatcg acatattcaa agtttcaaac 2460

ttgttaccac tggtactcgg gtgtgaacca tttccattta cgttacattt cgtgaaccaa 2520

acaacacctt agctctagag gcttggaaca ggtcttagtt cgcccaactg tacatgcaac 2580

ttgaataagg actgcgattg ttgagatctg agccttcaag cagcacccat cccacaaacg 2640

atgggaagag aaagtgtcgc gcatgtagaa agatccgcat cttcagtgga aaccacggcc 2700

ccctcccaat taatggattg tgattgtgat tgtgtaggca ggtccttctt gattaattgt 2760

ccctttacag accagtgtat ttttcatgca ttgtagcttt cctcttgtag ctactgaatt 2820

ttatctagtc taactacagc ccatgattcc agtttatagt gtgaacaaaa ggtattatct 2880

cttgttttgg ttatttacgg atcatagcta gtttgagtta gtgcttatta ctcctctatt 2940

ccaaattgta agccgttttg ggttttctag gtgcatagca aaggcgcata gatatacatt 3000

attgtctata cacgcagtaa aaagtaaaaa gtatatgtat ataaaaaggt cagaacggca 3060

taccaatttt ggaatgaaaa gggagtacta acctaaaatt gcttagctgc tttagttcga 3120

gaagctcaat ggaaaattgc aaactactta aaatctaaaa ggattagatt tgaaggtaaa 3180

ttccactaac cgaagccagt agttttgttg cttcctatat ctctgaaatc tttctactgt 3240

tctgtgaaaa gctgaagcac tcatgctgtc tctattccgt gcgtgtcttc tatgttcata 3300

gcaaccagca tgtgccaggc ttcatcacac aggctgagca gctcaaagcc aagggtgtag 3360

acgagatcct gcttatcagc ggtacgtttc cagcatatgt ttgcctgtct gtcttttttt 3420

tttttgctta tttcttcatc gtcaaatgtt taaagcttaa aacaaaagca aaatcctgac 3480

ctactatcct gttttacacg gactgaatac catcagtttg ccatgttgcg cgtgtatggc 3540

ctcctcgacc aaaagcagct agtaggccag ccagagccag atcatgacag aacttgtttc 3600

cgctgtgaca tgcagttaac gaccccttcg tcatgaaggc gtgggcgaag acctaccccg 3660

agaacaagca cgtgaagttc ctcgccgacg gatctggagc gtacaccaag gcgctcgacc 3720

tcgagctcga tctcacggac aaagggctgg gcgtgcgctc gaagaggttc gctctcctgg 3780

ccgacgacct cacggtcacc gtcgcaaaca tcgaggaagg cgggcagttc acgatctccg 3840

gcgctgagga gatcctgaag gcgctt 3866

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccaccccacc cattcactc 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccccttaact ctcccgtaca c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtcacgtgc acaacaacta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

actcggtcgt tctctcagga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gggatccaaa cgccctgtaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctgctcagcc tgtgtgatga 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acccatggat ggctcccatc gct 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acagatctct aaagcgcctt cag 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgacgcacaa tcccactatc cttc 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccagaaaccc acgtcatgcc agt 23

<210> 17

<211> 162

<212> PRT

<213> 玉米

<400> 17

Met Ala Pro Ile Ala Val Gly Asp Ala Leu Pro Asp Gly Gln Leu Gly

1 5 10 15

Trp Phe Asp Glu Asn Asp Gln Leu Gln Gln Val Ser Val His Ala Leu

20 25 30

Ala Ala Gly Lys Lys Val Ile Leu Phe Gly Val Pro Gly Ala Phe Thr

35 40 45

Pro Thr Cys Ser Asn Gln His Val Pro Gly Phe Ile Thr Gln Ala Glu

50 55 60

Arg Leu Lys Ala Lys Gly Val Asp Glu Ile Leu Leu Ile Ser Val Asn

65 70 75 80

Asp Pro Phe Val Met Lys Ala Trp Ala Lys Thr Tyr Pro Glu Asn Lys

85 90 95

His Val Lys Phe Leu Ala Asp Gly Ser Gly Ala Tyr Thr Lys Ala Leu

100 105 110

Asp Leu Glu Leu Asp Leu Thr Asp Lys Gly Leu Gly Val Arg Ser Lys

115 120 125

Arg Phe Ala Leu Leu Ala Asp Asp Leu Thr Val Thr Val Ala Asn Ile

130 135 140

Glu Glu Gly Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gly Ala Glu Glu Ile Leu Lys

145 150 155 160

Ala Leu

Claims

1.一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.6所示的Zm-Prx5基因。

2.一种权利要求1所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米的总RNA备用；

步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；

步骤3，分子标记的克隆

合成引物：Zm-Prx5F1:5'-AAAACCGGTTGCTATTAGTAC-3'；Zm-Prx5 R1:5'-GAAGAAAACAAAATGTCTGC-3'；

用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer 4μl、dNTP 1μl、Zm-Prx5 F1 0.5μl、Zm-Prx5 R1 0.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H₂O 17μl；

3.根据权利要求2所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，其特征在于，将回收743bp的条带转化入大肠杆菌感受态细胞中，保存备用。

4.根据权利要求1所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用。

5.根据权利要求4所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用，其特征在于，利用所述分子标记Zm-Prx5基因构建能够稳定表达Zm-Prx5的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米茎腐病抗性的阳性转基因株系。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Zm-Prx5的过表达载体按照以下步骤构建：

合成引物，如下：Zm-Prx5 R7：5'-ACCCATGGATGGCTCCCATCGCT-3'；Zm-Prx5F7：5'-ACAGATCTCTAAAGCGCCTTCAG-3'，；

以权利要求3含有Zm-Prx5基因的大肠杆菌感受态细胞为模板进行PCR扩增，PCR结束后，琼脂糖凝胶检测，回收目的DNA条带，并将回收的目的DNA条带与T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒PMD-Zm-Prx5；

将重组质粒PMD-Zm-Prx5和质粒载体pCAMBIA 3301分别用NcoI和BglⅡ双酶切，分别回收PMD-Zm-Prx5目的片段和线性的质粒载体pCAMBIA 3301目的片段；两个双酶切产物经T4T4-DNA连接，构建成Zm-Prx5过表达载体，命名为pCAMBIA 3301-Zm-Prx5保存备用；

用pCAMBIA 3301-Zm-Prx5转化S1的农杆菌感受态细胞，得到转化菌；

将转化菌导入到玉米幼胚培养的愈伤组织，后续进行筛选和诱导再生，获得T0代转基因材料。

7.根据权利要6所述的应用，其特征在于，种植T0代转基因材料，在玉米5叶时，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的阳性植株，阳性植株自交获得T0代种子；种植获得的T0代转基因玉米株系，在玉米5叶时，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T0代阳性植株，T0代阳性植株自交得到T1代种子；筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T1代阳性植株，T1代阳性植株自交得到T2代种子，种植T2代种子，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T2代阳性植株，T2代阳性植株为稳定性高的抗玉米茎腐病植株。

8.根据权利要6所述的应用，其特征在于，阳性克隆子的PCR反应体系如下：模板1μl、2×GC buffer I 12.5μl、dNTP 2.0μl、Zm-Prx5 F2 1.0μl、Zm-Prx5 R2 1.0μl、LA-Taq 0.3μl、ddH₂O 7.2μl；总体积25μl；

PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。