CN109679916A - 一种lff1细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LFF1细胞及其制备方法。该细胞用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞后刺激PBMC，之后后采用抑制性信号分子靶点敲除进行保护，从而有效的提高T细胞抗肿瘤的能力。

Description

一种LFF1细胞
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种LFF1细胞及其制备方法。
背景技术：
慢病毒(Lentivirus，LV)为一类逆转录病毒的亚群。由HIV-1改建而来的慢病毒载体系统以其高效而稳定的基因转移效率而成为近年来研究者们的主要选择。由于LV既能感染处于分裂期的细胞，又能感染处于非分裂期的细胞，而且由LV携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力，使得目的基因可在宿主细胞内的长期而稳定表达。同时，慢病毒感染目的细胞的过程与天然HIV病毒感染细胞的过程比较相似，但慢病毒无法自我复制，具有较高的生物安全性。综上所述，与其他逆转录病毒载体相比，LV具有较高的基因转导效率，蛋白表达具有长期稳定性及较高的生物安全性。因此，以慢病毒载体为表达载体，包装为重组慢病毒后感染目的细胞促使其大量表达抗原的方法具有重大优势与意义。
目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL、等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。
现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGE A3抗原。
以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢病毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。
上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤微环境。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种LFF1细胞，该细胞用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞后刺激PBMC，之后采用抑制性信号分子靶点敲除进行保护，从而有效的提高T细胞抗肿瘤的能力。
所述LFF1细胞的制备方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测；2)将抗原表位进行多肽连接后，筛选强免疫原性的多肽进行基因合成；3)构建表达抗原表位肽的慢病毒表达质粒，并进行慢病毒包装；4)使用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞，并与PBMC共孵育得到效应细胞；5)将T细胞上的免疫抑制性信号分子进行敲除，制备得到LFF1细胞。
LFF1细胞具体制备步骤如下：
1、全外显子测序
使用人源外周血进行ctDNA测序或者以肿瘤组织进行全外显子测序和类型检测，将测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；
所述外周血也可以是市售工程细胞系，如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等，进行全外显子测序检测突变；
2、抗原表位预测
(1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；
(2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为“抗原表位”；
3、多肽链接
(1)使用软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，可以连接；IC50＜1000nM时认为是强免疫原性，不能连接；根据上述结果将抗原表位连接在一起；
(2)将连接多肽的序列还原为核酸序列；
4、慢病毒包装
(1)将上述核酸序列构建慢病毒表达质粒后，进行慢病毒包装；
(2)慢病毒转染抗原递呈细胞(APC)后，收集APC；
5、APC与PBMC共培养获得效应细胞；
6、将步骤5获得的T细胞采用免疫抑制性信号分子敲除的方法进行保护，即制备得到LFF1细胞；
所述抑制性信号分子可以是PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160或2B4(CD244)。
有益效果：
1.本发明提供的LFF1细胞，以肿瘤抗原为突变抗原，与其它组织不同，靶点专一性强，不易发生脱靶效应，安全性高；
2.本发明获得的特异性细胞比例高，通常能够识别肿瘤抗原的特异性细胞，在PBMC的分布为0.5％以下，经过LFF1方案改造的细胞，释放IFN-γ的量显著增加，可对靶细胞进行显著杀伤；
3.本发明获得的LFF1细胞由于对PD1、CTLA4、TIM3、LAG3等免疫抑制性靶点进行敲除，因此，对肿瘤的杀伤能力不受限制，杀伤效率更高。
附图说明：
图1抑制性靶点的敲除情况；
图2LDH释放试验检测杀伤效率；
图3ELISA检测细胞因子IFN-γ的释放；
图4细胞对肿瘤荷瘤小鼠的生存改善情况。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对于专用名词LFF1的解释，其中，L：慢病毒转染技术；FF：混合多肽刺激技术；1：靶点敲除保护技术。LFF1细胞表示采用上述技术联合制备获得的细胞。
实施例1
本实施例将以肺癌患者为例，提供具有针对性的LFF1细胞及其制备方法：
1.全外显子测序
1)取肺癌患者外周血，进行ctDNA的测序和HLA分型检测；
2)利用软件对测序信息进行分析：将ctDNA测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；
2.抗原表位预测
1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位”；
2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan 3.0、PickPocket、artificial neural networks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为“抗原表位”；
3、多肽链接
(1)使用软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，可以连接；IC50＜1000nM时认为是强免疫原性，不能连接；根据上述结果将抗原表位连接在一起；
此处需考虑3个预测软件的IC50计算结果，当≥2个软件计算的IC50≥1000nM时才能认为是弱免疫原性，当≥2个软件计算的IC50＜1000nM时才能认为是强免疫原性；
(2)将连接多肽的序列还原为核酸序列，并进行密码子优化和合成；
连接完成后的核酸序列如果较短(＜100bp)可以适当把氨基酸序列进行重复，但是，需要注意还原成基因序列时，应尽量避免基因序列中反向重复、直接重复和镜像重复序列的出现；
4、慢病毒包装
(1)将上述核酸序列克隆到pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP质粒中构建慢病毒表达质粒；
(2)慢病毒包装；
复苏293T细胞，传代两次后用于慢病毒包装；
细胞转染：
取一支15mL离心管(标记为A)，将400μL Lipofectamine 2000加入4mL DMEM中,轻轻混匀，室温静置培养5min；
另取两支15mL离心管(标记为B和C，其中B管为对照组，C为实验组)，加入以下试剂并轻轻地混匀，室温静置培养5min；
将A管液体平均转入到B管和C管内，轻轻混匀，室温静置培养20min；
将T175中旧的培养基倒出，使用PBS把细胞洗一遍，换成新的25ml DMEM(不含抗生素和血清)，轻轻地加入A、B或者A、C混合液，轻轻摇匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；转染6h后，吸去含有转染复合物的培养基，更换为37℃预热的新鲜培养基。培养48h，并收集。
(3)慢病毒浓缩及滴度测定
慢病毒包装成功后，收集慢病毒上清液，4℃，4000g离心10min，用0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，按照病毒上清液：浓缩试剂＝5:1的比例混合，4℃放置2h或者过夜，将孵育好的混合液于4℃，4000g离心30min，即可见管底有米白色沉淀，小心移去上清(切勿碰触沉淀物)，加入适量体积的DMEM或者PBS，轻轻吹打重悬沉淀物，按需求分装病毒，-80℃保存；
测定前一天，将生长状态良好的293H细胞消化计数后稀释至5×104/ml，加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备8-10个孔；放入37℃，5％CO2培养箱中培养；
取一定量的病毒液感染细胞，在EP管中做10倍梯度稀释；稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μL培养液，往第一个管中加入10μL病毒原液，记作100；混匀后，吸取10μL加入第二个管混匀，记作10-1；以此类推(100-10-8)，在对应细胞孔中加入10μL稀释好的病毒液并做好标记，培养48-72h后观察结果；
滴度计算：对于带有荧光标记的慢病毒可使用荧光技术法测定滴度，在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数，假设为X和Y，则滴度(TU/mL)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μL)
(4)慢病毒转染APC
使用RPMI-1640配制含有300U/ml rIL-2，10％FBS的全细胞培养基，记为RPMI-10-IL-2；使用RPMI-10-IL-2把APC细胞浓度调整到1×106/ml；表达抗原表位肽的慢病毒对APC感染的MOI＝5-20；放入37℃培养72h，收集APC。
5、APC与PBMC共培养获得效应细胞
以APC：PBMC＝1：5-20的比例混合，PBMC约为5×107，加入50mL OKM100培养基到T75培养瓶中；放入30-37℃细胞培养箱中培养14天，即可得到效应细胞。
6、将步骤5获得的T细胞采用免疫抑制性信号分子敲除的方法进行保护，即制备得到LFF1细胞；
所述抑制性信号分子是PD-1；
1)分析抑制性信号分子的外显子，在pubmed上找到基因的mRNA的CDS区，分别将每个外显子进行敲除靶点的预测；
2)设计合成sgRNA所需的正向引物和反向引物，将正向引物和反向引物1：1混合后，95℃处理5～60min，再进行缓慢降温，形成sgRNA的DNA序列；
3)将CRISPR慢病毒表达载体进行双酶切，并与sgRNA对应的双链DNA进行连接，转入克隆感受态细胞，12h后，挑取单克隆进行测序，保留测序正确的克隆；
4)提取携带sgRNA对应DNA序列的CRISPR慢病毒载体质粒，进行病毒包装；
5)以1640+10％FBS复苏PBMC，第1至4天时，进行CRISPR慢病毒感染；
6)采用上述慢病毒对T细胞感染后，在1640+10％FBS中培养0-3天即得敲除抑制性信号分子的效应细胞LFF1。
7、构建特异性抗原表达靶细胞及肿瘤模型生存实验
1)构建可以表达筛选的抗原多肽的慢病毒载体；
2)将抗原表达慢病毒载体包装成慢病毒颗粒，感染HLA配型合适的肿瘤细胞，稳定过表达特异性抗原，流式检测表达水平及表达强度；
3)稳定过表达抗原肽的肿瘤细胞系接种NGS小鼠，做异位荷瘤动物模型；将5×105表达特异性抗原的肿瘤细胞悬于100μl生理盐水中，分别皮下注射至30只NSG小鼠的右侧胁肋部皮下，同时对小鼠进行编号；
4)在肿瘤生长至100-120mm3左右时分组回输细胞，根据肿瘤体积大小，将动物模型随机分成三组，每组5-6只小鼠，一组给予安慰剂生理盐水，一组给予没有进行任何遗传操作的T细胞(对照组)1×107，一组给予LFF1细胞1×107，首次注射细胞7天后进行第二次注射，7天之后第三次注射细胞，连续观察60天，统计存活数据，绘制生存曲线。
实验结果：
1、突变位点及抗原表位预测
表1为测序检测到的突变位点及抗原表位预测结果，下划线标出的为突变的氨基酸；
表1抗原表位预测
2、抑制性靶点的敲除情况
从图1中可以看出抑制性靶点PD-1敲除前的阳性率为35.4％，使用CRISPR慢病毒敲除后，PD-1阳性率降低到0.47％，敲除效果显著。
3、LDH释放检测杀伤能力实验
构建表达预测多肽的靶细胞，使用LFF1细胞作为效应细胞，进行体外细胞杀伤实验，效靶比设置为40:1，以无处理的细胞作为对照细胞，如图2所示，结果发现，LFF1细胞可以对靶细胞进行显著杀伤。
4、ELISA检测细胞因子IFN-γ的释放
构建表达预测多肽抗原的靶细胞，将对照细胞(未经处理的细胞)或者LFF1细胞与靶细胞1:1混合，加入U型底96孔板中，共培养24h，取上清，检测上清中的IFN-γ含量。结果如图3显示，在受到靶细胞刺激后，LFF1细胞释放IFN-γ的量显著增加。与杀伤实验结果吻合。
5、肿瘤模型生存实验
动物实验分为3组，安慰剂组，注射生理盐水；对照组，注射未做处理的细胞；实验组为LFF1细胞组，结果如图4显示，LFF1细胞可以明显改善荷瘤小鼠的生存时间。

Claims (5)

1.一种LFF1细胞，其特征在于，所述LFF1细胞的制备方法，包括以下步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测；2)将抗原表位进行多肽连接后，筛选强免疫原性的多肽进行基因合成；3)构建表达抗原表位肽的慢病毒表达质粒，并进行慢病毒包装；4)使用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞，并与PBMC共孵育得到效应细胞；5)将T细胞上的免疫抑制性信号分子进行敲除，制备得到LFF1细胞。
2.如权利要求1所述的一种LFF1细胞，其特征在于，抗原表位预测的方法为：(1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；(2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为“抗原表位”。
3.如权利要求1所述LFF1细胞，其特征在于，所述患者外周血也可以是市售工程细胞系。
4.如权利要求1所述LFF1细胞，其特征在于，所述抗原表位的预测是以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，作为潜在抗原表位。
5.如权利要求1所述LFF1细胞，其特征在于，所述表面免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160或2B4(CD244)。
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Application publication date: 20190426