CN109678852B - 6-氧代六氢嘧啶衍生物、其制备方法及制药应用 - Google Patents

6-氧代六氢嘧啶衍生物、其制备方法及制药应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种6‑氧代六氢嘧啶衍生物，还公开了所述衍生物的制备方法，以及其在制备预防和治疗由HIF‑1α不足引起的缺血导致脑中风、脑缺血、贫血等疾病的药物中的应用。本申请制备所得衍生物能够与HIF‑1α竞争性结合VHL蛋白，对HIF‑1α/VHL蛋白‑蛋白相互作用有明显的竞争性抑制作用，从而释放出HIF‑1α，对由HIF‑1α不足引起的脑缺血具有一定的作用，对于治疗和预防脑缺血，脑中风以及贫血等疾病具有潜在的药用作用。

Description

6-氧代六氢嘧啶衍生物、其制备方法及制药应用
技术领域
本发明属于药物化学技术，特别是涉及一种6-氧代六氢嘧啶衍生物、其制备方法及制药应用。
背景技术
脑缺血后，缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factors-1α，HIF-1α)通过激发其靶基因-血管内皮生长因子(VEGF)的表达，进而促使新生血管生成，改善脑血流动力学，使脑缺血得以迅速恢复；低氧时HIF-1α的表达还使葡萄糖运输酶-1等的表达水平增加，从而促进葡萄糖的转移、利用及酵解，为脑组织提供能量以减轻脑损伤；最后，HIF-1α还可以通过促进促红细胞生成素(EPO)的表达发挥脑保护作用。
HIF-1属于基本的螺旋-环-螺旋(basic helixloop-helix，bHLH)结构转录因子家族成员，三种α类似物(HIF-1α，HIF-2α，HIF-3α)和HIF-1β，都含有bHLH和PAS结构域。HIF-1α和HIF-2α具有相似的氨基酸序列，它们都有两个不同的TADs(C-TAD和N-TAD)；HIF-3α只有N-TAD。HIF-1α由α亚基、β亚基以异源二聚体形式组成α亚基是一个氧敏感亚基，在低氧的条件下会被诱导表达。β亚基呈组成性表达，对氧无反应，又称作芳香烃受体核转运蛋白(ARNT)，有研究表明在ARNT缺陷的细胞中不能诱导HIF-1的激活，HIF-1α必须与HIF-1β亚基聚合形成异源二聚体才能发挥转录因子的作用。
Von Hippel-Lindau(VHL)的复合物是具有显著治疗作用的E3泛素连接酶，其包括VHL蛋白、延长因子B、延长因子C等，VHL的主要底物是HIF-1α，在低氧条件下，能够调节很多转录因子，如促血管生成生长因子、血管内皮生长因子、葡萄糖转运体、GLUT1和促红细胞生成素。在常氧条件下，羟基化的HIF-1α被VHL蛋白识别，在E3连接酶作用下泛素化，使得HIF-1α被降解，抑制转录上调，从而引起脑缺血，而此类化合物具有诱导血管生成反应作用，其能够与HIF-1α竞争性结合VHL，从而使得体内的HIF-1α释放出来，对治疗和预防HIF-1α不足引起的缺血导致的脑中风，脑缺血，贫血等医学上的应用。
WO 2013106646公开了一种新的用于治疗贫血和缺血的E3泛素连接酶抑制剂羟脯氨酸衍生物，其通式如下，其中R1-R2如WO 2013106646文中定义：
Figure BDA0001913112530000011
WO 2018051107，GB 2554071公开了一种新的氟羟脯氨酸肽衍生物，其通式如下，其中R1-R2如WO 2018051107，GB 2554071文中定义：
Figure BDA0001913112530000021
尽管目前已公开了一系列的骨架结构，但是在治疗脑中风、贫血、脑缺血方面还是以羟脯胺酸为骨架做修饰，结构类型较为单一、活性一般。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种6-氧代六氢嘧啶衍生物，还提供了该衍生物的制备方法，以及其用于制备HIF-1α/VHL蛋白-蛋白抑制剂、由HIF-1α不足引起的缺血导致脑中风、脑缺血、贫血等药物中的用途。
技术方案：本发明公开了一种如通式I所示的化合物，
Figure BDA0001913112530000022
其中，R1选自芳基、杂芳基、烷基、烷氧基、卤素或羟基；
R2选自芳基、杂芳基、烷基或烷氧基；
R3选自4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基、1，1’-联苯基-4-甲氨基胺、(4-羟基苯基)甲胺、(4-乙基苯基)甲胺、苄胺、(4-异丙基苯基)甲胺、(4-叔丁基苯基)甲胺、(4-吗啉苯基)甲胺、环丙胺、正丁胺、对氨基苄胺、对氟苄胺或对甲氧基苄胺。
优选的，R1为叔丁基，所述化合物I如下所示，
Figure BDA0001913112530000023
其中，R2选自芳基、杂芳基、烷基或烷氧基；
R3选自4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基、1，1’-联苯基-4-甲氨基胺、(4-羟基苯基)甲胺、(4-乙基苯基)甲胺、苄胺、(4-异丙基苯基)甲胺、(4-叔丁基苯基)甲胺、(4-吗啉苯基)甲胺、环丙胺、正丁胺、对氨基苄胺、对氟苄胺或对甲氧基苄胺。
进一步优选的，本申请所述化合物选自化合物1-20：
Figure BDA0001913112530000031
本申请所述化合物的制备方法，反应式如下：
Figure BDA0001913112530000032
在HBTU，DIPEA的条件下，通式(I-A)和通式(I-B)化合物反应获得通式(I)的化合物。
其中，通式(I-A)化合物的制备方法为：
Figure BDA0001913112530000033
由天冬酰胺以水做溶剂，直接加甲醛反应，再在碱性条件下，与3，3-二甲基丁酰氯反应等步骤获得。
当R1为叔丁基时，通式(I-A)化合物的制备方法为：
Figure BDA0001913112530000041
由天冬酰胺以水做溶剂，直接加甲醛反应，再在碱性条件下，与3，3-二甲基丁酰氯反应获得。
本申请所述化合物的的互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式或其可药用的盐也在本申请的保护范围内。
本申请还公开了一种药物组合物，包括上述通式I所示的化合物和药学上可接受的载体。
本申请所述化合物在制备治疗或者预防脑缺血、脑中风、贫血的药物中的应用，特别是在制备治疗或者预防由HIF-1α减少引起的缺血所致的脑缺血、脑中风、贫血的药物中的用途，也在本发明的保护范围内。
本申请所述化合物通过与HIF-1α竞争性结合VHL蛋白的作用，具有诱导血管生成反应作用，对于治疗脑中风、贫血、脑缺血等均有作用。
除非另有说明，否则下列用在说明书和权利要求中的术语具有下述含义。
术语“烷基”是指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2，2-二乙基戊基、正癸基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、硫醇、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基中的一个或多个取代基所取代。
术语“芳基”指6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，其为具有共轭的π电子体系的多环(即其带有相邻对碳原子的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
Figure BDA0001913112530000051
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、硫醇、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基中的一个或多个取代基所取代。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
Figure BDA0001913112530000052
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、硫醇、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基中的一个或多个取代基所取代。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、硫醇、羟基、氨基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基中的一个或多个取代基所取代。
术语“环烷烃”指完全饱和的并且可以以呈单环、桥环或螺环存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环。环烷基非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基等。
术语“羟烷基”指被羟基取代的烷基，其中烷基如上所定义。
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”指-NH2。
术语“氰基”指-CN。
术语“硝基指-NO2。
术语“氧代基”指＝O。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“可药用盐”是指本发明化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。
术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；
(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
在本申请中，除非特别定义，所采用的缩略语的含义如下所示：
min是指分钟；h是指小时；d是指天；℃是指摄氏度；V:V是指体积比。
DCM是指二氯甲烷；EA或EtOAc是指乙酸乙酯；PE是指石油醚；MeOH是指甲醇；DMF是指N，N-二甲基甲酰胺；DMSO是指二甲基亚砜；TEA是指三乙胺；Pd(OAc)2是指醋酸钯；TFA是指三氟乙酸。
TLC是指薄层色谱；M是指摩尔浓度单位mol/L，例如2M是指2mol/L；mM是指摩尔浓度单位毫摩尔/升，例如2mM是指2mmol/L；N是指当量浓度，例如1N HCl是指浓度为1mol/L的盐酸；2N NaOH是指浓度为2mol/L的氢氧化钠；Et是指乙基；Me是指甲基；Ac是指乙酰基；DIPEA是指N，N-二异丙基乙胺；HBTU是指O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟硼酸酯；KOAc是指醋酸钾。
有益效果：本发明所述的新的6-氧代六氢嘧啶衍生物，可以作为制备HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用抑制剂的用途和在制备治疗由HIF-1α不足引起的缺血导致脑中风、脑缺血、贫血等药物中的用途，具有潜在药用价值。
附图说明
图1是TTC染色观察实施例1化合物和实施例2化合物对大脑梗塞组织体积大小的影响；
图2是实施例1化合物和实施例2化合物对海马和MDA表达水平的影响效果图；
图3是阳性药3JF、实施例1化合物和实施例2化合物对HIF-1α蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
本发明已知的起始原料可以采用或者按照本领域已知的方法来合成，或者购买自安耐吉、阿拉丁等公司。
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：石油醚/乙酸乙酯体系，D：丙酮，E：二氯甲烷/丙酮体系，F：乙酸乙酯/二氯甲烷体系，G：乙酸乙酯/二氯甲烷/正己烷，H：乙酸乙酯/二氯甲烷/丙酮，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(移R以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Ascend核磁共振仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用Agilent1100型液质联用。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶300-400目硅胶为载体或100-200目酸性或碱性氧化铝。荧光偏振测试所用的蛋白均由南京弼马温生物医药技术有限公司；荧光偏振实验检测用仪器为SpectraMaxRM5酶标仪。
实施例1
3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000081
步骤1：4-(4-甲基噻唑-5-基)苯甲腈
于50ml单口瓶中加入KOAc(3.2g)和4-甲基噻唑(3.24g)，加入15ml DMF溶解，加入对溴苯腈(3.0g)，加入Pd(OAc)2(16mg)，外浴加热回流搅拌，10h后，TLC检测原料反应完全，过滤，加水50ml，用EA(20mL×3)萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得3.2g标题化合物。
步骤2：(4(4-甲基噻唑-5-基)苯基)甲胺
于50ml三颈瓶中加入4-(4-甲基噻唑-5-基)苯甲腈(2.0g)，加入15ml的甲醇溶解，加入雷尼镍，用氢置换3次，加入氨水，25℃搅拌过夜，TLC检测，反应完全。过滤，减压浓缩得标题化合物。
步骤3：6-氧代六氢嘧啶-4-羧酸
于50ml的单口瓶中加入D-天冬氨酸(5.0g)，升温至45℃，加入甲醛(2.5ml)，维持20min。TLC检测反应完全，加入甲醇(3滴)，0℃保持2h，有白色固体析出，抽滤，50℃烘干，得标题化合物。
步骤4：3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸
于50ml单口瓶中加入6-氧代六氢嘧啶-4-羧酸(3.0g)，加入15ml DCM溶解，加入三乙胺(4.2g)，在冰浴中加入3，3-二甲基丁酰氯，室温搅拌过夜。TLC检测，反应完全，浓缩反应液，柱层析(DCM:MeOH＝20:1(V:V))，得标题化合物。
步骤5：3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入上述制得的(4(4-甲基噻唑-5-基)苯基)甲胺(130mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得190mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：99.65％)。
LC/MS：m/z 428.19[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.06(s,1H),8.63(s,1H),7.83-7.69(m,2H),7.56-7.42(m,2H),6.03(s,1H),5.38(s,1H),4.82(s,1H),4.63(d,J＝5.0Hz,2H),4.50(s,1H),2.98(s,1H),2.67-2.26(m,6H),2.36(s,3H),2.36(s,3H),0.91(s,9H)。
实施例2
N-([1，1'-联苯基-4-甲基)-3(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺]
Figure BDA0001913112530000091
步骤1：N-([1，1'-联苯基-4-甲基)-3(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺]
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入1，1'-联苯基-4-甲氨基胺(114mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得185mg油状物，HPLC制备得35mg标题化合物(HPLC纯度：97.6％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 408.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.27(s,1H),7.81-7.68(m,2H),7.67-7.52(m,2H),7.52-7.45(m,4H),7.40(s,1H),6.25(s,1H),5.05(s,1H),4.81(d,J＝43.2Hz,2H),4.59(s,1H),4.51(s,1H),3.04(s,1H),2.52(s,1H),2.39(s,2H),0.85(s,9H).
实施例3
3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-羟基苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000101
步骤1：3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-羟基苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(4-羟基苯基)甲胺(78.12mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得170mg油状物，HPLC制备得25mg标题化合物(HPLC纯度：96.4％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 347.4[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35(s,1H),7.11-6.97(m,2H),6.78-6.64(m,2H),6.25(s,1H),5.29(s,1H),5.06(d,J＝2.5Hz,2H),4.86(s,1H),4.55(s,1H),4.48(s,1H),3.05(s,1H),2.52(s,1H),2.37(s,2H),0.84(s,9H).
实施例4
3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-乙基苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000102
步骤1：3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-乙基苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(4-乙基苯基)甲胺(89mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得185mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：99.8％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 360.3[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.25(d,J＝7.4Hz,2H),7.07(d,J＝7.5Hz,2H),6.01(s,1H),5.39(s,1H),4.77(t,J＝36.8Hz,1H),4.61(s,1H),4.48(s,1H),2.96(dd,J＝12.5,3.7Hz,1H),2.68(d,J＝5.6Hz,2H),2.47(s,2H),1.25(s,3H),0.88(s,9H).
实施例5
N-苄基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000111
步骤1：N-苄基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入苄胺(65mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得190mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.1％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS m/z 322.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),7.32-7.22(m,5H),6.01(s,1H),5.38(s,1H),4.82(s,1H),4.62(d,J＝6.7Hz,2H),4.49(s,1H),2.97(s,1H),2.54(s,1H),2.46(s,2H),0.88(s,9H).
实施例6
3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-异丙基苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000121
步骤1：3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-异丙基苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(4-异丙基苯基)甲胺(95mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得190mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.2％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 374.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),7.26-7.10(m,4H),6.02(s,1H),5.38(s,1H),4.82(s,1H),4.63(d,J＝13.7Hz,2H),4.48(s,1H),2.95(d,J＝0.8Hz,2H),2.55(s,1H),2.46(s,2H),1.25(s,6H),0.88(s,9H).
实施例7
3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-吗啉苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000122
Figure BDA0001913112530000131
步骤1：3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-吗啉苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺的合成
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(4-吗啉苯基)甲胺(85mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得190mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：99.7％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 355.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),7.20-7.06(m,2H),6.81-6.66(m,2H),6.01(s,1H),5.36(s,1H),4.82(s,1H),4.62(s,1H),4.50(s,1H),4.38(s,1H),3.86-3.82(m,4H),3.43-3.39(m,2H),3.28-3.24(m,2H),2.96(s,1H),2.53(s,1H),2.46(s,2H),0.88(s,9H).
实施例8
N-(4-叔丁基-苄基)-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000132
步骤1：3-(3，3-二甲基丁酰基)-N-(4-吗啉苄基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺的合成
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(4-叔丁基-苯基)甲胺(105mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得200mg油状物，HPLC制备得45mg标题化合物(HPLC纯度：98.9％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS m/z 388.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(s,1H),7.31-7.17(m,4H),6.07(s,1H),5.38(s,1H),4.84(s,1H),4.62(d,J＝12.1Hz,1H),2.96(s,1H),2.57(s,1H),2.25(s,2H),1.36(s,9H),1.02(s,9H).
实施例9
N-环丙基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000141
步骤1：N-环丙基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入环丙胺(38mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得150mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：94.9％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 282.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.92(s,1H),6.26(s,1H),5.11(s,1H),4.82(d,J＝60.4Hz,2H),3.09(s,1H),2.81(s,1H),2.51(s,1H),2.42(s,2H),1.00(s,9H),0.94-0.88(m,2H),0.69-0.63(m,2H).
实施例10
N-丁基-3-(3，3-二甲基丁烷基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000142
Figure BDA0001913112530000151
步骤1：N-丁基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入正丁胺(48mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：99.4％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 298.0[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(s,1H),6.28(s,1H),5.33(s,1H),4.81(d,J＝52.6Hz,2H),3.28(s,1H),3.16(d,J＝17.7Hz,2H),2.58(s,1H),2.41(s,2H),1.57(s,2H),1.44(s,1H),1.04(s,9H),0.98(s,3H).
实施例11
N-(氨基苯)-3-(3，3-二甲基丁烷基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000152
步骤1：N-丁基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入叔丁基(4-(氨甲基)苯基)氨基甲酸酯(135mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物。
步骤2：将上一步中的油状物加入50ml圆底烧瓶中，加入二氯甲烷：三氟乙酸3：1进行脱Boc保护，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.1％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 346.4[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),7.15–7.00(m,2H),6.47–6.33(m,2H),6.02(s,1H),5.38(s,1H),4.84(s,1H),4.61(s,1H),4.48(s,1H),4.35(s,1H),3.70(s,2H),2.98(s,1H),2.55(s,1H),2.25(s,2H),1.04(s,9H).
实施例12
(4-(3-(3-二甲基丁酰基)6氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺基)甲基)苯甲酸
Figure BDA0001913112530000161
步骤1：(4-(3-(3-二甲基丁酰基)6氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺基)甲基)苯甲酸
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入苯甲酸苄胺(136mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：97.3％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 376.43[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.76(s,1H),8.05–7.91(m,2H),7.48–7.33(m,2H),6.02(s,1H),5.37(s,1H),4.84(s,1H),4.61(d,J＝2.1Hz,2H),4.49(s,1H),2.96(s,1H),2.56(s,1H),2.26(s,2H),1.05(s,9H).
实施例13
3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-甲氧基苄基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000171
步骤1：3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-甲氧基苄基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入4-甲氧基苄胺(103mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.4％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 362.4[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),7.19-7.05(m,2H),6.93-6.79(m,2H),6.07(s,1H),5.38(s,1H),4.85(s,1H),4.62(d,J＝18.3Hz,2H),4.46(s,1H),3.86(s,3H),2.96(s,1H),2.57(s,1H),2.27(s,2H),1.01(s,9H).
实施例14
3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-氟苄基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000172
Figure BDA0001913112530000181
步骤1：3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-氟苄基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入对氟苄胺(97mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.2％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 350.41[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(s,1H),7.38-7.34(m,2H),7.09-7.03(m,2H),6.07(s,1H),5.38(s,1H),4.85(s,1H),4.62(d,J＝14.4Hz,2H),4.47(s,1H),2.96(s,1H),2.57(s,1H),2.27(s,2H),1.02(s,9H).
实施例15
N-(1，3-二氢异丁苯甲烷-5-基)甲基3-(3，3-二甲基丁烷基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000182
步骤1：N-(1，3-二氢异丁苯甲烷-5-基)甲基3-(3，3-二甲基丁烷基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入二氢异苯甲烷-5-基甲基胺(104mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：96.7％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 374.5[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),7.32(s,1H),7.20(d,J＝17.1Hz,2H),6.07(s,1H),5.38(s,1H),4.85(s,1H),4.73(d,J＝9.5Hz,4H),4.57(d,J＝66.5Hz,2H),4.43(s,1H),2.96(s,1H),2.57(s,1H),2.27(s,2H),1.01(s,9H).
实施例16
N-(4-(二甲氨基)苄基)-3-(3,3-二甲基丁酰基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000191
步骤1：N-丁基-3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入4-(氨甲基)-N，N-二甲基苯胺(125mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.2％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 375.5[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),7.18-7.03(m,2H),6.75-6.61(m,2H),6.01(s,1H),5.37(s,1H),4.82(s,1H),4.62(s,1H),4.49(s,1H),4.36(s,1H),3.04(s,6H),2.97(s,1H),2.53(s,1H),2.46(s,2H),0.89(s,9H).
实施例17
N-(3,3-二甲基-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丁基)-3-(3,3-二甲基丁酰基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000201
步骤1：N-(3,3-二甲基-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丁基)-3-(3,3-二甲基丁酰基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(3,3-二甲基-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丁基)-胺(148mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：96.2％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 499.7[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.09(s,1H),8.27(s,1H),7.82-7.68(m,2H),7.49-7.34(m,2H),7.28-7.22(m,2H),7.21-7.11(m,3H),6.05(s,1H),5.49(d,J＝14.2Hz,2H),4.82(s,1H),4.64(s,1H),3.25(s,1H),3.07(s,1H),3.00(s,1H),2.58(s,1H),2.50(s,2H),2.35(s,3H),0.92(s,9H).
实施例18
3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(3-羟基-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丙基)-6-氧六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000211
步骤1：3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(3-羟基-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丙基)-6-氧六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入(3-羟基-1-(4-(4-methylthiazol-5-基)苯基)丙基)-胺基(165mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：98.2％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 473.6[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.09(s,1H),8.10(s,1H),7.82-7.68(m,2H),7.54-7.40(m,2H),6.09(s,1H),5.38(s,1H),4.91(d,J＝63.1Hz,2H),4.64(s,1H),3.72(s,2H),2.96(s,1H),2.57(s,1H),2.36(s,3H),2.27(d,J＝12.2Hz,3H),2.05(s,1H),1.12(s,1H),1.03(s,9H).
实施例19
3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2-苯基乙基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000212
Figure BDA0001913112530000221
步骤1：3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2-苯基乙基)-6-氧代氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)-2-苯基乙基(116mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：96.4％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 519.7[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.08(s,1H),8.24(s,1H),7.83-7.68(m,2H),7.56-7.42(m,2H),6.03(s,1H),5.37(s,1H),4.89(s,1H),4.83(s,1H),4.62(s,1H),2.96(s,1H),2.56(s,1H),2.35(s,3H),2.30(s,2H),2.02(s,1H),1.84(s,1H),1.34(s,1H),1.06(s,9H),0.97(s,3H).
实施例20
3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丁基)-6-氧代六氢嘧啶-4-甲酰胺
Figure BDA0001913112530000222
步骤1：3-(3,3-二甲基丁酰基)-N-(1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丁基)-6-氧六氢嘧啶-4-甲酰胺
于25ml的单口瓶中加入上述制得的3-(3，3-二甲基丁酰基)-6-氧六氢嘧啶-4-羧酸(150mg)，加入5ml的DMF，加入HBTU(250mg)，加入1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)丁烷-1-胺(105mg)，加入DIPEA(240mg)，室温搅拌3h，LC-MS检测反应完全。加入15ml的水，水相用EA(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液50ml洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩得160mg油状物，HPLC制备得30mg标题化合物(HPLC纯度：99.0％)。
其余的反应步骤参照实施例1中的合成方式制得。
LC/MS：m/z 471.6[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.11(s,1H),8.97(s,1H),7.87-7.72(m,2H),7.58-7.44(m,2H),6.29(s,1H),5.41(s,1H),5.01(s,1H),4.79(d,J＝46.4Hz,1H),3.21(s,1H),2.69(s,1H),2.61(s,1H),2.47(s,2H),2.36(s,3H),2.02(s,1H),0.95(s,9H),0.90(s,9H).
生物学评价
测试例1、本发明化合物对HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用的的抑制作用的测定。
本发明的化合物对HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用的抑制作用采用荧光偏振实验进行测定：在384孔板(coring 3575)中依次加入终浓度是450nmol/L的VCB蛋白9μL、100.00mmol/L→25.00mmol/L→6.25mmol/L→1.56mmol/L→390.63μmol/L→97.66μmol/L→24.41μmol/L→6.10μmol/L→1.53μmol/L→0.38μmol/L→0.095μmol/L→0.023μmol/L→0.0059μmol/L14个梯度的上述实施例制备所得化合物2μL以及终浓度是450nmol/L的探针(FAM-DEALA-Hyp-YIP)，室温孵育1小时后，利用酶标仪检测其荧光偏振值。空白孔为只含有FAM-DEALA-Hyp-YIP探针的对照，阴性孔为只含有FAM-DEALA-Hyp-YIP探针和VCB蛋白的对照孔。用Graphpad prism软件根据化合物各浓度与相应的信号值计算化合物对HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用的抑制作用的Ki值。本发明化合物的生物活性通过以上的实验进行测定，测得的Ki值见下表1。
表1本发明化合物对HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用的抑制作用的Ki
Figure BDA0001913112530000231
Figure BDA0001913112530000241
结论：本发明实施例化合物能与HIF-1α竞争性结合VHL蛋白，对HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用有明显的竞争性抑制作用，从而释放出HIF-1α，对由HIF-1α不足引起的脑缺血具有一定的作用，对于治疗和预防脑缺血，脑中风以及贫血等疾病具有潜在的作用。
测试例2、本发明化合物在动物层面的生物机制研究
1、摘要
以大鼠为受试动物，应用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注损伤模型研究动物层面的生物学机制。
2、实验方案
2.1试验药品
实施例1化合物和实施例2化合物。
脑得生片(广东国医堂制药股份有限公司)，尼莫地平(正大青春宝药业有限公司)，阳性药3JF(参照10.1021/jm5011258文献中的方法制备所得)。
2.2试验动物
健康成年SD大鼠12只，随机分组：假手术组和缺血组。将动物分为7组，每组8只，脑得生片拆方3个组。1号拆方、2号拆方和3号拆方的给药剂量均为288mg/kg，阳性对照药为脑得生片288mg/kg，死亡的大鼠随时补充，由南京中医药大学实验动物中心提供。
2.3药物配制
称取一定量药物，加5％体积的DMSO、5％体积的吐温80和90％体积的生理盐水配制成0.2mg/mL的无色澄清透明液体。
2.4给药
SD大鼠禁食过夜后灌胃给药，给药剂量均为2.0mg/kg，给药体积均为10.0mL/kg。
3、操作
大鼠灌胃给药实施例1化合物和实施例2化合物，于复灌后1h(缺血后3h)开始灌胃给药，每天给药一次，连续给药7天，首次给药剂量为维持量的2倍，给药容积为0.5ml/100g体重。大鼠用3％水合三氯乙醛(300mg/kg)腹腔注射(ip)麻醉，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。
将大鼠麻醉，取出全脑称重。做冠状切四刀，切成五片后迅速将脑片置5ml含有1％TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30分钟，在温孵过程中每隔7～8分钟翻动一次，温孵30分钟后取出脑片，用数码相机拍照，之后用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比如下：
梗塞百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％
Western Blot:提取蛋白、电泳分离样品，结束后转移至硝酸纤维素膜，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭，分别与不同一抗反应，再和二抗反应，曝光、显影、定影，进一步分析蛋白表达水平的变化。
4、化合物在动物层面的生物机制的研究结果
4.1实施例1化合物和实施例2化合物明显缩小脑梗塞组织体积大小
由MCAO模型大鼠的TTC染色试验可以得出(图1)，MCAO与假手术组相比，可见右半脑有明显的白色的未被染红梗塞组织(p<0.01)；而实施例1化合物(100mg/kg)明显比实施例2化合物(100mg/kg)的脑梗塞组织体积小(p<0.05)。实验结果也表明，实施例1化合物和实施例2化合物对脑梗塞的改善具有剂量依赖性。
4.2对海马中SOD和MDA水平的影响
由实验结果分析可得，实施例1化合物和实施例2化合物对海马中SOD和MDA的表达影响不明显，与尼莫地平组的影响效果相近，与假手术组相比MDA的受影响程度不大，而SODSOD则在给药时略有下降。这说明，实施例1化合物和实施例2化合物并不是靠清除自由基来保护受损脑神经的。(图2)
4.3实施例1化合物和实施例2化合物能明显上调HIF-1α在缺氧细胞中的蛋白表达水平通过WB实验，图3可以得出，阳性药3JF、实施例1化合物和实施例2化合物能明显上调HIF-1α在缺氧细胞中的蛋白表达水平，并且随着计量的增加表达浓度越高。横向比较可以发现，实施例1化合物和实施例2化合物在同等给药浓度时对HIF-1α蛋白的上调效果更好。同样地，作为HIF-1α下游基因的VEGF，随着HIF-1α的增加而增多。

Claims (8)

1.一种如通式I所示的化合物，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
I，
其中，R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基；
R2选自苯基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基；
所述R2未取代或独立任选地被卤素、羟基、硝基、氰基中的一个或多个取代基所取代；
R3为4-（4-甲基噻唑-5-基）苄基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R1为叔丁基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下化合物1-20，还包括其可药用的盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
4.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，
在HBTU，DIPEA的条件下，通式（I-A）和通式（I-B）化合物反应获得通式（I）的化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，化合物（I-A）的制备方法为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，
由天冬酰胺以水做溶剂，直接加甲醛反应，再在碱性条件下，与3，3-二甲基丁酰氯反应的步骤获得。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物和药学上可接收的载体。
7.权利要求1所述化合物在制备预防和治疗脑缺血、脑中风、贫血的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述化合物与HIF-1α竞争性结合VHL蛋白，释放出HIF-1α。
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