CN109655455A - 一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109655455A CN109655455A CN201910097653.9A CN201910097653A CN109655455A CN 109655455 A CN109655455 A CN 109655455A CN 201910097653 A CN201910097653 A CN 201910097653A CN 109655455 A CN109655455 A CN 109655455A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pulvis
- cell
- tris
- chromogenic substrate
- pure water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 91
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 50
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 32
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 20
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 40
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 22
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 22
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 21
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 20
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 18
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 16
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 16
- OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 6-chloropyridine-3,4-diamine Chemical compound NC1=CN=C(Cl)C=C1N OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102100036286 Purine nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 108010009099 nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 7
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 claims description 6
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 2
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims description 2
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 claims description 2
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N1/31—Apparatus therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及使用方法。该使用方法包括：采用Tris‑Gly配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温条件下，通过电泳、短暂孵化染色、纯水脱色，即可得到动物细胞的同工酶图谱，通过与对照细胞的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。该同工酶电泳鉴定细胞种属的方法操作简单、稳定性好、实现条件温和，以上优点使该试剂盒区别于常规同工酶电泳鉴定细胞种属的方法，在动物细胞种属鉴定中，简化了传统实验步骤，降低了科研工作者的工作量，同时提高了实验结果的稳定性和重复性，降低了资源损耗，为体外培养细胞在基础研究和进一步临床研究提供技术支持，在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞学领域，尤其是涉及一种用于动物细胞种属鉴定试剂盒及其使用方法。
背景技术
细胞体外培养技术是在人工提供的条件下使细胞在生物体外生长并维持其结构和功能特性的一项生物技术。近年来，动物细胞培养技术在很多领域被广泛应用。可以在体外直接观察活细胞的形态结构和生命活动，用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究。细胞体外培养技术可用于生产病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等蛋白生物制品；获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮；检测有毒物质；用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。
但是，近年来，随着体外培养细胞在基础研究及临床应用研究中的大量应用，体外培养过程中的不同种属间的细胞交叉污染也越来越严重，因此，细胞的种属来源成为了细胞质量控制中的重要内容之一，很多研究机构和保藏中心也强调了对细胞间交叉污染检测的重要性。目前，细胞种属鉴定及排除细胞间交叉污染的方法主要有染色体分析、STR图谱、同工酶图谱。其中，染色体分析十分耗时、成本比较高、灵敏度低，STR图谱的灵敏度高，但可鉴定的种属范围窄，目前只应用于人源细胞的检测。
同工酶是生物体内催化相同反应而组成、结构及理化性质不同的酶，大部分为蛋白质，同工酶是基因编码的产物，能较好地反映种间的遗传差异，常被用于物种的分类、鉴定和亲缘关系的研究。同工酶分析技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区以酶谱的形式标记出来。不同种属来源的细胞具有不同的同工酶分布，利用电泳分离可得到它们特异性的同工酶酶谱，因此同工酶检测可作为细胞种属鉴定的依据，该技术已经广泛地应用于动物细胞的种属鉴定。但是，目前常用的同工酶电泳检测方法存在着电泳条件要求高(0～4℃)、染色液配制繁琐、聚丙烯酰胺对人体有毒等缺点，严重影响了该技术的应用和进一步推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种电泳条件要求低(室温25℃左右)、染色步骤简单、灵敏度高的试剂盒，用于同工酶电泳鉴定动物细胞的种属来源；进一步地，本发明还提供了所述检测试剂盒的使用方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒，包括：
(1)制胶粉剂；
(2)Tris-Gly电泳缓冲液粉剂；
(3)显色底物粉剂；
(4)细胞裂解液；
所述的制胶粉剂包括：EDTA 0.035～0.040g、琼脂糖0.8～0.9g，该粉剂使用时需用100ml Tris-Gly电泳缓冲液溶解混匀；
上述的Tris-Gly电泳缓冲液粉剂包括：甘氨酸7.055～7.065g、Tris粉1.5～1.6g，该粉剂使用时需用1L的水溶解混匀，pH为8.50～8.60；
所述的显色底物粉剂包括乳酸脱氢酶(LD)的显色底物粉剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的显色底物粉剂、苹果酸脱氢酶(MD)的显色底物粉剂、嘌呤核苷磷酸化酶(NP)的显色底物粉剂，其中乳酸脱氢酶(LD)的显色底物粉剂包括：乳酸钠1.08～1.15g、NAD 1.8～2.0mg、氯化钠2.5～3.0mg、MTT1.8～2.2mg、PMS 0.3～0.5mg；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的显色底物粉剂包括：G6PD 45～55mg、NADP 2.7～3.2mg、氯化镁9～13mg、MTT 1.7～2.0mg、PMS0.35～0.52mg；苹果酸脱氢酶(MD)的显色底物粉剂包括：苹果酸钠1.8mg～2.2mg、NAD 3.8～5.2mg、氯化钠2.0～2.7mg、MTT 2.1～2.5mg、PMS 0.2～0.5mg；嘌呤核苷磷酸化酶(NP)的显色底物粉剂包括：肌苷36～45mg、黄嘌呤酶1.2～1.8U、MTT 2.6～3.3mg、PMS 0.9～1.5mg；其中：LD显色底物粉剂使用时需用1.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解；G6PD显色底物粉剂使用时需用2.0mL的0.5mol/L Tris-HCl和1.2～1.5ml的纯水溶解；MD显色底物粉剂和NP显色底物粉剂使用时需用2.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解。
上述使用的0.5mol/L Tris-HCl为Tris粉3.0g，使用时需添加浓盐酸1.0～1.2ml、纯水45～50ml，并调节pH至8.0；
所述的细胞裂解液为Triton X-100，使用时用100ml Tris-Gly电泳缓冲液稀释50倍。
本发明还提供了上述动物细胞种属鉴定试剂盒的使用方法，包括：
采用Tris-Gly电泳缓冲液配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温、电压150～165V、电流52～55mA条件下，以人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929为对照细胞，分别在琼脂糖同工酶胶块两边点样，通过20～35min电泳、3～5min孵化染色、纯水脱色，即可得到哺乳动物细胞同工酶的图谱。
上述使用方法中，人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929作为对照细胞，需要使用者自己准备，收集细胞，加入等体积的上述试剂盒中的细胞裂解液后，4℃条件下裂解一段时间，将细胞裂解物置于-20℃保存备用。
上述使用方法中，所述的琼脂糖同工酶胶块制备的粉剂采用EDTA0.035～0.040g、琼脂糖0.8～0.9g，将该粉剂用100ml Tris-Gly电泳缓冲溶液溶解混匀，倒入同工酶制胶的模具中，制成所需同工酶胶块。
上述使用方法中，同工酶电泳的条件为室温、电压150～160V、电流50～55mA，电泳时间为25～30min。
上述孵化染色中，LD显色底物粉剂使用时需用1.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解，G6PD显色底物粉剂使用时需用2.0mL的0.5mol/L Tris-HCl和1.2～1.5ml的纯水溶解，MD显色底物粉剂和NP显色底物粉剂使用时需用2.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解，并保证现配现用、避光37℃孵化。
上述纯水脱色中，可用流动自来水冲洗胶块背景至透明无色，将胶块上的残留水分去除干净，拍照即可得到动物细胞同工酶的图谱，通过与对照细胞人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及使用方法，采用Tris-GLy配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温条件下，通过电泳、短暂孵化染色、纯水脱色，即可得到动物细胞的同工酶图谱，通过与对照细胞的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属，且跑出的同工酶条带与ATCC出版的《Quality ControlMethods For Cell Lines》(第二版，1992)所描述的同一物种的同工酶条带一致。本发明提供的动物细胞种属鉴定的试剂盒具有操作简单、稳定性好、实现条件温度要求低等优点。该试剂盒所用裂解液配方，可保证细胞裂解物中的乳酸脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶和嘌呤核苷磷酸化酶半年内依然有活性。以上优点使该试剂盒区别于常规同工酶电泳鉴定细胞种属的方法，在动物细胞种属鉴定中，简化了传统实验步骤，降低了科研工作者的工作量，同时提高了实验结果的稳定性和重复性，降低了资源损耗，为体外培养细胞在基础研究和进一步临床研究提供技术支持，在分子生物学领域、生命科学等领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1乳酸脱氢酶鉴定细胞系染色结果。
图2葡萄糖-6-磷酸脱氢酶鉴定细胞系染色结果。
图3苹果酸脱氢酶鉴定细胞系染色结果。
图4嘌呤核苷磷酸化酶鉴定细胞系染色结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
在以下实施例中以待检细胞一及待检细胞二细胞为鉴定对象。
实施例1
本发明一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒，采用Tris-Gly配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温条件下，通过电泳、短暂孵化染色、纯水脱色，即可得到动物细胞乳酸脱氢酶(LD)的同工酶图谱，具体实施步骤如下：
(1)将一个T25培养瓶的细胞(约6×105～1×106)收集起来，用PBS将细胞反复冲洗几次，离心将PBS去除干净，加入等体积的细胞裂解液，4℃条件下裂解一段时间，放置于-20℃备用；
(2)将试剂盒中的电泳缓冲液粉剂用1L的水溶解混匀，调节pH为8.50～8.60；
(3)将试剂盒中的制胶粉剂用100ml步骤(2)的电泳缓冲溶液溶解混匀，倒入同工酶制胶的模具中，待其凝固即可制成所需同工酶胶块；
(4)将步骤(3)配好的同工酶胶块放置于电泳槽中，待点样；
(5)将步骤(1)中的细胞裂解物在4℃、12000rpm条件下离心30s～1min，取其上清点样，点样量为1μL，共点样两次，每次点样后需静置3min，另外，点样时需设置已确定种属动物细胞系(人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929)作为对照参照；
(6)待步骤(5)完成后，向电泳槽中加入电泳缓冲液，至将胶块完全覆盖并超出胶块0.5～1cm；
(7)接通电泳槽电源，将电压控制在150～155V、电流50～53mA范围内，电泳时间28～35min；
(8)配制0.5mol/L Tris-HCl，将试剂盒中的Tris粉3.0g，添加浓盐酸1.0～1.2ml、纯水45～50ml溶解，并调节pH至8.0；
(9)将试剂盒中的LD显色底物粉剂用1.5mL步骤(8)配制的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解；
(10)将步骤(9)配制好的染色液完全覆盖在胶块上，37℃避光孵化染色1-3min；
(11)将染完色的胶块用流动自来水冲洗胶块背景至透明无色，将胶块上的残留水分去除干净，拍照即可得到动物细胞同工酶的图谱，通过与对照细胞的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。如图1所示，待检细胞一和人源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞一为人源细胞；待检细胞二和小鼠源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞二为小鼠源细胞。
实施例2
本发明一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒，采用Tris-Gly配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温条件下，通过电泳、短暂孵化染色、纯水脱色，即可得到动物细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的同工酶图谱，具体实施步骤如下：
(1)将一个T25培养瓶的细胞(约6×105～1×106)收集起来，用PBS将细胞反复冲洗几次，离心将PBS去除干净，加入等体积的裂解液，4℃条件下裂解一段时间，放置于-20℃备用；
(2)将试剂盒中的电泳缓冲液粉剂用1L的水溶解混匀，用2mol/L HCl溶液调节pH为8.50～8.60；
(3)将试剂盒中的制胶粉剂用100ml步骤(2)的电泳缓冲溶液溶解混匀，倒入同工酶制胶的模具中，待其凝固即可制成所需同工酶胶块；
(4)将步骤(3)配好的同工酶胶块放置于电泳槽中，待点样；
(5)将步骤(1)中的细胞裂解物在4℃、12000rpm条件下离心30s～1min，取其上清点样，点样量为1μL，共点样两次，每次点样后需静置3min，另外，点样时需设置已确定种属动物细胞系(人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929)作为对照参照；
(6)待步骤(4)完成后，向电泳槽中加入电泳缓冲液，至将胶块完全覆盖并超出胶块0.5～1cm；
(7)接通电泳槽电源，将电压控制在154～160V、电流52～55mA范围内，电泳时间25～30min；
(8)配制0.5mol/L Tris-HCl，将试剂盒中的Tris粉3.0g，添加浓盐酸1.0～1.2ml、纯水45～50ml溶解，并调节pH至8.0；
(9)将试剂盒中的G6PD显色底物粉剂用2.0mL步骤(8)配制的0.5mol/L Tris-HCl和1.2～1.5ml的纯水溶解；
(10)将步骤(9)配制好的显色底物完全覆盖在胶块上，在37℃下，孵化染色1-3min；
(11)将染完色的胶块用流动自来水冲洗胶块背景至透明无色，将胶块上的残留水分去除干净，拍照即可得到动物细胞同工酶的图谱，通过与对照细胞的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。如图2所示，待检细胞一和人源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞一为人源细胞；待检细胞二和小鼠源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞二为小鼠源细胞。
实施例3
本发明一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒，采用Tris-Gly配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温条件下，通过电泳、短暂孵化染色、纯水脱色，即可得到动物细胞苹果酸脱氢酶(MD)的同工酶图谱，具体实施步骤如下：
(1)将一个T25培养瓶的细胞(约6×105～1×106)收集起来，用PBS将细胞反复冲洗几次，离心将PBS去除干净，加入等体积的细胞裂解液，4℃条件下裂解一段时间，放置于-20℃备用；
(2)将试剂盒中的电泳缓冲液粉剂用1L的水溶解混匀，调节pH为8.50～8.60；
(3)将试剂盒中的制胶粉剂用100ml步骤(2)的电泳缓冲溶液溶解混匀，倒入同工酶制胶的模具中，待其凝固即可制成所需同工酶胶块；
(4)将步骤(3)配好的同工酶胶块放置于电泳槽中，待点样；
(5)将步骤(1)中的细胞裂解物在4℃、12000rpm条件下离心30s～1min，取其上清点样，点样量为1μL，共点样两次，每次点样后需静置3min，另外，点样时需设置已确定种属动物细胞系(人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929)作为对照参照；
(6)待步骤(5)完成后，向电泳槽中加入电泳缓冲液，至将胶块完全覆盖并超出胶块0.5～1cm；
(7)接通电泳槽电源，将电压控制在150～155V、电流50～53mA范围内，电泳时间28～35min；
(8)配制0.5mol/L Tris-HCl，将试剂盒中的Tris粉3.0g，添加浓盐酸1.0～1.2ml、纯水45～50ml溶解，并调节pH至8.0；
(9)将试剂盒中的MD显色底物粉剂用2.5mL步骤(8)配制的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解；
(10)将步骤(9)配制好的染色液完全覆盖在胶块上，37℃避光孵化染色3-5min；
(11)将染完色的胶块用流动自来水冲洗胶块背景至透明无色，将胶块上的残留水分去除干净，拍照即可得到动物细胞同工酶的图谱，通过与对照细胞的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。如图3所示，待检细胞一和人源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞一为人源细胞；待检细胞二和小鼠源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞二为小鼠源细胞。
实施例4
本发明一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒，采用Tris-Gly配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温条件下，通过电泳、短暂孵化染色、纯水脱色，即可得到动物细胞嘌呤核苷磷酸化酶(NP)的同工酶图谱，具体实施步骤如下：
(1)将一个T25培养瓶的细胞(约6×105～1×106)收集起来，用PBS将细胞反复冲洗几次，离心将PBS去除干净，加入等体积的细胞裂解液，4℃条件下裂解一段时间，放置于-20℃备用；
(2)将试剂盒中的电泳缓冲液粉剂用1L的水溶解混匀，调节pH为8.50～8.60；
(3)将试剂盒中的制胶粉剂用100ml步骤(2)的电泳缓冲溶液溶解混匀，倒入同工酶制胶的模具中，待其凝固即可制成所需同工酶胶块；
(4)将步骤(3)配好的同工酶胶块放置于电泳槽中，待点样；
(5)将步骤(1)中的细胞裂解物在4℃、12000rpm条件下离心30s～1min，取其上清点样，点样量为1μL，共点样两次，每次点样后需静置3min，另外，点样时需设置已确定种属动物细胞系(人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929)作为对照参照；
(6)待步骤(5)完成后，向电泳槽中加入电泳缓冲液，至将胶块完全覆盖并超出胶块0.5～1cm；
(7)接通电泳槽电源，将电压控制在150～155V、电流50～53mA范围内，电泳时间28～35min；
(8)配制0.5mol/L Tris-HCl，将试剂盒中的Tris粉3.0g，添加浓盐酸1.0～1.2ml、纯水45～50ml溶解，并调节pH至8.0；
(9)将试剂盒中的NP显色底物粉剂用2.5mL步骤(8)配制的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解；
(10)将步骤(9)配制好的染色液完全覆盖在胶块上，37℃避光孵化染色2-3min；
(11)将染完色的胶块用流动自来水冲洗胶块背景至透明无色，将胶块上的残留水分去除干净，拍照即可得到动物细胞同工酶的图谱，通过与对照细胞的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。如图4所示，待检细胞一和人源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞一为人源细胞；待检细胞二和小鼠源细胞条带的数目和出现的位置一致，从而可以判断出待检细胞二为小鼠源细胞。
Claims (8)
1.一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)制胶粉剂；
(2)Tris-Gly电泳缓冲液粉剂；
(3)显色底物粉剂；
(4)细胞裂解液；
所述的制胶粉剂包括：EDTA 0.035～0.040g、琼脂糖0.8～0.9g，该粉剂使用时需用100ml Tris-Gly电泳缓冲液溶解混匀；
所述的Tris-Gly电泳缓冲液粉剂包括：甘氨酸7.055～7.065g、Tris粉1.5～1.6g，该粉剂使用时需用1L的水溶解混匀，pH为8.50～8.60；
所述的显色底物粉剂包括乳酸脱氢酶(LD)的显色底物粉剂和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的显色底物粉剂、苹果酸脱氢酶(MD)的显色底物粉剂、嘌呤核苷磷酸化酶(NP)的显色底物粉剂，其中乳酸脱氢酶(LD)的显色底物粉剂包括：乳酸钠1.08～1.15g、NAD 1.8～2.0mg、氯化钠2.5～3.0mg、MTT1.8～2.2mg、PMS 0.3～0.5mg；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的显色底物粉剂包括：G6PD 45～55mg、NADP 2.7～3.2mg、氯化镁9～13mg、MTT 1.7～2.0mg、PMS0.35～0.52mg；苹果酸脱氢酶(MD)的显色底物粉剂包括：苹果酸钠1.8mg～2.2mg、NAD 3.8～5.2mg、氯化钠2.0～2.7mg、MTT 2.1～2.5mg、PMS 0.2～0.5mg；嘌呤核苷磷酸化酶(NP)的显色底物粉剂包括：肌苷36～45mg、黄嘌呤酶1.2～1.8U、MTT 2.6～3.3mg、PMS 0.9～1.5mg；其中：LD显色底物粉剂使用时需用1.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解；G6PD显色底物粉剂使用时需用2.0mL的0.5mol/L Tris-HCl和1.2～1.5ml的纯水溶解；MD显色底物粉剂和NP显色底物粉剂使用时需用2.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解；所述使用的0.5mol/L Tris-HCl为Tris粉3.0g，使用时需添加浓盐酸1.0～1.2ml、纯水45～50ml，并调节pH至8.0；
所述的细胞裂解液为Triton X-100，使用时用Tris-Gly电泳缓冲液稀释50倍。
2.一种权利要求1所述的动物细胞种属鉴定的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：采用Tris-Gly电泳缓冲液配制的琼脂糖同工酶胶块，在室温、电压150～165V、电流52～55mA条件下，以人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929为对照细胞，分别在琼脂糖同工酶胶块两边点样，通过20～35min电泳、3～5min孵化染色、纯水脱色，即可得到哺乳动物细胞同工酶的图谱。
3.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，作为对照的人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929，需要使用者自己准备，收集细胞，加入等体积的上述试剂盒中的细胞裂解液后，4℃条件下裂解后，将细胞裂解物置于-20℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，所述的琼脂糖同工酶胶块制备的粉剂采用EDTA0.035～0.040g、琼脂糖0.8～0.9g，将该粉剂用100ml Tris-Gly电泳缓冲溶液溶解混匀，倒入同工酶制胶的模具中，制成所需同工酶胶块。
5.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，同工酶电泳的条件为室温、电压150～160V、电流50～55mA，电泳时间为25～30min。
6.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，孵化染色中，LD显色底物粉剂使用时需用1.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解，G6PD显色底物粉剂使用时需用2.0mL的0.5mol/L Tris-HCl和1.2～1.5ml的纯水溶解，MD显色底物粉剂和NP显色底物粉剂使用时需用2.5mL的0.5mol/L Tris-HCl和2.0～2.5ml的纯水溶解，并保证现配现用、避光37℃孵化。
7.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于，纯水脱色中，可用流动自来水冲洗胶块背景至透明无色，将胶块上的残留水分去除干净，拍照即可得到动物细胞同工酶的图谱，通过与对照细胞人源细胞HeLa和小鼠源细胞L929的同工酶图谱比对即可判定该细胞的种属。
8.权利要求1所述的试剂盒在动物细胞种属鉴定中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910097653.9A CN109655455A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910097653.9A CN109655455A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及其使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109655455A true CN109655455A (zh) | 2019-04-19 |
Family
ID=66121973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910097653.9A Pending CN109655455A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109655455A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110358816A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-10-22 | 湖北国际旅行卫生保健中心 | 一种用于鸡来源细胞pcr检测的引物组、试剂盒及应用 |
| CN110412002A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-05 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种鉴别人源细胞和小鼠源细胞的方法 |
| CN114062685A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-02-18 | 武汉尚恩生物技术有限公司 | 一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1431315A (zh) * | 2003-01-09 | 2003-07-23 | 中国人民解放军第二军医大学 | 乳酸脱氢酶同工酶检测试剂盒 |
| CN101531708A (zh) * | 2009-04-14 | 2009-09-16 | 福建农林大学 | 土壤蛋白质提取及胞内蛋白质的分离方法 |
| CN202041503U (zh) * | 2011-04-26 | 2011-11-16 | 武汉大学 | 一种同工酶琼脂糖凝胶电泳制胶装置 |
| CN106085980A (zh) * | 2016-06-13 | 2016-11-09 | 西南医科大学 | 乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法 |
-
2019
- 2019-01-31 CN CN201910097653.9A patent/CN109655455A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1431315A (zh) * | 2003-01-09 | 2003-07-23 | 中国人民解放军第二军医大学 | 乳酸脱氢酶同工酶检测试剂盒 |
| CN101531708A (zh) * | 2009-04-14 | 2009-09-16 | 福建农林大学 | 土壤蛋白质提取及胞内蛋白质的分离方法 |
| CN202041503U (zh) * | 2011-04-26 | 2011-11-16 | 武汉大学 | 一种同工酶琼脂糖凝胶电泳制胶装置 |
| CN106085980A (zh) * | 2016-06-13 | 2016-11-09 | 西南医科大学 | 乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| B.PARODI 等: "Species identification and confirmation of human and animal cell lines: a PCR based method", 《BIO TECHNIQUES》 * |
| 姜典才 等: "应用同功酶图谱鉴别动物细胞种属来源的研究", 《中国生物制品学杂志》 * |
| 孟和 等: "《农业生物基础实验教程》", 30 September 2006 * |
| 李芩 张国荣: "动物细胞同工酶检测方法的改良及其应用", 《中国医药生物技术》 * |
| 赵允文 等: "《新编实用临床检验手册》", 30 November 1995 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110412002A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-05 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种鉴别人源细胞和小鼠源细胞的方法 |
| CN110412002B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-01-11 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种鉴别人源细胞和小鼠源细胞的方法 |
| CN110358816A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-10-22 | 湖北国际旅行卫生保健中心 | 一种用于鸡来源细胞pcr检测的引物组、试剂盒及应用 |
| CN110358816B (zh) * | 2019-08-13 | 2024-01-12 | 湖北国际旅行卫生保健中心 | 一种用于鸡来源细胞pcr检测的引物组、试剂盒及应用 |
| CN114062685A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-02-18 | 武汉尚恩生物技术有限公司 | 一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒 |
| CN114062685B (zh) * | 2021-11-24 | 2023-12-26 | 武汉尚恩生物技术有限公司 | 一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109655455A (zh) | 一种用于动物细胞种属鉴定的试剂盒及其使用方法 | |
| Singhal et al. | DNA methylation in aging of mice | |
| Johnson et al. | Genetic variation of alcohol dehydrogenase in Drosophila melanogaster | |
| US7288373B2 (en) | Treatment of methylated nucleic acid | |
| Coste et al. | Non-adenylylated bis (5'-nucleosidyl) tetraphosphates occur in Saccharomyces cerevisiae and in Escherichia coli and accumulate upon temperature shift or exposure to cadmium. | |
| NØRBY | A specific nutritional requirement for pyrimidines in rudimentary mutants of Drosophila melanogaster | |
| Benkel et al. | Glucose repression of amylase gene expression in Drosophila melanogaster | |
| Xiong et al. | Expression of aquaporins in human embryos and potential role of AQP3 and AQP7 in preimplantation mouse embryo development | |
| CN103265947A (zh) | 一种用于活细胞中rna和核仁成像的吲哚吡啶盐类荧光探针 | |
| Shaw et al. | Response:" Galactose Dehydrogenase,"" Nothing Dehydrogenase," and Alcohol Dehydrogenase: Interrelation | |
| CN110514631A (zh) | 一种高灵敏、快速定量检测t4 pnk酶的方法 | |
| Guo et al. | Exaggerated block of hERG (KCNH2) and prolongation of action potential duration by erythromycin at temperatures between 37 C and 42 C | |
| Zhang et al. | Establishment and Characterization of a Telomerase‐Immortalized Sheep Trophoblast Cell Line | |
| CN103275699A (zh) | 一种用于活细胞中rna和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针 | |
| CN113584014B (zh) | 一种rna的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液 | |
| Patel et al. | Queuosine salvage in fission yeast by Qng1-mediated hydrolysis to queuine | |
| Edwards et al. | A sperm-specific enolase | |
| Ghallab | Highlight report: Metabolomics in hepatotoxicity testing | |
| Etkin | Regulation of lactate dehydrogenase (LDH) and alcohol dehydrogenase (ADH) synthesis in liver nuclei, following their transfer into oocytes | |
| Buehr et al. | An electrophoretically detectable modification of glucosephosphate isomerase in mouse spermatozoa | |
| Li et al. | Widespread transcriptional responses to the thermal stresses are prewired in human 3D genome | |
| McClain | A role for ribonuclease III in synthesis of bacteriophage T4 transfer RNAs | |
| CN106190953A (zh) | 一种高尿酸血症细胞模型及其构建方法与在降尿酸功效评价方面的应用 | |
| Kuriya et al. | Direct visualization of DNA replication dynamics in zebrafish cells | |
| Fundele et al. | Viability of trisomy 12 cells in mouse chimaeras |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190419 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |