CN109641016B - 表达甲状旁腺激素1受体的细胞及其用途 - Google Patents

表达甲状旁腺激素1受体的细胞及其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了用一种或多种肽培养的多能干细胞以及分离所述干细胞的方法。还公开了将所述干细胞靶向生物体内的期望区域或范围的方法。还公开了使用经分离的干细胞用于改善生育力、促进毛发生长、治疗或预防皮肤病症、治疗或改善骨失调症、治疗恶性肿瘤和治疗神经失调症的方法。

Description

表达甲状旁腺激素1受体的细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月23日和2017年1月12日提交的US临时申请Nos.62/353,993和62/445,636的优先权，以引用的方式明确地将其公开内容整体并入本文。
技术领域
本公开大体上涉及干细胞领域，包括干细胞的分离和干细胞的培养。特别地，本公开涉及表达甲状旁腺激素1型受体的多能干细胞用于改善生育力、促进毛发生长、改善或预防皮肤病症、改善或预防骨失调症、改善或预防黄斑变性以及改善或预防自身免疫疾病的用途。这些干细胞被称为外周血衍生的多能干细胞(PBD-PSC)。
背景技术
人干细胞是原始的、未成熟的、非特异性的多能前体细胞，其具有无限期分裂并产生新的或特化细胞的能力，并且能产生多种成熟的人细胞谱系。干细胞几乎发现于机体的所有组织中，包括骨髓、骨骼、肌肉、肝脏、大脑、脂肪组织、血液和皮肤。
干细胞对机体而言是必需的，因为它们充当在损害、疾病或细胞损伤期间能使细胞再生和更新的修复系统。例如，作为皮肤干细胞的成纤维细胞修复皮肤损伤、包括皮肤撕裂。作为骨干细胞的成骨细胞修复骨损伤、包括骨折。
通过重新填充许多类型的组织并恢复生理和解剖功能，干细胞能用于各种医学应用。这些用途包括同种异体再生细胞治疗、自体再生细胞治疗、组织工程和再生药物治疗。
发明内容
本公开针对多能干细胞群，其表达甲状旁腺激素1型受体(PTH1R)并且在培养时能分化为外胚层、中胚层和内胚层，并且在本文中称为外周血衍生的多能干细胞(PBD-PSCs)。
一些实施方式涉及包含PBD-PSC的细胞群，并且通过PTH1R的存在来鉴定、描述和/或分离此类细胞群。在一些实施方式中，包含PBD-PSC的干细胞群分离自脂肪组织、骨髓、外周血、女性卵泡液或男性精浆或其组合。在一些实施方式中，包含PBD-PSC的干细胞群分离自哺乳动物，包括人、家畜或农场动物(例如狗、猫、骆驼、马、牛、猪、绵羊或山羊)。
在一些实施方式中，表达PTH1R的细胞群内的PBD-PSC的直径为2.5μm-4.5μm，例如直径为2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm或4.5μm或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量。在一些实施方式中，包含PBD-PSC的干细胞群在培养时形成类胚体。在一些实施方式中，当在合适的诱导培养基中培养时，包含PBD-PSC的干细胞群分化为外胚层、中胚层和/或内胚层。
在一些实施方式中，包含PBD-PSC的经分离的细胞群表达经典的CD标记物。在一些实施方式中，表达PTH1R的PBD-PSC对CD90和/或CD133而言是阳性的；对CD29、CD34、CD105和/或CD106而言是阳性/阴性的；和/或对SSEA-3、CD200和/或CD45而言是阴性的。在一些实施方式中，所述干细胞群包含表达Sox2和Oct4的PBD-PSC。
在一些实施方式中，将所述PBD-PSC用一种或多种肽进行培养。在一些实施方式中，肽是细胞外基质(ECM)蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。在一些实施方式中，ECM蛋白包括例如蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖或纤维，并且可包括例如硫酸软骨素、硫酸肝素、硫酸角质素、透明质酸、集聚蛋白巢蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、内功素(entactin)、纤连蛋白、层粘连蛋白、基底膜蛋白聚糖、总蛋白和/或蛋白质片段。在一些实施方式中，细胞因子是例如淋巴因子、白细胞介素和趋化因子，可包括例如白细胞介素细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13)、干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)、集落刺激因子(GM-CSF和M-CSF)或其组合。在一些实施方式中，生长因子包括例如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF和bFGF)、转化生长因子(TGF-α以及TGF-β1、2和3)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角化细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素(EPO)或胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)或其组合。在一些实施方式中，将PBD-PSC用视黄酸和/或一种或多种视黄酸衍生物进行培养。
在一些实施方式中，用编码肽的一种或多种异源基因转染PBD-PSC。在一些实施方式中，肽是细胞外基质(ECM)蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。在一些实施方式中，ECM蛋白包括例如蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖或纤维，并且可包括例如硫酸软骨素、硫酸肝素、硫酸角质素、透明质酸、集聚蛋白巢蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、内功素、纤连蛋白、层粘连蛋白、基底膜蛋白聚糖、总蛋白和/或蛋白质片段。在一些实施方式中，细胞因子包括例如淋巴因子、白细胞介素和趋化因子，可包括例如白细胞介素细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13)、干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)或集落刺激因子(GM-CSF和M-CSF)或其组合。在一些实施方式中，生长因子包括例如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF和bFGF)、转化生长因子(TGF-α以及TGF-β1、2和3)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角化细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素(EPO)或胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)或其组合。
在一些实施方式中，将PBD-PSC靶向至生物体、组织或器官内的特定范围(region)或区域(area)。在一些实施方式中，通过所述区域内的甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)的过表达和/或甲状旁腺激素(PTH)的过表达，将PBD-PSC吸引至靶区域。PTH和PTHrP充当PBD-PSC的化学引诱物。在一些实施方式中，将PBD-PSC吸引到具有高浓度PTH和/或PTHrP的区域或范围。在一些实施方式中，PTH和/或PTHrP的高浓度或流入(influx)是过表达、天然表达和/或人工放置的结果。
实施方式还包括对PBD-PSC上的PTH1R而言特异性的抗体或其结合结构域。在一些实施方式中，抗体或结合结构域是单克隆抗体或其结合片段或者多克隆抗体或其结合片段。在一些实施方式中，抗体或其结合片段是人源化抗体或其人源化结合片段。
实施方式还包括分离多能干细胞群的方法，其中所述干细胞群包含表达PTH1R的PBD-PSC。在一些实施方式中，所述方法包括使含有包含PBD-PSC的细胞群的样品与对PTH1R而言特异性的抗体或其结合片段接触(优选与载体或表面如珠、膜、滤器、容器结合)，以形成经结合的细胞群(例如干细胞群)。在一些实施方式中，所述方法进一步包括分离经所述抗体结合的细胞群(例如干细胞群)。在一些实施方式中，所述方法包括从所述抗体或其结合片段释放所述经结合的细胞群(例如干细胞群)。在一些实施方式中，所述方法进一步包括使包含经所述抗体/其结合片段结合的细胞群(例如干细胞群)的样品与磁珠、表面或支持物(例如所述磁珠、表面、支持物、膜或过滤器可包含对PTH1R而言特异性的固定化或结合的抗体或其结合片段)接触。在一些实施方式中，所述方法包括对样品施加磁场和/或离心，从而分离经所述抗体/其结合片段结合的细胞群(例如干细胞群)。
更多实施方式包括使用PBD-PSC来治疗或改善或抑制失调症、疾病或疾病状态的方法，其中所述失调症、疾病或疾病状态是不育症、皮肤或毛发失调症(例如脱发、头发稀疏)、骨失调症、癌症、神经失调症、自身免疫疾病或其组合。在一些实施方式中，通过对一种或多种前述失调症、疾病或疾病状态的临床或诊断评估来识别患有一种或多种失调症的受试者，并且向所述个体施用包含PBD-PSC的干细胞群，其中静脉内、动脉内、皮下、透皮、玻璃体内、眼内、结膜下、眼球后、眼眶下或局部、或通过其组合施用所述包含PBD-PSC的干细胞群。在一些实施方式中，失调症、疾病或疾病状态的治疗或改善引起失调症的减轻、改善、逆转或消退。在一些实施方式中，动脉内注射包括注射到子宫、胰腺或卵巢的动脉或者其组合中。
本文提供的一些实施方式涉及改善、减轻、逆转、抑制或治疗糖尿病的方法。在一些实施方式中，所述方法包括施用有效量的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含根据本文所述进行分离的经分离的多能干细胞群。在一些实施方式中，所述组合物包含针对有需要的受试者的如本文所述的经分离的多能干细胞群。在一些实施方式中，糖尿病是1型糖尿病。在一些实施方式中，将所述组合物动脉内施用到胰腺动脉中。在一些实施方式中，组合物每12周施用一次。在一些实施方式中，所述组合物的施用减少了所述受试者的每日平均胰岛素用量。在一些实施方式中，所述每日平均胰岛素用量减少2％-10％、5％-20％、10％-30％、20％-40％、30％-50％、40％-60％、50％-70％、60％-80％、70％-90％、或80％-100％、或处于由前述的任意两个百分比限定的范围内。
本文提供的一些实施方式涉及降低患有糖尿病的受试者中的所述平均每日胰岛素剂量的方法。在一些实施方式中，所述方法包括施用有效量的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含通过如本文所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群。在一些实施方式中，所述组合物包含针对有需要的受试者的如本文所述的经分离的多能干细胞群。在一些实施方式中，糖尿病是1型糖尿病。在一些实施方式中，将所述组合物动脉内施用到胰腺动脉中。在一些实施方式中，组合物每12周施用一次。在一些实施方式中，所述组合物的施用将所述受试者的每日平均胰岛素用量减少2％-10％、5％-20％、10％-30％、20％-40％、30％-50％、40％-60％、50％-70％、60％-80％、70％-90％、或80％-100％、或处于由前述的任意两个百分比限定的范围内。
本文提供的一些实施方式涉及用于使经分离的多能干细胞群在基质上生长的方法。在一些实施方式中，所述方法包括通过如本文所述的方法从样品中分离多能干细胞群，使纳米纤维基质与所述经分离的多能干细胞接触，并使所述分离的多能干细胞在纳米纤维基质上生长。在一些实施方式中，产生包含多能干细胞的基质。在一些实施方式中，所述纳米纤维基质包含聚合物纤维，包括例如聚二甲基硅氧烷、聚甘油癸二酸酯、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、纤维素、藻酸盐/酯、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、透明质酸、纤维蛋白、聚-L-丙交酯或聚(乳酸-共-乙醇酸)。在一些实施方式中，聚合物纤维是静电纺丝。在一些实施方式中，所述聚合物纤维的厚度范围为200μm至700μm(例如200μm、300μm、400μm、500μm、600μm或700μm或处于由前述的任意两个厚度限定的范围内)。在一些实施方式中，所述多能干细胞在2分钟-40分钟内结合并沉积在所述基质中(例如2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟或40分钟或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量)。在一些实施方式中，将所述包含多能干细胞的基质用于注射到关节或骨中。在一些实施方式中，将所述包含多能干细胞的基质用于覆盖具有或不具有敷料的伤口，敷料可包括凝胶。
因此，本文描述的一些方面涉及以下替代方式：
1.一种多能干细胞，其特征在于，所述多能干细胞表达甲状旁腺激素1型受体(PTH1R)；直径为2.5μm至4.5μm，如直径为2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm或4.5μm、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量；当被培养时形成类胚体；并且在培养时能分化成外胚层、中胚层和内胚层。
2.如替代方式1所述的多能干细胞，其中，将所述细胞群用一种或多种肽进行培养。
3.如替代方式2所述的多能干细胞，其中，所述肽是细胞外基质(ECM)蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
4.如替代方式1-3中任一项所述的多能干细胞，其中，将所述多能干细胞用视黄酸和/或用一种或多种视黄酸衍生物进行培养。
5.如替代方式1-4中任一项所述的多能干细胞，其中，将所述多能干细胞用编码肽的异源基因进行转染。
6.如替代方式5所述的多能干细胞，其中，所述肽是细胞外基质(ECM)蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
7.如替代方式1-6中任一项所述的多能干细胞，其中，所述多能干细胞分离自外周血、精液和/或卵泡液。
8.一种存在于外周血、精液和卵泡液中的经分离的多能干细胞群，所述多能干细胞群：
表达甲状旁腺激素1型受体(PTH1R)；
直径为2.5μm至4.5μm，如直径为2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm或4.5μm、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量；
当被培养时形成类胚体；以及
在培养时能分化成外胚层、中胚层和内胚层。
9.如替代方式8所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述细胞群：
对CD90和CD133而言是阳性的；
对CD29、CD34、CD105和CD106而言是阳性/阴性的；以及
对SSEA-3、CD200和CD45而言是阴性的。
10.如替代方式8-9所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述细胞群表达Sox2和Oct4。
11.如替代方式8-10中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述经分离的多能干细胞群来源于人、马科动物、犬科动物或骆驼来源。
12.如替代方式8-11中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，将所述细胞群用肽进行培养。
13.如替代方式12所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述肽是细胞外基质(ECM)蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
14.如替代方式8-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，将所述细胞群用视黄酸和/或用一种或多种视黄酸衍生物进行培养。
15.如替代方式8-14中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，将所述多能干细胞用编码肽的异源基因进行转染。
16.如替代方式15所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述肽是细胞外基质(ECM)蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
17.一种对干细胞上的甲状旁腺激素1型受体(PTH1R)而言特异性的抗体。
18.如替代方式17所述的抗体，其中，所述抗体是单克隆抗体。
19.如替代方式17-18中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是人源化抗体。
20.用于分离如替代方式1-16中任一项所述的干细胞群的方法，所述方法包括：
使包含所述干细胞群的样品与对PTH1R而言特异性的抗体接触，以形成经抗体结合的干细胞；
分离所述经抗体结合的干细胞；以及
从所述抗体中释放所述干细胞。
21.如替代方式20所述的方法，所述方法进一步包括：
使包含所述经抗体结合的干细胞的样品与磁珠接触；以及
施加磁场，从而分离所述经抗体结合的干细胞。
22.如替代方式20-21中任一项所述的方法，其中，所述样品从选自于由脂肪组织、骨髓、外周血、精液、卵泡液及其组合所组成的组中的样品获得。
23.如替代方式20-22中任一项所述的方法，其中，所述经分离的干细胞群包含直径为2.5μm并表达干细胞CD标记物的干细胞。
24.如替代方式20-23中任一项所述的方法，其中，所述经分离的干细胞群包含以至少或等于如下的量分离的干细胞：10,000个细胞/mL组织样品、50,000个细胞/mL组织样品、100,000个细胞/mL组织样品、500,000个细胞/mL组织样品、1,000,000个细胞/mL组织样品、5,000,000个细胞/mL组织样品或10,000,000个细胞/mL组织样品的量、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量。
25.用于分离如替代方式1-16中任一项所述的多能干细胞群的方法，所述方法包括：
从个体获得外周血；
使所述外周血与体外多孔膜接触，所述体外多孔膜被配置成捕获如替代方式1-16中任一项所述的多能干细胞群；
对外周血和所述膜施加离心力或重力或压力；
捕获所述多能干细胞群；
收集通过的血液；以及
将所述通过的血液重新输注到所述个体内。
26.如替代方式25所述的方法，其中，将所述经捕获的多能干细胞群制备用于随后向所述个体内的重新输注。
27.用于分离如替代方式1-16中任一项所述的干细胞群的方法，所述方法包括：
使包含所述干细胞群的样品与抗CD45抗体接触；以及
去除未被抗CD45抗体结合的细胞。
28.如替代方式27所述的方法，其中，所述样品是外周血、血浆或血小板裂解物。
29.如替代方式27-28中任一项所述的方法，其中，所述经分离的干细胞群包含以如下的量分离的干细胞：约10,000个细胞/mL组织样品、50,000个细胞/mL组织样品、100,000个细胞/mL组织样品、500,000个细胞/mL组织样品、1,000,000个细胞/mL组织样品、5,000,000个细胞/mL组织样品或10,000,000个细胞/mL组织样品、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量。
30.一种改善受试者的生育力的方法，所述方法包括：
选择需要改善的生育力的受试者；以及
向所述受试者施用治疗有效量的通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群或如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
31.如替代方式30所述的方法，其中，所述多能干细胞是自体的。
32.如替代方式30-31中任一项所述的方法，其中，所述治疗有效量是足以引起卵巢功能、卵母细胞质量、子宫内膜厚度、子宫内膜容受性或其组合的可检测的改善的量。
33.如替代方式30-32中任一项所述的方法，其中，通过注射到睾丸或子宫中来施用所述治疗有效量的经分离的多能干细胞群。
34.如替代方式30-32中任一项所述的方法，其中，将治疗有效量的经分离的多能干细胞群静脉内施用至受试者的子宫动脉中，以促进子宫内膜壁的增厚和容受性。
35.如替代方式34所述的方法，其中，子宫内膜壁的增厚被增高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多、或处于由前述的任意两个百分比所限定的范围内。
36.如替代方式30-32中任一项所述的方法，其中，将所述治疗有效量的经分离的多能干细胞群静脉内施用至受试者的卵巢动脉中，以增加卵的数量和质量。
37.如替代方式30-36中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞分离自选自于由脂肪组织、骨髓、外周血、精浆和卵泡液和/或其组合所组成的组中的样品。
38.将通过如替代方式20-29中任一项所述的方法分离的多能干细胞群或如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群靶向到感兴趣的区域的方法，所述方法包括在所述区域中表达甲状旁腺激素相关蛋白质。
39.增加受试者的皮肤区域中的真皮胶原蛋白和/或弹性蛋白的产生的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
40.如替代方式39所述的方法，其中，所述组合物通过一次或多次皮下注射而被施用。
41.如替代方式39-40中任一项所述的方法，其中，所述增加的真皮胶原蛋白和/或弹性蛋白的产生减少细纹、减少皱纹、增加光泽、或增加皮肤紧致度、和/或其组合。
42.用于抑制脱发或促进毛发生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-26中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
43.如替代方式42所述的方法，其中，将所述组合物透皮施用至受试者。
44.如替代方式42所述的方法，其中，将所述组合物皮下施用至受试者。
45.一种改善、减轻、逆转或治疗骨失调症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
46.如替代方式45所述的方法，其中，所述骨失调症是骨损伤。
47.如替代方式46所述的方法，其中，所述骨损伤是骨折。
48.如替代方式47所述的方法，其中，所述骨折是棘突骨折。
49.如替代方式45所述的方法，其中，所述骨失调症是骨质疏松症。
50.如替代方式45所述的方法，其中，所述骨失调症是骨质减少。
51.如替代方式45-50中任一项所述的方法，其中，将所述组合物皮下注射至受试者。
52.如替代方式45-50中任一项所述的方法，其中，将所述组合物静脉内施用至受试者。
53.如替代方式45-50中任一项所述的方法，其中，将所述组合物动脉内施用至受试者。
54.如替代方式53所述的方法，其中，将所述组合物施用至子宫动脉、胰腺动脉或卵巢动脉中的一种或多种。
55.一种改善、减轻、抑制、逆转或治疗神经失调症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
56.一种改善、减轻、抑制、逆转或治疗转移性癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
57.一种预防、治疗、抑制、预防或减轻自身免疫失调症的方法，所述方法包括识别有需要的受试者并向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的细胞群。
58.用作药物的外周血衍生的多能干细胞(PBD-PSC)。
59.一种改善、抑制、减轻、逆转或治疗糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
60.如替代方式59所述的方法，其中，糖尿病是1型糖尿病。
61.如替代方式59-60中任一项所述的方法，其中，将所述组合物动脉内施用到胰腺动脉中。
62.如替代方式59-61中任一项所述的方法，其中，所述组合物每12周施用一次。
63.如替代方式59-62中任一项所述的方法，其中，所述组合物的施用减少了所述受试者的每日平均胰岛素用量。
64.如替代方式63所述的方法，其中，所述每日平均胰岛素用量减少约2％-10％、5％-20％、10％-30％、20％-40％、30％-50％、40％-60％、50％-70％、60％-80％、70％-90％、或80％-100％、或处于由前述的任意两个百分比限定的范围内。
65.一种降低患有糖尿病的受试者中的平均每日胰岛素剂量的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
66.如替代方式65所述的方法，其中，糖尿病是1型糖尿病。
67.如替代方式65-66中任一项所述的方法，其中，将所述组合物动脉内施用到胰腺动脉中。
68.如替代方式65-67中任一项所述的方法，其中，所述组合物每12周施用一次。
69.如替代方式65-68中任一项所述的方法，其中，所述组合物的施用使受试者的每日平均胰岛素用量减少约2％-10％、5％-20％、10％-30％、20％-40％、30％-50％、40％-60％、50％-70％、60％-80％、70％-90％、或80％-100％、或处于由前述的任意两个百分比限定的范围内。
70.一种使经分离的多能干细胞群在基质上生长的方法，所述方法包括：
通过如替代方式20-29中任一项所述的方法从样品中分离多能干细胞群；
使纳米纤维基质与所述经分离的多能干细胞接触；以及
使所述经分离的多能干细胞在所述纳米纤维基质上生长；
其中，产生包含多能干细胞的基质。
71.如替代方式70所述的方法，其中，所述纳米纤维基质包含聚合物纤维，包括例如聚二甲基硅氧烷、聚甘油癸二酸酯、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、纤维素、藻酸盐/酯、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、透明质酸、纤维蛋白、聚-L-丙交酯和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。
72.如替代方式71所述的方法，其中，所述聚合物纤维是静电纺丝。
73.如替代方式71-72中任一项所述的方法，其中，所述聚合物纤维的厚度为至少或等于200μm、300μm、400μm、500μm、600μm或700μm、或处于由前述的任意两个厚度限定的范围内。
74.如替代方式70-73中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞在约2分钟-40分钟内结合并沉积在所述基质中。
75.如替代方式70-74中任一项所述的方法，其中，将所述包含多能干细胞的基质用于注射到关节或骨中。
76.如替代方式70-74中任一项所述的方法，其中，将所述包含多能干细胞的基质用于覆盖伤口。
77.一种改善、减轻、逆转、抑制或治疗黄斑变性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含通过如替代方式20-29中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞群、或包含如替代方式1-16中任一项所述的经分离的多能干细胞群。
如替代方式77所述的方法，其中，黄斑变性是干性或湿性黄斑变性。
如替代方式77-78中任一项所述的方法，其中，所述组合物通过静脉内、玻璃体内、眼内、结膜下、眼球后或眼眶下注射而被施用。
如替代方式77-79中任一项所述的方法，其中，所述组合物每12周施用一次。
如替代方式77-80中任一项所述的方法，其中，所述组合物的施用改善了所述受试者中的视敏度。
如替代方式81所述的方法，其中，所述视敏度改善至约20/20、20/30、20/40、20/50、20/60、20/70、20/80、20/90或20/100或处于由前述的任意两个量限定的范围内。
通过阅读对附图的以下描述和详细描述，这些特征以及本文进一步说明的其它特征将变得显而易见。
附图说明
除了前述特征之外，从附图和示例性实施方式的以下描述中，附加特征和变型将是显而易见的。将理解的是，这些附图描绘了典型的实施方式，而并不旨在限制范围。
图1描绘了本文所述的PBD-PSC的特征。以800×g(子图A)、1000×g(子图B)和1200×g(子图C)离心并过滤后的甲状旁腺激素1受体(PTH1R)阳性细胞的流式细胞术结果。
图2描绘了通过流式细胞术而在本文中描述的PBD-PSC的特征。来自外周血的PTH1R阳性细胞显示在子图A中。子图B比较了PTH1R阳性细胞和CD133阳性细胞。子图C比较了CD133阳性细胞和CD90阳性细胞。子图D比较了SSEA4阳性细胞和CD45阳性细胞。
图3示出了来自离心和过滤后的卵泡液的PTH1R阳性细胞的特征。子图A示出了PTH1R阳性细胞。子图B比较了PTH1R阳性细胞和CD133阳性细胞。子图C比较了PTH1R阳性细胞和CD90阳性细胞。
图4A-图4C描绘了来自卵泡液和来自外周血的PTH1R阳性细胞的特征。图4A描绘了PTHR阳性细胞、图4B描绘了CD133阳性细胞、并且图4C描绘了PTHR/CD90阳性细胞。
图5A-图5E描绘了如本文所述的PBD-PSC的显微照片，使用针对PTH受体(图5A)、CD90(图5B)、CD133(图5C)、SSEA-4(图5D)和CD45(图5E)的抗体染色。
图6描绘了本文所述的PBD-PSC的显微照片。干细胞直径为2.5μm-4.5μm，并且携带多能干细胞标记物Kyoto探针1。
图7是示出了当被培养时PBD-PSC形成类胚体的显微照片，提供了这些细胞是非常原始且有潜能的干细胞的证据。
图8示出了PBD-PSC的基因表达，使用常规Rt-PCR进行干细胞标记物检测。泳道1是DNA梯状条带、泳道2是对照GAPDH1、泳道3示出了Sox2的检测、并且泳道4示出了Oct4的检测。
图9示出了来自不同动物来源的PBD-PSC的显微照片：马科动物、犬科动物和骆驼。
图10说明了开发靶向对PBD-PSC而言独特的标记物的独特的单克隆抗体的方法。该单克隆抗体可用于选择特定的多能干细胞以用于诊断和治疗目的。
图11说明了用于分离PBD-PSC的方法的一个实施方式。将含有干细胞的样品(组织匀浆、外周血或本文所述的其它干细胞来源)与如图10所示开发的单克隆抗体接触。将磁珠加入混合物中，并施加磁场。引入洗涤缓冲液，并分离PBD-PSC。
图12示出了用于在体外系统中分离PBD-PSCs的方法。使来自受试者的外周血通过体外膜(优选多孔膜)，该膜被配置成捕获PBD-PSCs。对外周血施加离心力或重力，从而捕获并收集PBD-PSCs。任选地，在从外周血中除去PBD-PSCs后，将通过的血液重新输注到受试者内。
图13说明了生物体衰老所涉及的过程。外源性影响与内源性影响共同作用，引起基因组学、表观基因组学和蛋白质组学变化，导致功能衰退。这反过来又导致组织功能障碍和生物体衰老。
图14示出了干细胞的典型进展。年轻的干细胞能产生健康的后代。然而，随着干细胞的衰老，产生的后代由于谱系特异性的丧失而在功能方面衰退、由于自我更新的丧失而耗竭、由于衰老而耗竭以及恶性转化。
图15说明了受试者年龄(x轴)与每毫升血浆的PTHR阳性干细胞(y轴)之间的负相关性。
图16说明了针对生物体内的任意给定的干细胞群随时间发生的遗传学和表观遗传学改变。
图17说明了癌症干细胞(CSCs)的性质，包括CSCs的化学治疗和放射治疗抗性。
图18说明了相比年老者，年幼者中的因子的在老年小鼠中激活干细胞和使细胞器恢复活力的能力。年老者中的因子看起来会抑制年幼小鼠的再生能力。
图19示出了随着时间和复制过程，干细胞显示出增加的衰老效应。然而，干细胞在实足(chronological)寿命和复制寿命期间经历的衰老效应可通过本文描述的处理而逆转。
图20A-图20D描绘了在纳米纤维基质上生长的从健康男性获得的PBD-PSCs的电子显微照片。显微照片示出了在0分钟(图20A)、5分钟(图20B)、30分钟(图20C)和120分钟(图20D)的时间点随时间变化的基质上的PBD-PSC。
图21示出了使用PBD-PSC制剂作为美塑治疗(mesotherapy)药剂以通过增加真皮胶原蛋白和弹性蛋白的存在来对抗过早的皮肤衰老的示例性的皮肤治疗。在治疗后的第0天和第30天的治疗前进行胶原蛋白和弹性蛋白的皮肤测定。
图22示出了使用PBD-PSC制剂对毛囊和头皮进行示例性治疗以诱导毛发再生，并且该图描绘了治疗前和治疗后10周的囊泡生长。
图23A-图23C示出了使用PBD-PSC治疗方法的实施方式进行的棘突骨折的棘突治疗后的图像。图23A示出了治疗前的骨折。图23B示出了使用PBD-PSC治疗进行的冠状颈骨折的治疗。左侧图像示出了治疗前的骨折，右侧图像示出了PBD-PSC治疗后4个月的骨折。图23C示出了使用PBD-PSC治疗进行的矢状性颈椎骨折的治疗。左侧图像示出了治疗前的骨折，且右侧图像示出了PBD-PSC治疗后4个月的骨折。
图24描绘了骨质疏松症的效果。左侧图像描绘了正常、健康骨骼的剖视图。右侧图像描绘了患有骨质疏松症的骨骼的剖视图，显示出增加的孔隙率和降低的骨密度。
图25描绘了患有严重的骨质疏松症的受试者的骨密度。顶部子图示出了单次输注PBD-PSCs后的腰椎的骨密度的变化。底部子图示出了单次输注PBD-PSCs后的左髋的骨密度的变化。y轴表示以g/cm2计的骨密度，且x轴表示时间。
图26描绘了患有骨质减少的受试者的骨密度和T评分的变化。顶部子图示出了单次PBD-PSC治疗后的腰椎的骨密度和T评分的变化。底部子图示出了单次PBD-PSC治疗后的左髋的骨密度和T评分的变化。
图27示出了使用PBD-PSC子宫内动脉注射进行的子宫内膜变薄的示例性治疗。治疗前图像描绘了高水平的子宫内膜变薄，而治疗后图像显示变薄已经在很大程度上消除。
图28示出了使用PBD-PSC的肺转移瘤的示例性治疗。该图示出了移植PBD-PSC同种异体移植物后30天(左)和129天(右)的肺转移瘤的CT图像，并显示了在移植后129天转移瘤完全缓解。
图29描绘了PBD-PSCs给药后平均胰岛素用量的减少。在第1周和第13周，向两名受试者(1名17岁男性和1名16岁女性)施用两剂PBD-PSCs。在PBD-PSC治疗后观察到平均每日胰岛素用量的减少。
具体实施方式
在以下的详细描述中，参考了附图，附图构成本文的一部分。在附图中，除非上下文另有指示，类似的符号通常标示类似的组分。在具体的描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方式并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其它实施方式，并且可以进行其它改变。将容易理解的是，如本文大体上描述的和图中所示的，本公开的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有的配置都在本文明确的考虑之列。
外周血衍生的多能干细胞(PBD-PSCs)是直径为2.5-4.5μm的非常小的干细胞，例如直径为2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm或4.5μm、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量。PBD-PSC是非常原始的干细胞，具有分化为多种特化谱系的高的潜能。因此，PBD-PSC在再生医学领域中具有高的应用倾向，并且特别是用于抗衰老治疗。特别地，PBD-PSC对于许多应用而言是有力的工具，包括例如：同种异体再生细胞治疗，其中供体细胞用于分化并且能释放生长因子以修复受损组织；自体再生细胞治疗，其中患者自身的细胞用于重新编程、扩增和/或分化，以通过永久地整合到组织中来治疗受损组织；以及组织工程，其中将患者自身的细胞置于支架上以产生新组织，然后将新组织移植到受损组织上以修复该组织。PBD-PSC的特征在于其高度表达PTH1R。因此，在一些方面，PBD-PSC在本文中也称为PTH1R阳性干细胞。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor，NY 1989)。出于本公开的目的，将以下术语定义如下。
本文使用的冠词“一个/一种”(a和an)指的是该冠词的一个或多于一个(例如至少一个)的语法对象。举例来说，“一个/一种要素”表示一个/一种要素或多于一个/一种的要素。
“约”意味着数量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”将被理解为暗示囊括所述步骤或要素或者步骤或要素的组但不排除任意其它的步骤或要素或者步骤或要素的组。
“由......组成”意味着包括并限于跟随短语“由......组成”的任意内容。因此，短语“由......组成”表示所列的要素是必需的或强制性的，并且没有其它要素可存在。“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任意要素，并且限于不干扰或有助于本公开中针对所列的要素指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列的要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并且可存在或不存在，取决于它们是否实质上影响所列的要素的活性或作用。
在一些实施方式中，可以具体地定义组合物中的任意给定试剂(例如，抗体、多肽结合剂)的“纯度”。例如，某些组合物可包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的试剂，包括其间的所有小数，例如(并且绝不限制)通过高压液相色谱(HPLC)(在生物化学和分析化学中经常用于分离、鉴定和定量化合物的公知形式的柱色谱法)所测量的。
如本文所用，术语“功能”和“功能的”等是指生物学、酶学或治疗功能。
术语“分离的”意味着实质上或本质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的物质。例如，如本文所用的“经分离的干细胞”或“经分离的干细胞群”包括已经从样品材料(包括来自其自然发生状态的其它细胞、碎片或外来样品材料)中纯化的干细胞或干细胞群。或者，如本文所使用的“经分离的干细胞”或“经分离的干细胞群”等包括从其自然环境、以及从与其出现在其中的样品或材料的其它组分的关联进行的细胞或细胞群的机体外(invitro)、体外(extracorporeal)或其它的分离和/或纯化。在一些实施方式中，分离意味着该组分与体内物质不显著相关。
除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中的许多在下文中出于说明的目的而描述。这些技术在文献中被充分说明。参见如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rdEdition，2000)；DNA Cloning：A Practical Approach，vol.1&II(D.Glover，ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，1984)；Oligonucleotide Synthesis：Methodsand Applications(P.Herdewijn，ed.，2004)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins，eds.，1985)；Nucleic Acid Hybridization：Modern Applications(Buzdinand Lukyanov，eds.，2009)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，eds.，1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney，ed.，1986)；Freshney，R.I.(2005)Culture ofAnimal Cells，a Manual of Basic Technique，5th Ed.Hoboken NJ，John Wiley&Sons；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(3rd Edition 2010)；Farrell，R.，RNA Methodologies：A Laboratory Guide for Isolation and Characterization(3rdEdition 2005)。
如本文所使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双抗体和单一链分子)、以及抗体片段(例如Fab或F(ab')2，以及Fv)。对于不同类别的抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties，AbbaI.Terr and Tristram G.Parsolw(eds)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第6章和第71页。
在一些实施方式中，提供了针对PBD-PSCs的抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。“经分离的抗体”是与天然相关组分无关联的抗体，该自然相关组分在其天然状态下伴随该抗体并且不含来自相同物种的其它蛋白质，该自然相关组分包括其它自然相关抗体。此外，经分离的抗体由来自不同物种的细胞或在自然界中不存在的细胞表达。术语人抗体包括具有衍生自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的所有抗体。人源化抗体是衍生自非人物种的抗体，其中重链和轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸已经突变，以避免或消除人类的免疫应答。可替代地，可以通过将来自人抗体的恒定结构域融合至非人物种的可变结构域来产生人源化抗体。嵌合抗体是指含有来自一种抗体的一个或多个区域以及来自一种或多种其它抗体的一个或多个区域的抗体。另外，可以容易地制备抗体片段。因此，如本文所述，提供了针对PBD-PSCs的抗体及其片段。
如本文所用，术语“治疗”是指响应于受试者表现出的疾病、失调症或生理条件而进行的干预，特别是患有年龄相关失调症或患有展现出退行性组织或细胞效应的失调症的受试者。此类失调症可包括但不限于皮肤失调症、脱发和毛发失调症、糖尿病(包括1型糖尿病)、骨失调症和损伤(包括骨质疏松症、骨质减少和/或骨折)、不育症、恶性癌症、自身免疫失调症、黄斑变性和涉及再生丧失的其它失调症，以及本文所述和本领域已知的其它疾病。治疗的目的可包括但不限于如下中的一种或多种：缓解或预防症状，减缓或停止疾病、失调症或病症的进展或恶化，以及缓和疾病、失调症或病症。在一些实施方式中，“治疗”是指治疗性治疗和防病性(prophylactic)或预防性(preventative)措施。需要治疗的情况包括已经受到疾病、失调症或不期望的生理条件的影响的情况，以及其中将要预防疾病、失调症或不期望的生理条件的情况。例如，在一些实施方式中，治疗减少、减轻或根除疾病的症状。如本文所使用的，术语“预防”是指减轻随后表达疾病症状的个体的负担的任意活动。这能够以一级、二级和/或三级预防水平进行，其中：a)一级预防避免症状/失调症/病症的发展；b)二级预防活动针对病症/失调症/症状治疗的早期阶段，从而增加干预以预防病症/失调症/症状的进展以及症状的出现的机会；c)三级预防通过例如恢复功能和/或减少任意的病症/失调症/症状或相关的并发症来减少已经确立的病症/失调症/症状的负面影响。
术语“治疗有效量”用于表示引发所示的生物或药物反应的活性化合物或药剂的量。例如，化合物的治疗有效量可以是预防、缓解或减轻疾病的症状或延长被施用治疗的受试者的存活所需的量。该反应可以在组织、系统、动物或人中发生，并且包括缓解所治疗的疾病的征象或症状。鉴于本文提供的公开内容，治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。本文公开的作为剂量需要的化合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的动物(包括人)的类型和所考虑的具体动物的身体特征。可定制剂量以实现期望的效果，但将取决于诸如体重、饮食、并存药物和医学领域的技术人员将认识到的其它因素等因素。
如本文所使用的，术语“骨质疏松症”是指特征在于减少的骨质量和骨结构的破坏的病症，导致增高的骨脆性和增高的骨折风险以及降低的骨钙化或密度。骨质疏松症是骨骼变薄，伴随归因于钙和骨蛋白的耗竭的骨质量的减少。在骨质疏松症患者中，骨强度异常并伴随作为结果发生的骨折风险的增加。骨折可以处于开裂(如在髋部骨折中)或塌陷(如在脊柱的压缩性骨折中)的形式。脊柱、髋部和腕部是骨质疏松症引起的骨折的常见区域，尽管骨折也可能发生在其它骨骼区域。未经检查的骨质疏松症可导致姿势改变、身体异常和活动能力下降。可以通过骨矿物质密度测量来识别骨质疏松症。如本文所使用的，“骨质减少”是指骨形成和骨吸收之间的不平衡，伴随再吸收速率超过形成速率，从而负面地影响骨的生物学和结构完整性，导致骨的钙化或密度降低。
如本文所使用的，术语“糖尿病”指由胰岛素的相对或绝对缺乏引起的疾病，导致不受控的碳水化合物代谢，通常简称为“糖尿病”(diabetes)，尽管糖尿病不应与尿崩症相混淆。除非另有说明，否则本文所使用的“糖尿病(diabetes)”是指糖尿病(diabetesmellitus)。“糖尿病病症”包括前驱糖尿病和糖尿病。1型糖尿病(有时称为“胰岛素依赖型糖尿病”或“青少年型糖尿病”)是一种自身免疫性疾病，其特征在于胰腺β细胞的破坏导致胰岛素完全或几乎完全缺乏。在2型糖尿病(T2DM；有时称为“非胰岛素依赖性糖尿病”或“成年型糖尿病”)中，尽管胰岛素存在，但身体对胰岛素没有反应。如本文所使用的，术语“代谢病症”用于指1型糖尿病、2型糖尿病、前驱糖尿病和糖尿病并发症。
糖尿病的症状包括：过度口渴(烦渴)；尿频(多尿)；极度饥饿或持续进食(多食)；原因不明的体重减轻；尿液中存在葡萄糖(糖尿)；疲倦或疲劳；视力变化；四肢麻木或刺痛(手、脚)；伤口或伤处愈合缓慢；异常高的感染频率。通过空腹血浆葡萄糖(FPG)浓度大于或等于7.0mmol/L(126mg/dL)或在负荷为75g的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后约2小时的血浆葡萄糖浓度大于或等于11.1mmol/L(200mg/dL)，可临床诊断为糖尿病。
如本文所使用的，术语“脱发”是指从头皮中去除毛发或使头发松散或变薄。表述“防止脱发”意味着预防和抑制这种脱发，并且表述“促进毛发生长”意味着促进新毛发的形成或保持现有毛发健康生长。
如本文所述的“皮肤损伤”或“皮肤失调症”可以指能够由可导致皮肤刺激的衰老、晒伤、癌症、皮肤失调症或皮肤疾病引起的对皮肤的损害。不受限制地，“皮肤失调症”和/或“皮肤疾病”可包括皱纹、皮肤的非酶促糖基化、晒伤、烟熏损伤、皮肤纤维化、夏令痤疮(夏季痤疮)、聚合性痤疮、美容剂痤疮(化妆品痤疮)、暴发性痤疮(急性发热性溃疡性痤疮)、颈项部瘢痕性痤疮(瘢痕性痤疮、发部乳头状皮炎、瘢痕性毛囊炎、颈项部瘢痕性毛囊炎、颈部瘢痕性痤疮)、成人前额散在的红色丘疹、寻常性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、坏死性粟疹(痘疱样痤疮)、寻常性痤疮、面部水肿痤疮(实性面部水肿(solid facial edema))、睑瘤、红斑疹性红斑痤疮(红斑血管扩张性红斑痤疮、血管性红斑痤疮)、剥脱性痤疮(少女人为剥脱性痤疮、少女人为痤疮)、腺体红斑痤疮、gnathophyma、革兰氏阴性红斑痤疮、肉芽肿性面部皮炎、成年男性的大的红色的球状鼻、肥大性酒糟鼻、肉芽肿性口周皮炎、卤素痤疮、化脓性汗腺炎(反常性痤疮、严重的脓皮病、韦尔讷伊氏病)、特发性面部无菌性肉芽肿、婴儿痤疮、狼疮状红斑痤疮(肉芽肿性红斑痤疮、丘疹性结核疹、Lewandowsky红斑痤疮样结核疹)、面部播散性粟粒状狼疮、metophyma、新生儿痤疮(婴儿痤疮、初生儿痤疮、新生儿头部脓疱病)、职业性痤疮、油性痤疮、眼红斑痤疮(眼科红斑痤疮、眼部红斑痤疮)、otophyma、口周皮炎、红斑痤疮持续性水肿(慢性上面部红斑性水肿、Morbihan病、红斑痤疮样淋巴水肿)、肿块型红斑痤疮、发膏剂痤疮、丘疹脓疱性红斑痤疮(炎性红斑痤疮)、头部脓肿性穿掘性毛囊周围炎(头皮切割性蜂窝组织炎、解剖性毛囊炎、Hoffman头部脓肿性穿掘性毛囊周围炎)、口周皮炎、眶周皮炎(眼周皮炎)、面部脓皮病(爆发性红斑痤疮)、肥大性红斑痤疮、红斑痤疮(痤疮样红斑痤疮)、聚合性红斑痤疮、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨肥厚-骨髓炎综合征(SAPHO综合征)、类固醇红斑痤疮、焦油痤疮、皮肤癌、热带痤疮、银屑病(包括斑块状银屑病、滴状银屑病、皮褶银屑病、脓疱性银屑病、红皮病性银屑病、指甲银屑病和/或银屑病性关节炎)、和/或其组合和/或变型。在本文所述的一些实施方式中，提供了治疗、抑制、预防或减轻有需要的受试者的疾病或病情的方法。如本文所述，受试者可具有影响皮肤的疾病或病情。
“头发和头皮失调症”是影响头发和头皮的疾病，并且也在本文中描述。影响头发和头皮的疾病可包括但不限于：发秃、雄激素性发秃、多毛症、毛干失调症、炎症、肢端肥大症、湿疹、银屑病、脓疱病、特应性皮炎、毛囊角化病(darier disease)和/或毛囊炎。头皮失调症的常见原因可包括但不限于：肢端肥大症、特应性皮炎、毛囊角化病、湿疹、脆性X综合征、脓疱病、厚皮性骨膜病、银屑病和/或罗-克二氏综合征。在本文所述的一些实施方式中，提供了治疗、抑制、预防或减轻有需要的受试者的疾病或病情的方法。受试者可患有影响皮肤和头皮的疾病。在一些实施方式中，所述受试者患有发秃、雄激素性发秃、多毛症、毛干失调症、炎症、肢端肥大症、湿疹、银屑病、脓疱病、特应性皮炎、毛囊角化病和/或毛囊炎。在一些实施方式中，所述受试者患有肢端肥大症、特应性皮炎、毛囊角化病、湿疹、脆性X综合征、脓疱病、厚皮性骨膜病、银屑病和/或罗-克二氏综合征。在一些实施方式中，该方案包括向有需要的受试者施用制剂。在一些实施方式中，该制剂处于如下范围内：发乳、发胶、头皮洗剂、洗发剂、护发素、喷发剂或头发摩丝。
“指甲疾病”是影响指甲、甲床或角质层区域的失调症或疾病，并且也在本文中描述。影响指甲和周围皮肤区域(如外皮)的疾病可导致可能需要医疗帮助的感染或炎症。感染指甲、甲床和/或外皮的疾病可包括但不限于：甲床炎、嵌甲(onchyocryptosis)、onychodystophy、甲弯曲、甲剥离、脱甲病、甲真菌病、甲癣、甲床角化、甲脱落、脆甲症(onchorrhexis)、甲沟炎、凹甲、甲下血肿、甲母质瘤、指甲天疱疮、红甲和/或黑甲。在本文所述的一些实施方式中，提供了治疗、抑制、预防或减轻有需要的受试者的疾病或病情的方法。受试者可患有影响指甲、甲床和/或外皮的疾病或病情。在一些实施方式中，所述受试者患有发秃、雄激素性发秃、多毛症、毛干失调症、炎症、肢端肥大症、湿疹、银屑病、脓疱病、特应性皮炎、毛囊角化病和/或毛囊炎。在一些实施方式中，所述受试者患有甲床炎、嵌甲、onychodystophy、甲弯曲、甲剥离、脱甲病、甲真菌病、甲癣、甲床角化、甲脱落、脆甲症、甲沟炎、凹甲、甲下血肿、甲母质瘤、指甲天疱疮、红甲和/或黑甲。在一些实施方式中，治疗、抑制、预防或减轻包括向有需要的受试者施用制剂。在一些实施方式中，制剂处于如下的范围内：护肤霜、洗剂、表皮润滑膏或指甲油。
如本文所使用的“自身免疫失调症”或“自身免疫疾病”描述了由针对机体自身的细胞或组织的免疫应答引起的疾病。自身免疫失调症导致一种或多种类型的机体组织的破坏、器官的异常生长、或者器官的一种或多种功能的改变。这些失调症可能仅影响一种器官或组织类型，或可能影响多种器官和组织类型。此外，一个人可同时经历一种或多种自身免疫疾病。通常受到自身免疫失调症影响的器官和组织包括血液成分，例如红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺体(例如甲状腺或胰腺、肌肉、关节和/或皮肤)。
自身免疫失调症通常分为两种一般类型：(1)系统性自身免疫疾病(例如损害许多器官或组织的失调症)，和(2)局部自身免疫疾病(例如仅损害单个器官或组织的疾病)。然而，通过间接影响其它的机体器官和系统，局部自身免疫疾病的影响可能是系统性的。系统性自身免疫疾病包括但不限于：类风湿性关节炎，其可影响关节并且可影响肺和皮肤；狼疮，包括系统性红斑狼疮(SLE)，其可影响皮肤、关节、肾脏、心脏、大脑和/或红细胞以及其它组织和器官；硬皮病，其可影响皮肤、肠和/或肺；干燥综合征(Sjogren’s syndrome)，其可影响唾液腺、泪腺和/或关节；肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)，其可影响肺部和/或肾脏；韦格纳肉芽肿病，其可影响鼻窦、肺和/或肾脏；风湿性多肌痛，其可影响大肌群、和/或颞动脉炎/巨细胞性动脉炎，可影响头部和/或颈部动脉。局部自身免疫疾病包括但不限于：1型糖尿病，其影响胰岛；桥本氏甲状腺炎和/或格雷夫斯病，其影响甲状腺；乳糜泻、克罗恩病和/或溃疡性结肠炎，其影响胃肠道；多发性硬化症(MS)和格林-巴利综合征，其影响中枢神经系统；爱迪生氏病，其影响肾上腺；原发性胆管硬化、硬化性胆管炎和/或自身免疫性肝炎，其影响肝脏；以及雷诺现象，其可以影响手指、脚趾、鼻子、耳朵。自身免疫失调症的额外的实例包括：恶性贫血、爱迪生氏病、皮肌炎、重症肌无力(MG)、Reiter综合征、寻常型天疱疮、硬皮病和/或CREST综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、强直性脊柱炎、血管炎、和/或肌萎缩侧索硬化症(Lou Gehrig病)。
根据疾病的类型，自身免疫失调症的症状可以广泛变化。常见的症状或疾病状态包括：疲劳、头晕、不适和/或发烧。在一种或多种自身免疫失调症中可观察到的其它症状或疾病状态包括：寒战、体重减轻、皮疹、血管炎、多关节痛、斑片状脱发、口腔和/或鼻腔溃疡、淋巴结肿大、胃病、全身疼痛(在关节炎的情况下，可能位于关节)、腺体增大(如在Grave病的情况下的甲状腺)、心悸、真皮水疱和/或病变、肌肉无力。在一些实施方式中，治疗、抑制、预防或减轻包括向受试者施用制剂以预防、治疗或减轻自身免疫失调症。在一些实施方式中，治疗、抑制、预防或减轻包括施用用于治疗自身免疫失调症的症状的制剂。
如本文所使用的“黄斑变性”是指视网膜的中央部分(黄斑)的恶化，其可导致视野中心的视力模糊或视力丧失。黄斑变性可被表征为年龄相关的黄斑变性(AMD)，并且可以包括干性黄斑变性或湿性黄斑变性(也称为新生血管性或渗出性黄斑变性)。在一些实施方式中，治疗、抑制、预防或减轻黄斑变性包括向受试者施用制剂以预防、治疗、抑制或减轻黄斑变性。在一些实施方式中，制剂可以静脉内施用。在一些实施方式中，除了治疗黄斑变性之外，静脉内施用作为用于其它疾病的治疗是有益的。在一些实施方式中，可以通过玻璃体内、眼眶下、眼球后、眼内、结膜下或其它眼部注射将制剂施用到眼中。在一些实施方式中，治疗、抑制、预防或减轻包括施用用于治疗黄斑变性的症状的制剂。对于在眼内或眼周的施用，将制剂以如下的量施用：5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL或100μL或处于由前述的任意两个体积所限定的范围内的量。对于眼内或眼周的施用，将制剂进行浓缩，从而使得对于每次施用，将PBD-PSC以如下的量施用或提供给有需要的受试者：1,000个细胞/μL、5,000个细胞/μL、10,000个细胞/μL、50,000个细胞/μL、100,000个细胞/μL、500,000个细胞/μL、1,000,000个细胞/μL、2,000,000个细胞/μL、3,000,000个细胞/μL、4,000,000个细胞/μL、5,000,000个细胞/μL、6,000,000个细胞/μL、7,000,000个细胞/μL、8,000,000个细胞/μL、9,000,000个细胞/μL、10,000,000个细胞/μL、50,000,000个细胞/μL或100,000,000个细胞/μL，或处于由前述的任意两个每μL的细胞的量限定的范围内的量。
如本文所用，术语“受试者”是动物，例如脊椎动物，优选哺乳动物。术语“哺乳动物”被定义为属于哺乳动物类的个体，并且包括但不限于人、家畜动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如绵羊、狗、马、猫或奶牛。在一些实施方式中，受试者是小鼠或大鼠。在一些实施方式中，受试者是人。“受试者”包括表现出本文所述的一种或多种失调症的症状或处于表现出该症状的风险中的任意动物。合适的受试者(患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。非人灵长类动物和/或优选人类患者被囊括在内。
“药学上可接受的”载体是对在所使用的剂量和浓度下暴露至其的细胞或哺乳动物而言无毒的载体。“药学上可接受的”载体可以是但不限于有机或无机、固体或液体赋形剂，该赋形剂适合于所选择的施用模式，如口服施用或注射，并且以常规药物制剂(例如诸如片剂、颗粒、粉末、胶囊的固体，和/或诸如溶液、乳液或混悬液的液体)的形式施用。生理学上可接受的载体通常是水性pH缓冲溶液如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。生理学上可接受的载体还可以包括下列中的一种或多种：抗氧化剂(包括抗坏血酸)、低分子量(少于约10个残基)的多肽、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸或碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(如EDTA)、糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)、成盐品反离子(如钠)和非离子表面活性剂(如TweenTM、聚乙烯乙二醇(PEG)和/或PluronicsTM)。还可以向载体中加入辅助剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂控制剂或等渗剂和其它的常规添加剂。
药学上可接受的或适当的载体可以包括已知对胃肠道的受损情况有益的其它化合物(例如抗氧化剂如维生素C、维生素E、硒或锌)；或食物组合物。食物组合物可以是但不限于乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方、片剂、液体细菌混悬液干的口服补充剂或湿润的口服补充剂。
干细胞
如本文所使用的，“干细胞”是指在合适的条件下能分化成具有特定的特化功能的其它细胞类型(例如“完全分化的”细胞)，而在其它合适的条件下能自我更新并保持处于如下文详述的未分化的多潜能或多能状态的细胞。如本文所使用的“细胞”是指单个细胞以及细胞群(例如多于一个细胞)。该群可以是包含一种细胞类型的纯的群。或者，该群可以包含多于一种的细胞类型。干细胞优选是从例如外周血、脂肪组织、骨髓、雌性卵泡液和/或雄性精液获得的PBD-PSC。
如本文所使用的，“外周血衍生的多能干细胞”(或“PBD-PSC”)是指细胞或细胞群，其特征在于所述细胞的直径为2.5μm-4.5μm，例如直径为2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm或4.5μm、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量，并且高度表达PTH1R。PBD-PSC在本文中也称为PTH1R阳性干细胞、PTH1R阳性细胞或PTH1R阳性PSC。PBD-PSC对CD90和CD133而言是阳性的；对CD29、CD34、CD105和CD106而言是阳性/阴性的；并且对SSEA-3、CD200和CD45而言是阴性的。在一些实施方式中，干细胞表达SOX2和OCT4。虽然名称表明干细胞来源于外周血，但PBD-PSC也可以来自其它来源(在该处发现它们可以大量存在)，包括外周血、脂肪组织、骨髓、雌性卵泡液和/或雄性精液。在一些实施方式中，PBD-PSC存在于细胞群中。在一些实施方式中，细胞群包括另外的干细胞和/或内皮细胞和/或其它的再生细胞。在一些实施方式中，PBD-PSC被包括在具有非再生细胞的细胞群中，所述非再生细胞例如脂肪细胞、皮肤细胞、骨细胞、肌肉细胞和/或来自雌性或雄性生殖系统的细胞(如子宫壁或睾丸细胞)。在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC添加回细胞群或与细胞群混合，该细胞群可以包括另外的再生细胞或可以包括非再生细胞(例如脂肪细胞、皮肤细胞、肌肉细胞、骨细胞、或者雌性或雄性生殖系统的细胞(如子宫细胞或睾丸细胞))。
可以通过离心、过滤、裂解和分离技术从外周血样品中获得细胞。离心可以在100G、200G、300G、400G、500G、600G、700G、800G、900G、1000G、1100G、1200G、1300G、1400G、1500G、1600G、1700G、1800G、1900G、2000G、2100G、2200G、2300G、2400G或2500G、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的离心力下进行。离心可以包括各种循环以分离外周血的期望组分。例如，可以使用第一离心步骤来分离血浆层，该步骤在低速离心(例如诸如100G、200G、300G、400G或500G)下进行，或在处于由前述的任意两个值限定的范围内的离心力下进行。然后可以使经分离的血浆层接受更高速的离心(例如诸如800G、900G、1000G、1100G、1200G或更高，或在处于由前述的任意两个值限定的范围内的离心力下进行)以分离血小板。血小板发生沉淀，并且可以分离和悬浮沉淀物。可以使经重悬的血小板在过滤器中接受过滤以除去碎片或不需要的物质，例如该过滤器具有0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、2μm、3μm、4μm或5μm的孔或大小处于由前述的任意两个值限定的范围内的孔。然后，可以使血小板接受裂解以获得血小板裂解物，该裂解物可以通过离心和/或过滤而进一步分离或纯化。裂解可以通过各种技术进行，包括例如基于试剂的裂解、物理破坏(超声处理)。通过阴性选择(例如使血小板裂解物与抗体、例如抗CD45抗体接触，以结合除PBD-PSC之外的细胞)或阳性选择(例如使血小板裂解物与抗体、例如抗PTH受体抗体接触以结合PBD-PSC)经由接触血小板裂解物而可以从血小板裂解物中分离PBD-PSC。
成年哺乳动物睾丸中的最原始的生殖细胞是精原干细胞(SSC)；而原始卵泡(PFs)被认为是卵巢中的基本功能单位。然而，最近已经随着成年哺乳动物性腺中的PBD-PSC的鉴定而修改了该中心法则。这些干细胞相对于SSCs更为原始，并且也在出生后的卵巢新生成和原始的卵泡组装的过程中涉及到。PBD-PSC在性质上是多能的并且其特征在于核Oct-4A、细胞表面SSEA-4和其它多能标记物如Nanog、Sox2和/或TERT。PBD-PSC被认为是外胚层干细胞的后代，并且可能是持续到成年期并经历不对称细胞分裂以在整个生命过程中补充性腺生殖细胞的原始生殖细胞。本文解决了PBD-PSC在不育症、子宫内膜修复、超数排卵和各种生殖疾病(如PCOS、子宫内膜异位症、癌症)的发病机理中的作用。本文提供的一些实施方式涉及用于更好地理解各种生殖过程和癌症的研究的新途径。在一些实施方式中，PBD-PSC与再生医学、转化研究和人类生殖中的临床应用相关。
雌性生来具有固定数量的卵的现有法则受到通过成年哺乳动物卵巢中的干细胞的检出的挑战。已使用不同策略积累数据以支持卵巢干细胞(OSCs)增殖、培养的维持、生殖细胞巢的形成和分化为卵母细胞、以及原始卵泡组装。
流式细胞术分析已鉴定出>8μm的OSC，该OSC为DDX1阳性的并且被认为等同于睾丸中的精原干细胞(SSC)。酶消化后获得的卵巢和睾丸涂片的分析已引起PBD-PSC的鉴定。如上所述，PBD-PSC和OSC/SSC在其大小和OCT-4表达方面彼此不同。PBD-PSC表达多能标记物，包括核OCT-4，而OSC/SSCs表达细胞质OCT-4，表明分化状态。PBD-PSC可以通过流式细胞术而被作为小尺寸细胞进行研究，其为LIN-/CD45-/Sca-1+。PBD-PSCs分别在正常、化学脱除和FSH处理后的化学脱除小鼠卵巢中占总细胞的0.02±0.008％、0.03±0.017％和0.08±0.03％。
在整个过程中以1000G(而不是1200rpm)的速度酶促消化卵巢组织后获得的细胞的旋转或离心允许通过流式细胞术可靠地检测PBD-PSC。因此，在一些程序中，通过一种方法制备PBD-PSC，其中卵巢组织被酶消化或机械剪切以释放PBD-PSC，并且通过以900G、950G、975G或1000G或以处于前述的任意两个值限定的范围内的离心力下离心来分离所述PBD-PSC。
“甲状旁腺激素1型受体”(或“PTH1R”)是在PBD-PSC上表达的蛋白质，其充当甲状旁腺激素(PTH)和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)的受体。PTH和PTHrP充当PBD-PSC的化学引诱物，并因此可用于将PBD-PSC靶向至生物体内特定的、期望的区域。
如本文所使用的，“细胞培养物”或“经培养的细胞”是指在人工的体外环境例如处于容器中的培养基中维持、培养、培育或生长的细胞或组织。该术语包括连续细胞系(例如具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如非转化细胞)和在体外维持的任意其它细胞群。在这方面，原代细胞是在没有培养的情况下直接从动物(包括人)的组织或器官获得的细胞。通常(尽管不是必需的)，在衰老和/或停止增殖之前，原代细胞能在体外经历10次或更少的传代。
如本文所使用的，“未分化的”是指当细胞群中的显著比例(至少20％，并且可能超过50％或80％)的细胞及其衍生物显示未分化细胞的形态特征时的经培养的细胞，该特征将它们与胚胎或成年来源的经分化的细胞区分开。当细胞在至少3周的培养期间经历至少1次群倍增，同时在所述培养期后保留至少约50％或相同比例的具有特征标记物或未分化的细胞的形态特征的细胞时，细胞被认为在未分化状态下增殖。
如本文所使用的，“细胞混悬液”是指其中大部分的细胞自由地漂浮在基质(通常是培养基(系统))中并且细胞作为单细胞、作为细胞簇和/或作为细胞聚集物漂浮的细胞培养物。换句话说，细胞在培养基中存活并繁殖，而不附着至固体或半固体基底。如本文所使用的“粘附细胞”是指粘附至基底或表面的细胞或细胞群。
如本文所使用的“培养系统”是指用于支持PBD-PSC的维持和繁殖的培养条件。该术语表示要素的组合，所述要素可包括基础培养基(通常包含限定的基础溶液(包含盐、糖和氨基酸)的细胞培养基)和血清替代补充物。培养系统可以进一步包含其它要素，例如但不限于细胞外基质(ECM)组分、额外的血清或血清替代物、培养物(营养物)培养基和其它外源添加因子，它们一起提供支持PBD-PSC生长、细胞培养物维持、细胞分化或各种分子的表达的合适条件。在相关的上下文中，术语“培养系统”还涵盖在其中培养的细胞。
如本文所使用的，PBD-PSC培养系统包括在蛋白质的存在下培养的干细胞，所述蛋白质例如细胞外基质蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。具体实例包括表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF和bFGF)、转化生长因子(TGF-α以及TGF-β1、2和3)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角化细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、白细胞介素细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13)、干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)、集落刺激因子(GM-CSF和M-CSF)、胰岛素、甲状旁腺激素、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、肌腱蛋白、血小板反应蛋白、明胶、肌原纤维蛋白、分区蛋白、锚蛋白、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨涎蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、epinectin、透明质粘连蛋白、粗纤维调节素、表皮整联配体蛋白、缰蛋白、胶原酶、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、集聚蛋白、巢蛋白和/或内功素或者其变型和/或组合。在一些实施方式中，将PBD-PSC用视黄酸和/或用一种或多种视黄酸衍生物或者其它小分子进行培养。
如本文所使用的“基因产物”是指转染到细胞或细胞群中的基因的产物。被转染的基因可编码例如蛋白质，如细胞外基质蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。具体实例包括表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF和bFGF)、转化生长因子(TGF-α以及TGF-β1、2和3)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角化细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、白细胞介素细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13)、干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)、集落刺激因子(GM-CSF和M-CSF)、胰岛素、甲状旁腺激素、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、肌腱蛋白、血小板反应蛋白、明胶、肌原纤维蛋白、分区蛋白、锚蛋白、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨涎蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、epinectin、透明质粘连蛋白、粗纤维调节素、表皮整联配体蛋白、缰蛋白、胶原酶、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、集聚蛋白、巢蛋白和/或内功素或者其变型和/或组合。
如本文所使用的，“细胞标记物”是指细胞的任意表型特征，其可用于显表征该细胞或将该细胞与其它细胞类型区分开。标记物可以是蛋白质(包括分泌的、细胞表面的或内部的蛋白质；由细胞合成或摄取)、核酸(例如mRNA或酶活性核酸分子)或多糖。被包括在内的是可通过抗体、凝集素、探针或核酸扩增反应检测的任意此类细胞组分的决定簇，该决定簇对感兴趣的细胞类型而言是特异性的。还可以通过取决于基因产物的功能的生物化学测定或酶测定来识别标记物。与每个标记物相关联的是编码转录物的基因，以及引起标记物表达的事件。如果标记物以至少高5倍的水平(就在抗体或PCR检测中测定的总的基因产物而言)或至少更多5倍的频率(就在群中的阳性细胞而言)进行表达，则认为该标记物优先在未分化或分化的细胞群中表达。更加优选10倍、100倍或10,000倍更高或更频繁地表达的标记物。
在一些实施方式中，提供了干细胞群，其中，所述干细胞群包含PBD-PSC。如图6所示，所述PBD-PSC的直径为2.5-4.5μm，如直径为2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm或4.5μm、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量。此外，细胞的特征在于其表达PTH1R。如图7所示，当被培养时，PBD-PSC形成类胚体，并且当被培养时能分化成外胚层、中胚层和内胚层。在一些实施方式中，细胞表达经典CD标记物。PBD-PSC对CD90和CD133而言是阳性的；对CD29、CD34、CD105和CD106而言是阳性/阴性的；并且对SSEA-3、CD200和CD45而言是阴性的。另外，如图8所示，PBD-PSC表达Sox2和Oct4。此外，PBD-PSC对SSEA-4和CXCR-4而言是阳性的。PBD-PSC对Lin Cocktail、Sca-1和Lgr5而言是+/-的。
除人之外，PBD-PSC还被发现于多种动物群体中，包括例如马科动物、犬科动物和骆驼，如图9所示。此外，可任选地将PBD-PSC用一种或多种肽(例如ECM蛋白、细胞因子、生长因子或抗原)进行培养。
在一些实施方式中，提供了针对PBD-PSC的抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。“经分离的抗体”是与天然相关组分无关联的抗体，包括以其天然状态伴随其并且不含来自相同物种的其它蛋白质的其它天然相关抗体。此外，经分离的抗体由来自不同物种的细胞表达或在自然界中不存在。术语人抗体包括具有人免疫球蛋白序列来源的一个或多个可变区和恒定区的所有抗体。人源化抗体是非人物种来源的抗体，其中重链和轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸已经突变，以避免或消除人的免疫应答。或者，可以通过将来自人抗体的恒定结构域融合至非人物种的可变结构域来产生人源化抗体。
分离PBD-PSC的方法
一些实施方式涉及从受试者的样品中分离PBD-PSC的方法。受试者可以是人或其它哺乳动物，如家畜、伴侣动物或农场动物。在一些实施方式中，受试者是马、狗、猫或骆驼。在一些实施方式中，样品是外周血、脂肪组织、骨髓、卵泡液或精液。在一些实施方式中，使样品与PBD-PSC的抗体接触。在一些实施方式中，抗体是抗PTH1R抗体。在一些实施方式中，抗体与磁珠结合，以帮助从样品中分离和分出抗体。在这种情况下，将磁场施加至样品，并将与抗体-PBD-PSC复合物结合的磁珠与样品混合物分离。在一些实施方式中，用分离缓冲液洗涤样品，并分离PBD-PSC。在一些实施方式中，使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和生物素以将磁珠附着至抗体。
在一些实施方式中，将PBD-PSC在体外分离。通过一种这样的方式，获得来自受试者的全血或血浆并将其引入体外系统中，所述体外系统包括膜、支持物或珠，优选多孔膜，其被配置成捕获PBD-PSC，例如具有附着或固定化至膜、支持物或珠的抗PTH1R抗体或其结合部分的膜、珠或支持物。附着或固定化至所述膜、支持物或珠的抗PTH1R抗体或其结合部分可以被引入盒中，所述盒被配置用于引入或组装到透析或血液再循环装置中。在一些实施方式中，向膜施加离心力或重力或压力，从而使全血通过膜、支持物或珠但保留PBD-PSC，PBD-PSC被膜、支持物或珠捕获。在一些实施方式中，将通过的血液重新输注到受试者内。在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC制备用于随后向个体的重新输注到或施用。
在一些实施方式中，从受试者的样品中分离的PBD-PSC的量是1,000个细胞/mL样品、5,000个细胞/mL样品、10,000个细胞/mL样品、50,000个细胞/mL样品、100,000个细胞/mL样品、500,000个细胞/mL样品、1,000,000个细胞/mL样品、2,000,000个细胞/mL样品、3,000,000个细胞/mL样品、4,000,000个细胞/mL样品、5,000,000个细胞/mL样品、6,000,000个细胞/mL样品、7,000,000个细胞/mL样品、8,000,000个细胞/mL样品、9,000,000个细胞/mL样品、10,000,000个细胞/mL样品、50,000,000个细胞/mL样品或100,000,000个细胞/mL样品(外周血、组织匀浆等)、或处于由前述的任意两个量限定的范围内的量。
使用PBD-PSC的方法
本发明的方面关于PBD-PSC的第一医学用途。因此，一些实施方式涉及用作药物的PBD-PSC。本文提供的一些实施方式涉及PBD-PSC用于治疗或减轻不育症、皮肤失调症、脱发、恶性癌症、骨失调症、神经失调症和/或自身免疫失调症的用途。在这些方法中，将PBD-PSC和/或包含PBD-PSC的细胞群施用或提供给所选定的或鉴定的受试者，例如经选定或鉴定用于接受治疗或减轻不育症、皮肤失调症、脱发、恶性癌症、骨失调症、神经失调症和/或自身免疫失调症的疗法的受试者。可以通过临床评估和/或诊断测试来完成对这种有需要的受试者的选择和/或鉴定。
在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC施用至患有不育症的受试者，例如被选定和/或鉴定为需要不育症治疗或需要减轻不育症的治疗方法的受试者。在一些实施方式中，所选定或鉴定的受试者先前已进行过体外受精和/或胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)，但是未成功。在一些实施方式中，所选定或鉴定的受试者不患有多囊性卵巢综合征(PCOS)。在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC或包含PBD-PSC的细胞群通过动脉内注射到子宫动脉中而施用至所述受试者。在一些实施方式中，静脉内施用PBD-PSC。在一些实施方式中，PBD-PSC治疗增加子宫内膜厚度、子宫内膜容受性、卵母细胞计数、卵母细胞质量、卵巢功能或雌二醇量或其组合。
在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC或包含PBD-PSC的细胞群施用至已被选定或鉴定为患有皮肤失调症的受试者，例如被选定和/或鉴定为需要皮肤失调症治疗或需要减轻皮肤失调症的治疗方法的受试者。在一些实施方式中，受试者被鉴定或选定为患有皮肤失调症(例如导致皱纹的皮肤衰老、弹性丧失或皮肤光泽丧失)的受试者。在一些实施方式中，受试者已被鉴定或选定为患有真皮胶原蛋白丧失和/或真皮弹性蛋白丧失或具有细纹和/或皱纹或期望去除细纹和/或皱纹的受试者。在一些实施方式中，将PBD-PSC通过乳膏或洗剂进行局部施用。在一些实施方式中，将PBD-PSC皮下或透皮施用。在一些实施方式中，PBD-PSC治疗增加真皮胶原蛋白和弹性蛋白，并减少细纹、减少皱纹、增加光泽、或增加皮肤紧致度或其组合。
在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC或包含PBD-PSC的细胞群施用至已被选定或鉴定为患有骨失调症的受试者，例如被选定和/或鉴定为需要骨失调症治疗或需要减轻骨失调症的治疗方法的受试者。在一些实施方式中，骨失调症是骨损伤、骨折、棘突骨折、骨质减少或骨质疏松症或其组合。在一些实施方式中，将组合物皮下、静脉内或动脉内施用至被鉴定或选定的受试者。在一些实施方式中，PBD-PSC的施用引起骨密度增加、骨损害修复或其组合。
在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC或包含PBD-PSC的细胞群施用至已被选定或鉴定为患有神经失调症的受试者，例如被选定和/或鉴定为需要神经失调症治疗或需要减轻神经失调症的治疗方法的受试者。在一些实施方式中，神经失调症是小脑性共济失调。在一些实施方式中，将PBD-PSC皮下、静脉内或动脉内施用至受试者。在一些实施方式中，PBD-PSC的施用引起神经失调症的改善。
在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC或包含PBD-PSC的细胞群施用至已被选定或鉴定为患有转移性癌或其它恶性肿瘤的受试者，例如被选定和/或鉴定为需要治疗恶性肿瘤或转移性癌或者需要减轻恶性肿瘤或转移性癌的治疗方法的受试者。在一些实施方式中，转移性癌是肺转移瘤。在一些实施方式中，将PBD-PSC皮下、静脉内或动脉内施用至受试者。在一些实施方式中，PBD-PSC的施用引起恶性肿瘤或转移性癌的改善。
在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC或包含PBD-PSC的细胞群施用至已被选定或鉴定为患有自身免疫失调症或表现出自身免疫病失调症的症状的受试者。在一些实施方式中，自身免疫失调症是本文鉴定或描述的一种或多种失调症。在一些实施方式中，将PBD-PSC皮下、静脉内或动脉内施用至受试者。在一些实施方式中，PBD-PSC的施用引起自身免疫失调症的改善。
在一些实施方式中，从供体分离PBD-PSC并移植到需要用PBD-PSC进行治疗的受体。在一些实施方式中，供体是年轻受试者。在一些实施方式中，受体是有需要的年老的受试者。在一些实施方式中，受体可能患有如本文所述的失调症。在一些实施方式中，受体可能遭受衰老效应。在一些实施方式中，供体细胞可以或可以不与受体细胞的组织或血液匹配，但是受体能进行治疗而无不匹配的供体的后果。图13-图19总体上描绘了供体细胞用于向受体提供抗衰老作用的用途。
因此，在一些实施方式中，根据本文所述的教导制备的PBD-PSC制剂包含纯化的PBD-PSC。在一些实施方式中，该制剂还包含药学上可接受的载体、蛋白质(例如细胞外基质蛋白、细胞因子、生长因子或抗原)。在一些实施方式中，前述制剂可用于治疗、预防或减轻或抑制皮肤失调症，例如任意一种或多种如下的失调症：皱纹、皮肤的非酶促糖基化、晒伤、烟熏损伤、皮肤纤维化、夏令痤疮(夏季痤疮)、聚合性痤疮、美容剂痤疮(化妆品痤疮)、暴发性痤疮(急性发热性溃疡性痤疮)、颈项部瘢痕性痤疮(瘢痕性痤疮、发部乳头状皮炎、瘢痕性毛囊炎、颈项部瘢痕性毛囊炎、颈部瘢痕性痤疮)、成人前额散在的红色丘疹、寻常性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、坏死性粟疹(痘疱样痤疮)、寻常性痤疮、面部水肿痤疮(实性面部水肿)、睑瘤、红斑疹性红斑痤疮(红斑血管扩张性红斑痤疮、血管性红斑痤疮)、剥脱性痤疮(少女人为剥脱性痤疮、少女人为痤疮)，腺体红斑痤疮、gnathophyma、革兰氏阴性红斑痤疮、肉芽肿性面部皮炎、成年男性的大的红色的球状鼻、肥大性酒糟鼻、肉芽肿性口周皮炎、卤素痤疮、化脓性汗腺炎(反常性痤疮、严重的脓皮病、韦尔讷伊氏病)、特发性面部无菌性肉芽肿、婴儿痤疮、狼疮状红斑痤疮(肉芽肿性红斑痤疮、丘疹性结核疹、Lewandowsky红斑痤疮样结核疹)、面部播散性粟粒状狼疮、metophyma、新生儿痤疮(婴儿痤疮、初生儿痤疮、新生儿头部脓疱病)、职业性痤疮、油性痤疮、眼红斑痤疮(眼科红斑痤疮、眼部红斑痤疮)、otophyma、口周皮炎、红斑痤疮持续性水肿(慢性上面部红斑性水肿、Morbihan病、红斑痤疮样淋巴水肿)、肿块型红斑痤疮、发膏剂痤疮、丘疹脓疱性红斑痤疮(炎性红斑痤疮)、头部脓肿性穿掘性毛囊周围炎(头皮切割性蜂窝组织炎、解剖性毛囊炎、Hoffman头部脓肿性穿掘性毛囊周围炎)、口周皮炎、眶周皮炎(眼周皮炎)、面部脓皮病(爆发性红斑痤疮)、肥大性红斑痤疮、红斑痤疮(痤疮样红斑痤疮)、聚合性红斑痤疮、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨肥厚-骨髓炎综合征(SAPHO综合征)、类固醇红斑痤疮、焦油痤疮、皮肤癌、热带痤疮、银屑病(包括斑块状银屑病、滴状银屑病、皮褶银屑病、脓疱性银屑病、红皮病性银屑病、指甲银屑病和/或银屑病性关节炎)和/或其组合和/或变型。
图13是描绘作为衰老的结果的干细胞的一般功能衰退的示意图。许多影响一致地工作以导致功能衰退，包括例如外源性和内源性影响。外源性影响可包括例如炎性细胞因子或增加的Wnt激活因子。内源性影响包括代谢功能障碍。这些影响与分子效应器(例如活性氧物质)一起工作，导致基因组学、表观基因组学和/或蛋白质组学变化，造成干细胞的功能衰退，这进一步加剧了负面内源性影响。此外，功能衰退导致组织功能障碍和生物体衰老，这进一步加剧了外源性影响，导致衰老效应。
图14示出了从经历较少负面影响的年幼干细胞以及经历较多数量的内源性和外源性影响(导致衰老效应)的年老干细胞角度来看的干细胞的后代。图15显示了PBD-PSC数量与患者年龄呈负相关的强烈趋势。
本文使用肯定的语言来描述许多实施方式，大体上公开了本发明以。本发明还包括在其中全部或部分排除主题(如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序)的实施方式。因此，就本发明并不包含的方面(本发明中并未明确排除的方法)而言，尽管本发明总体上并不会在本文中表达，但其仍然在本文中公开。
实施例
以下实施例中更详细地公开了上文讨论的实施方式的一些方面，这些实施例并不旨在以任何方式限制本公开的范围。本领域技术人员将理解的是，许多其它实施方式也落入本发明的范围内，如上文和权利要求中所述。
实施例1
抗PBD-PSC抗体的制备
以下实施例说明了开发针对PBD-PSC的单克隆抗体(mAb)的方法。
图10提供了用于开发针对PBD-PSC的单克隆抗体的一般程序。在步骤1中，通过向小鼠注射干细胞，用PBD-PSC免疫小鼠。小鼠脾脏产生分泌针对干细胞的抗体的浆细胞。在步骤2中，选择不能产生抗体的骨髓瘤细胞。在步骤3中，移除小鼠脾脏，将来自脾脏的浆细胞分离并与骨髓瘤细胞混合。诱导细胞融合以产生杂交瘤。在步骤4中，将细胞转移至次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中。未融合的浆细胞和未融合的骨髓瘤细胞死亡。最后，在步骤5中，选择产生对多能干细胞而言特异性的抗体的杂交瘤并大量生长。
实施例2
从血液或组织来源分离PBD-PSC
以下实施例说明了分离PBD-PSC的方法。
从受试者获得样品。样品可包括外周血、脂肪组织、骨髓、卵泡液或精浆或其组合。如图11所示，将样品与针对PBD-PSC的mAb混合。单克隆抗体可以是例如抗PTH1R的抗体。在一些实施方式中，可包括磁珠以用于分离mAb-PBD-PSC复合物。在一些实施方式中，使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和生物素将磁珠附着至抗体。在这种情况下，施加磁场，并洗涤样品以除去未结合的上清液。用洗涤缓冲液从mAb释放PBD-PSC，并分离细胞。
实施例3
从外周血中分离PBD-PSC
以下实施例说明了使用体外系统从外周血中分离PBD-PSC的方法。
将受试者或供体连接至体外装置。从供体抽取全血，并引导至体外装置，如图12所示。该装置包括血液通过的多孔膜。血液可以借助离心力或重力通过膜，而PBD-PSC被分离或捕获在膜上。以这种方式将PBD-PSC从全血中分离。通过的血液可以被重新输注到个体内。将PBD-PSC以1,000个细胞/mL样品至100,000,000个细胞/mL样品的量进行分离。在一些实施方式中，将经分离的PBD-PSC制备用于随后的向个体的重新输注或施用。
实施例4
PBD-PSCs在纳米纤维基质上的生长
以下实施例说明了使PBD-PSC在纳米纤维基质上生长的方法。
从55岁健康男性中分离PBD-PSC并在纳米纤维基质上生长。具有PBD-PSC生长于其上的纳米纤维基质的电子显微照片在图20A(0分钟)、图20B(5分钟；顶部，1200倍放大；底部，5000倍放大)、图20C(30分钟；顶部，1200倍放大；底部，5000倍放大)和图20D(120分钟)中示出。PBD-PSC在5分钟-30分钟内结合并沉积在基质上。
纳米纤维基质由静电纺丝聚己内酯(PCL)纤维制备，其厚度范围为200μm-700μm。通过使用激光将纤维分解成粉末。该基质的组合使用可包括注射到关节和骨骼中(例如骨折和牙科应用)或放置在伤口上。
实施例5
使用PBD-PSC的皮肤治疗
以下实施例说明使用PBD-PSC制剂治疗皮肤以改善胶原蛋白和弹性蛋白的方法。
将PBD-PSC制剂用于解决衰老皮肤的问题。从受试者获得自体PBD-PSC并用作美塑治疗剂以通过增加真皮胶原蛋白和弹性蛋白来对抗过早的皮肤衰老。如图21所示，胶原蛋白和弹性蛋白的量从治疗前(第0天)到治疗后30天增加。另外，如表1所示，在治疗后，皮肤衰老的美容测量值得到改善。
表1.PBD-PSC用于衰老皮肤的治疗的美容效果
*n＝30
这些结果表明，PBD-PSC制剂用于通过增加真皮胶原蛋白和弹性蛋白来改善衰老皮肤的影响，从而减少细纹，并增加光泽和紧致度。
实施例6
使用PBD-PSC的毛发再生
以下实施例说明了使用PBD-PSC制剂治疗脱发或改善毛发生长的方法。
向患有脱发的受试者提供PBD-PSC的自体制剂。如图22所示，在用PBD-PSC制剂处理10周后，毛发生长显著增加。该结果证明了PBD-PSC制剂用于改善毛发生长的有效性。PBD-PSC制剂包含经纯化或分离的PBD-PSC，并且还包含药学上可接受的载体。该制剂可进一步包含蛋白质、生长因子或其它试剂。
实施例7
PBD-PSCs用于骨折的治疗
以下实施例证明PBD-PSC对治疗骨折有用。
图23A-图23C描绘了骨折的图像。受试者是一名50岁的患者，患有不愈合的C-7棘突骨折。在损伤后9个月用包含PBD-PSC的制剂处理骨折。将PBD-PSC静脉内和局部注射到骨折处附近。
图23B描绘了冠状颈椎骨折的CT扫描。左侧图像示出了治疗前的骨折。如上所述用PBD-PSC制剂静脉内和局部注射来治疗受试者。治疗后4个月(右侧图像)，骨折完全愈合。图23C描绘了矢状颈椎骨折的CT扫描。左侧图像显示治疗前的骨折。治疗后4个月(右侧图像)，骨折完全愈合。
实施例8
PBD-PSC用于骨质疏松症的治疗
以下实施例证明PBD-PSC对治疗骨质疏松症有用。
PBD-PSC制剂对治疗骨质疏松症有用。由于超过正常的骨流失，骨质疏松症通常发生在老年人中。在该实施例中，老年女性受试者表现出进行性绝经后骨流失，如表2所示。
表2.骨质疏松症骨流失和PBD-PSC治疗
骨矿物质密度的所有测量值(g/cm2)
用包含PBD-PSC的制剂治疗受试者。治疗后，腰椎和股骨的骨流失均停止。事实上，如表中所示，骨密度不仅停止降低，而且在用PBD-PSC治疗后86个月时增加。这些数据证明了PBD-PSC通过改善骨密度来治疗骨质疏松症的有效性。
实施例9
PBD-PSC用于骨质疏松症的改善
以下实施例证明了随着施用PBD-PSC的65岁受试者中的骨质疏松症的改善。
患有严重的腰椎和左髋的骨质疏松症的65岁女性患者在单次输注PBD-PSC后显示出腰椎的骨密度略有改善。如图25所示，腰椎骨密度从0.641提高到0.647(1.6％)g/cm2。在输注后9个月，PBD-PSC输注的益处略微减少(0.643g/cm2)，表明以6个月的间隔重复输注可维持或建立初始输注的益处。PBD-PSC输注后左髋骨密度从0.650降至0.619(-4.77％)g/cm2。然而，随后骨密度流失减慢至0.611(-1.3％)g/cm2，表明输注阻止了左髋骨密度的急剧衰退。
实施例10
PBD-PSCs用于骨质减少的治疗
以下实施例证明PBD-PSC对治疗骨质减少有用。
PBD-PSC制剂对治疗骨质减少有用。骨质疏松症是骨矿物质密度低于正常值的病症，具有在-1.0和-2.5之间的T评分。在该实施例中，患有腰椎和左髋的骨质减少的75岁女性受试者在单次PDB-PSC治疗后显示出骨矿物质密度T评分的显著改善。如图26所示，腰椎的T评分(顶部图片)从-2.4增加到-1.5(改善37.5％)，同时骨密度从0.79g/cm2增加到1.004g/cm2。左髋(底部图片)的T评分从-1.7增加到-1.2(改善29.4％)，同时骨密度从0.66g/cm2增加到0.851g/cm2。
实施例11
PBD-PSC用于生育力的改善
以下实施例证明PBD-PSC对改善生育力有用。
为了确定PBD-PSC是否对改善生育力有用，制备了PBD-PSC的自体制剂。将制剂动脉内注射到具有广泛的子宫内膜变薄的受试者的子宫动脉中。如图27所示，在用PBD-PSC治疗后，子宫内膜变薄显著改善。因此，PBD-PSC对改善子宫内膜变薄有用。
为了确定PBD-PSC治疗是否对改善生育力有用，将PBD-PSC治疗用于先前经历过不育症的受试者。对之前尝试过体外受精/胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)、以及未患多囊性卵巢综合征(PCOS)且具有至少4次重复的IVF/ICSI失败的女性用PBD-PSC静脉疗法进行治疗。表3总结了PBD-PSC治疗的结果。
表3.静脉内PBD-PSC治疗以用于改善生育力
结果 PBD-PSC治疗 先前结果
受刺激的周期 33 198
占优势的卵泡的直径(mm2) 19.6+0.2 18.6+0.2
直径>12毫米的卵泡数 12.6+1.8 10.8+0.9
雌二醇(pg/mL) 2418+276 1878+144
每个直径>12毫米的卵泡的雌二醇(pg/mm) 252+18 208+10
子宫内膜厚度(mm) 10.9+0.3 10.6+0.4
取消的周期 0 18
取卵术(周期) 33 180
胚胎转移 33 162
临床妊娠(％) 7(21.2％) 16(8.0％)
正在进行的妊娠(％) 5(15.1％) 2(1.0％)
卵母细胞数 7.3+2.6 5.6+1.7
受精的卵母细胞数 5.4+1.1 3.7+0.9
胚胎数 3.3+1.0 1.8+0.6
优良胚胎数 3.1+0.5 1.1+0.2
这些结果证明，PBD-PSC治疗改善了先前尝试过IVF/ICSI的、之前经历不育症的女性的许多结果。
此外，在涉及226名受试者的研究中，尝试单独的IVF的女性比起将PBD-PSC治疗与IVF组合的女性(81.6％)经历较低的成功的IVF结果(41.3％)，如表4所示。
表4.用或未用PBD-PSC治疗的女性的IVF/ICSI结果
治疗 成功的结果
IVF 41.3％
IVF+淋巴细胞免疫治疗 62.4％
IVF+淋巴细胞免疫治疗–PBD-PSC 81.6％
另外，对于先前植入失败的17名不育的妇女的子宫内膜变薄的子宫内动脉PBD-PSC注射显示子宫内膜厚度增加和生育力结果改善，如表5所示。治疗前17名女性的平均子宫内膜厚度为4.67mm，且治疗后的平均厚度为7.75mm(增加3.08mm；增加66％)。
表5.静脉内PBD-PSC治疗以用于增加的子宫内膜厚度
总之，这些结果证明PBD-PSC治疗对于改善生育力的统计学上显著的效果。具体而言，该治疗引起卵巢功能、卵母细胞数量和质量、子宫内膜厚度和子宫内膜容受性的可检测的改善。
实施例12
PBD-PSC用于神经失调症的治疗
以下实施例证明PBD-PSC对治疗神经失调症有用。
为了确定PBD-PSC治疗是否对治疗神经失调症有效，从患有进行性小脑性共济失调的受试者中分离自体干细胞。小脑性共济失调可能由于许多疾病而发生，并且表现出无法协调平衡、步态、肢体和眼球运动的症状。小脑的病变可引起协同失调、辨距障碍、轮替运动障碍、构音障碍以及站姿和步态的共济失调。观察到与病变在身体同侧运动时的缺陷(身体同侧的)。临床医生经常使用对执行运动任务的人的视觉观察来寻找共济失调的征象。小脑性共济失调的原因很多，其中包括对Purkinje细胞或小脑中的其它神经细胞的自身免疫、SNC血管炎、多发性硬化、感染、出血性梗塞、肿瘤、直接损伤、毒素(例如酒精)和遗传失调症。在区别诊断后，认为当前受试者患有酒精诱导的小脑性共济失调。自被诊断以来，受试者已停止饮酒。受试者遭受渐进至严重的无力协调平衡，并且平均接近每天五次跌倒。之前的强化康复计划未能阻止进展，数月的丁螺环酮几乎没有至没有产生积极效果。
在给出知情同意书后，患者同意自体施用PBD-PSC治疗。采集外周血并在24小时内通过使用PTH1R、CD90和CD133的磁性抗体阳性选择和CD45的阴性选择来分离PBD-PSC。然后将细胞用视黄酸与患者自身富含血小板的裂解物和血浆致敏(prime)18小时。通过在45分钟的时间段内静脉内施用来施用该细胞。
在七天之后，患者通过无力协调平衡的减少而注意到她的状态的改善，并且在第八天期间没有跌倒。八周的时间段后，患者只经历了一次跌倒。没有观察到治疗的副作用。该实施例显示了PBD-PSC治疗对于治疗小脑性共济失调的有效性。
实施例13
PBD-PSC用于恶性肿瘤的治疗
以下实施例证明PBD-PSC在治疗恶性肿瘤中有用。
具有合适的常见供体的在肺中患有难治性转移性肾细胞癌的50岁患者接受来自血型相同的同胞的PBD-PSC同种异体移植物的输注。患者每月接受三次供体多能干细胞的输注，持续三个月。
如图28所示，移植后30天，肺转移瘤(箭头)很容易看到。在移植后第129天，肺转移瘤很大程度上消失。患者具有完整的反应，一直处于缓解状态，并且已经经历了转移瘤的完全消退。
该实施例证明了PBD-PSC治疗用于在对常规免疫治疗没有反应的患者中诱导转移性肾细胞癌的持续消退的有效性。
实施例14
PBD-PSCs用于1型糖尿病的治疗
以下实施例证明PBD-PSC在治疗1型糖尿病中有用。
对患有1型糖尿病的17岁男性受试者和16岁女性受试者给予两次注射到胰动脉中的PBD-PSC输注。第1周给予第一次输注，且第13周给予第二次输注。
图29示出了以周为间隔的胰岛素平均每日用量随时间的变化。如图29所示，初始PBD-PSC输注后胰岛素平均每日用量下降，并且在第二次PBD-PSC输注后再次下降。
该实施例证明PBD-PSC治疗对降低患有1型糖尿病的受试者中的胰岛素平均每日用量的有效性。
实施例15
PBD-PSC用于黄斑变性的治疗
以下实施例证明PBD-PSC在治疗黄斑变性中有用。
使用典型的静脉穿刺从患有干性黄斑变性的71岁女性患者中取出200mL外周血。将柠檬酸钠用作抗凝剂。治疗前的患者的视敏度测试分数在一只眼睛中为20/200，在另一只眼睛中为20/500。该受试者在法律上是失明的，并且无法驾驶汽车。使用离心(在吊桶式转头离心机中)和过滤的组合分离PBD-PSC。首先将血液以300g离心10分钟。除去血浆层，并以800g另外离心10分钟。将血浆上清液再次以1100g离心10分钟。取出处于底部的细胞层并置于5mL无菌盐水中并重悬。然后将经悬浮的细胞的溶液通过5μm过滤器过滤。取出25μL上清液(其仍含有血小板)并使其接受超声降解和40-60兆赫超声20分钟以裂解血小板。然后使血小板裂解物接受2,500g离心15分钟以除去碎片。将富含血小板的裂解物进一步通过0.22μm过滤器过滤以除去碎片。然后将血小板裂解物加入已悬浮在盐水中的细胞中，并置于在板的底部已用抗人CD45抗体包被的无菌培养板中。然后将板置于4℃、5％CO2的冷藏培养箱中24小时。24小时后除去流体，并使其接受另外的5μm过滤。然后在10分钟的时间段内将滤液(约30mL)静脉内注射到患者内。滤液的分析显示总共约900万个细胞/mL，其中细胞的中值粒径为直径4.3μm。流式细胞术分析显示超过90％的细胞是CD133阳性的和PTH受体阳性的。低于1％的细胞是CD45阳性的。
在施用其血小板裂解物活化的PBD-PSC细胞三个月后，患者表现出的视敏度评分在一只眼睛中为20/40，并且在另一只眼睛中为20/50。该受试者不再是法律上失明的，并获得了新的视力。该受试者现在可以开车，并且独立地过日常生活。在施用其自身的PBD-PSC6个月后，维持了其视力改善。
在至少一些先前描述的实施方式中，实施方式中使用的一个或多个要素可以互换地用于另一个实施方式中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求限定的主题的范围内。
关于本文中任意复数和/或单数术语的实质使用，本领域技术人员可以视上下文和/或应用的情况而从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数的置换。
本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语、尤其是所附权利要求(例如所附权利要求的正文)中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果期望特定数量的介绍性的权利要求详述，在权利要求中将明确地详述该期望，并且在缺少这样的详述的情况下，不存在这样的期望。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求详述。然而，即使当相同的权利要求包含介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”，以及诸如“一种/一个”的不定冠词(例如“一种”和/或“一个”应该被解释为“至少一个/一种”或“一个或多个/一种或多种”)，这些短语的使用也不应被解释为暗示由不定冠词“一个/一种”介绍的权利要求详述将包含这种介绍性权利要求详述的任意特定权利要求限制于仅包含一个这样的详述的实施方式；对于用于介绍权利要求详述的定冠词的使用也是如此。另外，即使明确地引述了特定数量的介绍性权利要求详述，本领域技术人员将认识到，这种引述应该被解释为至少表示所引述的数字(例如，仅有“至少两个”而没有其它修饰语的详述表示至少两个详述或两个以上的详述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的结构旨在在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、具有单独的B、具有单独的C、A和B一起具有、A和C一起具有、B和C一起具有，和/或A、B和C一起具有的系统等)。在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的结构旨在在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、具有单独的B、具有单独的C、A和B一起具有、A和C一起具有、B和C一起具有，和/或A，B和C一起具有的系统等)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，实际上呈现两个以上的供选择的术语的任意转折词和/或短语都应该被理解为考虑包括这些术语之一、任意一个术语或两个术语的可能性，例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
另外，在以马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此以马库什组的任意单个成员或成员亚组的形式来描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任意和所有目的(如就提供书面描述而言)，本文公开的所有范围还涵盖该范围的任意和所有可能的子范围及子范围的组合。任意列出的范围都可以容易地被认为充分描述并且使得相同的范围被分成至少相等的两等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为非限制性实施例，本文所讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括所引述的数字，并且涉及如上所讨论的可以随后分成子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单个的成员。因此，例如具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等。
虽然本文已经公开了各种方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方式是出于说明的目的而不是旨在限制，真正的范围和精神由所附权利要求指示。

Claims (65)

1. 一种多能干细胞，其特征在于，所述多能干细胞表达甲状旁腺激素1型受体（PTH1R），直径为2.5 µm至4.5 μm，能形成类胚体，并且能分化成外胚层、中胚层和内胚层，其中，所述多能干细胞分离自人、马科动物、犬科动物或骆驼的外周血，并且其中，所述多能干细胞对CD90和CD133而言是阳性的，对SSEA-3、CD200和CD45而言是阴性的，并且表达Sox2和核Oct-4。
2.如权利要求1所述的多能干细胞，其中，将所述多能干细胞用一种或多种肽进行培养。
3.如权利要求2所述的多能干细胞，其中，所述肽是细胞外基质（ECM）蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多能干细胞，其中，将所述多能干细胞用视黄酸进行培养。
5.如权利要求1-3中任一项所述的多能干细胞，其中，将所述多能干细胞用编码肽的异源基因进行转染。
6.如权利要求5所述的多能干细胞，其中，所述肽是细胞外基质（ECM）蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
7.一种存在于外周血中的经分离的多能干细胞群，所述多能干细胞群：
表达甲状旁腺激素1型受体（PTH1R）；
直径为2.5 µm至4.5 µm；
能形成类胚体；
能分化成外胚层、中胚层和内胚层；
分离自外周血；
来源于人、马科动物、犬科动物或骆驼来源；
对CD90和CD133而言是阳性的；
对SSEA-3、CD200和CD45而言是阴性的；以及
表达Sox2和核Oct-4。
8.如权利要求7所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述细胞群对CD29、CD34、CD105和CD106而言是阳性/阴性的。
9.如权利要求7-8中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，将所述细胞群用肽进行培养。
10.如权利要求9所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述肽是细胞外基质（ECM）蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
11.如权利要求7-8中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，将所述细胞群用视黄酸进行培养。
12.如权利要求7-8中任一项所述的经分离的多能干细胞群，其中，将经分离的多能干细胞用编码肽的异源基因进行转染。
13.如权利要求12所述的经分离的多能干细胞群，其中，所述肽是细胞外基质（ECM）蛋白、细胞因子、生长因子或抗原。
14.用于分离如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的干细胞群的方法，所述方法包括：
使包含所述干细胞或干细胞群的外周血样品与对所述多能干细胞或干细胞群而言特异性的抗体接触，以形成经抗体结合的干细胞或干细胞群；
分离所述经抗体结合的干细胞或干细胞群；以及
从所述抗体中释放所述干细胞或干细胞群。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括：
使包含所述经抗体结合的干细胞或干细胞群的样品与磁珠接触；以及
施加磁场，从而分离所述经抗体结合的干细胞或干细胞群。
16.如权利要求14-15中任一项所述的方法，其中，所述经分离的干细胞或干细胞群包含直径为2.5 μm并表达经典CD标记物的干细胞。
17.如权利要求14-15中任一项所述的方法，其中，所述经分离的干细胞或干细胞群包含以如下的量分离的干细胞：10,000个细胞/mL组织样品、50,000个细胞/mL组织样品、100,000个细胞/mL组织样品、500,000个细胞/mL组织样品、1,000,000个细胞/mL组织样品、5,000,000个细胞/mL组织样品或10,000,000个细胞/mL组织样品、或处于由前述的任意两个值限定的范围内的量。
18.用于分离如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的多能干细胞群的方法，所述方法包括：
从人、马科动物、犬科动物或骆驼获得外周血；
使所述外周血与体外多孔膜接触，所述体外多孔膜被配置成捕获如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的多能干细胞群；
对外周血和所述膜施加离心力或重力或压力；以及
捕获所述多能干细胞或所述多能干细胞群。
19.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于改善受试者的生育力的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述多能干细胞是自体的。
21.如权利要求19-20中任一项所述的用途，其中，所述药物包含足以引起卵巢功能、卵母细胞质量、子宫内膜厚度、子宫内膜容受性或其组合的可检测的改善的量的经分离的多能干细胞或多能干细胞群。
22.如权利要求19-20中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于注射到睾丸或子宫中。
23.如权利要求19-20中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于静脉内施用至受试者的子宫动脉中，以促进子宫内膜壁的增厚和容受性。
24.如权利要求23所述的用途，其中，所述子宫内膜壁的增厚被增高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。
25.如权利要求19-20中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于静脉内施用至受试者的卵巢动脉中，以增加卵的数量和质量。
26.如权利要求19-20中任一项所述的用途，其中，所述多能干细胞分离自外周血样品。
27.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备靶向到感兴趣的区域的试剂中的用途，其中，在所述区域中表达甲状旁腺激素相关蛋白质。
28.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于增加受试者的皮肤区域中的真皮胶原蛋白和/或弹性蛋白的产生的药物中的用途。
29.如权利要求28所述的用途，其中，将所述药物配制用于皮下注射。
30.如权利要求28-29中任一项所述的用途，其中，所述药物减少细纹、减少皱纹、增加光泽、增加皮肤紧致度、或其组合。
31.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于促进受试者的毛发生长的药物中的用途。
32.如权利要求31所述的用途，其中，将所述药物配制用于透皮施用。
33.如权利要求31所述的用途，其中，将所述药物配制用于皮下注射。
34.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于改善、减轻、逆转或治疗受试者的骨失调症的药物中的用途。
35.如权利要求34所述的用途，其中，所述骨失调症是骨损伤。
36.如权利要求35所述的用途，其中，所述骨损伤是骨折。
37.如权利要求36所述的用途，其中，所述骨折是棘突骨折。
38.如权利要求34所述的用途，其中，所述骨失调症是骨质疏松症。
39.如权利要求34所述的用途，其中，所述骨失调症是骨质减少。
40.如权利要求34-39中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于皮下注射。
41.如权利要求34-39中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于静脉内施用。
42.如权利要求34-39中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于动脉内施用。
43.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于改善、减轻、逆转、抑制或治疗受试者的神经失调症的药物中的用途。
44.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于改善、减轻、逆转、抑制或治疗受试者的转移性癌的药物中的用途。
45.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于预防、治疗、抑制或减轻受试者的自身免疫失调症的药物中的用途。
46.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于改善、减轻、逆转、抑制或治疗受试者的1型糖尿病的药物中的用途。
47.如权利要求46所述的用途，其中，将所述药物配制用于动脉内施用到胰腺动脉中。
48.如权利要求46-47中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于每12周施用一次。
49.如权利要求46-47中任一项所述的用途，其中，所述用途减少了所述受试者每日平均胰岛素用量。
50.如权利要求49所述的用途，其中，所述每日平均胰岛素用量减少2%-10%、5%-20%、10%-30%、20%-40%、30%-50%、40%-60%、50%-70%、60%-80%、70%-90%、或80%-100%。
51.一种使经分离的多能干细胞或多能干细胞群在基质上生长的方法，所述方法包括：
通过如权利要求14-18中任一项所述的方法从样品中分离多能干细胞或多能干细胞群；
使纳米纤维基质与所述经分离的多能干细胞接触；以及
使所述经分离的多能干细胞在所述纳米纤维基质上生长；
其中，产生包含多能干细胞的基质。
52.如权利要求51所述的方法，其中，所述纳米纤维基质包含聚合物纤维。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述纳米纤维基质包含聚二甲基硅氧烷、聚甘油癸二酸酯、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、纤维素、藻酸盐/酯、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、透明质酸、纤维蛋白和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。
54.如权利要求53所述的方法，其中，所述聚乳酸包括聚-L-丙交酯。
55.如权利要求52所述的方法，其中，所述聚合物纤维是静电纺丝。
56.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中，所述聚合物纤维的厚度范围为200 μm至700 μm。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述聚合物纤维的厚度为200 μm、300 μm、400 μm、500 μm、600 μm或700 μm或处于由前述的任意两个厚度限定的范围内。
58.如权利要求51-55中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞在2分钟-40分钟内结合并沉积在所述基质中。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述多能干细胞在2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟或40分钟内结合并沉积在所述基质中。
60.通过如权利要求14-18中任一项所述的方法进行分离的经分离的多能干细胞或多能干细胞群、如权利要求1-6中任一项所述的多能干细胞或如权利要求7-13中任一项所述的经分离的多能干细胞群在制备用于改善、减轻、逆转、抑制或治疗受试者的黄斑变性的药物中的用途。
61.如权利要求60所述的用途，其中，黄斑变性是干性或湿性黄斑变性。
62.如权利要求60-61中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于静脉内、玻璃体内、眼内、结膜下、眼球后或眼眶下注射。
63.如权利要求60-61中任一项所述的用途，其中，将所述药物配制用于每12周施用一次。
64.如权利要求60-61中任一项所述的用途，其中，所述用途改善了所述受试者中的视敏度。
65.如权利要求64所述的用途，其中，所述视敏度改善至20/20、20/30、20/40、20/50、20/60、20/70、20/80、20/90或20/100或处于由前述的任意两个量限定的范围内。
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