CN109633005B - 抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，包括以下步骤：纯化处理，将二氧化硅加入甲醇中，调节pH至4～5，得到预处理硅胶；依次向预处理硅胶中加入N,N‑二甲基甲酰胺、氢氧化钠溶液混合，得到浑浊液；将丁香酚、黄酮、百里香酚混合，并加入N,N‑二甲基甲酰胺，得到备用液，然后将备用液加入浑浊液中，得到初改性硅胶；向初改性硅胶中加入四氢呋喃、3‑(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯，得到改性硅胶；加入保健品甲醇溶液进行柱层析，得到待检测样；用比色法测定待检测样中总皂苷的含量。本发明通过使用改性二氧化硅对保健品甲醇溶液进行处理，能够有效减少总皂苷在二氧化硅上的吸附，进而提高抗疲劳保健品中总皂苷含量测定的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及成份检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法。
背景技术
随着社会竞争的加剧，会使身体长期处于疲劳状态，会损害人体的体力、体能、身体失衡。为缓解身体的疲劳，抗疲劳保健品成为大多数人的选择之一。
皂苷是一类由甾体或是三萜类化合物作为苷元与糖分子缩合而成的低聚糖苷，在自然界分布很广，是很多中草药中的主要活性成分。在保健食品总皂苷被认为是以多味中药为主原料的保健品中的主要功效成分，具有抗疲劳、改善机体免疫力等作用。而在抗疲劳保健品中，部分保健品中总皂苷起到重要的作用，并通过总皂苷的含量来评价保健品的质量和功效。目前，多采用比色法、紫外分光光度法、薄层扫描法、气相色谱法等进行测定抗疲劳保健品中总皂苷的含量，而在测定前需对抗疲劳保健品进行纯化、富集处理，“比色法测定保健食品中的总皂苷”(海峡药学，2013年第25卷第8期)公开了保健食品的样品纯化使用大孔树脂层析柱进行处理，但是在这种处理方法中，部分总皂苷吸附在树脂上，不易脱附，造成总皂苷含量测定结果存在一定的误差。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其通过使用改性二氧化硅对保健品甲醇溶液进行处理，能够有效减少总皂苷在二氧化硅上的吸附，进而提高抗疲劳保健品中总皂苷含量测定的准确性。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、取抗疲劳保健品，并加入其总质量1倍量的甲醇、1倍量的二氧化硅，浓缩，得到待处理样品；
步骤二、纯化处理
S1、将二氧化硅加入其总质量10倍量的甲醇中，然后用乙酸调节pH至4～5，并置于50℃条件下加热30min，用蒸馏水洗涤至洗涤液的pH为6～7，再将二氧化硅置于120℃条件下干燥4h，得到预处理硅胶；
S2、依次向预处理硅胶中加入其总质量20倍量的N,N-二甲基甲酰胺、质量分数为4％的氢氧化钠溶液混合，并置于70℃条件下加热30min，得到浑浊液；
将丁香酚、黄酮、百里香酚混合，并加入丁香酚总质量10倍量的N,N-二甲基甲酰胺，得到第一备用液，然后将第一备用液分五次等量加入浑浊液中，每次间隔10min，待第一备用液全部加入浑浊液后，置于190℃条件下加热3h，减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，再用二氯甲烷冲洗3次，并置于120℃条件下真空干燥4h，得到初改性硅胶，其中，预处理硅胶、丁香酚、黄酮、百里香酚、氢氧化钠溶液的质量比为1:0.3:0.3:0.4:0.1；
S3、向初改性硅胶中加入其总质量10倍量的四氢呋喃，并于60℃条件下逐滴加入乙酸至pH为3～4，然后搅拌20min，再加入初改性硅胶总质量1倍量的3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯，并置于70℃条件下加热5h，过滤得到固体，固体先用丙酮冲洗2次，再用蒸馏水洗涤至洗涤液的pH为5～6，最后置于100℃的真空干燥箱中干燥10h，得到改性硅胶；
S4、将改性硅胶装入色谱柱内，然后加入待处理样品进行柱层析，洗脱剂为体积比为1:2的蒸馏水、甲醇混合而成，收集洗脱液，并浓缩，得到待检测样；
步骤三、采用比色法测定待检测样中总皂苷的含量。
优选的是，S1中将二氧化硅加入其总质量10倍量的甲醇中后，再加入二氧化硅总重量0.1倍量的十六烷基三甲基溴化铵、0.01倍量碳酸氢钠。
优选的是，在经过纯化处理后还进行了二次纯化，二次纯化的具体过程为：
A1、将待检测样逐滴加入其总质量20倍量的石油醚中，并于40℃、200r/min的条件下搅拌30min，静置，得到絮状不溶物，过滤得到沉淀；
A2、将沉淀加入其总质量5倍量的蒸馏水中，并于40℃、200r/min的条件下逐滴加入沉淀总质量0.05倍量的二甲亚砜，待二甲亚砜滴加完毕，加入沉淀总质量0.01倍量的碳酸氢钠，并置于70℃、200r/min的条件下搅拌1h，得到清液，向清液总质量3倍量的乙醚中加入乙酸，并调节乙醚的pH至3～4，然后将乙醚加入清液中，搅拌20min，静置至完全分层，分离，收集水相并浓缩，然后置于-80℃的条件冷冻4h，得到待处理液；
A3、向待处理液中加入其总质量5倍量的甲醇并溶解，然后分4次等量加入其总质量0.02倍量柠檬酸钠，最后加入待处理液总质量0.05倍量的活性炭，搅拌2h，过滤并浓缩，得到步骤三所需要的待检测样。
优选的是，二氧化硅的平均粒径为1.8～25μm。
优选的是，S4中使用洗脱剂冲柱后，再依次使用甲醇、蒸馏水分别冲柱，然后将冲柱后的甲醇、蒸馏水、洗脱液收集并浓缩，即为待检测样。
优选的是，S2中依次向预处理硅胶中加入其总质量20倍量的N,N-二甲基甲酰胺、质量分数为4％的氢氧化钠溶液的具体操作为：向预处理硅胶中加入N,N-二甲基甲酰胺后，置于300r/min的条件下搅拌10min，然后再加入质量分数为4％的氢氧化钠溶液。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明通过使用改性硅胶对保健品甲醇溶液进行处理，能够有效减少总皂苷在硅胶上的吸附，进而提高抗疲劳保健品中总皂苷含量测定的准确性。
第二、纯化处理，减少总皂苷在二氧化硅中的吸附，提高总皂苷含量测定的准确性；通过使用乙酸调节pH至4～5，并置于50℃条件下加热30min，实现对二氧化硅的活化处理，使二氧化硅表面形成大量的硅羟基，活化率高；使用丁香酚、黄酮、百里香酚对预处理硅胶进行改性，通过酚羟基与二氧化硅表面的硅羟基进行反应实现二氧化硅的改性，一方面丁香酚、黄酮、百里香的分子量大小不同，避免空间位阻影响反应，进而减少总皂苷反应的硅羟基的数量，避免总皂苷死吸附，同时，丁香酚、黄酮、百里香酚的协同的作用，有利于硅胶对色素的吸附，减少色素随洗脱液流出，从而有效减少色素对总皂苷含量测定的影响，另一方面将备用液分五次等量加入浑浊液中，可使丁香酚、黄酮、百里香酚与二氧化硅充分反应，避免与二氧化硅反应不均匀，使用二氯甲烷冲洗避免未参与反应的丁香酚、黄酮、百里香酚残留在二氧化硅中；使用3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯对二氧化硅进行改性，3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯对二氧化硅不仅可有效减少总皂苷在二氧化硅上的吸附，减少总皂苷在二氧硅中的残留，而且3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯与丁香酚、黄酮、百里香酚协同作用，可促进二氧化硅对色素的吸附；通过3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯中的硅羟基与二氧化硅中的硅羟基进行反应，完成二氧化硅的改性；通过丙酮冲洗可减少未参加反应的3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯残留在二氧化硅中。
第三、二次纯化处理中，通过将待检测样加入石油醚中，可使总皂苷析出，使部分色素溶解在石油醚中，进而减少总皂苷中的色素。
第四、通过加入二甲亚砜和碳酸氢钠可以促进总皂苷在水中的溶解，减少总皂苷在乙醚中的溶解；通过调节乙醚的pH至3～4，一方面可影响色素的稳定性，另一方面促进色素在乙醚中的溶解，减少总皂苷在乙醚中的溶解，进而实现降低色号；加入少量活性炭实现对色素的进一步吸附。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、取抗疲劳保健品，并加入其总质量1倍量的甲醇、1倍量的二氧化硅，浓缩，得到待处理样品；
步骤二、纯化处理
S1、将二氧化硅加入其总质量10倍量的甲醇中，然后用乙酸调节pH至4～5，并置于50℃条件下加热30min，用蒸馏水洗涤至洗涤液的pH为6～7，再将二氧化硅置于120℃条件下干燥4h，得到预处理硅胶；
S2、依次向预处理硅胶中加入其总质量20倍量的N,N-二甲基甲酰胺、质量分数为4％的氢氧化钠溶液混合，并置于70℃条件下加热30min，得到浑浊液；
将丁香酚、黄酮、百里香酚混合，并加入丁香酚总质量10倍量的N,N-二甲基甲酰胺，得到第一备用液，然后将第一备用液分五次等量加入浑浊液中，每次间隔10min，待第一备用液全部加入浑浊液后，置于190℃条件下加热3h，减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，再用二氯甲烷冲洗3次，并置于120℃条件下真空干燥4h，得到初改性硅胶，其中，预处理硅胶、丁香酚、黄酮、百里香酚、氢氧化钠溶液的质量比为1:0.3:0.3:0.4:0.1；
S3、向初改性硅胶中加入其总质量10倍量的四氢呋喃，并于60℃条件下逐滴加入乙酸至pH为3～4，然后搅拌20min，再加入初改性硅胶总质量1倍量的3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯，并置于70℃条件下加热5h，过滤得到固体，固体先用丙酮冲洗2次，再用蒸馏水洗涤至洗涤液的pH为5～6，最后置于100℃的真空干燥箱中干燥10h，得到改性硅胶；
S4、将改性硅胶装入色谱柱内，然后加入待处理样品进行柱层析，洗脱剂为体积比为1:2的蒸馏水、甲醇混合而成，收集洗脱液，并浓缩，得到待检测样；
步骤三、采用比色法测定待检测样中总皂苷的含量，比色法为《保健食品检验与评价技术规范》中的检测方法。
S1中将二氧化硅加入其总质量10倍量的甲醇中后，再加入二氧化硅总重量0.1倍量的十六烷基三甲基溴化铵、0.01倍量碳酸氢钠。
在经过纯化处理后还进行了二次纯化，二次纯化的具体过程为：
A1、将待检测样逐滴加入其总质量20倍量的石油醚中，并于40℃、200r/min的条件下搅拌30min，静置，得到絮状不溶物，过滤得到沉淀；
A2、将沉淀加入其总质量5倍量的蒸馏水中，并于40℃、200r/min的条件下逐滴加入沉淀总质量0.05倍量的二甲亚砜，待二甲亚砜滴加完毕，加入沉淀总质量0.01倍量的碳酸氢钠，并置于70℃、200r/min的条件下搅拌1h，得到清液，向清液总质量3倍量的乙醚中加入乙酸，并调节乙醚的pH至3～4，然后将乙醚加入清液中，搅拌20min，静置至完全分层，分离，收集水相并浓缩，然后置于-80℃的条件冷冻4h，得到待处理液；
A3、向待处理液中加入其总质量5倍量的甲醇并溶解，然后分4次等量加入其总质量0.02倍量柠檬酸钠，最后加入待处理液总质量0.05倍量的活性炭，搅拌2h，过滤并浓缩，得到步骤三所需要的待检测样。
二氧化硅的平均粒径为1.8～25μm。
S4中使用洗脱剂冲柱后，再依次使用甲醇、蒸馏水分别冲柱，然后将冲柱后的甲醇、蒸馏水、洗脱液收集并浓缩，即为待检测样。
S2中依次向预处理硅胶中加入其总质量20倍量的N,N-二甲基甲酰胺、质量分数为4％的氢氧化钠溶液的具体操作为：向预处理硅胶中加入N,N-二甲基甲酰胺后，置于300r/min的条件下搅拌10min，然后再加入质量分数为4％的氢氧化钠溶液。
<对比例1>
按照实施例1的方法检测总皂苷的含量，不同的是纯化处理采用大孔树脂进行纯化，再采用比色法测定总皂苷含量。
<对比例2>
按照实施例1的方法检测总皂苷的含量，不同的是不进行S2的处理，将预处理硅胶直接进行S3的操作。
<对比例3>
按照实施例1的方法检测总皂苷的含量，不同的是不进行S3的处理，将改性硅胶直接进行S4的操作。
<对比例4>
按照实施例1的方法检测总皂苷的含量，不同的是在二次纯化处理过程中不进行A1的操作。
<对比例5>
按照实施例1的方法检测总皂苷的含量，不同的是在二次纯化处理过程中不进行A2的操作。
<性能表征>
样品1的配制：于50℃、300r/min的条件下将20mg的β-胡萝卜素溶于500mL纯化水中，搅拌至纯化水的颜色均匀，冷却至室温，然后于300r/min的条件下加入210mg的人参总皂苷、31mg的维生素B、58mg的葡萄糖，搅拌1h，即得到样品1(色号1665)；
样品2的配制：于50℃、300r/min的条件下将23mg的焦糖色溶于500mL纯化水中，搅拌至纯化水的颜色均匀，冷却至室温，然后于300r/min的条件下加入201mg的西洋参总皂苷、36mg的维生素B、41mg的葡萄糖，搅拌1h，即得到样品2(色号7512)；
样品3的配制：于50℃、300r/min的条件下将18mg的姜黄素溶于5mL的丙二醇，然后加入500mL的纯化水中，搅拌至纯化水的颜色均匀，冷却至室温，再后于300r/min的条件下加入241mg的葛根总皂苷、41mg的维生素B、36mg的葡萄糖，搅拌1h，即得到样品3(色号606)；
将样品1、样品2、样品3分别按照实施例1、对比例1～5的六组方法进行检测，记录六组实验的相应表征数据。
1、将实施例1、对比例1～3所对应的四组实验处理后的硅胶进行收集，将四组硅胶分别用等量的甲醇浸泡24h，然后浓缩，通过HPLC进行检测是否含有总皂苷，并依据测试的峰的高度从低到高依次编号为0～3，并记录纯化处理后得到待检测样的色号色，结果如表1所示；
表1、硅胶中总皂苷的检测
其中，0～3表示总皂苷的含量依次增多；
结果表明纯化处理不仅可有效减少总皂苷在二氧化硅中的吸附，而且可有效提高二氧化硅对色素的吸附，进而提高皂苷含量测定的准确性，同时，丁香酚、黄酮、百里香酚的协同的作用，有利于硅胶对色素的吸附，减少色素随洗脱液流出。
2、观察色号
分别观察经过实施例1、对比例4～5三组实验处理后样品1、样品2、样品3色号，观察结果如表2所示；
表2、色号
结果表明二次纯化处理中通过将待检测样加入石油醚中，可使总皂苷析出，使部分色素溶解在石油醚中，进而减少总皂苷中的色素；通过调节乙醚的pH至3～4，一方面可影响色素的稳定性，另一方面促进色素在乙醚中的溶解，减少总皂苷在乙醚中的溶解，进而实现降低色号；加入少量活性炭实现对色素的进一步吸附。
3、总皂苷含量
记录实施例1、对比例1所测的总皂苷含量，其中，总皂苷含量为测定5次的平均值，测试结果如表3所示；
表3、总皂苷含量
| 样品 | 组别 | 含量/mg |
| 样品1 | 实施例1 | 204 |
| 对比例1 | 189 | |
| 样品2 | 实施例1 | 197 |
| 对比例1 | 180 | |
| 样品3 | 实施例1 | 235 |
| 对比例1 | 211 |
结果表明经本发明的方法对样品进行处理，可有效提高总皂苷含量测定的准确性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (6)
1.抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取抗疲劳保健品，并加入其总质量1倍量的甲醇、1倍量的二氧化硅，浓缩，得到待处理样品；
步骤二、纯化处理
S1、将二氧化硅加入其总质量10倍量的甲醇中，然后用乙酸调节pH至4～5，并置于50℃条件下加热30min，用蒸馏水洗涤至洗涤液的pH为6～7，再将二氧化硅置于120℃条件下干燥4h，得到预处理硅胶；
S2、依次向预处理硅胶中加入其总质量20倍量的N,N-二甲基甲酰胺、质量分数为4％的氢氧化钠溶液混合，并置于70℃条件下加热30min，得到浑浊液；
将丁香酚、黄酮、百里香酚混合，并加入丁香酚总质量10倍量的N,N-二甲基甲酰胺，得到第一备用液，然后将第一备用液分五次等量加入浑浊液中，每次间隔10min，待第一备用液全部加入浑浊液后，置于190℃条件下加热3h，减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，再用二氯甲烷冲洗3次，并置于120℃条件下真空干燥4h，得到初改性硅胶，其中，预处理硅胶、丁香酚、黄酮、百里香酚、氢氧化钠溶液的质量比为1:0.3:0.3:0.4:0.1；
S3、向初改性硅胶中加入其总质量10倍量的四氢呋喃，并于60℃条件下逐滴加入乙酸至pH为3～4，然后搅拌20min，再加入初改性硅胶总质量1倍量的3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯，并置于70℃条件下加热5h，过滤得到固体，固体先用丙酮冲洗2次，再用蒸馏水洗涤至洗涤液的pH为5～6，最后置于100℃的真空干燥箱中干燥10h，得到改性硅胶；
S4、将改性硅胶装入色谱柱内，然后加入待处理样品进行柱层析，洗脱剂为体积比为1:2的蒸馏水、甲醇混合而成，收集洗脱液，并浓缩，得到待检测样；
步骤三、采用比色法测定待检测样中总皂苷的含量。
2.如权利要求1所述的抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其特征在于，S1中将二氧化硅加入其总质量10倍量的甲醇中后，再加入二氧化硅总重量0.1倍量的十六烷基三甲基溴化铵、0.01倍量碳酸氢钠。
3.如权利要求1所述的抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其特征在于，在经过纯化处理后还进行了二次纯化，二次纯化的具体过程为：
A1、将待检测样逐滴加入其总质量20倍量的石油醚中，并于40℃、200r/min的条件下搅拌30min，静置，得到絮状不溶物，过滤得到沉淀；
A2、将沉淀加入其总质量5倍量的蒸馏水中，并于40℃、200r/min的条件下逐滴加入沉淀总质量0.05倍量的二甲亚砜，待二甲亚砜滴加完毕，加入沉淀总质量0.01倍量的碳酸氢钠，并置于70℃、200r/min的条件下搅拌1h，得到清液，向清液总质量3倍量的乙醚中加入乙酸，并调节乙醚的pH至3～4，然后将乙醚加入清液中，搅拌20min，静置至完全分层，分离，收集水相并浓缩，然后置于-80℃的条件冷冻4h，得到待处理液；
A3、向待处理液中加入其总质量5倍量的甲醇并溶解，然后分4次等量加入其总质量0.02倍量柠檬酸钠，最后加入待处理液总质量0.05倍量的活性炭，搅拌2h，过滤并浓缩，得到步骤三所需要的待检测样。
4.如权利要求1所述的抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其特征在于，二氧化硅的平均粒径为1.8～25μm。
5.如权利要求1所述的抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其特征在于，S4中使用洗脱剂冲柱后，再依次使用甲醇、蒸馏水分别冲柱，然后将冲柱后的甲醇、蒸馏水、洗脱液收集并浓缩，即为待检测样。
6.如权利要求1所述的抗疲劳保健品中总皂苷的检测方法，其特征在于，S2中依次向预处理硅胶中加入其总质量20倍量的N,N-二甲基甲酰胺、质量分数为4％的氢氧化钠溶液的具体操作为：向预处理硅胶中加入N,N-二甲基甲酰胺后，置于300r/min的条件下搅拌10min，然后再加入质量分数为4％的氢氧化钠溶液。
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