CN109628554A - 一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，首先，通过电源控制系统对电泳槽电源发出指令，使核酸条带在琼脂糖凝胶中发生移动和分离，电泳后点亮能够使核酸条带发光的激发光光源，通过可沿滑轨移动的机械手架上搭载的切胶机械手上的图像识别系统，判断核酸条带在凝胶上的位置，大小和亮度等参数，向切胶机械手发出指令决定目标条带是否切割并收集，切胶完成后，机械控制系统向可沿滑轨移动的机械手架上搭载的移液机械手发指令，移液机械手依次完成溶胶，吸附，漂洗和洗脱等自动化核酸回收操作。本发明可以实现核酸切胶回收的自动化，具有全自动化完成，安全无毒，高效等。同时，本发现可以扩展到其它生命科学领域的核酸纯化和回收。

Description

一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法

技术领域

本发明涉及生命科学领域的核酸切胶和回收，尤其涉及一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法。

背景技术

核酸是生命的最基本物质之一，可分为DNA和RNA两类，广泛存在于动物、植物细胞、微生物等所有生命体内。不仅起着储存和传递遗传信息的作用，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸的纯化回收是生化实验室的一项常规操作,也是基因分析过程中的关键步骤。基因分析过程中常常需要将特定的核片段从混合样品中分离和提取出来,用于后续操作(如Southern杂交,PCR扩增,限制性酶切分析,DNA测序,基因治疗等)[Horn,N.A.；Meek,J.A.；Budahazi,G.；Marquet,M.Hum.Gene Ther.1995,6,565.；Becker,S.；Franco，J.R.；Simarro,P.P.；Stich,A.；Abel,P.M.；Steverding,D.Diagn.Microbiol.Infect.Dis.2004,50,193.].因此,核酸的纯化回收效果直接影响到整个基因分析过程的进程和结果.目前，核酸分子纯化回收的方法主要有两种,一种是常规的实验室方法:电泳→切胶→溶胶→酚氯仿抽提→乙醇沉淀→溶解,这种方法操作步骤繁琐,对操作人员的技术和熟练程度有一定要求，且涉及有毒化学试剂,并存在样品损失,不适于微量样品的纯化回收[Harwood,A.J.Basic DNA and RNA Protocols,Humana Press,Totawa,New Jersey,1996,pp.160～166.；Ausubel,F.M.；Brent,R.；Kingston,R.E.；Moore,D.D.；Seidman,J.G.；Smith,J.A.；Struhl,K.Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,Publishers,New Jersey,2000,pp.218～223.]。另一种方法是商品试剂盒方法:电泳→切胶→溶胶→吸附→洗脱溶解,这种方法同样步骤繁琐也对操作人员有一定技术要求。两种方法中的第一步是电泳，目前常用的是琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6-9之间，离子强度0.02-0.05为最适。常用1％的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10-7bp的DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动，通过电泳能把不同大小的核酸分子分离[黄永莲，琼脂糖凝胶电泳实验技术研究.湛江师范学院学报,2009,30(6):83-85.；蔡培原电泳技术研究进展及应用.生命科学仪器,2008,6(4):3-7.]。一般正在凝胶电泳的核酸链中都嵌入了荧光染料，比如溴化乙锭，GeneFinder，SYBER Greenl等，这些染料在一定的波长光下能发出荧光，便于对目标核酸条带的鉴定和分离[Miller SE,Taillon-Miller P,Kwok PY.Cost-effective staining ofDNA with SYBR Green in preparative agarose gel electrophoresis.Biotechnique，1999，27(1):34-36.]，一般在做琼脂糖凝胶电泳的时候都会添加一道已知分子量大小的核酸混合物作为对照(Marker)，通过和核酸Marker做对比就能够清晰的分辨出目的条带，然后使用刀片切割出这条发光的琼脂糖凝胶，此过程叫切胶。传统的琼脂糖凝胶的切胶回收过程中，一般使用人工手动切胶，为了能够清晰的看到核酸条带，在切胶的过程中需要紫外光或蓝光照射以便激发荧光染料，紫外和蓝光对人眼都有一定的危害，同时荧光染料有一定的毒性，这使得切胶过程不但繁琐，而且有一定的健康风险。切胶完成后还需要溶胶，吸附，漂洗和洗脱溶解等多步回收操作。

发明内容

本发明的目的在于提高基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，解决了现有技术中需要人工切胶回收费时费力，有毒有害的技术问题。

本发明的技术手段如下：

一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，利用可沿滑轨移动机械手架上搭建的有图像识别系统的切胶机械手，根据图像识别系统采集到琼脂糖凝胶上的泳道信息，通过图像识别系统向切胶机械手发出指令，切胶机械手按要求切胶。

优选地，在切胶之前，通过可沿滑轨移动的机械手架上搭载的切胶机械手上的图像识别系统，识别核酸条带在琼脂糖凝胶中的位置，大小和浓度，向切胶机械手发出是否切胶和收集胶块的指令；切胶完成之后，利用可沿滑轨移动机械手架上搭载的移液机械手，通过机械控制系统向移液机械手发出指令，完成溶胶，吸附，漂洗和洗脱等核酸回收。

优选地，具体包括以下步骤：

1)电泳：放置制备好的琼脂糖凝胶到电泳槽中，机械控制系统向移液系统发出指令，向电泳槽中添加足量的电泳缓冲液，核酸样品添加后，电源控制系统向电泳槽电源发出开关指令，电泳开始；

2)切胶：电源管理系统向激发光光源发出通断指令，使琼脂糖凝胶上的核酸条带显色，通过可沿滑轨移动的机械手架上搭载的切胶机械手的图像识别系统采集核酸片段大小，相对位置，亮度等参数，判断哪条条带是目标，然后向切胶机械手发出指令切胶，并把胶块移动到相应的收集管中；

3)溶胶：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手从试剂瓶中转移溶胶液到胶块收集管中，电源控制系统向机械手架上的加热模块发出指令，加热溶胶；

4)吸附：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手把溶胶液从胶块收集管转移到核酸吸附柱中，电源控制系统向抽滤泵系统发出指令，抽滤；

5)漂洗：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手向核酸吸附柱中添加漂洗液，电源控制系统向抽滤泵系统发出指令，抽滤；

6)洗脱：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手向核酸吸附柱中添加低盐缓冲液或纯洁水，抽滤或离心收集。

优选地，在步骤1)中，在电泳之前需要配制好琼脂糖凝胶，胶的浓度可以根据核酸分子量的大小调整，称取琼脂糖粉添加到一定比例的缓冲液中，加热溶解，稍微冷却后添加适量核酸荧光染料，充分混匀，然后倒入制胶板中冷却凝固，把凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，机械控制系统向移液系统发出指令，向电泳槽中添加足量的电泳缓冲液，制备完成的凝胶上带有核酸加样孔，加样前向核酸样品溶液中添加电泳指示剂，加样。加样完成后，电源控制系统控制电泳槽通电，恒压或恒流电泳开始。

优选地，在步骤2)中，核酸螺旋中镶嵌有荧光染料分子，在激发光光源照射下能够显色，所以，电泳完成后，电源控制系统打开激发光光源，琼脂糖凝胶电泳道中的核酸分子被显示出来，通过可沿滑轨移动的机械手架上装载的切胶机械手前端的图像识别系统，采集到核酸电泳条带图，通过识别判断核酸条带的位置，大小和亮度来决定是否对目标条带进行切割，切割后的凝胶块被程序性的分类收集。

优选地，在步骤3)中，琼脂糖凝胶能在高温(50-60度)条件下被溶胶液溶解成透明液体，凝胶中的核酸分子同时被释放到溶液中，溶胶开始前，电源控制系统向加热模块发出指令预热胶块收集管，然后机械控制系统向可沿滑轨移动的机械手架上搭载的移液机械手发出指令，移液机械手转移溶胶液到胶块收集管内，加热溶胶10-20分钟。

优选地，在步骤4)中，溶解后的琼脂糖溶液室温冷却后，由机械控制系统向可沿滑轨移动的工作台上搭载的移液机械手发出指令，移液机械手把胶块收集管中的溶胶液转移到核酸吸附柱中，然后电源控制系统打开抽滤泵抽滤。吸附柱是一种可抽滤或离心吸附核酸分子，流出溶液的过滤装置，由于吸附柱容积有限，过量的溶胶液可以分多次添加过滤。

优选地，在步骤5)中，为了漂洗掉步骤4)中吸附柱上残留的蛋白质，碳水化合物等杂质，由机械控制系统向可沿滑轨移动的机械手架上搭载的移液机械手发出指令，移液机械手从试剂瓶中转移适量漂洗液到吸附柱中，电源控制系统打开抽滤泵抽滤，此过程重复2次。

优选地，在步骤6)中，吸附柱上绑定的核酸分子在低盐低pH值条件下容易被洗脱溶解，基于此，机械控制系统向可沿滑轨移动的机械手架上搭载的移液机械手发出指令，移液机械手转移洗脱液到吸附柱内，吸附柱下方套装有核酸收集管，室温静置2分钟，离心收集。

本发明还提供了一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化装置，包括：

工作平台，所述工作平台是本发明装置的工作空间；

滑轨，所述滑轨包括x，y，z三个坐标方向；

机械手架，所述机械手架可以在所述滑轨上移动；

机械手，所述机械手安装在所述机械手架上，所述机械手包括切胶机械手，移液机械手，切胶机械手前部安装有图像识别系统；

试剂瓶，所述试剂瓶包括溶胶试剂瓶和漂洗试剂瓶；

电泳槽，所述电泳槽放置在工作台中间，带有正负极和蠕动泵；

枪头盒，所述枪头盒用来放置一次性移液枪枪头；

垃圾桶，所述垃圾桶用来收集废弃的移液枪枪头；

抽滤装置，所述抽滤装置包括用来抽真空的抽滤泵和吸附柱架；

加热装置，所述加热模块用来对溶胶过程加热。

发明作用与效果

采用本发明所提供的一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，可以实现核酸琼脂糖凝胶切胶和回收的自动化，具有自动化程度高，安全无毒，效率高等特点。同时，本发明技术可以扩展到生命科学领域的其它核酸切胶回收，不限于琼脂糖凝胶的切胶回收。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明的结构示意图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所列实施例子只用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。

如图1，图2所示，一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，首先，把预先制备好的琼脂糖凝胶放置到电泳槽中，电源控制系统向蠕动泵发出指令，蠕动泵向电泳槽中添加足量的电泳缓冲液，接着用移液枪向凝胶孔中加样，加样完成后，电源控制系统向电泳槽控制电源发出指令，通电，电泳开始。根据预估核酸分子量大小设定电泳时间，待电泳结束后，电源控制系统向激发光光源发出指令，激发光照射琼脂糖凝胶，核酸条带发荧光，这时机械控制系统向可沿滑轨运动的机械手架上的图像识别系统发出指令，摄像装置移动到电泳槽的正上方，采集凝胶上核酸条带的位置，大小和亮度，图像信息经过计算机加工处理后得到图像坐标系，相机坐标系和物理世界坐标系的对应关系，机械控制系统向切胶机械手发出切胶指令，切胶机械手根据指令移动到目标条带的准确位置进行切割，切割后的胶块按照预定的指令被转移到胶块收集管中。切胶完成后，机械控制系统向可沿滑轨移动的移液机械手发出指令，移液机械手根据指令首先移动到一次性枪头盒上方插上枪头，然后移动到溶胶液试剂瓶正上方吸取溶胶液，最后把溶胶液注入到胶块收集管中，此移液完成，电源控制系统向加热模块发出指令加热胶块收集管加速凝胶溶解，溶解后，机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手沿着滑轨移动到胶块收集管正上方，吸取溶胶液后，然后移动到吸附柱正上方，把溶胶液注入，这时，电源控制系统打开抽滤泵开关，抽空溶胶液，核酸被吸附在柱子上，吸附完成，移液机械手根据机械控制系统的指令移动到垃圾桶的正上方退掉一次性枪头，然后再次移动到枪头盒正上方戴上新枪头。机械控制系统向可沿滑轨移动的机械手架上搭载的移液机械手发出指令，移液机械手根据指令移动到漂洗液试剂瓶正上方，吸取漂洗液，然后移动到吸附柱正上方把溶液注入柱子内，静置片刻，电源控制系统控制抽滤泵抽空漂洗液，重复上述过程2次，漂洗完成。取出吸附柱，进一步离心风干，添加洗脱液溶解收集核酸样品。

如图2所示，本发明还提供了一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化装置，该装置包括：

工作平台2-1，工作平台是整个装置的容器，用来放置和固定装置的各个部件。滑轨2-2沿坐标系x轴移动，滑轨2-3可沿坐标系y轴移动，滑轨2-4可沿坐标系z轴移动。机械手架2-5可沿滑轨在坐标系xyz方向自由移动，用来固定和安装切胶机械手2-6和移液机械手2-7。切胶机械手2-6用来切割凝胶上呈现长方形的核酸条带，切胶机械手前方安装有摄像设备2-8，用来对电泳胶成像，摄像设备2-8和切胶机械手2-6相对距离固定，方便了图像坐标系，相机坐标系和物理世界坐标系之间的转换，有利于对核酸条带的精确切割。移液机械手2-7也被安装在机械手架2-5上可沿坐标系3个方向自由移动，移液机械手2-7可以自动插拔一次性枪头，有效的避免了实验过程中的试剂的交叉污染，移液机械手2-7对枪头的物理位置定位可以根据枪头盒2-10的物理位置和其所插枪头的数量进行计算。加热模块2-12被用来对溶胶过程进行加热，它可以通过开关电源的通断来调整温度。蠕动泵被用来把试剂瓶中的电泳缓冲液添加到电泳槽2-9中，它由步进电机控制，抽滤装置2-14的抽滤泵用来抽真空过滤，它由电源的通断控制开关。胶块收集管用来收集切割下来的琼脂糖凝胶，吸附柱用来绑定溶胶液中的核酸分子，核酸样品收集管收集洗脱下来的纯化核酸样品，试剂瓶2-13用来存放溶胶液，漂洗液和洗脱液，垃圾桶2-11用来临时存放移液机械手推掉的用过的一次性枪头。综上所述，采用本发明所提供的一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，可以实现核酸切胶和回收纯化的自动化，具有自动化程度高，无毒无害，高效等特点。同时，本发明技术可以扩展到生命科学领域的其它核酸切胶回收，不限于琼脂糖凝胶的切胶回收。

以上所述仅仅为本发明的一种实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精髓和原则之内，所做的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (3)

1.一种基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，其特征在于，利用可沿滑轨移动机械手架上搭载的有图像识别系统的切胶机械手，根据图像识别系统采集到琼脂糖凝胶上的核酸片段条带信息，通过机械控制系统切胶机械手发出指令，切胶机械手按指令要求切胶。

2.根据权利要求1所述的基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，其特征在于，在切胶之前，通过可沿滑轨移动的机械手架上搭载的切胶机械手上的图像识别系统，识别核酸条带在琼脂糖凝胶中的位置，大小和浓度特征参数，向切胶机械手发出是否切胶和收集胶块的指令；切胶完成后，利用可沿滑轨移动机械手架上搭载的移液机械手，通过机械控制系统向移液机械手发出指令，自动完成溶胶，吸附，漂洗，洗脱过程的移液操作。

3.根据权利要求1或2所述的基于图像识别的核酸切胶回收自动化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)电泳：放置制备好的琼脂糖凝胶到电泳槽中，电源控制系统向蠕动泵发出指令，向电泳槽中添加足量的电泳缓冲液，核酸样品添加后，电源控制系统向电泳槽电源发出开关指令，电泳开始；

2)切胶：电源管理系统向激发光光源发出通断指令，使琼脂糖凝胶上的核酸条带显色，通过可沿滑轨移动的机械手架上搭载的切胶机械手的图像识别系统采集核酸片段大小，相对位置，亮度等参数，判断哪条条带是目标，然后向切胶机械手发出指令切胶，并把胶块移动到相应的收集管中；

3)溶胶：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手从试剂瓶中转移溶胶液到胶块收集管中，电源控制系统向机械手架上的加热模块发出指令，加热溶胶；

4)吸附：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手把溶胶液从胶块收集管转移到核酸收集管中，电源控制系统向抽滤泵系统发出指令，抽滤；

5)漂洗：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手向核酸收集管中添加漂洗液，电源控制系统向抽滤泵系统发出指令，抽滤；

6)洗脱：机械控制系统向移液机械手发出指令，移液机械手向核酸收集管中添加低盐缓冲液或纯洁水，抽滤或离心收集。