CN109628538A - 一种仿生法制备功能性蛋白多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，是以天然植物蛋白为原料，利用非动物源性蛋白酶，模拟动物消化过程，生产酶解蛋白多肽。包括：将植物蛋白原料预粉碎，加水调制，采用非动物源性复合蛋白酶A、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行一次酶解，再加入复合蛋白酶B、赖氨酸氨肽酶和羧肽酶进行二次酶解，制得二次酶解蛋白浆液，然后均质、喷雾干燥、灭菌，即得。本发明工艺流程简单，成本低，所制备的产品活性小分子肽(相对分子量介于186～1000Da之间)和游离氨基酸(<186Da)含量高，抗营养因子全部降解，体外消化吸收率≥95％以上，能有效替代优质动物源性蛋白，显著促进幼龄动物的生长，具有良好的社会和经济效益。

Description

一种仿生法制备功能性蛋白多肽的方法

技术领域

本发明涉及一种仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，属于豆粕蛋白、棉籽蛋白、豌豆蛋白或大米蛋白等植物蛋白的深加工技术领域。

背景技术

豆粕蛋白、棉籽蛋白、菜籽粕、豌豆蛋白或大米蛋白等是相应产品加工中得到的副产品，尤其是豆粕蛋白，一种优质的植物蛋白质资源，约占大豆质量的75％。目前在世界范围内，豆粕在饲用的所有植物性饼粕中所占比例高达62％，成为最重要的植物蛋白饲料原料。但是由于上述植物蛋白的复杂致密的立体结构以及其中的胰蛋白酶抑制因子、非淀粉多糖(NSP)、抗原蛋白、致过敏因子等抗营养因子的存在限制了其最大化利用。研究表明，幼龄动物的营养性腹泻、免疫力低下等问题多与植物蛋白的特性有着密切关系，直接造成蛋白质利用率低、原料浪费、环境污染和养殖成本增加等问题的发生。国际原材料的紧张、兽用抗生素的陆续禁用和低蛋白日粮的强制推动，需要采取必要手段对豆粕或其他植物蛋白进行深加工，一是解决植物蛋白中的抗营养因子、二是产品富含功能性小肽、三是提高植物蛋白的消化吸收利用率。

动物采食的蛋白质首先在胃内，经过胃蛋白酶等的作用降解为多肽，然后在肠道内经过胰蛋白酶和肽酶等进一步酶解，把植物蛋白进一步降解为小肽和游离氨基酸，被动物直接吸收利用。未被生物转化处理的豆粕及其他植物蛋白在消化吸收过程中会对畜禽肠道，特别是幼龄畜禽肠道造成损伤。专利申请CN1786182A和CN101558818A中提到利用发酵法制备低抗营养因子、高效化率豆粕，但是由于工艺不易控制的缺点，造成发酵豆粕品质的不稳定性、功能性小肽含量低和抗原蛋白降解的不彻底等；CN1911066B也存在类似上述产品质量不易控制的问题；CN106578421A通过采用酶解法制备，工艺过程可控制性强，产物相对明确，但是其产物以多肽为主，抗原蛋白含量未能充分降解，消化吸收率未能充分最大化。目前市场上还未出现利用仿生法制备低抗营养因子、富含功能性小肽和高消化率的植物蛋白多肽产品。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种模拟仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，本发明方法将功能性植物蛋白中抗营养因子彻底消除、富含功能性小肽、消化吸收利用率高，能够有效替代动物源性蛋白原料(鱼粉、血浆粉)，促进仔猪等幼龄动物的生长、减少发病率、间接减少抗生素的使用，节约生产成本。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

本发明的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，包括：将植物蛋白原料预粉碎，加水调制，采用非动物源性复合蛋白酶A、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行一次酶解，再加入复合蛋白酶B、赖氨酸氨肽酶和羧肽酶进行二次酶解，制得二次酶解蛋白浆液，然后均质、喷雾干燥、灭菌，即得。

进一步的，所述植物蛋白原料为豆粕蛋白、棉籽蛋白、菜籽粕、豌豆蛋白或大米蛋白等中的至少一种，预粉碎的粒径过40～80目筛。

作为优选的，所述植物蛋白原料的粗蛋白含量为43％或以上。

进一步的，所述水的添加量与植物蛋白质量的比例为4～10:1。此添加量下，既能将蛋白原料均匀分散，又能促进下一步酶解的进行。

进一步的，所述一次酶解过程中，加入复合蛋白酶A、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，在pH＝3～5条件下，酶解2～10h，灭酶，即得到一次豆粕酶解液。此时，大分子蛋白被酶解为中、低分子多肽和极少量氨基酸，为二次酶解做准备。

作为优选的，一次酶解后，将酶解液升温至85～95℃，灭酶10～30min。

进一步的，所述二次酶解为加入复合蛋白酶B、赖氨酸氨肽酶和羧肽酶，在50～70℃温度下，酶解1.5～10h。

作为优选的，一次酶解后，将所得的一次蛋白酶解液的pH值调至6～10，再进行二次酶解。

进一步的，所述复合蛋白酶A为嗜酸性的枯草杆菌和米曲霉发酵提取的混合蛋白酶；

所述复合蛋白酶A的添加量为植物蛋白固形物质量的0.8％～5％；所述木瓜蛋白酶添加量为植物蛋白固形物质量的0.03％～1％；所述菠萝蛋白酶添加量为植物蛋白固形物质量的0.02～1.5％。一次酶解将大分子蛋白酶切成多肽和部分小肽。

作为本发明的其中一些实施例，所述复合蛋白酶A的提取发酵方法为：将活化后的枯草杆菌和米曲霉菌种以2～5:1，按照2～10％的添加量接种至马铃薯葡萄糖培养基中，培养10～24h，所得培养液低温(30～50℃温度下)真空浓缩至原体积的1/2。

所述复合蛋白酶A的酶活力为200000～500000U/ml；所述木瓜蛋白酶，酶活力为490000～510000U/ml；所述菠萝蛋白酶，酶活力为490000～510000U/ml。

作为本发明的其中一些实施例，所述的制马铃薯葡萄糖培养基的制备方法为：将20g葡萄糖加入1000ml含量为20％的马铃薯浸汁中，定容至1000mL，调整pH为3～6，115℃灭菌20min，冷却备用。

作为本发明的其中一些实施例，所述复合蛋白酶B为嗜中性的枯草杆菌和黑曲霉发酵提取的混合蛋白酶；

所述复合蛋白酶B添加量为植物蛋白固形物质量的1％～8％，所述赖氨酸氨肽酶添加量为植物蛋白固形物质量的0.5％～3％；所述羧肽酶添加量为植物蛋白固形物质量0.3％～5％。二次酶解将多肽和部分小肽酶切成大量小肽和氨基酸。

所述复合蛋白酶B酶活力为100000～500000U/ml；所述赖氨酸氨肽酶，酶活力为95000～105000U/ml；所述羧肽酶酶活力为95000～110000U/ml。

作为本发明的其中一些实施例，所述复合蛋白酶B的提取发酵方法为：将活化后的嗜中性的枯草杆菌和黑曲霉菌种以2～7:1；按照2～10％的添加量接种至豆芽汁葡萄糖培养基中，培养8～18h，所得培养液低温(30～50℃温度下)真空浓缩至原体积的1/3即可。

作为本发明的其中一些实施例，所述的制豆芽汁葡萄糖培养基的制备方法为：将50g葡萄糖加入到1000ml含量为10％的豆芽汁中，定容至1000mL，调整pH为6～10，115℃灭菌20min，冷却备用。

本发明的二次蛋白酶解液，进行均质后、高速离心喷雾干燥，即得到功能性酶解蛋白多肽。

进一步的，所述均质设备为高速均质乳化机。

进一步的，所述高速均质乳化机，速度为3000～15000转/min，均质30～90min。

进一步的，所述喷雾干燥的进风温度为180～220℃，出风口温度为60～80℃。

本发明完成喷雾干燥后出料，过筛，所得产品80％或以上通过80目筛。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的方法在微生物中提取的高效复合蛋白酶A、复合蛋白酶B以及植物蛋白酶，模拟仿生法，采用分段酶解，将豆粕等植物蛋白酶解成最理想的小分子肽和氨基酸水平，水解效率高。

2、本发明所制备的豆粕等植物蛋白产品粗蛋白含量在56％以上，胰蛋白酶抑制因子、寡糖和大豆抗原蛋白含量等抗营养因子完全降解，其中蛋白中活性小分子肽(相对分子量介于0～186Da之间的为19～21％，186～800Da之间的为30～35％，800～1000Da之间的为15～17％)含量高达65％以上，易于消化吸收，生物活性强，能够有效替代动物源性蛋白原料(鱼粉、血浆粉等)，显著增强仔猪免疫力和抗病力，有效促进幼龄动物的生长，间接减少抗生素的使用。

3、本发明的制备方法工艺流程简单、原料来源广泛、生产成本低，适合工业化的推广，具有良好的社会和经济效益。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

取脱脂去皮豆粕原料500kg，将其预粉碎过60目筛，加水(豆粕原料与水的比例为1:5)搅拌均匀，配制成固形物为15％的豆粕混合液；将豆粕浆液的pH值调至3.5，加入复合蛋白酶A(添加量为植物蛋白固形物质量的3％、木瓜蛋白酶(添加量为植物蛋白固形物质量的1％)和菠萝蛋白酶(添加量为植物蛋白固形物质量的1.5％)，在50℃下，酶解6h，将酶解液升温至85℃，灭酶20min，即得到一次豆粕酶解液；将一次豆粕酶解液的pH值调至7，加入复合蛋白酶B(添加量为植物蛋白固形物质量的3.5％)、赖氨酸氨肽酶(添加量为植物蛋白固形物质量的3％)和羧肽酶(添加量为植物蛋白固形物质量的5％)，在55℃温度下酶解7h，即得到二次豆粕酶解液；将所得到的二次豆粕酶解液均质30分钟后，在进风温度为180℃，出风口温度为80℃条件下，进行高速离心喷雾干燥，即得到功能性酶解豆粕蛋白。

本实施例，产品质量稳定、活性小分子肽(相对分子量介于0～186Da之间的为20％，186～800Da之间的为33％，800～1000Da之间的为15％)含量高达68％。

实施例2

本实施例与上述实施例1不同的是：1)取大米蛋白原料300kg，大米蛋白与水重量比为1:6，所加入的复合蛋白酶A的量为2％、0.05％的木瓜蛋白酶和0.5％的菠萝蛋白酶，在pH为4.5，温度为40℃条件下，酶解5h；2)高温灭酶：在一次酶解之后，升温至70℃，维持30分钟；3)所加入的复合蛋白酶B的量为5％、0.6％的赖氨酸氨肽酶和2％的羧肽酶，在pH为8，温度为45℃条件下，酶解6h；4)将所得到的二次蛋白酶解液均质60分钟后，在进风温度为200℃，出风口温度为70℃条件下，进行高速离心喷雾干燥。

本实施例，产品质量稳定、活性小分子肽(相对分子量介于0～186Da之间的为19％，186～800Da之间的为32％，800～1000Da之间的为14％)含量高达65％。

实施例3

本实施例与上述实施例1不同的是：1)取去皮豆粕、棉籽粕和菜籽粕(1:1:1)原料150kg，原料与水重量比为1:7，所加入的复合蛋白酶A的量为4％、0.7％的木瓜蛋白酶和1％的菠萝蛋白酶，在pH为5.5，温度为45℃条件下，酶解4h；2)高温灭酶：在一次酶解之后，升温至90℃，维持10分钟；3)所加入的复合蛋白酶B的量为7％、1％的赖氨酸氨肽酶和4％的羧肽酶，在pH为8，温度为60℃条件下，酶解3h；4)将所得到的二次蛋白酶解液均质50分钟后，在进风温度为220℃，出风口温度为80℃条件下，进行高速离心喷雾干燥。

本实施例，产品质量稳定、活性小分子肽(相对分子量介于0～186Da之间的为25％，186～800Da之间的为30％，800～1000Da之间的为15％)含量高达70％。一、为进一步验证本发明方案的技术效果，采取如下指标测试：

1.1产品抗营养因子测试

表1抗营养因子指标

由表1可知，本申请方法获得的功能性蛋白多肽，其棉籽糖、水苏糖、大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白含量指标均在较低水平。

1.2肽相对分子量分布情况

表2肽相对分子量分布指标

由表2可知，申请方法获得的功能性大豆蛋白多肽相对分子量分布，相对分子量介于0～186Da之间的为20％左右，186～800Da之间的为30～35％，800～1000Da之间的为约15％。

二、为进一步验证本发明方案的技术效果，实验室模拟消化试验效果如下：

2.1模拟胃蛋白酶消化测试

表3模拟胃蛋白酶消化率

普通豆粕(43％蛋白)	13.60％
		去皮豆粕(46％蛋白)	22.50％
发酵豆粕A(CN 1786182A)	38.30％
		发酵豆粕B(CN 101558818A)	36.40％
酶解豆粕(CN 106578421A)	71.20％
		超级蒸汽鱼粉	93.10％
本发明实施例1制备的产品	95.90％
		本发明实施例2制备的产品	96.03％
本发明实施例3制备的产品	95.79％

由表3可知，体外模拟消化率高达95％以上，本发明所制备的产品易于消化吸收。

注：体外消化模拟技术是通过模拟动物消化生理特点，采用与动物体内相近的消化环境和消化酶系，在体外评定饲料消化吸收的一种方法(参考张铁鹰等，2005<单胃动物体外消化模拟技术研究进展>)。

三、为进一步验证本发明方案的技术效果，动物应用试验效果如下：

3.1.材料方法

3.1.1试验设计和分组

表4试验设计

组别	添加方案
		处理1组	基础日粮组
处理2组	本申请实施例1制备的产品等蛋白替代鱼粉组
		处理3组	本申请实施例1产品等蛋白替代鱼粉、乳清粉和酵母提取物组
处理4组	按CN106578421A实施例1所得产品，等蛋白替代鱼粉组

选择日龄一致、健康的断奶仔猪192头(约8.5kg/头)，随机分成4个处理，每处理4个重复，每重复12头仔猪。按试验设计(见表4)每组用对应的试验日粮，周期为21天，试验前、后每组称重。

3.1.2试验日粮

表5基础日粮

3.1.3饲养管理

试验期间试验猪舍日常管理按猪场正规程序执行。采取自由采食、自由饮水的饲喂方法。保持猪舍清洁卫生，通风状况良好。试验期间每天定时观察和记录仔猪疾病、死亡等情况。

3.1.4测定项目

3.1.4.1生长性能

每天记录采食量、死淘猪只数量和重量，计算试验期间各阶段平均日增重、日耗料、料肉比及死淘率。

平均日采食量＝(添加饲料总量－料槽剩余料)/(栏剩余头数×试验总天数+死淘猪头数×试验天数)

平均日增重＝(栏末重－栏初重+死淘猪末重)/(栏剩余头数×试验总天数+死淘猪头数×试验天数)

料肉比＝日均采食量/日均增重

死淘率＝(死淘总数×100％)/每组仔猪总数；

3.1.4.2腹泻率

每天记录仔猪腹泻情况。

腹泻率＝腹泻总头次×100％/(试验总头数×试验总天数)。

3.1.4.3外观评分

每周观察比较一次，根据猪的毛、色，可分为差、中、良、优4个等级(评分分别为1、2、3、4分)；

3.1.5数据统计与分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，用SPSS16.0软件进行单因子方差分析，并采用Dun-can法进行差异显著性检验，结果以平均数±标准误差表示。

4.2、结果与分析

4.2.1实验结果

表6不同工艺蛋白源对乳仔猪生产性能的影响

项目	处理组1	处理组2	处理组3	处理组4
					初重(kg)	8.50±0.01	8.50±0.01	8.50±0.00	8.50±0.01
末重(kg)	12.58±0.19	12.98±0.11	13.18±0.15	12.55±0.01
					平均日采食量(g/d)	340.88±30.32	417.18±9.91	425.83±8.32	380.13±30.95
平均日增重(g/d)	238.37±9.19	267.30±24.96	285.37±9.19	249.31±14.96
					料肉比	1.59±0.09	1.54±0.02	1.52±0.08	1.57±0.01
腹泻率(％)	2.76±1.09	2.21±0.99	1.96±1.08	2.64±0.35
					毛色评分	4.32±0.01	4.33±0.01	4.32±0.02	4.31±0.02
淘汰头数(头)	2	1	0	2

由表6可知，在仔猪日粮中，处理组3乳仔猪平均末重、平均采食量、平均日增重明显高于处理1和处理4组；从料肉比上看，处理组3乳仔猪料肉比优于对照处理1和处理4组；从腹泻率上看，处理组3乳仔猪腹泻率较低；各处理组乳仔猪的毛色外观均无显著差异。而处理2组略低于处理3组，乳仔猪平均末重、平均采食量、平均日增重明显高于处理1和处理4组。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，包括：将植物蛋白原料预粉碎，加水调制，采用非动物源性复合蛋白酶A、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行一次酶解，再加入复合蛋白酶B、赖氨酸氨肽酶和羧肽酶进行二次酶解，制得二次酶解蛋白浆液，然后均质、喷雾干燥、灭菌，即得。

2.根据权利要求1所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，所述植物蛋白原料为豆粕蛋白、棉籽蛋白、菜籽粕、豌豆蛋白或大米蛋白中的至少一种，预粉碎的粒径过40～80目筛。

3.根据权利要求1所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，所述水的添加量与植物蛋白质量的比例为4～10:1。

4.根据权利要求1所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，所述一次酶解过程中，加入复合蛋白酶A、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，在pH＝3～5条件下，酶解2～10h，灭酶，即得到一次豆粕酶解液。

5.根据权利要求4所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，一次酶解后，将酶解液升温至85～95℃，灭酶10～30min。

6.根据权利要求1或4所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，所述二次酶解为加入复合蛋白酶B、赖氨酸氨肽酶和羧肽酶，在50～70℃温度下，酶解1.5～10h。

7.根据权利要求6所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，一次酶解后，将所得的一次蛋白酶解液的pH值调至6～10，再进行二次酶解。

8.根据权利要求1所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶A为嗜酸性的枯草杆菌和米曲霉发酵提取的混合蛋白酶；

所述复合蛋白酶A的添加量为植物蛋白固形物质量的0.8％～5％；所述木瓜蛋白酶添加量为植物蛋白固形物质量的0.03％～1％；所述菠萝蛋白酶添加量为植物蛋白固形物质量的0.02～1.5％。

9.根据权利要求6所述的仿生法制备功能性蛋白多肽的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶B为嗜中性的枯草杆菌和黑曲霉发酵提取的混合蛋白酶；

所述复合蛋白酶B添加量为植物蛋白固形物质量的1％～8％，所述赖氨酸氨肽酶添加量为植物蛋白固形物质量的0.5％～3％；所述羧肽酶添加量为植物蛋白固形物质量0.3％～5％。