CN109628322B - 一株白及内生真菌3-g2及其应用 - Google Patents

一株白及内生真菌3-g2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株白及内生真菌3‑G2及其应用。一株白及内生真菌3‑G2，分类命名为黑毛壳霉菌(Chaetomium nigricolor)，于2018年06月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60383。本发明首次从药用植物白及内部分离筛选到一株内生真菌(Chaetomium nigricolor)3‑G2，该菌株对白及各方面生长具有较强的促生作用，为白及的产量、质量控制带来广阔的应用前景。

Description

一株白及内生真菌3-G2及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株白及内生真菌3-G2及其应用。
背景技术
现代农业对植物病害的防治过度依赖于化学农药的使用，大量化学农药的施放不仅对生态环境具有长期的破坏作用，也引起农产品品质下降，农药残留超标、病原菌的耐药性以及对人畜有害等诸多问题。寻找更为安全、有效的病害防治方法具有重大的意义，利用生物的方法来防治植物病害可以有效解决上述问题。
白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.F.为兰科白及属多年生草本植物，名白鸡儿、羊角七、军求子、地螺丝等，白及是我国传统的中药材之一，其肉质肥厚且具黏性的块茎可入药，具有止血、保护粘膜、抗肿瘤、抗菌等功效，很少有植物多糖具有收敛的功效，因此素有“必涩而收，入肺止血，生肌治疮，外科最善”之称，为白及糖浆、白及冲剂、胃康灵、快胃片等中成药的主要组方原料。近年来，由于野生白及受到过度开发和自然栖息地的破坏，野生白及资源直线下降，白及药材的产量和质量得不到保证，现已被国家列为重点保护的野生药用植物之一，目前已经濒危。由于白及种子无胚乳，难以直播成苗，且组培苗种植成活率较低。这都使得进行白及大规模种植困难重重。
目前，广西地区白及的人工栽培过程中，多采用野生白及分块茎种植，大苗种植三年收获。但种苗质量标准缺乏、品种与质量控制技术研发应用滞后，都是制约白及产业可持续发展的关键问题。因此，为此筛选出能促进白及生长的内生真菌具有重大意义，筛选进而开发利用白及内生真菌也是有效保证白及药材质量的措施之一。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明目的是提供一株白及内生真菌3-G2，该菌株具有促进白及生长的作用，从而能有效促进白及生长、提高产量，更进一步提高白及的质量。
本发明提供的技术方案如下：
一株白及内生真菌3-G2，分类命名为黑毛壳霉菌(Chaetomium nigricolor)，于2018年06月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60383。
本发明还提供了所述的白及内生真菌3-G2在促进白及生长作用中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次从药用植物白及内部分离筛选到一株内生真菌黑毛壳霉菌(Chaetomium nigricolor)3-G2，该菌株对白及各方面生长具有较强的促生作用，为白及的产量、质量控制带来广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的白及内生真菌3-G2菌落形态图；
图2为本发明的白及内生真菌3-G2菌株基于ITS序列的聚类图系统进化树；
图3为部分共生菌苗生长状态；
图4为本发明的白及内生真菌3-G2与白及无菌苗共生培养生长状态；
图5为本发明的白及内生真菌3-G2菌株IAA合成能力检测；
图6为本发明的白及内生真菌铁载体合成能力检测。
保藏信息说明
Chaetomium nigricolor，其保藏编号为GDMCC NO.60383，保藏日期为2018年06月06日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮政编码：510070)。
具体实施方式
以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：菌株的分离、筛选与鉴定
1.1菌株的分离
供试材料：采自广西资源县和环江县地区的野生白及。
培养基：1000ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，PDA培养基含马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g和氯霉素0.1g，培养基pH值为6.0±0.2。
表面消毒：将长为6-8cm、宽为1-2cm新鲜健康的白及假鳞茎和根用流水冲洗30min以冲干净泥沙，然后将洗净的白及假鳞茎和根用无菌水漂洗2次，风干表面水分，移到超净工作台，在无菌条件下，将白及假鳞茎和根用体积浓度为75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗2次，次氯酸钠(有效氯1％)浸泡2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。
菌株的分离、纯化：表面消毒好的白及根和假鳞茎，无菌条件下，用无菌枝剪剪成0.5cm长的组织块，无菌转接至制备好的PDA培养基(含氯霉素)，28℃培养。取最后一次漂洗液涂布在PDA平板上，作为阴性对照。每天观测，待组织周围长出菌丝，挑取单一菌丝，接于无抗生素的PDA培养基。长出的菌落，如果外部形态不一致，继续挑取单一菌丝转接PDA培养基，直至平板上新长出的菌落的外部形态一致。初步依据菌落的颜色、形状和菌丝形状等对菌株进行编号，并拍照，记录其形态特征。
于超净工作台上，用接种针挑取菌株的少量孢子或者菌丝(不易产孢的真菌)，置于25％的无菌甘油中，-80℃冷藏保存。
1.2筛选
采用菌苗共生法对供试白及内生真菌进行菌体促生活性的初筛。
在超净工作台上，将白及无菌组培苗取出，用无菌水洗净根部带出的培养基，置于无菌滤纸上吸干水分，然后移入DE培养基中。每瓶接4株，呈“口”字居中排列，转接完成后放入培养室中培养15d，温度25-26℃，每天光照8-12h，光照强度为2000-3000Lux。
待白及无菌苗于DE培养基上生长15d后，其生长状态基本稳定。此时，用打孔器从已活化的白及内生真菌母菌落边缘打取直径为0.6cm的菌饼作为接种材料，挑取菌饼接种到4株白及苗的中间，每个组培瓶内接种一块，重复3次，对照组接入无菌的PDA琼脂块。接种完成后封口，放于培养室中培养，温度25-26℃，每天光照8-12h，光照强度为2000-3000Lux。定期观察真菌及白及组培苗的生长状态。共生培养30天后，以菌生长速度适中且白及无菌苗正常生长为标准，挑选出能与白及无菌苗良好共生的真菌。
如图3所示，部分真菌在DE培养基上生长速度较快，菌丝覆盖整个培养基表面和组培瓶瓶壁，大量菌丝缠绕植株叶片，被缠绕的叶片慢慢变黄，最后枯死；一些真菌生长速度虽然不快，只有一薄层菌丝覆盖在培养基表面，但是部分接种真菌处理的白及无菌苗叶片逐渐变黄，再者植株的生长状态明显不如对照组；一些真菌生长速度不快，且菌丝体不发达，菌丝长满整个培养基表面，植株根周围有菌丝包裹，叶片上没有菌丝缠绕，且白及无菌苗叶色正长，有明显的新根和新芽长出，新生芽和新生根生长状态良好。
将初筛得到的菌株，以相同的方法，重新接种于DE培养基中，每瓶3株无菌苗，以接入相同大小的无菌琼脂块作为对照。相同的培养条件，共生培养60d后，分别取出对照苗和共生苗，洗净根部残留培养基，用滤纸吸干表面水分。测定其株高、新生根数、新生芽数、块茎直径大小。
表1白及内生真菌菌株3-G2的促生效应
菌株 株高(cm) 块茎直径(nm) 新生芽数 新生根数
CK 5.98±0.79BAb 3.31±0.34Bb 0.2±0.13Bb 0.8±0.33Ab
3-G2 3.28±0.54Aa 4.761±0.32Aa 1.1±0.10Aa 2±0.36BAa
注：不同的小写字母表示均值差的显著性水平为0.05，不同的大写字母表示均值差的显著性水平为0.01。
如图4和表1所示，结果共得到5株对白及无菌苗生长具有很强促生效应的白及内生真菌菌株，其中一株名称为3-G2，块茎直径增加了44％；新生芽数均为对照的5.5倍。
1.3鉴定
(一)菌株形态特征
菌体形态特征观察：将待鉴定的内生菌真菌菌株3-G2接种在PDA培养基上，置于28℃培养，分别在5、14及20天观察其培养特征和颜色变化。取稳定成熟的颜色特征作为其培养特征，作为鉴定的依据。观察记录气生菌丝的颜色，菌落的大小、颜色、组织形状、表面形状等作为参考特征。
孢子形态特征观察：将待鉴定的内生菌真菌菌株3-G2作插片培养，当在PDA培养基上不产孢子，将菌丝转接于含无菌白及植株的低营养培养基(四分之一浓度PDA)上以诱导孢子，将所观察到的形态结果显微照相，如图1所示。
如图1所示，在人工PDA培养基上比商品化的PDA培养基上生长好，在人工PDA上，菌落局限生长，生长缓慢，培养一个月，菌落纺锤状，直径16mm，高度3mm；菌落正面浅黄褐色，背面浅褐色，边缘深褐色；菌丝组成紧密的绒毛状；紧密的菌丝；主要是气生菌丝，无孢子，老菌丝黄色。
(二)菌株ITS序列及其系统发育学分析
DNA模板的制备：
试剂：(1)裂解缓冲液：Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA 1mM，SDS 1％(w/v)；
(2)5M NaCl溶液。
DNA提取：
加600μL65℃预热的提取液(Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA 1mM，SDS1％)到1.5ml离心管(EP管)，用棒刮取少量菌丝放入EP管研磨，65℃水浴30min，离心转速12000r/min，离心10min；
取离心所得上清液400μL，加5M NaCL 100μL，冰浴10min；
然后在温度为4℃下保持离心转速为12000r/min，离心10min，取上清液；加上清液0.6倍异丙醇与上清液混匀(或2倍无水乙醇)冰浴1h，保持离心转速12000r/min，离心10min，弃去上清液后所得余下物质晾干，加20μL双蒸水(ddH2O)，取1-2μL做DNA模板。
PCR扩增ITS序列：
(1)PCR仪：ABI 3730-XL DNA测序仪(Applied Biosystems,USA)
(2)扩增引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)
(3)扩增体系：ITS序列PCR扩增体系如表2所示。
表2 ITS序列PCR扩增体系
Figure GDA0002643792720000061
Figure GDA0002643792720000071
PCR反应条件如表3所示。
表3 PCR反应条件
Figure GDA0002643792720000072
注：步骤2进行30个循环。
PCR扩增产物的电泳检测：
电泳条件为1％的琼脂糖凝胶(含Goldview 5μl/100ml)，1×TBE电泳缓冲液，90V电压电泳1小时，PCR产物上样量为3μL，与1μL Loading dye混匀后点样。在254nm紫外下观察结果，以TaKaRa公司的DL1000 DNA Marker为核酸标准分子量参照物，确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物400-700bp的位置上。
PCR产物纯化和测序：由深圳华大基因科技有限公司进行。
系统进化树的构建：
将所测的ITS序列与GenBank基因库中已测定的真菌的ITS序列进行比对，根据比对结果下载相关序列。通过MEGA 6.0的邻接算法(Neighbor-joining NJ)进行系统分析并构建系统进化树，如图2所示。
利用引物ITS1和ITS4，从菌株基因组DNA中扩增出一条500-600bp大小的片段，经测序并将测序结果通过GenBank中BLASTn比对，根据比对结果下载相关的参考菌株序列，利用MEGA6的邻接算法(Neighbor-joining NJ)进行系统分析并构建系统进化树。
结果表明，菌株3-G2与Chaetomium nigricolor(EU543258)聚在一起形成支持强度为100％的末端分支。
综合形态学和分子生物学特征，将菌株初步鉴定为Chaetomium nigricolor。
实施例2：菌株促生能力检测及菌液对白及盆栽苗的促生作用评价
2.1活性菌株3-G2发酵液吲哚乙酸(IAA)合成能力检测
(1)取0.6cm菌块接种于20mlIAA检测培养基，置于摇床中28℃，150r/min培养5天。取100μL培养液滴到白色陶瓷板上，加入100μL Salkowski比色液，将白色陶瓷板常温避光放置30min，观察颜色变化，设置阴性对照(无菌培养基)和阳性对照(比色液加入50mg/L和25mg/L的IAA)。
(2)将有明显颜色变化的菌株培养液8000r/min，离心10min，分别取2ml上清液过0.22μm微孔滤膜，过滤除菌后，加入2ml Salkowski比色液，室温避光放置30min后，用空白的IAA检测培养基相同处理作为对照调零，测定各混合液的OD530。利用IAA标样构建标准曲线，参照IAA标准曲线计算样品的IAA含量，上述实验均重复三次3个重复。
如图5所示，左起阳性对照中分别为100μL ug/ml和25ug/ml的IAA溶液中加入100μL Salkowski比色液，遮光放置30min后，混合液颜色由无色变为粉红色，阴性对照CK无颜色变化。将真菌3-G2发酵液离心，取上清液与Salkowski比色液混合，遮光放置30min后，混合液有明显的粉色变化，证明3-G2有明显的吲哚乙酸(IAA)合成能力。
菌株白及内生真菌3-G2吲哚乙酸(IAA)合成量如表4所示。
表4菌株白及内生真菌3-G2吲哚乙酸(IAA)合成量
菌株 株活性菌发酵液中IAA的含量(μg/ml)
CK 0
3-G2 14.44
如表4所示，IAA对植物生长的促进作用主要是促进细胞的生长。菌株白及内生真菌3-G2的产IAA能力测试结果表明，菌株白及内生真菌3-G2对白及无菌苗促生作用主要由于3-G2能够合成吲哚乙酸所引起的。3-G2发酵液中IAA的含量为14.44μg/ml。
2.2菌株合成能力铁载体检测
(1)取已活化母菌落的0.6cm的菌块，将菌块分别接种到20ml无铁查氏培养基，每个试管接种两块，对照中加入相同大小的无菌琼脂块，28℃，150r/min培养5天。将培养液8000rpm离心10min，取上清夜，在白色陶瓷板上，按体积比1:1取上清液和CAS显色液，摇晃混匀，观察其颜色变化，记录混合后液体颜色变化。
(2)将颜色变化的菌株培养液离心10min(8000rpm)，分别取2ml上清液过0.22μm微孔滤膜，加入2ml CAS比色液，室温静置放置1h后，测定其OD680，计为“As”，取2ml无菌的无铁查氏培养液，按相同的方法测定其OD680作为参比值，计为“Ar”。由空白对照的OD680值的改变确定培养液中铁载体的浓度大小。试验中铁载体的浓度用铁载体活性单位(SU)表示。
铁载体活性计算公式为：SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％。
铁载体是由微生物产生的一类小分子金属离子螯合物，其对Fe3+具有强亲和性，能够增加植物对铁元素的吸收。
如图6所示，真菌3-G2菌悬液与CAS显色液混合呈紫色反应，无菌培养液与CAS混合后，颜色呈浅绿色。说明真菌3-G2具有合成铁载体的能力。
表5菌株产铁载体的定量测定
Figure GDA0002643792720000091
如表5所示，菌株3-G2的SU为0.2762，其As/Ar值为0.7238，大于0.5，表明该菌具有产铁载体能力。
2.3菌液对白及盆栽苗的促生作用评价
(1)菌液制备：将菌苗共生初筛得到活性菌株在PDA固体培养基上活化，取0.6cm的菌块，接入250ml的无菌PDB液体培养基中，26℃～28℃，150r/min，暗培养4～6d，取出备用。
(2)菌液施放：选取大小和长势一致的一年生白及苗，移栽至温室盆栽培养，每盆种植30株。15d后，将菌液稀释10倍后施以盆栽苗，每盆施放50ml，每个真菌处理30株，浇等量的无菌PDB培养液做为对照，每隔15d同样的方法菌液处理一次，进行3次处理。按常规栽培方式统一管理，培养90d后，统计植株的根数，块茎大小、块茎重量等指标。
表6白及3-G2真菌发酵液对白及盆栽苗的促生作用评价
编号 鲜重 鳞茎重 根数 芽数 根重
CK 0.76±0.03Bb 0.54±0.02Bb 8.61±0.57Bb 0.5±0.11Bb 0.22±0.02Bb
3-G2 1.55±0.09Aa 1.06±0.07Aa 13.85±1.09Aa 1.50±0.19Aa 0.48±0.05Aa
注：n＝30；不同的小写字母表示均值差的显著性水平为0.05，不同的大写字母表示均值差的显著性水平为0.01。
从表6可知，白及3-G2发酵液液处理的白及苗都能正常生长，且与对照不施菌液处理相比，各项指标均达到极显著差异。鲜重为对照的2.04倍，鳞茎的重量分别为对照的1.96倍，根重为对照的2.18倍；根数和芽数与对照差异极显著，根数分别为对照的1.61倍，芽数为对照的3.0倍。
经分析，真菌3-G2在该试验中表现出较明显的促生活性。因此，在白及有机生态栽培上，菌株白及内生真菌3-G2具有突出的潜力。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Figure GDA0002643792720000111
Figure GDA0002643792720000121
序列表
<110> 广西大学
<120> 一株白及内生真菌3-G2及其应用
<130> ZYWS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 531
<212> DNA
<213> 一株白及内生真菌3-G2及其应用(Chaetomium sp)
<400> 1
taaaattgga aactccccaa ccattgtgaa cgttaccatt atcgttgctt cggcgggcgg 60
cgcccagcgc tcccaggccc cctcgcgggg cgcccgccgg aggttaccta actcttgaca 120
actgtatggc ctctctgagt ctctatactt aataagttaa aactttcaac aacggatctc 180
ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat 240
tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagtattctg gcgggcatgc 300
ctgttcgagc gtcatttcaa ccatcaagcc ccaggcttgt gttggggacc tgcggctgcc 360
gcaggccctg aaaaccagtg gcgggctcgc tagtcacacc gagcgtagta gcatacacat 420
cgctcagggc gtgctgcggg ttccggccgt taaacccctt ttttacccaa ggttgacctc 480
ggatcaggta ggaagacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga a 531

Claims (2)

1.一株白及内生真菌3-G2，其特征在于，分类命名为黑毛壳菌(Chaetomium nigricolor)，于2018年06月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNO.60383。
2.根据权利要求1所述的白及内生真菌3-G2在促进白及生长中的应用。
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