CN109627300A - Nisin溶液稳定剂开发及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种在Nisin溶液的生产和储存过程中的长效稳定剂,属于微生物保存技术领域。将1~10g乳酸链球菌素即Nisin纯品与0.1~2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后,用0.02M盐酸定容至100mL,然后用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0~4.0;在Nisin生产过程中,5000L酸化罐加入0~10kg的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后,再加入盐酸酸化调节pH1.9,80℃保温1h后降到50℃,随后陶瓷膜过滤除菌。本发明稳定剂性价比高,可用于维持食品、化妆品等领域中Nisin溶液的活性及长效,同时可用于Nisin生产过程,减少Nisin在酸化过程中的破坏。
Description
技术领域
本发明涉及微生物保存技术领域,尤其是涉及三种Nisin溶液稳定剂制备及应用。
背景技术
乳酸链球菌素(Nisin)亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛,是乳酸链球菌产生的一种多肽物质,由34个氨基酸残基组成,分子量约为3400Da。由于乳酸链球菌素可抑制大多数革兰氏阳性细菌,并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用,因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。。
在工业生产中,乳酸链球菌素(Nisin)往往容易因在其制剂制备、贮存和释放过程中受外界条件影响而发生降解或破坏,导致较大的经济损失,所以提高蛋白质的稳定性十分重要。乳酸链球菌素(Nisin)是一种浅棕色固体粉末,使用时需溶于水或液体中,且于不同pH值下溶解度不同。如在水中(pH=7),溶解度为49.0mg/mL(Nisin),若在0.02M盐酸中,溶解度为118.0mg/mL(Nisin),在碱性条件下,几乎不溶解。在工业生产中采用盐酸调节pH,增加Nisin溶解度,在强酸条件下,Nisin中的肽键和二硫键可能发生多处断裂,致使Nisin的稳定性会发生一定的变化。
目前,增加多肽、蛋白质类药物稳定性的方法的途径主要有:用PEG(聚乙二醇)修饰多肽、蛋白质抵抗酶解、使用酶抑制剂、应用微乳制剂、应用纳米粒制剂、应用生物黏附性颗粒等。PEG虽然能对多肽进行修饰,但该聚合物在体内降解存在很大的问题,低分子量的有肾脏毒性,高分子量的体内降解机理目前尚不明确。微乳制剂、纳米粒制剂、生物黏附性颗粒等生产成本较高。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本申请提供了一种在Nisin溶液的生产和储存过程中的长效稳定剂。本发明稳定剂性价比高,可用于维持食品、化妆品等领域中Nisin溶液的活性及长效,同时可用于Nisin生产过程,减少Nisin在酸化过程中的破坏。
本发明的技术方案如下:
本发明提供的长效Nisin溶液稳定剂每100mL中包括以下原料:
1~10g Nisin纯品;
0.1~2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖;
采用0.02M盐酸定容至100mL;
采用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0~4.0。
所述的长效Nisin溶液稳定剂的制备方法为:将1~10g乳酸链球菌素即Nisin纯品与0.1~2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后,用0.02M盐酸定容至100mL,然后用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0~4.0,优选pH为3.5;所述乳酸链球菌素效价大于1000IU/mg。
所述的长效Nisin溶液稳定剂的应用方法为:在装有Nisin发酵液的酸化罐中,加入0.1~5%的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖,再加入浓盐酸调节Nisin发酵液pH为1.5~2.0,搅匀,加热至70~85℃,保持0.5~2h后随后降温到45~60℃,随后陶瓷膜过滤,去除菌体及大分子蛋白。
另一种应用方法为:在Nisin生产过程中,含有5000L Nisin的酸化罐加入0~10kg的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后,再加入盐酸酸化调节pH1.9,80℃保温1h后降到50℃,随后陶瓷膜过滤除菌。
优选的,在生产应用过程中陶瓷膜的截留分子量为2千~1万道尔顿。
优选的,所述甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖的添加量均以乳酸链球菌的重量为基准。
本发明有益的技术效果在于:
本发明为增加Nisin在生产和储存过程中的稳定性,展开了Nisin溶液稳定剂的研究,通过改变pH和温度来加速Nisin溶液的破坏,同时加入供试稳定剂,并在实验室条件下模拟Nisin溶液生产过程和长期储存过程,进一步证明稳定剂对Nisin溶液的保护作用。
Nisin能有效抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌,如乳杆菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌等,特别是对产芽孢的细菌如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用。Nisin可被消化道蛋白酶降解为氨基酸,无残留,不影响人体益生菌,不产生抗药性,不与其它抗生素产生交叉抗性。常温下储存蛋白和多肽仍是目前比较棘手的问题,虽然Nisin与其他多肽和蛋白相比,具有较好的耐酸、耐热性能,但在生产和长期的存储过程中,亦会发生降解和破坏,导致活性降低。目前食品工业应用中,为了改善Nisin的抑菌稳定性,采用钠磷酸盐、EDTA二钠和柠檬酸钠等对乳酸链球菌素抗菌活性进行保护。
申请人的研究表明,甲硫氨酸、低酯果胶、壳聚糖均对Nisin溶液具有一定的保护效果。尤其是壳聚糖,可大幅提高Nisin在溶液中的稳定性,具有很好的应用价值。壳聚糖、低酯果胶在蛋白质和多肽保护过程中,主要发挥的是封闭剂的作用,维持其空间结构,而甲硫氨酸的保护机理目前尚不清楚,有待进一步深入研究。
本发明配置操作简单,可重复性好,生产成本低廉。本稳定剂对Nisin有很好地保护作用,且稳定性较长。在Nisin溶液添加保护剂,同时进行空白对照实验,置于55℃培养箱中,分别于7天和14天取样,Nisin的热稳定性相对于对照品都有所提升。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述。但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1:
准确称取0.5g Nisin纯品(含量98%),加入0.1%、0.5%、1%、2%、5%的甲硫氨酸,溶解于50mL 0.02M盐酸,分别取10mL至具塞试管中,并室温搅拌15min,最后使用200mM,pH=7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5,搅拌均匀后,将所有样品置于55℃培养箱中,同时进行对照实验。分别于7天和14天取样,Nisin的含量测定均使用生物效价法测定,测定方法依据国标NY/T392-2000操作,结果如表1所示。
表1在甲硫氨酸作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)
从表1数据中可见,甲硫氨酸对Nisin浓缩液有一定程度的保护效果,相对于对照品,浓缩中添加1%甲硫氨酸对稳定性有20~30%的保护效果。
实施例2:
准确称取0.5g Nisin纯品(含量98%),加入0.1%、0.5%、1%、2%、5%的壳聚糖,溶解于50mL 0.02M盐酸,分别取10mL至具塞试管中,并室温搅拌15min,最后使用200mM,pH=7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5,搅拌均匀后,将所有样品置于55℃培养箱中,同时进行对照实验。分别于7天和14天取样,Nisin的含量测定均使用生物效价法测定,测定方法依据国标NY/T392-2000操作,结果如表2所示。
表2在壳聚糖作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)
从表2数据中可见,壳聚糖对Nisin浓缩液有一定程度的保护效果,相对于对照品,浓缩中添加1%壳聚糖对稳定性有17~40%的保护效果。
实施例3:
准确称取5g正常Nisin产品(含量98%),分别加入0.1%、0.5%、1%、2%、5%的低酯果胶,溶解于50mL 0.02M盐酸,分别取10mL至具塞试管中,并室温搅拌15min,CK加溶剂调节至同一体积,最后使用200mM,pH=7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5,搅拌均匀后,将所有样品置于55℃培养箱中,同时进行对照实验。分别于7天和14天取样,Nisin的含量测定均使用生物效价法测定,测定方法依据国标NY/T392-2000操作,结果如表3所示。
表3在低酯果胶作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)
从表3数据中可见,低酯果胶均对Nisin有一定程度的保护作用,相对于对照品,浓缩中添加1%甲硫氨酸对稳定性有25~40%的保护效果。
实施例4:
准确称取0.5g Nisin纯品(含量98%),分别加入1%的巯基乙醇和巯基叔糖醇,溶解于50mL 0.02M盐酸,分别取10mL至具塞试管中,同时进行对照实验。将所有样品置于80℃水浴中,隔一段时间采样,立即采用岛津高效液相色谱仪(LC-15C)装备C18色谱柱(Agelatechnology,C18 250*4.6;5um;150A)实现对Nisin的高效液相色谱在线分离,流动相为乙腈/水(0.1%三氟乙酸)=45/55,检测波长220nm,进样量10μL。在此液相色谱条件下,Nisin的出峰时间在8min左右,如表4所示。
表4在巯基乙醇和巯基叔糖醇作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)
从表4数据中可见,在巯基乙醇和巯基叔糖醇的作用下,Nisin的含量发生明显降低,可见,巯基乙醇和巯基叔糖醇不适宜做Nisin溶液的稳定剂。
实施例5:
准确称取0.5g Nisin纯品(含量98%),分别加入1%卵蛋白和明胶,溶解于50mL0.02M盐酸,分别取10mL至具塞试管中,最后使用200mM,pH=7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5,搅拌均匀后,将所有样品置于55℃培养箱中,同时进行对照实验。分别于7天和14天取样,Nisin的含量测定均使用生物效价法测定,测定方法依据国标NY/T392-2000操作,结果如表5所示。
表5在3种蛋白作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)
从表5数据中可见,在该试验条件下,1%的牛血清蛋白、卵蛋白和明胶对Nisin溶液没有明显的保护作用,且在某些极端条件下,反而有可能会产生一定程度的破坏。
实施例6
在3个含有5000L Nisin发酵液的酸化罐中,分别加入5kg的甲硫氨酸、低酯果胶、壳聚糖,再加入100~130L浓盐酸调节pH为1.9,搅拌均匀,加热至80℃,保持1h后随后降温到50℃,随后陶瓷膜过滤,去除菌体,测定其中的Nisin浓度。同时进行对照组,不加保护剂,酸化结束后,测定Nisin浓度,结果如表6所示。
表6甲硫氨酸、低酯果胶和壳聚糖作用下浓缩液中Nisin的含量(mg/L)
表6数据表明,甲硫氨酸、低酯果胶、壳聚糖等3种物质作为Nisin溶液的稳定保护剂,应用于工业生产中,对Nisin的稳定性有较好的保护作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施案例,本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下,可以对这些实施案例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其同物限定。
Claims (5)
1.长效Nisin溶液稳定剂,其特征在于每100mL中包括以下原料:
1~10g Nisin纯品;
0.1~2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖;
采用0.02M盐酸定容至100mL;
采用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0~4.0。
2.权利要求1所述的长效Nisin溶液稳定剂的制备方法,其特征在于,将1~10g乳酸链球菌素即Nisin纯品与0.1~2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后,用0.02M盐酸定容至100mL,然后用200mM磷酸盐缓冲液调节pH 2.0~4.0;所述乳酸链球菌素效价大于1000IU/mg。
3.权利要求1所述的长效Nisin溶液稳定剂的应用方法,其特征在于,在装有Nisin发酵液的酸化罐中,加入0.1~5%的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖,再加入浓盐酸调节Nisin发酵液pH为1.5~2.0,搅匀,加热至70~85℃,保持0.5~2h后随后降温到45~60℃,随后陶瓷膜过滤,去除菌体及大分子蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用方法,其特征在于,在生产应用过程中陶瓷膜的截留分子量为1万~5万道尔顿。
5.根据权利要求3所述的应用方法,其特征在于,所述甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖的添加量均以乳酸链球菌的重量为基准。
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