CN109596727A - 一种尿液中双酚a的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尿液中双酚A的检测方法，涉及检测技术领域。该检测方法包括以下步骤：将待测的尿液样品冷冻干燥后得到冻干粉，在所述冻干粉中加入提取剂，经浸泡、提取、分离后得到待测液；采用液相色谱质谱联用法对待测液进行检测；取双酚A标准品溶于溶剂中，制成一系列浓度的双酚A标准液，按照与步骤S2相同的检测条件检测各浓度的所述双酚A标准液，并根据检测结果绘制标准曲线；将所述待测液的检测结果与所述标准曲线对照，计算出所述待测样品中双酚A的含量。采用冷冻干燥的前处理方式，简单高效，祛除蛋白效果好，有机溶剂使用量少，适用于大样本的尿液样品中的痕量双酚A的分析。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，且特别涉及一种尿液中双酚A的检测方法。
背景技术
双酚A是用于生产聚碳酸酯(PC)、环氧树脂、苯丙醚树脂等高分子材料的前体，也是一种环境雌激素，长期大量接触会扰乱人体的内分泌等代谢过程。PC塑料则是广泛应用的食品接触材料，在使用过程中，特别是通过加热使用时，其中的双酚A会析出到食品中，人体不可避免的要接触到一定量的双酚A。由于双酚A是一种脂溶性的小分子物质，可通过简单扩散进入人体的各种体液和组织，目前在人母乳、羊水、胎盘组织、血清、尿液、卵泡液、脐带血等中都己检测到了双酚A的存在。越来越多流行病学显示，双酚A不只是内分泌干扰物，也与心血管疾病、二型糖尿病等疾病密切相关。故有必要对尿液中痕量存在的双酚A进行快速准确的定性定量检测，为临床诊断双酚A对人体的影响提供实验依据。
尿液是一种重要体液，含有人体丰富的信息，更重要的是，尿液是一种可以完全无创采集的生物样本。目前，检测双酚A的方法主要包括气相/质谱联用、液相/质谱联用、酶联免疫法等，这些方法都需要对尿液进行复杂的前处理过程。例如，肖晶等提供了HPLC-FL法检测尿液中类雌激素双酚A和烷基酚(中国食品卫生杂志，2008.20(2)，111-114)，需要对尿液进行酶解、SPE萃取，得到的萃取物才能用于样品的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液中双酚A的检测方法，此检测方法前处理简单、操作方便，降低过程污染、祛除蛋白效果好、有机溶剂使用量少。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种尿液中双酚A的检测方法，包括以下步骤：
S1，前处理：将待测的尿液样品冷冻干燥后得到冻干粉，在所述冻干粉中加入提取剂，经浸泡、提取、分离后得到待测液；
S2，样品检测：采用液相色谱质谱联用法对待测液进行检测；
S3，标准曲线绘制：取双酚A标准品溶于溶剂中，制成一系列浓度的双酚A标准液，按照与步骤S2相同的检测条件检测各浓度的所述双酚A标准液，并根据检测结果绘制标准曲线；
S4，定量计算：将所述待测液的检测结果与所述标准曲线对照，计算出所述待测的尿液样品中双酚A的含量。
本发明实施例的尿液中双酚A的检测方法的有益效果是：
先将采集到的尿液冷冻干燥，得到尿液的冻干粉，通过甲醇提取冻干粉中双酚A成分。冻干过程中，待测物质被充分富集，且尿液蛋白等生物大分子在该过程中被沉降，在对冻干粉进行提取剂提取时，尿液蛋白以及其他水溶性物质不会进入到提取剂中对目标物质产生干扰，提取过程简单、高效，尤其是蛋白的祛除效果好。采用极少用量的提取剂就能够实现提取过程，有效降低环境污染。此外，采用低温处理尿液样品，能够有效防止塑料器皿中的双酚A迁移到样品中，从而影响测定结果，使得实际测试浓度偏高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例的尿液中双酚A的检测方法的流程图；
图2为本发明实施例1提供的尿液样品A的样品提取色谱图；
图3为本发明实施例3提供的尿液样品B的样品提取色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的尿液中双酚A的检测方法进行具体说明。
本发明实施例提供一种尿液中双酚A的检测方法，包括以下步骤：
S1，前处理：将待测的尿液样品冷冻干燥后得到冻干粉，在所述冻干粉中加入提取剂，经浸泡、提取、分离后得到待测液；
S2，样品检测：采用液相色谱质谱联用法对待测液进行检测；
S3，标准曲线绘制：取双酚A标准品溶于溶剂中，制成一系列浓度的双酚A标准液，按照与步骤S2相同的检测条件检测各浓度的所述双酚A标准液，并根据检测结果绘制标准曲线；
S4，定量计算：将所述待测液的检测结果与所述标准曲线对照，计算出所述待测的尿液样品中双酚A的含量。
进一步地，在本发明较佳实施例中，步骤S1中，冷冻干燥的步骤为：将所述尿液样品在-6～0℃条件下冷冻后，在真空条件下冷冻干燥24～36h，得到所述冻干粉。先将尿液样品在-6～0℃条件下冷冻至固状，然后置于真空冷冻干燥器中进行冷冻干燥。优选地，真空冷冻干燥器内的温度≤-45℃，真空度≤1.0bar，在该条件下，冷冻干燥24～36h后，尿液样品形成粉末状。尿液样品中的水分被完全去除。
进一步地，在本发明较佳实施例中，步骤S1中，提取剂为甲醇，加入甲醇后，浸泡25～35min，然后超声提取15～25min，低温冷冻离心后得到所述待测液。更为优选地，超声提取的条件为200～240W、75～85Hz。低温冷冻离心的温度为-20～-40℃。先使提取剂充分浸润冻干粉，然后进行超声提取。冻干粉的颗粒小，且疏松多孔，经过浸泡和超声后，能够完全提取出样品中的双酚A。提取完成后，采用低温冷冻离心，避免塑料离心管中的双酚A迁移。
进一步地，浸泡和超声提取过程在低温下进行，或者是采用玻璃容器进行冻干粉的浸泡和提取，避免塑料容器中的双酚A迁移到样品中，导致检测结果失真。
进一步地，尿液样品与提取剂的体积比为1:0.2～0.4。更为优选地，尿液样品与提取剂的体积比为1:0.2～0.3。尿液样品经过冷冻干燥后，只需极少量的提取剂即可进行提取。控制提取剂的含量，提取剂含量过少，则无法进行有效提取，提取剂含量过多，则会导致待测液中的双酚A含量过低，不利于检测。
进一步地，在本发明较佳实施例中，步骤S2中，采用Agilent 6460B三重四级杆串联质谱仪对S1获得的待测液进行检测。三重四级杆串联质谱仪的色谱分离度好、专属性强、稳定性好。
其中，色谱条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×100mm，1.8μm)；
流速：0.1～0.5mL/min，优选为0.4mL/min；柱温：35℃；流动相：A相为水，B相为乙腈；
洗脱梯度：0～3min，从40％B相洗脱至60％B相；进样体积：20μL。
通过调整色谱柱的洗脱程序，采用梯度洗脱方法，分离度好，且洗脱时间仅需要3min，高效便捷。超短的洗脱时间，能够适应于大批量样品的快速分析检测。
进一步地，在本发明较佳实施例中，步骤S3中，溶剂选自选自甲醇、丙酮、异丁醇中的一种。优选为甲醇。更为优选地，双酚A标准液的制备步骤为：取双酚A对照品，以甲醇作为溶剂，制成每1mL含10mg的溶液，作为标准品溶液的储备液，等体积稀释至10ppb(10ng/mL)、5ppb、2.5ppb、1.25ppb、0.625ppb作为标准溶液。
进一步地，在本发明的其他实施例中，步骤S2中，采用飞行时间液质联用仪检测所述待测液。其中，色谱条件为：采用Agilent 1200快速分离液相色谱系统；
色谱柱：Agilent Rx-SIL色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；
流速：0.1～0.5mL/min，优选为0.4mL/min；柱温：35℃；
流动相：A相为75％水，B相为25％乙腈，等梯度洗脱15min；进样体积：2.0μL。
质谱条件为：
采用Agilent 6530Q-TOF质谱仪、电喷雾电离-正离子模式(ESI+)，Vcap:+4000V，气体温度为350℃，雾化气为N2，35psi，干燥气为N2，10L/min，flagmentor:120V，skimmer:60V；MS/MS碰撞气：He，碰撞能：15V，35V。质量扫描范围m/z 100～1200，干燥气流量(N2)为9L/min，干燥气温度为250℃，雾化电压为0.2758MPa，毛细管电压为3.5kV，碎裂电压为150V，锥孔电压为65V。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种尿液中双酚A的检测方法，其包括以下步骤：
(1)取待测尿液样品A 5mL，置于离心管中，-4℃冷冻后，置冷冻干燥器内真空冷冻干燥24h，得到冻干粉。往冻干粉中加入1.5mL甲醇，浸泡25min后，于200W、75Hz超声提取15min，低温冷冻离心后，取上清液0.5mL，作为待测液。
(2)取双酚A标准品，以甲醇作为稀释剂，制成每1mL含10mg的溶液，作为标准样品溶液的储备液，等体积稀释至所需浓度的标准溶液：10ppb(10ng/mL)、5ppb、2.5ppb、1.25ppb、0.625ppb。
(3)三重四级杆串联质谱仪检测待测液：
Agilent 1290高效液相色谱仪(包括二元溶剂输送泵，自动进样器，柱温箱)；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×100mm，1.8μm)；流动相：A相为水，B相为乙腈，洗脱梯度为：0-3min，40-60％B；柱温：35℃；流速：0.4mL/min；进样体积：20μL。
Agilent 6460B三重四级杆串联质谱仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)；离子源：电喷雾离子源(Electrospray ionization，ESI)；负离子检测模式；离子源参数：雾化器温度(gas temperature)300℃，雾化器流速(gas flow)5L/min，毛细管电压(capillary)3500V，喷雾器压力(nebulizer pressure)45psi，鞘气温度(Sheath gas tem)400，鞘气流速(Sheath gas flow)5L/min，喷嘴电压(Nozzle voltage)：500V。质谱扫描方式：多重反应监测模式(Multiple reaction monitoring，MRM)，负离子模式，具体MRM条件见表1。
(4)步骤(2)的双酚A标准溶液同样以步骤(3)中的检测条件进行检测，得到样品的总离子流色谱图，在Mass Hunter软件的分子特征识别模式下，进行峰校准、背景扣除、面积归一化和数据简化处理，将结果转化为包含化合物的保留间和质荷比信息的CEF格式文件。将CEF格式文件导入Mass Profiler Professional(MPP，Agilent Tech-nologies，USA)软件，统计软件进行滤噪和归一化。获得以双酚A浓度为横坐标、定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线函数关系为：y＝3.957483x+0.698077，相关系数R2＝0.9949，(请补充标准曲线图和函数关系)该标准曲线线性良好，可以用于测定待测物中双酚A的量。
(5)将待测液的检测结果代入步骤(4)的标准曲线，计算待测液中双酚A的量。
如图2所示为本实施例建立的方法得到的尿液样品A的样品提取色谱图，其中，母离子227.0000，子离子212.0000；133.0000。
该的方法检测限为1ppb(1ng/mL)，定量限为2ppb。经检测，尿液样品A双酚A含量分别为2.82ppb。
实施例2
本实施例提供一种尿液中双酚A的检测方法：
采用Agilent 1200快速分离液相色谱系统(美国Agilent公司)，配备高压二元泵，控温自动进样器；Agilent 6530 Q-TOF质谱仪(美国Agilent公司)，配有ESI离子源。具体包括以下步骤：
(1)取待测尿液样品B 5mL，置于离心管中，-4℃冷冻后，置冷冻干燥器内真空冷冻干燥24h，得到冻干粉。往冻干粉中加入1.5mL甲醇，浸泡25min后，于200W、75Hz超声提取15min，低温冷冻离心后，取上清液0.5mL，作为待测液。
(2)取双酚A标准品，以甲醇作为稀释剂，制成每1mL含10mg的溶液，作为标准样品溶液的储备液，稀释至0.01mg/mL(10ppm)作为双酚A标准溶液。
(3)飞行时间液质联用仪检测待测液和标准溶液：
Agilent Rx-SIL色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm美国Agilent公司)，柱温：35℃；流动相为A：水(75％)，B：乙腈(25％)，流速：0.4mL/min。进样量：2.0μL。
电喷雾电离-正离子模式(ESI+)，Vcap:+4000V，气体温度:350℃，雾化气:N2，35psi，干燥气:N2，10L·min-1。flagmentor:120V，skimmer:60V；MS/MS碰撞气：He，碰撞能：15V，35V。质量扫描范围m/z 100～1200，干燥气流量(N2)为9L/min，干燥气温度为250℃，雾化电压为0.2758MPa，毛细管电压为3.5kV，碎裂电压为150V，锥孔电压为65V。在样品测试之前，使用调谐液校正质量轴。标准品提取色谱图的提取离子精确质量数为227.1076。
如图3所示为本实施例的尿液样品B的样品提取色谱图，其中，母离子227.0000，子离子212.0000；133.0000，上述建立的方法检测限为1ppm(1mg/mL)，定量限为2ppm。
采用LC/MS-QTOF对尿液样品B进行双酚A定性检测后，再采用实施例1中的三重四级杆串联质谱仪对尿液样品B的双酚A进行定量检测，检测结果为尿液样品B的双酚A含量为3.87ppb。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，前处理：将待测的尿液样品冷冻干燥后得到冻干粉，在所述冻干粉中加入提取剂，经浸泡、提取、分离后得到待测液；
S2，样品检测：采用液相色谱质谱联用法对所述待测液进行检测；
S3，标准曲线绘制：取双酚A标准品溶于溶剂中，制成一系列浓度的双酚A标准液，按照与步骤S2相同的检测条件检测各浓度的所述双酚A标准液，并根据检测结果绘制标准曲线；
S4，定量计算：将所述待测液的检测结果与所述标准曲线对照，计算出所述待测的尿液样品中双酚A的含量。
2.根据权利要求1所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取剂为甲醇，加入甲醇后，浸泡25～35min，然后超声提取15～25min，低温冷冻离心后得到所述待测液。
3.根据权利要求2所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，超声提取的条件为200～240W、75～85Hz。
4.根据权利要求1所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S1中，冷冻干燥的步骤为：将所述尿液样品在-6～0℃条件下冷冻后，在真空条件下冷冻干燥24～36h，得到所述冻干粉。
5.根据权利要求1所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S2中，采用Agilent 6460B三重四级杆串联质谱仪检测所述待测液，检测的色谱条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18；
流速：0.1～0.5mL/min；柱温：35℃；
流动相：A相为水，B相为乙腈；
洗脱梯度：0～3min，从40％B相到60％B相。
6.根据权利要求5所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S2中，检测的质谱条件为：
采用电喷雾离子源，负离子检测模式；其中，离子源参数为：雾化器温度300℃，雾化器流速5L/min，毛细管电压3500V，喷雾器压力45psi，鞘气温度400℃，鞘气流速5L/min，喷嘴电压500V；质谱扫描方式为多重反应监测模式。
7.根据权利要求1所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述尿液样品与所述提取剂的体积比为1:0.2～0.4。
8.根据权利要求1所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述溶剂选自甲醇、丙酮、异丁醇中的一种。
9.根据权利要求1所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S2中，采用飞行时间液质联用仪检测所述待测液，检测的色谱条件为：
色谱柱：Agilent Rx-SIL色谱柱；
流速：0.1～0.5mL/min；柱温：35℃；
流动相：A相为75％水，B相为25％乙腈，等梯度洗脱。
10.根据权利要求9所述的尿液中双酚A的检测方法，其特征在于，步骤S2中，检测的质谱条件为：
Agilent 6530Q-TOF质谱仪；采用电喷雾电离-正离子模式，气体温度为350℃，雾化气为N2，35psi，干燥气为N2，10L/min，flagmentor:120V，skimmer:60V；MS/MS碰撞气：He，碰撞能：15V，35V；质量扫描范围m/z 100～1200，干燥气流量为9L/min，干燥气温度为250℃，雾化电压为0.2758MPa，毛细管电压为3.5kV，碎裂电压为150V，锥孔电压为65V。
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