CN109593661A - 一种产棘白菌素b的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。该基因工程菌的基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。该基因工程菌的构建过程无需对菌株进行单核处理，从而避免了通过同源重组发生单交换、遗传稳定性差以及易发生回复突变等问题；该基因工程菌不产生杂色曲霉素，且棘白菌素B产量较野生菌株可提高44％，并且经过多次传代，发酵性状仍维持稳定。

Description

一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)作为天然环脂肽类化合物，具有较强的抗真菌作用。在其基础上进行侧链修饰后获得的阿尼芬净在2006年被FDA批准用于真菌感染的治疗，具有低毒、高安全性、广谱的优势，市场前景良好。

棘白菌素B可以通过德拉克洛瓦曲霉(Aspergillus delacroxii)NRRL3860(＝Asp.nidulans var.echinulatus，此为以前文献中标识的菌种名)(Benz F,Knüsel F,Nüesch J,Treichler H,Voser W,Nyfeler R,Keller-Schierlein,W.Stoffwechselproduktevon Mikroorganismen 143.Mitteilung.Echinocandin B,ein neuartiges Polypeptid-Antibioticum aus Aspergillus nidulans var.echinulatus:Isolierung undBausteine.Helv Chim Acta.1974；57(8):2459–77；CIBA GEIGY AG.Antifungalantibiotic A32204 production by aerobic cultivation of Aspergillus nidulansvar.echinulatus A32204.Swiss patent 568386.1975；Samson RA,Visagie CM,Houbraken J,Hong SB,Hubka V,Klaassen CHW,Perrone G,Seifert KA,Susca A,TanneyJB,et al.Phylogeny,identification and nomenclature of the genusAspergillus.Stud Mycol.2014；78:141–73.)、厚冠突曲霉(Aspergilluspachycristatus)NRRL 11440(＝Asp.nidulans var.roseus NRRL 11440)、皱褶曲霉(Aspergillus rugulosus)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)NRRL 8112(＝Emericellanidulans DSM 946)等菌株发酵产生，但是这些Aspergillus sp.会产生大量杂色曲霉素。杂色曲霉素与黄曲霉素结构类似，具有相似的生物毒性，其主要污染玉米、花生、大米和小麦等谷物，尽管污染范围和程度不如黄曲霉毒素，然而在肝癌和食管癌高发地区居民所使用的食物中，杂色曲霉素污染较为严重。且由于杂色曲霉素具有极强的致癌毒性，在实际生产操作中对人体健康也极为不利。

Hodges(R.L.Hodges,D.W.Hodges,K.Goggans，et al.Genetic modification ofan echinocandin B-producing strain of Aspergillus nidulans to produce mutantsblocked in sterigmatocystin biosynthesis.Journal of Industrial Microbiology,13(1994)372-381)等人对多核高产菌株C747进行传统诱变及大批量筛选，均未获得去除杂色曲霉素的高产菌株，随后通过对菌株C747进行单核处理获得单核菌株C747-GR14，在菌株C747-GR14的基础上进行传统诱变获得降低杂色曲霉素含量的突变菌株OC-1和OC-2，但是突变菌株均未提高棘白菌素B的产量，且产量明显低于原始菌株C747，并且低于出发菌株C747-GR14，不适合工业生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的产棘白菌素B的方法中存在的发酵过程中产生大量强致癌物质——杂色曲霉素以及在现有改造过程中棘白菌素B产量不高的缺陷，提供一种去除了杂色曲霉素且还能提高产物菌素产量的产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。

本申请人为获得不产杂色曲霉素同时高产棘白菌素B的基因工程菌株，在理论的基础上进行了大量的尝试。当通过现有技术中常用的同源重组发生单交换，导致目的菌株的遗传稳定性差、极易发生回复突变；且所得菌株的产棘白菌素B的水平往往相比于未改造菌株有所下降，不利于工业化生产。或者如上所述的传统诱变也存在虽然去除了杂色曲霉素但是棘白菌素B产量大幅下降的问题。可见，现有的改造棘白菌素B产生菌以降低杂色曲霉素产量，同时保证棘白菌素B的生产水平的方法并不成熟。而本发明意外发现将产棘白菌素B的同时也产杂色曲霉素的菌株中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因进行失活或者敲除后，该菌株不但不产杂色曲霉素，而且其产棘白菌素B的能力与改造前的菌株相比，不仅没有下降，甚至具有大幅度的提高。

本发明解决上述技术问题的技术方案具体如下：

本发明提供一种产棘白菌素B的基因工程菌，其基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。

其中，所述失活指的是本领域常规意义上的基因失活，通常可以利用反义技术使目的基因或者有害基因不表达或者降低其表达活性。所述的基因修饰可为本领域常规，较佳地为基因中碱基的增添、替换或者缺失，只要能使杂色曲霉素不表达即可。理论上，只要是在上述基因外显子部分所述缺失的碱基个数至少为1bp即可实现；若含有内含子的情况下，所述缺失的碱基个数至少为100bp。

所述的基因工程菌所用菌种可为本领域常规的产棘白菌素B的菌种，例如德拉克洛瓦曲霉(Aspergillus delacroxii)、厚冠突曲霉(Aspergillus pachycristatus)、皱褶曲霉(Aspergillus rugulosus)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，所用的菌株较佳地为德拉克洛瓦曲霉(Aspergillus delacroxii)NRRL 3860、厚冠突曲霉(Aspergilluspachycristatus)NRRL 11440或者构巢曲霉(Aspergillus nidulans)NRRL 8112。

在本发明一较佳实施例中，所用菌株为德拉克洛瓦曲霉(Aspergillusdelacroxii)NRRL3860。较佳地，所述缺失的碱基的核苷酸序列具有如序列表中SEQ IDNO.1所示的序列。

本发明还提供一种生产棘白菌素B的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)培养上述的基因工程菌以产生含有棘白菌素B的发酵产物；

(2)从步骤(1)所得发酵产物中分离出棘白菌素B。

本发明还提供一种上述基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

(1)构建敲除质粒，所述敲除质粒依次含有以下元件：杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因的左、右同源臂序列；所述敲除质粒缺失杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因；

(2)将步骤(1)所得敲除质粒转化至农杆菌(Agrobacterium)中；

(3)将步骤(2)所得农杆菌的菌液与产棘白菌素B以及杂色曲霉素的菌株的孢子液混合；筛选所述左、右同源臂序列与所述菌株的基因组发生同源重组的菌株。

其中，步骤(1)中所述敲除质粒的骨架较佳地为质粒pDHt-sk。

步骤(1)中所述的敲除质粒在所述左、右同源臂序列之间较佳地含有筛选基因以便于筛选左、右同源臂序列与所述菌株的基因组发生同源重组的菌株，所述筛选基因优选为潮霉素基因、寡霉素基因、博来霉素基因、腐草霉素基因或者卡那霉素基因。

如本领域技术人员所知，步骤(1)中所述的左、右同源臂序列过长或者过短均不利于同源双交换，且过长的同源臂序列会大大增加实验成本，因此同源臂序列的长度较佳地为1500～5000bp。更佳地，所述左、右同源臂序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

步骤(2)中所述农杆菌较佳地为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1。

步骤(2)中所述转化为：将含有所述编码序列的载体导入宿主细胞，可采用本领域的多种己知技术，包括但不限于：磷酸钙沉淀、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、微注射、反转录法、噬菌体转导法以及碱金属离子法。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔以及脂质体包装等。

步骤(3)中所述同源重组(Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

本发明还提供一种敲除质粒，所述敲除质粒依次含有下列元件：杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因的左、右同源臂序列；所述敲除质粒缺失杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因。

如上所述，所述的敲除质粒在所述左、右同源臂序列之间含有筛选基因，所述筛选基因优选为潮霉素基因、寡霉素基因、博来霉素基因、腐草霉素基因或者卡那霉素基因。其中，所述的左、右同源臂序列的长度较佳地为1500～5000bp；更佳地，所述左、右同源臂序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。所述敲除质粒的骨架优选为质粒pDHt-sk。

本发明还提供一种包含上述敲除质粒的转化体。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明构建不产杂色曲霉素且高产棘白菌素B的菌株的方法无需对菌株进行单核处理，从而避免了通过同源重组发生单交换、遗传稳定性差以及易发生回复突变等问题；利用该构建方法获得的基因工程菌不产生杂色曲霉素，且棘白菌素B产量较野生菌株可提高44％，并且经过多次传代，发酵性状仍维持稳定。

附图说明

图1为线性化质粒、潮霉素抗性盒、左右同源臂片段及敲除质粒pDHt-stcA-hyg-stcB的电泳图；其中图1A为原始质粒PvuII酶切结果胶图；图1B为左右同源臂及潮霉素抗性盒片段胶图；图1C为构建质粒胶图；1为PvuII酶切后质粒片段(7036bp)；2为未酶切质粒；3为左同源臂(3017bp)；4为右同源臂(3078bp)；5为潮霉素抗性盒(hyg，1943bp)；6为敲除质粒(15090bp)。

图2为敲除质粒构建流程图。

图3为基因敲除示意图。

图4为工程菌株与出发菌株发酵提取液的HPLC检测结果。

图5为工程菌株与出发菌株的棘白菌素发酵产量比较。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1杂色曲霉合成相关的聚酮合酶基因以及左右同源臂的克隆

首先以棘白菌素B产生菌德拉克洛瓦曲霉(Aspergillus delacroxii)NRRL 3860(购自美国农业研究菌种保藏中心NRRL)的总基因组为模板克隆杂色曲霉素聚酮合酶基因及其附近基因，使用高保真聚合酶KOD-FX(TOYOBO公司)进行片段的克隆。上游引物S1：5’-cagaatatcaaacaccgcccc-3’(SEQ ID NO.4)，下游引物S2：5’-tccgtcaccgatcgtcctag-3’(SEQ ID NO.5)，进行PCR，PCR条件为：98℃30s，55℃30s，68℃8min，30个循环。所得片段进行测序，序列(详见SEQ ID NO.6)与网上序列(Genbank Accession Number：U34740.1)比对同源性为92％。

根据获得杂色曲霉素聚酮合酶基因及其附近基因的序列设计引物，扩增左右同源臂，以棘白菌素B产生菌Aspergillus delacroxii NRRL 3860的总基因组为模板，使用高保真聚合酶KOD-FX(TOYOBO公司)进行片段的克隆。左同源臂上游引物：5’-cgggcctcttcgctattacgccagctgccgtttctgcaccataaagt-3’(SEQ ID NO.7)，左同源臂下游引物：5’-tccctttagtgagggttaattgcgcatcagcaaatcatcacagat-3’(SEQ ID NO.8)；右同源臂上游引物：5’-cgcgttggccgattcattaatcagctgagctagacgcatctccatac-3’(SEQ IDNO.9)，右同源臂下游引物：5’-ggaaaccgaccagacatgga-3’(SEQ ID NO.10)。PCR条件为：98℃30s，55℃30s，68℃3min，30个循环。PCR产物电泳后，回收目的条带，并进行测序。PCR所得产物——左右同源臂的全长分别为3017bp和3078bp，其序列分别如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

以质粒pSilent-1(Genbank编号:LT827033.1)为模板，使用高保真聚合酶KOD-FX(TOYOBO公司)进行潮霉素抗性基因盒的克隆。上游引物H1：5’-gcgcaattaaccctcactaa-3’(SEQ ID NO.11)；下游引物H2：5’-ttgtgtccatgtctggtcggtttcccagggctggtgacggaattt-3’(SEQ ID NO.12)。PCR条件为：98℃30s，55℃30s，68℃2min，30个循环。PCR产物电泳后，回收目的条带。PCR产物全长为1943bp(图1)。

使用限制性内切酶PvuII(Thermo公司)对质粒pDHt-sk(购自BioVector NTCC典型培养物保藏中心；或者根据文献Chang H K,Park S Y,Lee Y H,etal.A dual selectionbased,targeted gene replacement tool for Magnaporthe grisea,and Fusariumoxysporum[J].Fungal Genetics&Biology Fg&B,2005,42(6):483的记载自行构建)进行酶切，电泳回收目的条带(7036bp，见图1)，获得线性化质粒骨架片段。

实施例2敲除质粒的构建及农杆菌介导的真菌转化

将实施例1所得到的左右同源臂、潮霉素抗性基因盒、线性化质粒骨架片段一共4个片段通过使用诺维赞公司的MultiS One Step Cloning Kit进行同源重组连接(方法具体见使用手册)，得到敲除质粒pDHt-sk-stcA-hyg-stcAB，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子在LB中培养，提取质粒进行酶切和PCR验证，最终构建成敲除质粒pDHt-sk-stcA-hyg-stcAB(15090bp，见图1)。上述质粒构建流程图见图2。

将质粒pDHt-sk-stcA-hyg-stcAB通过化学转化至根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1(购自北京华越洋生物公司)中，步骤：将0.5～1μg质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴30min。液氮迅速冻5min，然后37℃温浴5min，然后立即冰浴2min。加入1ml YEB液体，28℃，150rpm培养3h。室温下，8000rpm离心2min，弃上清，剩余约200μl YEB液体，将菌体重悬后均匀涂布于YEB平板(50μg/ml头孢西罗和50μg/ml卡那霉素)上，于28℃培养2～3天后，挑斑PCR及质粒提取鉴定。

将已转入目的质粒的农杆菌接种于4ml YEB液体培养基(50μg/ml头孢西罗和50μg/ml卡那霉素)中，28℃摇床中220rpm过夜培养。培养液12000rpm，离心2min去上清，收集菌体，并用IMAS液体重悬菌体至OD660＝0.1。28℃摇床220rpm培养20h。将棘白菌素B产生菌Aspergillus delacroxii NRRL 3860在PDA固体培养基上培养5～7天，收取孢子，悬浮于无菌水中，得真菌孢子悬液，孢子浓度大约为10⁶/ml。将上述农杆菌菌液100μl和孢子悬浮液100μl混匀，涂布于IMAS平板，25℃共孵育2天。用3ml无菌水洗涤共孵育2天后的培养物，将充分混匀的洗涤物200μl涂布于M-100平板(75μg/ml潮霉素(hyg)和300μg/ml噻孢霉素(cef)(其中噻孢霉素的作用是抑制农杆菌生长)上，适当风干后，放入28℃培养，挑取转化子进行PCR验证。

实施例3敲除杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶的基因工程菌的筛选

挑取转化子于含潮霉素(75μg/ml)的斜面培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1L，pH自然)进行二次培养，转化子的同源重组方式见示意图3。挑取转化子，提取总DNA，使用引物A：5’-gattccggagcgatatagc-3’(SEQ ID NO.13)和引物B：5’-gatcatcccagccatcaatg-3’(SEQ ID NO.14)从出发菌株的基因组扩增出条带2488bp(图3)，而从转化子基因组可扩增出2102bp的片段(图3)，从而验证得到的扩增出2102bp片段的转化子是发生了同源双交换的敲除基因工程菌株(图3)。

实施例4产棘白菌素B工程菌的发酵验证

挑取实施例3中能扩增出2102bp片段的工程菌于斜面培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g，pH自然)28℃培养7天，接种于种子培养液(葡萄糖1％、甘油1％、棉籽粕2.5％、碳酸钙0.1％、水95.4％，上述百分比均为重量百分比)，28℃培养3天后10％转接种子培养液(葡萄糖1％、甘油1％、棉籽粕2.5％、碳酸钙0.1％、水95.4％，上述百分比均为重量百分比)，28℃培养2天后10％转接发酵培养液(葡萄糖6％、马铃薯淀粉4％、鱼粉蛋白胨3％、玉米油1％、KCl 0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、FeSO₄·7H₂O 0.004％、CaCO₃ 0.2％、余量为水，pH6.5)，25℃培养7天后放瓶。取450μl发酵液加入2倍体积丙酮提取，0.22μm微孔滤膜过滤获上清滤液进行HPLC检测。HPLC色谱条件：色谱柱C18柱(4.6mm×200mm，5μm)；流动相甲醇：乙腈：水(7:2:2)；流速1ml/min；检测波长212nm；柱温30℃；进样量10μl。杂色曲霉素和棘白菌素B的出峰时间分别为3.434min和8.033min。HPLC分析结果见图4。可见，通过双同源重组的工程菌发酵液中未检出杂色曲霉素，同时棘白菌素B的含量较出发菌株提高了44％。

实施例5

挑取实施例3中能扩增出2102bp片段的工程菌株，经过连续5次传代，在与实施例4相同的斜面培养基上培养，经过与实施例4相同的培养方法及HPLC分析，均未检出杂色曲霉素，并且棘白菌素B的产量稳定，较出发菌株提高了44％以上(具体见图5，出发菌株ECB产量为1072mg/L，工程菌为1549mg/L)。说明本发明中构建的产棘白菌素B工程菌具有传代稳定性。

对比例1

根据实施例1中获得杂色曲霉素聚酮合酶基因及其附近基因的序列设计引物，所用引物的核苷酸序列具体如下：左同源臂上游引物：5’-cgggcctcttcgctattacgccagctgtaacttgtatccgctcttgg-3’(SEQ ID NO.15)以及左同源臂下游引物：5’-tccctttagtgagggttaattgcgcatcagcaaatcatcacagat-3’(SEQ ID NO.8)；右同源臂上游引物：5’-atcctgtcaaacactgatagtttaaagttactccagaaatatgttg-3’(SEQ ID NO.16)以及右同源臂下游引物：5’-ggaaaccgaccagacatgga-3’(SEQ ID NO.10)。并控制PCR条件为：98℃30s，55℃30s，68℃3min，30个循环。扩增得到长度为1000bp的左右同源臂。其他方法均同上述实施例，经PCR检测，未获得同源双交换转化子。

<110> 上海医药工业研究院；中国医药工业研究总院

<120> 一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用

<130> P1711185C

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2339

<212> DNA

<213> Aspergillus delacroxii

<400> 1

cgcgagcatg ttcaaggacc gacaccatct tgaccggctc ccggcaatgg cgggcgaggt 60

aaactgggtc cacggtgccc tcttcatcga tcaccttgac caaaagagga gacaatactg 120

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cggccggtga tgcccgaacg gcgagcatcg cgtgggtgcc tcgctgacag cgttcttgaa 420

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aggagcccag aaggtttccc aaagccattt caagactcac cagggccaat tggacaacaa 600

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tgggaaaccc atagctcctg gccagttggt caaatcgctc caggtcagac ctgaaagtcg 720

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caatgacgat tttaggcttt gttgcggggc ggttgactcc atcccctctt gctatagcgc 840

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ggtgccatcg gcgagcagtg gtcgtatatg agagttccgc aggattgatt tccggctgct 960

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aaacagtaac aatgtggcta gttcggggat ccgaggcagt tactggatca cgaataggag 1080

cgtcctcaac caggacagcg gtattccctc cagcggcact aaagttgttg ataagcacac 1140

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cctgcgtccc ggtaccgtgc atttcgatat agctaaggtc aagcgggctg atgccggctg 1500

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ccgacatggc cgagtggttg gttttgatgt cgaggatggt ggccagaata ggatcattgt 1620

ctgctaatgc atcctcaaga cgtttgatga atacggtacc aactccttcc gcacggcaat 1680

agccatctgc cgcatcgtca aaagccttgc agttgcctgt tcgagaaagg aaaaagcctt 1740

tatccaggcc agtatgtcca tcaggggtaa agatcatatt cgtgcctcca gccaccgcag 1800

tgtcgcagtc accacgccac agggagttac atgcgagatg aatagctgcc aggctggagg 1860

aacacgcagt gtcattacta taactgggcc ctgaaaattc aaagcagaag ttgatccggc 1920

cgggaatgaa ccctctattt ccgcccgtga tgaagtaggt gtcgatattt tgcgcggtat 1980

ttgtttccat ccagtcattg ctggtaacgc cgtggaacac tccgatgcgg ttacgttgag 2040

ttgacggtgt cgtgtccggc acgatgcctc ctcgctccat ggcttcgtaa gttgacatca 2100

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gtggatcgaa ttcaccggca aagtcaagcc agcaacccca gcgtgtggcc cctttgttgc 2220

gcgctttgcc gctcgggtca acatgggtct ttacatccca tcgacgtgtg gggacctctt 2280

tgcaaacgtc gaggccttta taaagcagat cccagaatga atcggtagaa ggggcctcg 2339

<210> 2

<211> 3017

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 左同源臂序列

<400> 2

atcagcaaat catcacagat cgcacgattg tcattgacgt cggacctaaa gcattgatgg 60

ctgggatgat caagacgaca cttgataagg ataccagttc ggctttgcca attctgggac 120

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tgcctactta cggatgggac ctgaaagatt acttcatccc atacaagggt gagtggtgtt 300

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cagctaccac acgcttcgcg aaaatcaagt ttgctaccta cttcgccgac ggcaagctgg 840

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agaagaaagt gcccgaatat aaggaacgaa taaagcaatt aggagagggt cttcgccaag 960

gccagttcat tcgatatacg accaagagcg gatacaagtt aatgagcagc atggccagtt 1020

tccatccaga ctacaagctc ctgaaccatc tgattctgaa cgaggctgac aatgaagcgg 1080

tctcgagaat ggatttctcc gcagccaaga gcgagggaac atttgctgcg cacccggctt 1140

atgttgatgc cattactcag gtcggtggct tcgctatgaa tgccaacgac aatacggata 1200

tccaacagga agtgtttgtg aaccatggat ggaattcgtt ccaggtttac cagccgctcg 1260

tcaagggcaa gacttatgaa gtctacgcgc ggatgacaga ggacgagaaa ggggatcttg 1320

ttcatggcga taccattgtg ctggacggtg atgttgttgt tgcattcttt aaagggctct 1380

cggtaagtct gtttcacgca tagtagaccc agctaatgtc gtgatagctc cgccgtgtcc 1440

cgcgaagggg ccttcgaatg gtcttgcagc aggcgtccga gaaagcagct cgcctacatg 1500

gggataaacc agccgccaaa acccaggcgt cacagcgtgc cgtccttaca ccaaactccc 1560

aatcggcagc agcacaacca catgcatcaa aggtggctta cccaacacca gcaaccctgc 1620

ctacggtagg aaaaccagtg gtggccgcga gagacctacc gcgagaagac gatgctaaag 1680

tcaaggccgt tttgagcgtc atatccgagg agagtggtgt tgcgttggaa gagctcacag 1740

atgataccaa ttttgccgac atcgggatag attctcttag ctctatggtc attggtagta 1800

ggctacgtga ggacttcggc cttgaacttg gagccgaatt ctccttgttt atcgactgcc 1860

cgactgtcaa atccctcaga acgtttctct ctggaccagc ggcaggtgta aaggaagaca 1920

aggatgagcg ggagcctggt cggccagaag agacggcggc gccaacgcaa ctagattcac 1980

gccgtgggga tgccgcgccc gacaaggcta gagatgccaa catcgagtcg cttgaccttg 2040

gtgacgagct gttcaacaac gccctcaaaa ttgtttcgga agagagcggg gtggcgctcg 2100

atgagttgag cgctgagact gtctttgctg acatcggcat cgattcgctg agctccatgg 2160

tgataacgag ccgcttccgt gaagaccttg ggatgtctct ggactcgtcg ttcaacctat 2220

tcgaggaagt gccaacagtc gcacgcctac aagagttttt cggcgccaca agcggaagca 2280

cgactggttc ctcgggctcg ggcagctcag aggacgagac cgatagcatt ccatcgactc 2340

cggaggaata cactacgtca gaaacccggg tctctgaatg ccgtccaacc acttcggtcg 2400

tcctccaggg tctcccccag atggccaaac agatcctctt catgctcccc gacggcggcg 2460

gctcagcatc ctcctacctc acaatcccgc gcctccatgc cgacgtagcc atcgttgggc 2520

taaactgccc ctatgcgcgg gaccccgaaa acatgaaatg cactcaccag tccatgatcc 2580

agagcttctg caacgaaatc aaacgtcgcc agccggaagg cccatatcat ctcggtggct 2640

ggtcctccgg tggcgccttc gcctacgtaa cagccgaagc cctcgtcaat gcaggcaacg 2700

aagtccactc gctcattata atcgatgcac ctgtcccgca agtgatggaa aaactcccca 2760

cctcgttcta cgagtactgc aacaacctcg gcctcttcgc caaccagccc agtggcacaa 2820

cagacggcac cgcgcagccc ccgccatacc taatcccgca tttccaggcc accgttgacg 2880

tgatgctcga ctaccgcgtt gcgccgctga aaagcaaccg catgcccaag gtaggtataa 2940

tctgggcgtc tgagacggtg atggacgagg accgcgcacc gaaaatgaaa gggatgcact 3000

ttatggtgca gaaacgg 3017

<210> 3

<211> 3078

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 右同源臂序列

<400> 3

agctagacgc atctccatac gaccgagatg aatacctagg cactgacgtg ccccgtatcc 60

gaacgggttg aatgccagct tggcctcgtc agtgattcgc gagtcggata gccagcgcgt 120

gtgatcgaac ctagccactc tctgtcagca ctgctcaccc gcatttttga atcggcttcc 180

acttacgtgt ctgcatcgtc ccagatactc ggattgcgct gaagactcca gttctgtgtg 240

accactatgg tgtcgcctgg aatgaaatac cccccaattg tcgcaccccc gggtggtgga 300

ctgcgaggca tgcatcctgg agccgcccca tacagccgta gactttcgtc gatgaccgca 360

ttcaggatgg gcaaccgctc gcaggcttcg tcggtcactt catctagaag agtggcgacc 420

tcggcttcga cttgcttttg gacttctggc cgactcagaa cacaccagag aaggaacgtc 480

aaagagattg ccgtcgggtc ggagcccgcc agtagtagag ccccggcgtc agtaattata 540

tcggtatcag tcaagcttcc ggcctctaaa gccttattga atagatttct cggtccggcc 600

tgggccgtct ctgcttctcg tgctcgggag actacgtcgc ctcccgcagc gaacattttc 660

tcctgagaat agaacacgtc ctggagtggc gggataaccc aagccaacgc acgcccgaga 720

tagtagccag ggggagcaaa gtgcttaagc agatgcgcaa ggtctcccat ccgtcgttct 780

agcataagaa cgaagggttc tttgacgcct ttggcgacaa tgcctgcgcc gccgccgaac 840

gtaagctggc aaactatttc gttggccatg agagtccacc accccatgac ctcggcctcg 900

cccttcaagg cgtcgcgttt gatcctctcc acggccaact tgataatatc ccggaccttt 960

ggctcccact cgtttcgtaa gctttgcagc gtgaaccccc gggcgtaaag tttacgacgg 1020

gccgagtgga gtttggcatc ccgaaagttg aagatattgt ccaccggccc tggcgaaaga 1080

agcttgtaaa agggagcttt tgtgaagccg gatcccatgc ggtggatctc gcgtcctgcc 1140

acaggatctg ccacgtcgat ttctcgaggc ccgatacgga cgatgggccc atacttctgg 1200

tgcaagctat ggacgtagtg gattcgattg ttggcgaaga cggaccacga caagcgaagc 1260

cctgtcaagg acgcatacca ggggcccgga atatgtttca acggactgaa gtaagctatc 1320

cgaatggcct gggatacatc agcgccagtt tgcctccggg ccgaacgaag taccttgatt 1380

atgctaagca ctaggaagaa gttgccgacg taactgagca tggagagcca ttttatgctc 1440

ataagggccg catagaagtc tctactgtct gaagccattg gagtagcaag cagacgggga 1500

caatttgcat catgagttcc ccttctgttg gaacgcctga tatagttcgc ttgtgtggct 1560

ggccccagtg tatcgggcac tgcaaccggt catctatcct tgactcggcg atgagagact 1620

ttcagtaccc ggcagacgct cgggtctcgc tgaagagtac cctgttctct tcctcagtaa 1680

ccccccgtac agtcagcgac ggatcacggt cagcgaggcc atgaccgact cggcagcagc 1740

tccttggatg acaccttgca catgtaagat aaaataggca atctgaatct actgctggct 1800

tcagaatcat gccactgcag accatactct gttccaataa acggcttcag gatggccagt 1860

cacactgagc cgacccggct cttcctcttt ggggaccaga cctatgactt tgttgcagat 1920

ttgcgagatc ttctcaatat tcgcaacaat ccaattatag tggccttcct tgaacaatcg 1980

cactatgtca tacgtgccca gatgatccgg gagctgtcac cgaaagagca caagcaagct 2040

cggactgcgt ccttagcaga gttactccag aaatatgttg atcgaaagct gccgtctgct 2100

ttccagactg ccctctcctg cattactcaa atcgggttat ttatgcgcca atttgacgac 2160

ccgcgcgttc cttacccaca cgctaacgac agctatgtct tgggagtctg cacaggatct 2220

ctcgcggcag ccgccatcag ttgcagtact tctctatctg agcttttacc catcgccgtc 2280

cagactgtcc tcgtcgcctt ccgccttggc ctctgggcgc agaaagtgcg cgacaacctt 2340

gaaatatccg aatctgatca aacacagcct tggtcggccg tgtgccatgt tccaccggag 2400

gaggtggccg ttgccattga caggttcagc cacgaacagg tccgtagccc tgcatattaa 2460

actgaaaggt ctcactaact cactttctgc tgaacaggcg ctgtcgagca cccgcagacc 2520

ttggatcacg gcaacatcag ccaagactac tacagttagc gcaagccctg atatattgag 2580

ccaattggct agccaagcac ccttcacgaa tagcaaactg tggagggaga ttccaatcta 2640

tgttccggca cataacaact atctattctc ctcaagggac gtcgacgaca tcctggcgac 2700

cactaatgag aacccctggt ccaccttcgg cgcccaaata ccgttcctgt cctccgtcac 2760

cggaaaattg gcttgggtcc gaaattaccg tgacctcctg catctggccc tctcgcaatg 2820

ccttatcgaa cctatacgat gggatgtcgt cgagacagaa gtgccgcgac ttatttacga 2880

tcgggatggt ctcgatacgc tgacggttgt acccttcaca accgttctca ctaaaagttt 2940

gtccaatgcc ctcgctgccg aaggtataaa gccagcggaa cctcggagtt ctttaaataa 3000

gattccggag cgatatagcc accgtccagg gtctgacaga ggcaaactgg caattgtgtc 3060

catgtctggt cggtttcc 3078

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物S1

<400> 4

cagaatatca aacaccgccc c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物S2

<400> 5

tccgtcaccg atcgtcctag 20

<210> 6

<211> 8551

<212> DNA

<213> Aspergillus delacroxii

<400> 6

cagaatatca aacaccgccc ccggacaaac cacatcccaa ccatccggcc caaaatccct 60

ccgtttctgc accataaagt gcatcccttt cattttcggt gcgcggtcct cgtccatcac 120

cgtctcagac gcccagatta tacctacctt gggcatgcgg ttgcttttca gcggcgcaac 180

gcggtagtcg agcatcacgt caacggtggc ctggaaatgc gggattaggt atggcggggg 240

ctgcgcggtg ccgtctgttg tgccaccggg ctggttggcg aagaggccga ggttgttgca 300

gtactcgtag aacgaggtgg ggagtttttc catcacttgc gggacaggtg catcgattat 360

aatgagcgag tggacttcgt tgcctgcatt gacgagggct tcggctgtta cgtaggcgaa 420

ggcgccaccg gaggaccagc caccgagatg atatgggcct tccggctggc gacgtttgat 480

ttcgttgcag aagctctgga tcatggactg gtgagtgcat ttcatgtttt cggggtcccg 540

cgcatagggg cagtttagcc caacgatggc tacgtcggca tggaggcgcg ggattgtgag 600

gtaggaggat gctgagccgc cgccgtcggg gagcatgaag aggatctgtt tggccatctg 660

ggggagaccc tggaggacga ccgaagtggt tggacggcat tcagagaccc gggtttctga 720

cgtagtgtat tcctccggag tcgatggaat gctatcggtc tcgtcctctg agctgcccga 780

gcccgaggaa ccagtcgtgc ttccgcttgt ggcgccgaaa aactcttgta ggcgtgcgac 840

tgttggcact tcctcgaata ggttgaacga cgagtccaga gacatcccaa ggtcttcacg 900

gaagcggctc gttatcacca tggagctcag cgaatcgatg ccgatgtcag caaagacagt 960

ctcagcgctc aactcatcga gcgccacccc gctctcttcc gaaacaattt tgagggcgtt 1020

gttgaacagc tcgtcaccaa ggtcaagcga ctcgatgttg gcatctctag ccttgtcggg 1080

cgcggcatcc ccacggcgtg aatctagttg cgttggcgcc gccgtctctt ctggccgacc 1140

aggctcccgc tcatccttgt cttcctttac acctgccgct ggtccagaga gaaacgttct 1200

gagggatttg acagtcgggc agtcgataaa caaggagaat tcggctccaa gttcaaggcc 1260

gaagtcctca cgtagcctac taccaatgac catagagcta agagaatcta tcccgatgtc 1320

ggcaaaattg gtatcatctg tgagctcttc caacgcaaca ccactctcct cggatatgac 1380

gctcaaaacg gccttgactt tagcatcgtc ttctcgcggt aggtctctcg cagccaccac 1440

tggttttcct accgtaggca gggttgctgg tgttgggtaa gccacctttg atgcatgtgg 1500

ttgtgctgct gccgattggg agtttggtgt aaggacggca cgctgtgacg cctgggtttt 1560

ggcggctggt ttatccccat gtaggcgagc tgctttctcg gacgcctgct gcaagaccat 1620

tcgaaggccc cttcgcggga cacggcggag ctatcacgac attagctggg tctactatgc 1680

gtgaaacaga cttaccgaga gccctttaaa gaatgcaaca acaacatcac cgtccagcac 1740

aatggtatcg ccatgaacaa gatccccttt ctcgtcctct gtcatccgcg cgtagacttc 1800

ataagtcttg cccttgacga gcggctggta aacctggaac gaattccatc catggttcac 1860

aaacacttcc tgttggatat ccgtattgtc gttggcattc atagcgaagc caccgacctg 1920

agtaatggca tcaacataag ccgggtgcgc agcaaatgtt ccctcgctct tggctgcgga 1980

gaaatccatt ctcgagaccg cttcattgtc agcctcgttc agaatcagat ggttcaggag 2040

cttgtagtct ggatggaaac tggccatgct gctcattaac ttgtatccgc tcttggtcgt 2100

atatcgaatg aactggcctt ggcgaagacc ctctcctaat tgctttattc gttccttata 2160

ttcgggcact ttcttctgca atgacttgag ctgcgcctcg cttgtgaagc gaaccgtgca 2220

agtcgcgtgc tcagtatcca gcttgccgtc ggcgaagtag gtagcaaact tgattttcgc 2280

gaagcgtgtg gtagctgcag ccttgggcgg ccatgtcatg gtcagcgttg tccgaagcag 2340

ctgtggcgat ttgccatgag gaatgagggc cttgtcgata accatgtcgg caacgtcgac 2400

aacaccgtcc atggcgccgg ggtgactcgc tcgaaggcgg ttcatggagt acctcccaac 2460

atgaagggcg atatctgcgt ataccgacgg ggtgcacagc ggtattccat ccaccaggtg 2520

accttgagca atctggttca cgtctgggcg agagatatcg gtttctacta ccagagtagc 2580

cccaaatggc tcagtcttct cttccaccac gcggtgcact gttgtagtgg cggctatctc 2640

cggatatgct tccttgcttt catcttgttt cgaaggcctc ttagctgcga cttggccatc 2700

tgaaggaagt tggtagtcgc tcgtcgcagt ctccttcccc ggagtcgcgc agctgcaatg 2760

aatttcgtga cggtgcaaac accactcacc cttgtatggg atgaagtaat ctttcaggtc 2820

ccatccgtaa gtaggcagtt cgacgacttt ctttgcagac ccaaacggct cgtgatacgc 2880

aacccagtta atatccaacc ctcgcgaata cagcgtgccc aagacattag tcaggctttt 2940

ccagacgtcc agactgggtc ccagaattgg caaagccgaa ctggtatcct tatcaagtgt 3000

cgtcttgatc atcccagcca tcaatgcttt aggtccgacg tcaatgacaa tcgtgcgatc 3060

tgtgatgatt tgctgatcgc gagcatgttc aaggaccgac accatcttga ccggctcccg 3120

gcaatggcgg gcgaggtaaa ctgggtccac ggtgccctct tcatcgatca ccttgaccaa 3180

aagaggagac aatactggta tctggggctt gtggaaggtc acgccacggg ccacgttttt 3240

aaactcctct agaataggtt ggacctgagc agaatggaag gcaaatggca gcttcagtag 3300

agtacctttg atgcctttcg cggacaggga atgctgaagg atcataacct ccttaagtgg 3360

tccacttaaa acagtgtcgt tagggccatt atggcaggct acttcacaat tggagtccgc 3420

cagttcctca gacagcgcgg ccggtgatgc ccgaacggcg agcatcgcgt gggtgcctcg 3480

ctgacagcgt tcttgaagca gcttcgctct cttcccgacc aagtacaatg tatcggcagc 3540

tgaaagaacg ccgccgatgt atagcgcggc gtattcgcca agactatggc caatgaccgc 3600

acttggtttc aggccgaagg agcccagaag gtttcccaaa gccatttcaa gactcaccag 3660

ggccaattgg acaacaactg ggaggagatc ttccatgctg tcgcccaccg gcttagaagt 3720

gtagacctca aggaagctgg gaaacccata gctcctggcc agttggtcaa atcgctccag 3780

gtcagacctg aaagtcggat aactgttgta tagctgccag cccatccctg tgtactggga 3840

gccttgccca ctacatgcaa tgacgatttt aggctttgtt gcggggcggt tgactccatc 3900

ccctcttgct atagcgcttt ctacattgcg caagatttcc atagtgttag ctcctgctat 3960

acccacccgg tgaagatggt gccatcggcg agcagtggtc gtatatgaga gttccgcagg 4020

attgatttcc ggctgcttca tcaaatgacc ccgcaatttc tccaagttca acttgagaga 4080

cttcccaacg tggccagaaa cagtaacaat gtggctagtt cggggatccg aggcagttac 4140

tggatcacga ataggagcgt cctcaaccag gacagcggta ttccctccag cggcactaaa 4200

gttgttgata agcacacgtc gaggggtatc cgtccgaggc cacggttttg gctcaaaagc 4260

tatatgcaca ttgcgagcgg gaaggtctgg atagttgcgg ttgattcggc tcccgggttt 4320

aatgccgcag tgaggaggaa tggtgtcatg tttcatcatc aaaaggacct tgatgagact 4380

ggtgacaccg gagactcctt ctccatgacc aatgttcgct ttcgccgatc ccacgtatag 4440

cggcttgtct cggggtcgga atgtctcgtc cggagcaaag agactcagaa ccgactccat 4500

ctcaacggcg tcacccacct gcgtcccggt accgtgcatt tcgatatagc taaggtcaag 4560

cgggctgatg ccggctgtgc tcaatacagc cgacatgttg tcaacctgcg caggcttgaa 4620

cggccgtgtc atcgagtccg acatggccga gtggttggtt ttgatgtcga ggatggtggc 4680

cagaatagga tcattgtctg ctaatgcatc ctcaagacgt ttgatgaata cggtaccaac 4740

tccttccgca cggcaatagc catctgccgc atcgtcaaaa gccttgcagt tgcctgttcg 4800

agaaaggaaa aagcctttat ccaggccagt atgtccatca ggggtaaaga tcatattcgt 4860

gcctccagcc accgcagtgt cgcagtcacc acgccacagg gagttacatg cgagatgaat 4920

agctgccagg ctggaggaac acgcagtgtc attactataa ctgggccctg aaaattcaaa 4980

gcagaagttg atccggccgg gaatgaaccc tctatttccg cccgtgatga agtaggtgtc 5040

gatattttgc gcggtatttg tttccatcca gtcattgctg gtaacgccgt ggaacactcc 5100

gatgcggtta cgttgagttg acggtgtcgt gtccggcacg atgcctcctc gctccatggc 5160

ttcgtaagtt gacatcaatg ccatcctctg ggccggatcc atctgcggcg cctctttggg 5220

cgagatgcta aagaagcgtg gatcgaattc accggcaaag tcaagccagc aaccccagcg 5280

tgtggcccct ttgttgcgcg ctttgccgct cgggtcaaca tgggtcttta catcccatcg 5340

acgtgtgggg acctctttgc aaacgtcgag gcctttataa agcagatccc agaatgaatc 5400

ggtagaaggg gcctcgggaa accgaccaga catggacaca attgccagtt tgcctctgtc 5460

agaccctgga cggtggctat atcgctccgg aatcttattt aaagaactcc gaggttccgc 5520

tggctttata ccttcggcag cgagggcatt ggacaaactt ttagtgagaa cggttgtgaa 5580

gggtacaacc gtcagcgtat cgagaccatc ccgatcgtaa ataagtcgcg gcacttctgt 5640

ctcgacgaca tcccatcgta taggttcgat aaggcattgc gagagggcca gatgcaggag 5700

gtcacggtaa tttcggaccc aagccaattt tccggtgacg gaggacagga acggtatttg 5760

ggcgccgaag gtggaccagg ggttctcatt agtggtcgcc aggatgtcgt cgacgtccct 5820

tgaggagaat agatagttgt tatgtgccgg aacatagatt ggaatctccc tccacagttt 5880

gctattcgtg aagggtgctt ggctagccaa ttggctcaat atatcagggc ttgcgctaac 5940

tgtagtagtc ttggctgatg ttgccgtgat ccaaggtctg cgggtgctcg acagcgcctg 6000

ttcagcagaa agtgagttag tgagaccttt cagtttaata tgcagggcta cggacctgtt 6060

cgtggctgaa cctgtcaatg gcaacggcca cctcctccgg tggaacatgg cacacggccg 6120

accaaggctg tgtttgatca gattcggata tttcaaggtt gtcgcgcact ttctgcgccc 6180

agaggccaag gcggaaggcg acgaggacag tctggacggc gatgggtaaa agctcagata 6240

gagaagtact gcaactgatg gcggctgccg cgagagatcc tgtgcagact cccaagacat 6300

agctgtcgtt agcgtgtggg taaggaacgc gcggggtcgt caaattggcg cataaataac 6360

ccgatttgag taatgcagga gagggcagtc tggaaagcag acggcagctt tcgatcaaca 6420

tatttctgga gtaactctgc taaggacgca gtccgagctt gcttgtgctc tttcggtgac 6480

agctcccgga tcatctgggc acgtatgaca tagtgcgatt gttcaaggaa ggccactata 6540

attggattgt tgcgaatatt gagaagatct cgcaaatctg caacaaagtc ataggtctgg 6600

tccccaaaga ggaagagccg ggtcggctca gtgtgactgg ccatcctgaa gccgtttatt 6660

ggaacagagt atggtctgca gtggcatgat tctgaagcca gcagtagatt cagattgcct 6720

attttatctt acatgtgcaa ggtgtcatcc aaggagctgc tgccgagtcg gtcatggcct 6780

cgctgaccgt gatccgtcgc tgactgtacg gggggttact gaggaagaga acagggtact 6840

cttcagcgag acccgagcgt ctgccgggta ctgaaagtct ctcatcgccg agtcaaggat 6900

agatgaccgg ttgcagtgcc cgatacactg gggccagcca cacaagcgaa ctatatcagg 6960

cgttccaaca gaaggggaac tcatgatgca aattgtcccc gtctgcttgc tactccaatg 7020

gcttcagaca gtagagactt ctatgcggcc cttatgagca taaaatggct ctccatgctc 7080

agttacgtcg gcaacttctt cctagtgctt agcataatca aggtacttcg ttcggcccgg 7140

aggcaaactg gcgctgatgt atcccaggcc attcggatag cttacttcag tccgttgaaa 7200

catattccgg gcccctggta tgcgtccttg acagggcttc gcttgtcgtg gtccgtcttc 7260

gccaacaatc gaatccacta cgtccatagc ttgcaccaga agtatgggcc catcgtccgt 7320

atcgggcctc gagaaatcga cgtggcagat cctgtggcag gacgcgagat ccaccgcatg 7380

ggatccggct tcacaaaagc tcccttttac aagcttcttt cgccagggcc ggtggacaat 7440

atcttcaact ttcgggatgc caaactccac tcggcccgtc gtaaacttta cgcccggggg 7500

ttcacgctgc aaagcttacg aaacgagtgg gagccaaagg tccgggatat tatcaagttg 7560

gccgtggaga ggatcaaacg cgacgccttg aagggcgagg ccgaggtcat ggggtggtgg 7620

actctcatgg ccaacgaaat agtttgccag cttacgttcg gcggcggcgc aggcattgtc 7680

gccaaaggcg tcaaagaacc cttcgttctt atgctagaac gacggatggg agaccttgcg 7740

catctgctta agcactttgc tccccctggc tactatctcg ggcgtgcgtt ggcttgggtt 7800

atcccgccac tccaggacgt gttctattct caggagaaaa tgttcgctgc gggaggcgac 7860

gtagtctccc gagcacgaga agcagagacg gcccaggccg gaccgagaaa tctattcaat 7920

aaggctttag aggccggaag cttgactgat accgatataa ttactgacgc cggggctcta 7980

ctactggcgg gctccgaccc gacggcaatc tctttgacgt tccttctctg gtgtgttctg 8040

agtcggccag aagtccaaaa gcaagtcgaa gccgaggtcg ccactcttct agatgaagtg 8100

accgacgaag cctgcgagcg gttgcccatc ctgaatgcgg tcatcgacga aagtctacgg 8160

ctgtatgggg cggctccagg atgcatgcct cgcagtccac cacccggggg tgcgacaatt 8220

ggggggtatt tcattccagg cgacaccata gtggtcacac agaactggag tcttcagcgc 8280

aatccgagta tctgggacga tgcagacacg taagtggaag ccgattcaaa aatgcgggtg 8340

agcagtgctg acagagagtg gctaggttcg atcacacgcg ctggctatcc gactcgcgaa 8400

tcactgacga ggccaagctg gcattcaacc cgttcggata cggggcacgt cagtgcctag 8460

gtattcatct cggtcgtatg gagatgcgtc tagctgcggc catgtttttt cgcgaatgtg 8520

ttggggcgcg actaggacga tcggtgacgg a 8551

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 左同源臂上游引物

<400> 7

cgggcctctt cgctattacg ccagctgccg tttctgcacc ataaagt 47

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 左同源臂下游引物

<400> 8

tccctttagt gagggttaat tgcgcatcag caaatcatca cagat 45

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 右同源臂上游引物

<400> 9

cgcgttggcc gattcattaa tcagctgagc tagacgcatc tccatac 47

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 右同源臂下游引物

<400> 10

ggaaaccgac cagacatgga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物H1

<400> 11

gcgcaattaa ccctcactaa 20

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物H1

<400> 12

ttgtgtccat gtctggtcgg tttcccaggg ctggtgacgg aattt 45

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物A

<400> 13

gattccggag cgatatagc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物B

<400> 14

gatcatccca gccatcaatg 20

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 左同源臂上游引物（对比例）

<400> 15

cgggcctctt cgctattacg ccagctgtaa cttgtatccg ctcttgg 47

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 右同源臂上游引物（对比例）

<400> 16

atcctgtcaa acactgatag tttaaagtta ctccagaaat atgttg 46

Claims (10)

1.一种产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于，其基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因修饰为基因中碱基的增添、替换或者缺失，所述缺失的碱基个数至少为1bp；较佳地，所述缺失的碱基个数至少为100bp。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为德拉克洛瓦曲霉(Aspergillus delacroxii)NRRL 3860；较佳地，所述缺失的碱基的核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的序列。

4.一种生产棘白菌素B的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)培养如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌以产生含有棘白菌素B的发酵产物；

(2)从步骤(1)所得发酵产物中分离出棘白菌素B。

5.一种如权利要求1～3任一项所述产棘白菌素B的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：

(1)构建敲除质粒，所述敲除质粒依次含有以下元件：杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因的左、右同源臂序列；所述敲除质粒缺失杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因；

(2)将步骤(1)所得敲除质粒转化至农杆菌(Agrobacterium)中；

(3)将步骤(2)所得农杆菌的菌液与产棘白菌素B以及杂色曲霉素的菌株的孢子液混合；筛选所述左、右同源臂序列与所述菌株的基因组发生同源重组的菌株。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述敲除质粒的骨架为pDHt-sk；

步骤(1)中所述的敲除质粒在所述左、右同源臂序列之间含有筛选基因，所述筛选基因优选为潮霉素基因、寡霉素基因、博来霉素基因、腐草霉素基因或者卡那霉素基因；

步骤(1)中所述左、右同源臂序列的长度为1500～5000bp；较佳地，所述左、右同源臂序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

和/或，步骤(2)中所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1。

7.一种敲除质粒，其特征在于，所述敲除质粒依次含有下列元件：杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因的左、右同源臂序列；所述敲除质粒缺失杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因。

8.如权利要求7所述的敲除质粒，其特征在于，在所述敲除质粒的所述左、右同源臂序列之间含有筛选基因，所述筛选基因优选为潮霉素基因、寡霉素基因、博来霉素基因、腐草霉素基因或者卡那霉素基因；

和/或，所述敲除质粒的骨架为pDHt-sk。

9.如权利要求7所述的敲除质粒，其特征在于，所述左、右同源臂序列的长度为1500～5000bp；较佳地，所述左、右同源臂序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。

10.一种包含如权利要求7～9任一项所述的敲除质粒的转化体。