CN109593120A - 一种橙色类胡萝卜素蛋白的制备方法 - Google Patents

一种橙色类胡萝卜素蛋白的制备方法 Download PDF

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CN109593120A CN201910034039.8A CN201910034039A CN109593120A CN 109593120 A CN109593120 A CN 109593120A CN 201910034039 A CN201910034039 A CN 201910034039A CN 109593120 A CN109593120 A CN 109593120A
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ala
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周明
夏坤
付卫雷
吴明
陈彦蓉
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Huazhong Agricultural University
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Guangzhou Tianbao Songyuan Biology Science & Technology Development Co Ltd
Huazhong Agricultural University
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Abstract

本发明公开了一种脱辅基蛋白，由野生型脱辅基蛋白N端序列修饰得到。本发明中还公开了一种可用于表达合成类胡萝卜素蛋白的微生物，该微生物含有两种质粒，质粒A携带基因a，基因a用于合成β‑胡萝卜素，质粒B携带有基因b和基因c，基因b用于将β‑胡萝卜素转化成类胡萝卜素，基因c用于合成脱辅基蛋白。使用该微生物可以以单一诱导的方法表达出类胡萝卜素蛋白，流程简捷，耗时短，生产周期仅18h左右；色素蛋白产量大，相比于现有技术，色素蛋白产量提高10倍；纯度高，纯度比值2.4，可用于单晶体制备。

Description

一种橙色类胡萝卜素蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种橙色类胡萝卜素蛋白的制备方法。
背景技术
藻类和植物可以利用光来进行光合作用。其中蓝细菌和红藻为了能在水中生长，增加捕光效率，其光合作用机体进化出了一种独特的超分子捕光天线复合体，即藻胆体(PBS)。但是在强烈的阳光下暴晒，光合作用系统特别是反应中心又会产生致命的光氧化作用。因此蓝细菌和红藻又进化出一种可调节的光保护作用系统，可避免过量的光对藻胆体造成伤害。这种保护机制称为非光化学淬灭(NPQ)，主要是依靠藻胆体(PBS)和橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)之间的相互作用，消耗多余的激发能量。
橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)是一种光敏蛋白和光强传感器。在高亮度的蓝光照射下，暗稳态的橙色类胡萝卜素蛋白(OCPO)，会转换成一种红色的激发态(OCPR)，同时触发非光化学淬灭(NPQ)作用，淬灭来自藻胆体的荧光。橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)有两个结构域，N端的结构域(NTD)由α-螺旋组成，C端的结构域(CTD)由α-螺旋/β-折叠组成，色素基团与脱辅基蛋白非共价结合。晶体结构表明，橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)的光敏化过程，是从暗稳态OCPO转换成激发态OCPR，最终又回到暗稳态OCPO；此过程同时伴随着色素基团位移12埃米。有两种途径可导致激发态OCPR：一种是使用高浓度的盐进行化学激发，另一种是通过低温进行冷冻激发。暗稳态转换成激发态也可以自然发生，前提是蛋白的聚集形态发生变化，由二聚体变成单体。
橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)最初是从极大螺旋藻Spirulina maxima中分离得到，逐渐地很多相似的蛋白也在其他一些蓝细菌中发现。经测定，分离后的橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)的吸收光谱特征峰在495nm和467nm。集胞藻Synechocystis PCC6803的天然OCP蛋白是由基因slr1963编码得到，其色素基团为3'-羟基海胆酮，与节螺藻Arthrospiramaxima一样。
由于在体内表达水平较低，从蓝细菌中分离和纯化这些类胡萝卜素蛋白(OCP)需要很长的时间，流程冗长，最终也只有很低的产量。
近些年，出现了基因工程制备生产完整的类胡萝卜素蛋白(OCP)的方法，主要是在大肠杆菌细胞中完成，中间过程包括色素基团的产生和脱辅基蛋白表达，然后组合生成完整的色素蛋白。
一种是三质粒组合表达方案：第一个质粒，pAC-BETA，携带有连续的基因簇(crtB，crtE，crtI，crtY)，通过crtE启动子控制进行组成型表达，用于合成β-胡萝卜素；第二个质粒携带有基因crtO或者crtW，分别用于将胡萝卜素转化成海胆酮(ECN)或者角黄素(CAN)，表达时受阿拉伯糖诱导型启动子araBAD控制；第三个质粒携带有脱辅基蛋白基因ocp及其衍生型，表达时受IPTG诱导的T7启动子控制。三质粒方案需要3种抗性质粒和2种诱导剂(阿拉伯糖和IPTG)。因此制备时基因工程菌筛选难度大，表达制备耗时多。
另一种是双质粒组合表达方案：第一个质粒pACCAR25ΔcrtXZcrtO，携带有基团簇，由来自噬夏孢欧文菌的基因crtB,crtE,crtI,crtY和crtO组成，可以实现海胆酮(ECN)的生物合成。另一个质粒携带有脱辅基蛋白基因ocp，用于合成脱辅基蛋白。双质粒合成方案虽然只需要2种抗性质粒和1种诱导剂(IPTG)，菌株筛选难度相对较低，但是其中的组成型表达质粒pACCAR25ΔcrtXZcrtO拷贝数极低，色素可能产生量不足，导致色素蛋白与脱辅基蛋白比例低下，最终影响到纯化制备效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类胡萝卜素蛋白的制备方法，具体为一种橙色类胡萝卜素蛋白的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种脱辅基蛋白，所述脱辅基蛋白由野生型脱辅基蛋白(SEQ ID No.1)N端序列修饰得到，野生型脱辅基蛋白N端序列修饰方法选自以下任一种：
d)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A；
e)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS；
f)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSSSQDC。
进一步地，野生型脱辅基蛋白N端序列修饰方法选自以下任一种：
d)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A-亲和标记序列；
e)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列；
f)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列-SQDC。
进一步地，亲和标记序列为His6-tag。
进一步地，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.4中的任一种所示。
编码权利要求上述的脱辅基蛋白的序列。
一种微生物，含有两种质粒，质粒A携带基因a，基因a用于合成β-胡萝卜素，质粒B携带有基因b和基因c，基因b用于将β-胡萝卜素转化成类胡萝卜素，基因c用于合成野生型脱辅基蛋白或上述的脱辅基蛋白；优选地，质粒B为高拷贝数的质粒；更优选的，质粒B为高拷贝数的Duet质粒。
进一步地，基因a为基因crtB、crtE、crtI、crtY组成的基因簇。
进一步地，类胡萝卜素为角黄素或海胆酮。
进一步地，基因b为基因crtW或crtO。
一种类胡萝卜素的制备方法，使用上述的微生物表达合成类胡萝卜素。
一种类胡萝卜素蛋白，上述的类胡萝卜素的制备方法制备得到。
一种橙色类胡萝卜素蛋白，其特征在于：由色素基团和上述的脱辅基蛋白组合生成。。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种由野生型脱辅基蛋白N端序列修饰得到的脱辅基蛋白以及一种可用于表达合成类胡萝卜素蛋白的微生物。使用该微生物可以以单一诱导的方法表达出类胡萝卜素蛋白，流程简捷，耗时短，生产周期仅18h左右；色素蛋白产量大，相比于现有技术，色素蛋白产量提高10倍；纯度高，纯度比值2.4，可用于单晶体制备。
附图说明
图1为类胡萝卜素蛋白生物合成途径；
图2为野生型OCP及其突变序列同源对比图；
图3为经Ni2+-亲和层析纯化的OCP的SDS-PAGE结果；
图4为经过尺寸排阻色谱纯化的OCP的产量；
图5为经过尺寸排阻色谱纯化的OCP的SDS-PAGE结果；
图6为OCP光转化前后的吸收光谱图；
图7为经过尺寸排阻色谱纯化的OCP的吸收光谱图；
图8为OCP对藻胆体荧光淬灭效果。
具体实施方式
下面将结合具体实验进一步阐述本发明，应理解，以下实验仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
本发明中类胡萝卜素蛋白生物合成途径如图1所示，本发明中采用双质粒组合表达，携带有基因crtE，crtB，crtI，crtY的pAC-BETA用于表达β-胡萝卜素，携带基因crtW和基因ocp的pETDuet-ocp-crtW用于合成β-胡萝卜素酮化酶和脱辅基蛋白，β-胡萝卜素酮化酶将β-胡萝卜素转化成角黄素(CAN)，CAN与脱辅基蛋白组合形成类胡萝卜素蛋白。
所有实验操作，均参照《分子克隆》等标准实验手册进行。
1)克隆
质粒pAC-BETA(Addgene plasmid#53272)，携带基因crtE，crtB，crtI，crtY。
基因ocp来自集胞藻Synechocystis sp.PCC6803，可通过酶切位点NcoI和NotI插入pETDuet位点1(Site1)。基因crtW来自鱼腥藻Anabaena sp.PCC7210，可通过酶切位点NdeI和XhoI插入pET Duet位点2(Site2)。最终得到质粒pET Duet-ocp-crtW。基因ocp突变序列可根据设计要求，进行全基因合成，然后通过上述酶切位点接入相应的质粒中。
以上两种质粒pAC-BETA和pET Duet-ocp-crtW，可通过感受态细胞制备的方法，导入大肠杆菌BL21细胞。然后经过抗性筛选，得到所需的基因工程菌株。
(2)表达
改造后的大肠杆菌使用Terrific Broth medium(24gL-1酵母提取物,12gL-1胰蛋白胨,0.71molL-1K2HPO4,0.17molL-1KH2PO4,0.4％v/v甘油)进行培养，同时加入抗生素ampicillin(终浓度50mgmL-1)和chloramphenicol(终浓度40mgmL-1)。
培养温度37℃，时长3-4h直到OD600＝0.6～0.8。然后加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃条件下诱导培养表达。16～18h后，离心收集细胞，离心力12,000×g，时间3min，离心温度4℃。收集时用纯水清洗两遍，可储存于-20℃。
(3)分离与纯化
收集好的细胞用冰预冷的裂解缓冲液((20mM Tris,300mM NaCl,10％甘油，pH8.0)重悬，弱光下采用法式破碎。破碎后的样品12,000×g离心，取上清悬浮液进行层析，层析柱为Ni-ProBond resin(Invitrogen)。清洗杂质时，裂解缓冲液含20mM imidazole。收集样品时，裂解缓冲液含300mM imidazole。然后用缓冲液(20mM Tris·HCl，50mM NaCl，pH8.0)透析12h。
进一步的纯化，可采用分子筛层析柱进行色谱层析。
类胡萝卜素蛋白主要表达方法及产品性质对比结构如下表所示：
a)pAC-BETA质粒携带基因crtE,crtB,crtI,crtY；pCDF(或者pET30)质粒携带基因ocp；pBAD质粒携带基因crtW或者crtO；pETDeuT质粒携带基因ocp和crtW。
b)A：N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A；GSS：在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS；GSSHHHHHHSQDC：N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSSHHHHHHSQDC；HHHHHH为亲和标记序列His6-tag；OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)与野生型OCP的氨基酸序列变化如图2所示。
c)可见光与紫外吸收比值，OCP采用A476/A280。
d)Ni:样品通过Ni2+-亲和层析纯化；
SEC:样品通过Ni2+-亲和层析纯化后，再通过分子筛纯化柱色谱纯化。
e)产量计算统一采用Ni2+-亲和层析后获取的蛋白量数据。
通过Ni2+-亲和层析纯化得到的OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)的SDS-PAGE结果如图3所示，从左至右依次为Marker，OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)。
经过尺寸排阻色谱纯化的OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)的产量如图4所示，从左至右依次为OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)，SDS-PAGE结果如图5所示，从左至右依次为Marker，OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)。
(4)可逆光转化与光谱分析
为了实现OCP从暗稳态到激发态的转化，纯化后的样品，需要在4℃条件下，用白光照射5min，强度5000mmol photons m-1s-1，卤素光源(Volpi5100)。光转化前后的吸收光谱图如图6所示，其中样品经过Ni2+-亲和层析纯化，检测的缓冲液环境为20mMTris，300mM NaCl，10％甘油。
OCP的光谱分析采用的设备是型号为UV-9000S(Shanghai Metash InstrumentsCo.,Ltd)的紫外可见光谱仪。
经过尺寸排阻色谱进一步纯化的OCP(A)、OCP(GSS)、OCP(GSS-SQDC)的吸收光谱图如图7所示。检测的缓冲液环境为20mM Tris，50mM NaCl，室温检测。
(5)藻胆体荧光淬灭
OCP用白光照射5min，从暗稳态转化到激发态后，与纯化的集胞藻藻胆体共同混匀孵育，缓冲液环境为0.8M phosphate。淬灭实验过程中，需要使OCP蛋白保持在激发态OCPR，因此OCP实验组须要受到蓝绿光持续照射。所有实验组的OCP(0.48μM)与藻胆体(0.012μM)摩尔比统一为40。
荧光淬灭检测采用的设备是型号为F320的荧光分光光度计(TianJin GangDongSci and Tech Development Company,China)。OCP浓度是根据其摩尔吸收系数换算得到，OCP结合色素CAN后在495nm处的摩尔吸收系数ε＝63,000M-1cm-1。
OCP对藻胆体荧光淬灭效果图如图8所示。其中被激发的藻胆体(终浓度0.012μM)，分别加入各种OCPs进行荧光淬灭，淬灭时长5min。荧光检测波长位于663nm，加入OCP系列蛋白淬灭的实验组检测时需要蓝绿光持续照射激发。OCP系列蛋白均采用本技术表达制备，并通过Ni2+-亲和层析纯化。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> 一种橙色类胡萝卜素蛋白的制备方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Synechocystis sp. PCC 6803
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Claims (10)

1.一种脱辅基蛋白，由野生型脱辅基蛋白(SEQ ID No.1)N端序列修饰得到，其特征在于：野生型脱辅基蛋白N端序列修饰方法选自以下任一种：
a)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A；
b)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS；
c)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSSSQDC。
2.根据权利要求1所述的脱辅基蛋白，其特征在于：野生型脱辅基蛋白N端序列修饰方法选自以下任一种：
a)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A-亲和标记序列；
b)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列；
c)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列-SQDC。
3.根据权利要求2所述的脱辅基蛋白，其特征在于：亲和标记序列为His6-tag。
4.根据权利要求3所述的脱辅基蛋白，其特征在于：蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2～SEQ ID No.4中的任一种所示。
5.编码权利要求1～4任一项所述的脱辅基蛋白的序列。
6.一种微生物，含有两种质粒，其特征在于：质粒A携带基因a，基因a用于合成β-胡萝卜素，质粒B携带有基因b和基因c，基因b用于将β-胡萝卜素转化成类胡萝卜素，基因c用于合成野生型脱辅基蛋白或权利要求1～4任一项所述的脱辅基蛋白；优选地，质粒B为高拷贝数的质粒；更优选的，质粒B为高拷贝数的Duet质粒。
7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于：基因a为基因crtB、crtE、crtI、crtY组成的基因簇。
8.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于：类胡萝卜素为角黄素或海胆酮；进一步的，基因b为基因crtW或crtO。
9.一种类胡萝卜素的制备方法，其特征在于：使用权利要求6～8任一项所述的微生物表达合成类胡萝卜素。
10.一种类胡萝卜素蛋白，其特征在于：由色素基团和权利要求1～4任一项所述的脱辅基蛋白组合生成。
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