CN109580587A - 一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪及其方法，属于光学测量技术领域。光谱仪包括控制单元、双波长激光器、双通道光切换器和探测器等。通过双波长激光器发射双波长激光先后激发样品产生散射光谱获得拉曼数据，然后通过控制单元对双波长拉曼数据进行重筑处理，包括数据平滑、特征峰局部插值和拉曼重筑处理，获得扣除荧光的拉曼光谱图。本发明具有实时扣除拉曼光谱测量过程中的荧光背景、提高样品检测效果等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪及其方法，属于光谱技术领域。
背景技术
拉曼光谱检测具有检测速度快、不损坏样品、制样简单等突出优点，是一种应用广泛的检测方法。而且随着拉曼光谱检测技术的成熟，其小型化、便携化和智能化得到了更多青睐及发展。便携式拉曼光谱仪具有体积小、成本低、现场实时检测等优点，但也不可避免的遇到一些障碍，其中荧光干扰就是最大的障碍。
拉曼光谱技术的物理机制是拉曼散射，但拉曼散射发生的几率很小，拉曼光强度更是远远小于荧光强度。即使对于共振拉曼散射，荧光强度也是拉曼信号强度的1000倍以上，因而拉曼信号经常淹没在荧光信号中。荧光干扰是拉曼光谱测量过程中难以绕开的话题，目前应对荧光干扰的方式有多种，比较有效的包括荧光淬灭法、近红外激发法、紫外激发法、移频激发法等。荧光淬灭法尽管能够减弱荧光甚至是避免产生荧光，但是却具有很强的局限性和针对性，例如不同的样品需要采取不同的淬灭剂，有些猝灭剂甚至会对被测样品产生破坏。
极少样品分子在近红外区有电子跃迁吸收带，使用红外激光作为激发光源可以有效地避免荧光的产生。但由于拉曼散射强度与激发波长的四次方成反比，激发波长过长，需要大幅提高激光器的输出功率，而且红外光电探测器成本很高，因此在选用红外激发法消减荧光时，多选择波长785nm的半导体激光器作为拉曼光谱仪的激发光源。但785nm激光器不能完全消除荧光，食品、药品、毒品、爆炸物等样品仍有明显的荧光背景，仍须采取进一步措施来抑制荧光。紫外激光作为光源也可以避免荧光背景的产生，此时往往选择244nm激光器。但紫外激发法的主要问题是在紫外光照射下样品容易分解变质，而且高性能紫外激光器成本非常高。
采用多波长激光光源的移频激发法是目前比较简单和常用的方法，也就是差分光谱法。由于拉曼光的波长(频率)与激发光的波长(频率)密切相关，而荧光光谱和激发光波长之间则没有明显相关性。因此可以通过稍微改变激发波长，得到两幅拉曼光谱，直接差分光谱，从而扣除荧光背景。
专利文献CN105067114A公开了一种用于拉曼光谱仪荧光抑制的多波长外腔激光发射装置，包括准直激光发射组、光栅、光纤合路输出装置和控制器，通过电路切换连接两个以上的激光二极管实现输出波长切换。每个准直激光发射装置均包含一激光二极管和一准直透镜，其每相邻两个激光二极管经准直透镜射出的准直光束之间夹角为0～10°。专利文献CN105552713A公开了一种用于无荧光拉曼光谱仪的多波长外腔激光器，包括平行激光发射装置、光栅、光纤合路输出装置和控制器，平行激光发射装置包括至少两个中心波长相同的激光二极管组成的激光二极管阵列和准直激光校准光学元件。准直激光校准光学元件包括快轴准直镜和包括至少两个微透镜的微透镜阵列。专利文献CN205607531U公开了一种便携式双波长消荧光拉曼光谱检测系统，包括光学透镜组、拉曼光谱仪、第一激光器、第二激光器和控光装置，其中第一激光器波长680nm，第二激光器波长685nm。专利文献CN207816830U公开一种变波长激发及光谱范围可调的拉曼光谱仪，包括可变波长的激光器、第一/第二平面反射镜、第一/第二凹面反射镜、探测器、信号处理单元等。
但现有差分拉曼光谱仪对光谱的采集和光谱的差分基本上都是分步完成，即先采集光谱，然后再做差分，在实际应用中受到极大限制。一方面。被测物成分不均匀、被测表面不平、甚至活动，而光谱采集时间长达数秒、几十秒甚至更长，这个过程中样品很容易因为机械振动、受热变形等因素发生缓慢的位移，造成被测位置的变化，荧光发射和荧光收集过程都会受到影响，两次测量的荧光背景会相差较大，从而无法有效扣除荧光背景。另一方面，被测样品本身还有荧光强度随被照射时间逐渐减弱的现象，称为荧光衰减，即使对于表面平整、均匀、固定不动的样品，第二次测量的光谱中荧光信号也会弱于第一次测量的荧光信号。
发明内容
本发明旨在提供一种实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，将波长切换系统和探测器(如CCD)触发以及信号采集过程实现联动，使得光谱采集和光谱差分过程同时完成，消除来自活动、表面复杂或成分不均匀的样品的荧光干扰。
本发明通过以下技术方案实现：
一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，包括控制单元、激光器、准直透镜、反射镜、二向色镜和会聚透镜；所述光谱仪还包括双通道光切换器、滤波片、聚焦透镜、分光器和探测器，所述滤波片包括窄带滤波片和长通滤波片，所述双通道光切换器、准直透镜、窄带滤波片和反射镜依次设置在所述激光器之后，且中心同轴，形成发射光路；所述反射镜与入射光线呈45°设置，且其与二向色镜平行设置，所述会聚透镜和所述长通滤波片分别设置在所述二向色镜的前、后两侧，所述聚焦透镜、分光器和探测器依次设置在所述长通滤波片之前，且会聚透镜、二向色镜、长通滤波片、聚焦透镜、分光器和探测器中心同轴，形成探测光路；所述激光器和反射镜之间的发射光路主轴与所述探测光路主轴呈平行设置；所述控制单元分别连接所述双通道光切换器和所述探测器；所述激光器选用双波长激光器，用于提供两束不同波长的激光。
上述技术方案中，所述控制单元包括彼此相连的控制模块、储存模块与重筑处理模块，所述控制模块分别与所述双通道光切换器和所述探测器相连；所述储存模块与所述探测器相连。
上述技术方案中，所述双通道光切换器包括与所述双波长激光器提供的两束激光相对应的第一通道和第二通道，以及能够切换设置在所述第一通道或第二通道上的控制开关。
一种实时扣除荧光差分拉曼光谱法，包括：
将待测样品放置在会聚透镜的前方且位于会聚透镜的焦点范围内；
使激光器产生两束波长分别为λ1和λ2的激光；
通过控制单元将双通道光切换器切换到使波长为λ1的激光通过，并使波长为λ1的激光依次透过准直透镜准直和窄带滤波片过滤形成直线入射的中心波长为λ1、波段范围为[λ1-1,λ1+1]nm的第一入射光；中心波长为λ1的窄波段第一入射光经过反射镜反射到二向色镜上，所述二向色镜将第一入射光反射到会聚透镜，通过会聚透镜聚焦到待测样品上，使待测样品被激发产生第一散射信号；第一散射信号经过会聚透镜聚焦返回并透过二向色镜进入长通滤波片使得波长200nm以上的光谱透过，并经聚焦透镜聚焦通过分光器获得供探测器收集的第一色散光谱；持续收集时间t，获得第一色散光谱积分值，记为S(λ1)并通过控制单元存储记录；
通过控制单元将双通道光切换器切换到使波长为λ2的激光通过，并使波长为λ2的激光依次透过准直透镜准直和窄带滤波片过滤形成直线入射的中心波长为λ2、波段范围为[λ2-1,λ2+1]nm的第二入射光；中心波长为λ2的窄波段第二入射光经过反射镜反射到二向色镜上，所述二向色镜将第二入射光反射到会聚透镜，通过会聚透镜聚焦到待测样品上，使待测样品被激发产生第二散射信号；第二散射信号经过会聚透镜聚焦返回并透过二向色镜进入长通滤波片使得波长200nm以上的光谱透过，并经聚焦透镜聚焦通过分光器获得供探测器收集的第二色散光谱；持续收集时间t，获得第二色散光谱积分值，记为S(λ2)并通过控制单元存储记录；
通过控制单元对S(λ1)和S(λ2)进行光谱重筑处理，包括对S(λ1)和S(λ2)进行光谱平滑获得相应的拉曼特征峰、对相应的拉曼特征峰进行插值得到fcn1(λ1)和fcn1(λ2)，以及对拉曼特征峰插值求差分并进行多峰拟合重筑，得到待测样品的实时扣除荧光的差分拉曼光谱。
上述方法还包括：
重复两次以上通过控制单元将双通道开关依次切换到使波长为λ1或λ2的激光通过，记为N次，获得N组S(λ1)和S(λ2)的存储记录；
通过控制单元1对N组S(λ1)和S(λ2)进行光谱重筑处理，剔除毛刺：分别对N组S(λ1)和S(λ2)进行光谱平滑，剔除毛刺等虚假峰影响。峰有效性判定：根据已知的拉曼特征峰个数m，设定边界0.1m×FWHM≤p≤0.5m×FWHM，满足要求的峰定义为有效峰，即拉曼特征峰，其中FWHM值可以通过现有的FWHM函数测量。峰位置判定：通过对拉曼光谱进行5点三阶导数寻峰，寻峰函数其中x表示为横坐标波数，p表示纵坐标强度，当出现x点处的三阶导数从正数变为负数，定义三阶导数为0的位置是拉曼特征峰位置，记录为Xi，i＝1,2,……,m。拉曼特征峰局部插值：对拉曼特征峰两侧各2/3FWHM范围内进行插值，从而插值得到fcni(λ1)和fcni(λ2)，分别对fcni(λ1)和fcni(λ2)求和得到和通过对f1-f2进行多峰拟合重筑，拟合边界条件是[Xi-2,Xi+2]，从而得到待测样品的实时扣除荧光的差分拉曼光谱。
上述技术方案中，所述多峰拟合重筑选用高斯多峰拟合重筑。
上述技术方案中，所述激光器产生的两束激光，其波长λ1和λ2的差值小于2nm。
本发明具有以下优点及有益效果：通过双波长激光器发出两个波长的激光先后激发样品产生散射光谱，获取样品拉曼数据，通过对其拉曼数据进行全局平滑、拉曼特征峰局部插值和多峰拟合重筑，获得样品实时扣除荧光的拉曼光谱；在已知样品光谱峰数时，尤其能够有效增强拉曼特征峰局部信号，并削弱非拉曼特征峰位置处的信号，从而较好地实现实时扣除荧光功能，为解决强荧光样品，提高样品检测效果并提供了相应的技术解决方案。
附图说明
图1为本发明所涉及的可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪示意图。
图2为本发明所涉及的可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪的双通道切换器示意图。
图3为本发明所涉及的实施例1的拉曼光谱图：a)差分光谱；b)拟合光谱；c)重筑拉曼光谱。
图4为本发明所涉及的实施例1的测量拟合光谱图和标准光谱图对比。
图中：1–控制单元；2–激光器；3–双通道光切换器；4–准直透镜；5–窄带滤波片；6–反射镜；7–二向色镜；8–会聚透镜；9–待测样品；10–长通滤波片；11–聚焦透镜；12–分光器；13–传感器；14–重筑处理模块；15–控制模块；16–存储模块；31–第一通道；32–第二通道；33–光切换反射镜；34–光切换二向色镜；35–斩波电机；36–斩波片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式及工作过程作进一步的说明。
本申请文件中的上、下、左、右、前和后等方位用语是基于附图所示的位置关系而建立的。附图不同，则相应的位置关系也有可能随之发生变化，故不能以此理解为对保护范围的限定。
如图1所示，一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，包括控制单元1、激光器2、准直透镜4、反射镜6、二向色镜7、会聚透镜8、双通道光切换器3、滤波片、聚焦透镜11、分光器12和探测器13。激光器2选用双波长激光器，用于提供两束不同波长的激光。
滤波片包括窄带滤波片5和长通滤波片10。
以待测样品所放置的位置为后，光谱仪位置为前。双通道光切换器3、准直透镜4、窄带滤波片5和反射镜6依次设置在激光器2之后，且中心同轴，形成发射光路。反射镜6与入射光线呈45°设置，且其与二向色镜7平行设置，反射镜6的反射面朝向二向色镜7。会聚透镜8和长通滤波片10分别设置在二向色镜7的前、后两侧。聚焦透镜11、分光器12和探测器13由近及远依次设置在长通滤波片10之前，且会聚透镜8、二向色镜7、长通滤波片10、聚焦透镜11、分光器12和探测器13中心同轴，形成探测光路。发射光路主轴与探测光路主轴呈平行布置。
控制单元1分别连接双通道光切换器3和探测器13。控制单元1包括彼此相连的控制模块15、储存模块16与重筑处理模块14。控制模块15分别与双通道光切换器3和探测器13相连。储存模块16与探测器13相连。
双通道光切换器3包括与双波长激光器提供的两束激光相对应的第一通道和第二通道，以及能够切换设置在第一通道或第二通道上的控制开关。其中一个实施例如图2所示，双通道光开关3包括第一通道31、第二通道32、斩波电机35和斩波片36，第一通道31上设置有光切换反射镜33，第二通道32上设置有光切换二向色镜34，且光切换反射镜33将第一通道的激光发射到光切换二向色镜34上，使光切换反射镜33与光切换二向色镜34之间的光路成为第一通道31的一部分。斩波片36通过斩波电机35控制，在光切换反射镜33与光切换二向色镜34之间的第一通道31和第二通道32之间移动，遮挡切断激光通路，使得仅有一束激光能够通过双通道光切换器3。
使用时，将待测样品放置在会聚透镜8的前方且位于会聚透镜8的焦点范围内，如图1所示的待测样品9的位置。
使激光器2产生两束波长分别为λ1和λ2的激光，两束激光从两个位置发出，分别与双通道光切换器3的第一通道入口和第二通道入口对应。波长λ1和λ2的差值小于2nm。
通过控制单元1将双通道光切换器3切换到使波长为λ1的激光通过，并使波长为λ1的激光依次透过准直透镜4准直和窄带滤波片5过滤形成直线入射的中心波长为λ1，波段范围为[λ1-1,λ1+1]nm第一入射光；中心波长为λ1的窄波段第一入射光经过反射镜6反射到二向色镜7上，所述二向色镜7将第一入射光反射到会聚透镜8，通过会聚透镜8聚焦到待测样品上，使待测样品被激发产生第一散射信号；第一散射信号经过会聚透镜8聚焦返回并透过二向色镜7进入长通滤波片10使得波长200nm以上的光谱透过，并经聚焦透镜11聚焦通过分光器12获得供探测器14收集的第一色散光谱；持续收集时间t，获得第一色散光谱积分值，记为S(λ1)并通过控制单元1存储记录。
通过控制单元1将双通道光切换器3切换到使波长为λ2的激光通过，并使波长为λ2的激光依次透过准直透镜4准直和窄带滤波片5过滤形成直线入射的中心波长为λ2，波段范围为[λ2-1,λ2+1]nm第二入射光；中心波长为λ2的窄波段第二入射光经过反射镜6反射到二向色镜7上，所述二向色镜7将第二入射光反射到会聚透镜8，通过会聚透镜8聚焦到待测样品上，使待测样品被激发产生第二散射信号；第二散射信号经过会聚透镜8聚焦返回并透过二向色镜7进入长通滤波片10使得波长200nm以上的光谱透过，并经聚焦透镜11聚焦通过分光器12获得供探测器14收集的第二色散光谱；持续收集时间t，获得第二色散光谱积分值，记为S(λ2)并通过控制单元1存储记录。
重复两次以上上述过程，通过控制单元1将双通道开关3依次切换到使波长为λ1或λ2的激光通过，记为N次，获得N组S(λ1)和S(λ2)的存储记录；
通过控制单元1对N组S(λ1)和S(λ2)进行光谱重筑处理，剔除毛刺：分别对N组S(λ1)和S(λ2)进行光谱平滑，剔除毛刺等虚假峰影响。峰有效性判定：根据已知的拉曼特征峰个数m，设定边界0.1m×FWHM≤p≤0.5m×FWHM，满足要求的峰定义为有效峰，即拉曼特征峰，其中FWHM(full width at half maximum，半高全宽)值可以通过现有的FWHM函数测量。峰位置判定：通过对拉曼光谱进行5点三阶导数寻峰，寻峰函数其中x表示为横坐标波数，p表示纵坐标强度，当出现x点处的三阶导数从正数变为负数，定义三阶导数为0的位置是峰位置，记录为Xi，i＝1,2,……,m。拉曼特征峰局部插值：对拉曼特征峰两侧各2/3FWHM范围内进行插值，从而插值得到fcni(λ1)和fcni(λ2)，分别对fcni(λ1)和fcni(λ2)求和得到和通过对f1-f2进行多峰拟合重筑，拟合边界条件是[Xi-2,Xi+2]，从而得到待测样品的实时扣除荧光的差分拉曼光谱。
多峰拟合重筑选用高斯多峰拟合重筑。
实施例1：
待测样品选用石膏晶体，石膏晶体放置在短焦透镜8的焦平面焦点附近，石膏晶体表面在空气中会自发形成一层荧光层，荧光信号遍布整个拉曼光谱，形成背景噪声，干扰拉曼光谱。石膏晶体在785nm或者784nm激光激发下，在波数为200～1300cm-1范围内有6个拉曼特征峰。
设定积分时间为t＝100ms、N＝5、λ1＝785nm、λ2＝784nm，按照上述描述的步骤分别获取到5组S(785nm)和5组S(784nm)，通过Savitzky-Golay卷积算法平滑光谱，Savitzky-Golay卷积算法窗口为5，阶数为9，将平滑后的数据的拉曼特征峰进行Lagrange插值，得到fcni(λ1)和fcni(λ2)，分别对fcni(λ1)和fcni(λ2)求和得到和再进行差分得到f1-f2，即如图3a空心圆圈对应的差分光谱，利用高斯峰近似进行6峰拟合，得到如图3b实线差分数据，进而重筑得到石膏在785nm(或者784nm，两者可以同时得到，在此仅以785nm激光激发条件下为例)激发条件下的拉曼特征峰位置，如图3c短虚线所示的本发明重筑石膏拉曼光谱。将石膏在785nm的重筑拉曼光谱(如图4短虚线所示)和石膏785nm标准拉曼光谱数据(85nm激发条件下的拉曼特征峰如图4实线所示)对比，重筑拉曼光谱峰对应的波数与标准拉曼光谱峰对应的波数几乎一致，波位移最大偏差4cm-1，对应波长偏差约为0.25nm。如重筑拉曼光谱峰位置按照波数从小到大依次为419cm-1、498cm-1、621cm-1、676cm-1、1013cm-1、1141cm-1，标准拉曼光谱峰位置按照波数从小到大依次为417cm-1、497cm-1、619cm-1、674cm-1、1010cm-1、1137cm-1，均小于光谱分辨率，比较完美的重现了拉曼光谱。同时有效的扣除了荧光背景噪声。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，所述光谱仪包括控制单元(1)、激光器(2)、准直透镜(4)、反射镜(6)、二向色镜(7)和会聚透镜(8)，其特征在于，所述光谱仪还包括双通道光切换器(3)、滤波片、聚焦透镜(11)、分光器(12)和探测器(13)，所述滤波片包括窄带滤波片(5)和长通滤波片(10)，所述双通道光切换器(3)、准直透镜(4)、窄带滤波片(5)和反射镜(6)依次设置在所述激光器(2)之后，且中心同轴，形成发射光路；所述反射镜(6)与入射光线呈45°设置，且其与二向色镜(7)平行设置，所述会聚透镜(8)和所述长通滤波片(10)分别设置在所述二向色镜(7)的前、后两侧，所述聚焦透镜(11)、分光器(12)和探测器(13)依次设置在所述长通滤波片(10)之前，且会聚透镜(8)、二向色镜(7)、长通滤波片(10)、聚焦透镜(11)、分光器(12)和探测器(13)中心同轴，形成探测光路；所述激光器(2)和反射镜(6)之间的发射光路主轴与所述探测光路主轴呈平行布置；所述控制单元(1)分别连接所述双通道光切换器(3)和所述探测器(13)；所述激光器(2)选用双波长激光器，用于提供两束不同波长的激光。
2.根据权利要求1所述的一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，其特征在于，所述控制单元(1)包括彼此相连的控制模块(15)、储存模块(16)与重筑处理模块(14)，所述控制模块(15)分别与所述双通道光切换器(3)和所述探测器(13)相连；所述储存模块(16)与所述探测器(13)相连。
3.根据权利要求1或2所述的一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，其特征在于，所述双通道光切换器(3)包括与所述双波长激光器提供的两束激光相对应的第一通道和第二通道，以及能够切换设置在所述第一通道或第二通道上的控制开关。
4.一种实时扣除荧光差分拉曼光谱法，其使用如权利要求1所述的一种可实时扣除荧光的差分拉曼光谱仪，其特征在于，所述方法包括：
将待测样品放置在会聚透镜(8)的前方且位于会聚透镜(8)的焦点范围内；
使激光器(2)产生两束波长分别为λ1和λ2的激光；
通过控制单元(1)将双通道光切换器(3)切换到使波长为λ1的激光通过，并使波长为λ1的激光依次透过准直透镜(4)准直和窄带滤波片(5)过滤形成直线入射的中心波长为λ1，波段范围为[λ1-1,λ1+1]nm第一入射光；中心波长为λ1的窄波段第一入射光经过反射镜(6)反射到二向色镜(7)上，所述二向色镜(7)将第一入射光反射到会聚透镜(8)，通过会聚透镜(8)聚焦到待测样品上，使待测样品被激发产生第一散射信号；第一散射信号经过会聚透镜(8)聚焦返回并透过二向色镜(7)进入长通滤波片(10)使得波长200nm以上的光谱透过，并经聚焦透镜(11)聚焦通过分光器(12)获得供探测器(14)收集的第一色散光谱；持续收集时间t，获得第一色散光谱积分值，记为S(λ1)并通过控制单元(1)存储记录；
通过控制单元(1)将双通道光切换器(3)切换到使波长为λ2的激光通过，并使波长为λ2的激光依次透过准直透镜(4)准直和窄带滤波片(5)过滤形成直线入射的中心波长为λ2，波段范围为[λ2-1,λ2+1]nm第二入射光；中心波长为λ2的窄波段第二入射光经过反射镜(6)反射到二向色镜(7)上，所述二向色镜(7)将第二入射光反射到会聚透镜(8)，通过会聚透镜(8)聚焦到待测样品上，使待测样品被激发产生第二散射信号；第二散射信号经过会聚透镜(8)聚焦返回并透过二向色镜(7)进入长通滤波片(10)使得波长200nm以上的光谱透过，并经聚焦透镜(11)聚焦通过分光器(12)获得供探测器(14)收集的第二色散光谱；持续收集时间t，获得第二色散光谱积分值，记为S(λ2)并通过控制单元(1)存储记录；
通过控制单元(1)对S(λ1)和S(λ2)进行光谱重筑处理，包括对S(λ1)和S(λ2)进行光谱平滑获得相应的拉曼特征峰、对相应的拉曼特征峰进行插值得到fcn1(λ1)和fcn1(λ2)，以及对拉曼特征峰插值求差分并进行多峰拟合重筑，得到待测样品的实时扣除荧光的差分拉曼光谱。
5.根据权利要求4所述的一种实时扣除荧光差分拉曼光谱法，其特征在于，所述方法还包括：
重复两次以上通过控制单元(1)将双通道开关(3)依次切换到使波长为λ1或λ2的激光通过，记为N次，获得N组S(λ1)和S(λ2)的存储记录；
通过控制单元(1)对N组S(λ1)和S(λ2)进行光谱重筑处理，分别对N组S(λ1)和S(λ2)进行光谱平滑获得相应的拉曼特征峰，分别对拉曼特征峰进行插值得到fcni(λ1)和fcni(λ2)，分别对fcni(λ1)和fcni(λ2)求和得到和通过对f1-f2进行多峰拟合重筑，得到待测样品的实时扣除荧光的差分拉曼光谱。
6.根据权利要求4或5所述的一种实时扣除荧光差分拉曼光谱法，其特征在于，所述多峰拟合重筑选用高斯多峰拟合重筑。
7.根据权利要求4所述的一种实时扣除荧光差分拉曼光谱法，其特征在于，所述激光器(2)产生的两束激光，其波长λ1和λ2的差值小于2nm。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |