CN109576211A - 一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程 - Google Patents

一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程 Download PDF

Info

Publication number
CN109576211A
CN109576211A CN201811295348.2A CN201811295348A CN109576211A CN 109576211 A CN109576211 A CN 109576211A CN 201811295348 A CN201811295348 A CN 201811295348A CN 109576211 A CN109576211 A CN 109576211A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lung
cell
pluripotent stem
stem cells
human pluripotent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811295348.2A
Other languages
English (en)
Inventor
董永聘
冯荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Huaipo Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Huaipo Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Huaipo Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Huaipo Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811295348.2A priority Critical patent/CN109576211A/zh
Publication of CN109576211A publication Critical patent/CN109576211A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程；具体流程包括：1)人多能干细胞培养于基质胶包被的培养板；2)ESC/iPSC生长至月95％汇合度的时候开始诱导分化；3)分化的第二阶段为腹部前肠内胚层阶段；4)分化的第三个阶段为肺系分化阶段；5)41天的诱导；本发明提供的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，本诱导分化流程为目前最经济，仅用5种细胞因子/小分子化合物的3D肺类器官定向分化平台。

Description

一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程
技术领域
本发明涉及一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程。
背景技术
多能干细胞，是能够分化成多种类型体细胞的干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。这个多能的意思，顾名思义：有多种分化能力。多能干细胞的概念是相对于单能干细胞和全能干细胞而言的。人类多能干细胞凭借其无限自我更新，非常适合扩增；具有的多向分化潜能，可作为体细胞损伤、缺失的替代者，是理想的再生医学种子细胞。自体多能干细胞来源的组织细胞可避免组织器官移植的排异现象，使得组织器官的自体再造和移植成为可能。肺损伤甚至肺功能衰竭是临床常见的致命性疾病，目前物理人造肺尚不能使得肺衰竭患者有质量地生存；肺移植治疗也存在移植肺来源有限、移植排异等诸多问题。所以，以多能干细胞为原料的组织工程肺是肺损伤患者理想的治疗材料。然而，许多研究者多年来一直没有理想的定向肺类器官分化的方案。
发明内容
本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其中，具体技术方案为：
具体流程包括：
1)人多能干细胞培养于基质胶包被的培养板，培养基为多能干细胞专用培养基；
2)ESC/iPSC生长至月95％汇合度的时候开始诱导分化，分化第一个阶段为定型内胚层阶段，诱导培养基为RPMI1640基础培养基含100ng/ml的活化素A，每天跟换诱导培养基，DE阶段持续3天，ESC/iPSC进入DE阶段，应表达DE阶段特异性标志物SOX17和FOXA2，同时下调多能性标志物OCT4；
3)分化的第二阶段为腹部前肠内胚层阶段，诱导培养基为Advanced-DMEM/F12基础培养基含200ng/ml Noggin,500ng/ml FGF4,10μM SB431542和2μM CHIR99021，每天跟换诱导培养基，AFE阶段持续4天；
4)分化的第三个阶段为肺系分化阶段，诱导培养基为含1％FBSAdvanced-DMEM/F12培养基，细胞经过DE和AFE阶段共7天的诱导后，PBS洗2次，酶,消化3分钟,1％FBSAdvanced-DMEM/F12培养基中和，1000转离心，弃去上清，细胞包埋于预冷的基质胶中,37℃，5％CO2培养箱中静置30分钟，待基质胶固化后加入含1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基，每3天跟换培养基，6-8天传代一次，诱导35天；
5)经过41天的诱导，形成3D立体结构的肺类器官，表达多种肺系标志物，同时电镜应能看到“9+2”微管结构，即肺近端纤毛细胞特异结构。
上述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其中：1)中，基质胶包括胶原或Matrigel,BD；354277，培养基包括mTeSR1，StemCell Technologies；05850。
上述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其中：2)中，诱导培养基包括Activin A,R&D systems；338-AC-50。
上述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其中：3)中，基础培养基含R&Dsystems；6057-NG-100，500ng/ml FGF4包括Peprotech；100-31-1MG,10μM SB431542包括Tocris；1614-10MG；2μM CHIR99021包括Tocris；4423-10MG。
上述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其中：4)中，细胞包埋于预冷的基质胶包括Matrigel,BD；356237。
上述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其中：5)中，表达多种肺系标志物包括NKX2.1肺系早期祖细胞的标志，SOX2肺近端祖细胞的标志，SOX9肺远端祖细胞的标志，SPC及SPB肺远端AT2细胞的标志，PDPN肺远端AT1细胞的标志，P63肺近端基质细胞，basalcell的标志,CC10肺近端克拉克细胞，Club cell的标志,MUC5AC肺近端高脚杯细胞，Gobletcell的标志。
有益效果
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：本诱导分化流程为目前最经济，仅用5种细胞因子/小分子化合物的3D肺类器官定向分化平台。
附图说明
图1是体外高效诱导人胚胎干细胞来源的肺类器官细胞。
其中：
(A)肺类器官诱导分化流程；
(B)体外分化各阶段明场图片，标尺＝100μm；
(C)体外分化各阶段转录水平表达情况；
(D)诱导分化各阶段标志物检测，SOX17为D3定型内胚层标志物，NKX2.1为D31肺系祖细胞标志物，SPC为D41二型肺泡细胞标志物标尺＝50μm。
具体实施方式
本方法适用于人多能干细胞定向肺类器官分化。
具体流程包括：
1、人多能干细胞(ESC/iPSC)培养于基质胶(包括胶原或Matrigel,BD；354277)包被的培养板，培养基为多能干细胞专用培养基(例如mTeSR1，StemCell Technologies；05850)，37℃，5％CO2，细胞每天换液，4天左右传代一次，传代比例1：6。
2、ESC/iPSC生长至月95％汇合度的时候开始诱导分化。分化第一个阶段为定型内胚层(Definitive endoderm,DE)阶段，诱导培养基为RPMI1640基础培养基含100ng/ml的活化素A(例如Activin A,R&Dsystems；338-AC-50),每天跟换诱导培养基，DE阶段持续3天。ESC/iPSC进入DE阶段，应表达DE阶段特异性标志物SOX17和FOXA2(-95％阳性率)，同时下调多能性标志物OCT4等。
3、分化的第二阶段为腹部前肠内胚层(Anterior foregut stage,AFE)阶段，诱导培养基为Advanced-DMEM/F12基础培养基含200ng/ml Noggin(例如R&D systems；6057-NG-100),500ng/ml FGF4(例如Peprotech；100-31-1MG),10μM SB431542(例如Tocris；1614-10MG)和2μM CHIR99021(例如Tocris；4423-10MG)，每天跟换诱导培养基，AFE阶段持续4天。
4、分化的第三个阶段为肺系分化阶段，诱导培养基为含1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基。细胞经过DE和AFE阶段共7天的诱导后，PBS洗2次，酶(例如Accutase)消化3分钟,1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基中和，1000转离心，小心弃去上清，细胞包埋于预冷的基质胶(例如Matrigel,BD；356237)中,37℃，5％CO2培养箱中静置30分钟，待基质胶固化后加入含1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基。每3天跟换培养基，6-8天传代一次，诱导35天。
5、经过41天的诱导，形成3D立体结构的肺类器官，应表达多种肺系标志物如：NKX2.1(肺系早期祖细胞的标志)，SOX2(肺近端祖细胞的标志)，SOX9(肺远端祖细胞的标志)，SPC及SPB(肺远端AT2细胞的标志)，PDPN(肺远端AT1细胞的标志)，P63(肺近端基质细胞，basal cell的标志),CC10(肺近端克拉克细胞，Club cell的标志),MUC5AC(肺近端高脚杯细胞，Goblet cell的标志),同时电镜应能看到“9+2”微管结构(肺近端纤毛细胞特异结构)。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：
具体流程包括：
1)人多能干细胞培养于基质胶包被的培养板，培养基为多能干细胞专用培养基；
2)ESC/iPSC生长至月95％汇合度的时候开始诱导分化，分化第一个阶段为定型内胚层阶段，诱导培养基为RPMI1640基础培养基含100ng/ml的活化素A，每天跟换诱导培养基，DE阶段持续3天，ESC/iPSC进入DE阶段，应表达DE阶段特异性标志物SOX17和FOXA2，同时下调多能性标志物OCT4；
3)分化的第二阶段为腹部前肠内胚层阶段，诱导培养基为Advanced-DMEM/F12基础培养基含200ng/ml Noggin,500ng/ml FGF4,10μM SB431542和2μM CHIR99021，每天跟换诱导培养基，AFE阶段持续4天；
4)分化的第三个阶段为肺系分化阶段，诱导培养基为含1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基，细胞经过DE和AFE阶段共7天的诱导后，PBS洗2次，酶,消化3分钟,1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基中和，1000转离心，弃去上清，细胞包埋于预冷的基质胶中,37℃，5％CO2培养箱中静置30分钟，待基质胶固化后加入含1％FBS Advanced-DMEM/F12培养基，每3天跟换培养基，6-8天传代一次，诱导35天；
5)经过41天的诱导，形成3D立体结构的肺类器官，表达多种肺系标志物，同时电镜应能看到“9+2”微管结构，即肺近端纤毛细胞特异结构。
2.如权利要求1所述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：1)中，基质胶包括胶原或Matrigel,BD；354277，培养基包括mTeSR1，StemCell Technologies；05850。
3.如权利要求2所述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：2)中，诱导培养基包括Activin A,R&D systems；338-AC-50。
4.如权利要求3所述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：3)中，基础培养基含R&D systems；6057-NG-100，500ng/ml FGF4包括Peprotech；100-31-1MG,10μMSB431542包括Tocris；1614-10MG；2μM CHIR99021包括Tocris；4423-10MG。
5.如权利要求4所述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：4)中，细胞包埋于预冷的基质胶包括Matrigel,BD；356237。
6.如权利要求5所述的人多能干细胞定向肺类器官分化流程，其特征在于：5)中，表达多种肺系标志物包括NKX2.1肺系早期祖细胞的标志，SOX2肺近端祖细胞的标志，SOX9肺远端祖细胞的标志，SPC及SPB肺远端AT2细胞的标志，PDPN肺远端AT1细胞的标志，P63肺近端基质细胞，basal cell的标志,CC10肺近端克拉克细胞，Club cell的标志,MUC5AC肺近端高脚杯细胞，Goblet cell的标志。
CN201811295348.2A 2018-11-01 2018-11-01 一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程 Pending CN109576211A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811295348.2A CN109576211A (zh) 2018-11-01 2018-11-01 一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811295348.2A CN109576211A (zh) 2018-11-01 2018-11-01 一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109576211A true CN109576211A (zh) 2019-04-05

Family

ID=65921250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811295348.2A Pending CN109576211A (zh) 2018-11-01 2018-11-01 一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109576211A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215080A (zh) * 2021-05-31 2021-08-06 中国科学院生态环境研究中心 诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法
CN117126798A (zh) * 2023-10-20 2023-11-28 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种用于多能干细胞衍生肺类器官的培养基以及培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103068970A (zh) * 2010-04-25 2013-04-24 西奈山医学院 来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成
WO2018176044A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of lung bud organoids with branching structures and uses thereof for lung disease modeling

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103068970A (zh) * 2010-04-25 2013-04-24 西奈山医学院 来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成
WO2018176044A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of lung bud organoids with branching structures and uses thereof for lung disease modeling

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRIANA R DYE: "In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids", 《ELIFE》 *
YONG CHEN: "Long-Term Engraftment Promotes Differentiation of Alveolar Epithelial Cells from Human Embryonic Stem Cell Derived Lung Organoids", 《STEM CELLS DEV》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215080A (zh) * 2021-05-31 2021-08-06 中国科学院生态环境研究中心 诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法
CN117126798A (zh) * 2023-10-20 2023-11-28 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种用于多能干细胞衍生肺类器官的培养基以及培养方法
CN117126798B (zh) * 2023-10-20 2024-05-03 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种用于多能干细胞衍生肺类器官的培养基以及培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7120993B2 (ja) 多能性細胞を分化させるための方法
Li et al. Neural differentiation from pluripotent stem cells: the role of natural and synthetic extracellular matrix
US8883502B2 (en) Expandable cell source of neuronal stem cell populations and methods for obtaining and using them
CN105683361B (zh) 使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞
JP6824267B2 (ja) ヒト誘導多能性幹細胞からライディッヒ細胞への分化誘導方法及びその用途
CN105940101A (zh) 由人多能干细胞特化功能性颅基板衍生物
JP2017532047A5 (zh)
CN106795487A (zh) 胰腺祖细胞的增殖方法
WO2018062269A1 (ja) 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物
JP4439396B2 (ja) 神経系細胞の製造方法
WO2020258946A1 (zh) 一种诱导脊髓星形胶质细胞重编程为运动神经元的方法
CN101962630B (zh) 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
CN109880800A (zh) 一种中脑多巴胺能神经前体细胞及其制备方法和应用
CN109576211A (zh) 一种人多能干细胞定向肺类器官分化流程
Kong et al. Cellular Stemness Maintenance of Human Adipose‐Derived Stem Cells on ZnO Nanorod Arrays
WO2012141471A2 (ko) 역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법
Li et al. Influence of surface roughness on neural differentiation of human induced pluripotent stem cells
Han et al. Efficient and fast differentiation of human neural stem cells from human embryonic stem cells for cell therapy
Wiley et al. Generation of xeno‐free, cGMP‐compliant patient‐specific iPSCs from skin biopsy
JPWO2019182044A1 (ja) 多分化能性幹細胞分化促進剤
US20220073873A1 (en) Method for purifying neural crest cells or corneal epithelial cells
US10472607B2 (en) Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neuroepithelial cells
WO2011060342A2 (en) Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions using matrix overlay methods
Alexanian et al. Quiescent neural cells regain multipotent stem cell characteristics influenced by adult neural stem cells in co-culture
Abu-Bonsrah et al. Generation of neural crest progenitors from human pluripotent stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190405