CN109575117A - [Pyr1]-apelin-13的制备方法 - Google Patents

[Pyr1]-apelin-13的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109575117A
CN109575117A CN201811530632.3A CN201811530632A CN109575117A CN 109575117 A CN109575117 A CN 109575117A CN 201811530632 A CN201811530632 A CN 201811530632A CN 109575117 A CN109575117 A CN 109575117A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fmoc
apelin
pyr1
resin
boc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811530632.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109575117B (zh
Inventor
张朴永
袁兵占
申长念
张云
刘小龙
王立江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KUNMING JIDA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
KUNMING JIDA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KUNMING JIDA PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical KUNMING JIDA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN201811530632.3A priority Critical patent/CN109575117B/zh
Publication of CN109575117A publication Critical patent/CN109575117A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109575117B publication Critical patent/CN109575117B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及[Pyr1]‑apelin‑13的制备方法，包括：步骤(1)，将苯丙氨酸树脂置入反应瓶中溶胀处理；步骤(2)，向该反应瓶中加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc‑Pro‑OH、偶联剂和DMF的混合溶液进行偶联反应，之后脱保护脱去保护基团Fmoc；步骤(3)，依次使用Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑His(Trt)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH以及Boc‑Pyr‑OH分别进行步骤(2)，在Boc‑Pyr‑OH偶联完成后不脱除Boc，得到带有侧链保护基的[Pyr1]‑apelin‑13保护肽树脂；步骤(4)，裂解得到[Pyr1]‑apelin‑13粗肽；步骤(5)，纯化得到[Pyr1]‑apelin‑13。该制备方法安全、环保，收率高，纯度高。

Description

[Pyr1]-apelin-13的制备方法
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，涉及一种[Pyr1]-apelin-13的制备方法。
背景技术
Apelin(爱帕琳肽)是Tatemoto等人于1998年首次通过反向药理学方法从牛胃的分泌物中提取并纯化的内源性APJ天然配体，是一种新发现的具有重要生物学作用的心血管活性多肽，与血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)具有31％同源性，属于肾素一血管紧张素系统(reunin-angiotensis system，RAS)新的组分，具有扩张血管、正性肌力、减少抗利尿激素释放、降低血压、调节垂体激素释放、调整生物节律和抑制人类免疫缺陷病毒侵入等多种生物学效应。
Apelin表示具有77个残基的前蛋白，其被加工为apelin肽的生物活性形式，诸如apelin-36(三十六肽)、apelin-17(十七肽)、apelin-16(十六肽)、apelin-13(十三肽)、apelin-12(十二肽)。全长成熟肽也称为“apelin-36”，包含36个氨基酸。Apelin-36具有较强的抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)入侵的能力，而其他亚型则在心血管活动的调节中具有更强的效应。但近来的观点认为apelin-36是一个仅有少许生物学活性的前体，起作用时被水解及翻译后修饰成活性更高的成熟多肽，且主要为焦谷氨酸型Apelin-13，即(Pyr1)apelin-13，其也被称为“Pyr-1-apelin-13”或“[Pyr1]-apelin-13”。
[Pyr1]-apelin-13由13个氨基酸组成，其分子结构如下：
[Pyr1]-apelin-13氨基酸序列为：H-Pyr1-Arg2-Pro3-Arg4-Leu5-Ser6-His7-Lys8-Gly9-Pro10-Met11-Pro12-Phe13-OH
[Pyr1]-apelin-13为13肽化合物，多肽药物的合成方法通常包括液相合成和固相合成，固相合成方法是比较常用的多肽合成方法。现有文献对于[Pyr1]-apelin-13的合成制备方法的报道仅在专利CN1283228A中有简略描述。
专利CN1283228A采用Boc保护的氨基酸进行固相合成，偶联试剂采用NMP-HOBt，裂解过程中使用氟化氢(HF)，然后用乙醚沉淀，所述方法在用Boc保护的氨基酸偶联脱Boc过程中需要用酸，导致树脂肽裂解，并且用到强腐蚀性的剧毒试剂氟化氢(HF)，收率也较低，制备规模只有毫克级。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的[Pyr1]-apelin-13的制备方法，该方法不使用对环境污染影响大的乙二硫醇(EDT)，并且不使用毒性大且易燃的危险化学品乙醚和剧毒试剂氟化氢，制备方法安全、环保，收率高，纯度高，低成本，且更适合于工业放大生产，且所得[Pyr1]-apelin-13的纯度为98.5％以上。
用于解决技术课题的技术手段
本发明的[Pyr1]-apelin-13的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将苯丙氨酸树脂作为起始原料，置入反应瓶中进行溶胀处理；
步骤(2)，向所述反应瓶中加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc-Pro-OH、偶联剂和DMF的混合溶液进行偶联反应，反应完成后进行脱保护，脱去保护基团Fmoc；
步骤(3)，作为带有保护基团的原料氨基酸依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH以及Boc-Pyr-OH，依次进行所述步骤(2)，在Boc-Pyr-OH偶联完成后无需脱除保护基团Boc，从而得到带有侧链保护基的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂；
步骤(4)，将由步骤(3)得到的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂进行裂解脱保护反应，除去树脂、侧链保护基以及保护基团Boc，得到[Pyr1]-apelin-13粗肽；
步骤(5)，将所得的粗肽进行纯化，得到[Pyr1]-apelin-13。
在本发明的方法中，优选所述偶联剂为由1-羟基苯并三唑与选自N,N’-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯及二环己基碳二亚胺中的任一种构成的试剂。更优选所述偶联剂为1-羟基苯并三唑与N,N’-二异丙基碳二亚胺。
在本发明的方法中，优选所述苯丙氨酸树脂为载有苯丙氨酸的氯甲基树脂，取代度为0.6～0.9mmol/g。
在脱保护反应中，用于脱去保护基团Fmoc的脱保护试剂优选为DBLK，即哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比1：4的混合溶剂。
在裂解反应中，作为裂解剂，优选使用由三氟乙酸、三异丙基硅烷、二硫代苏糖醇、甲基苯基硫醚以及水构成的混合试剂，且，混合试剂中各组分的重量百分含量为：三氟乙酸：86～96％，三异丙基硅烷：1～5％，二硫代苏糖醇：1～5％，甲基苯基硫醚：0～5％，以及水：0～5％。更优选三氟乙酸：三异丙基硅烷：二硫代苏糖醇：甲基苯基硫醚：水＝94:2:2:1:1。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明针对传统的[Pyr1]-apelin-13的合成方法进行了改进，不使用对环境污染影响大的乙二硫醇(EDT)，并且不使用毒性大且易燃的危险化学品乙醚以及剧毒试剂氟化氢，制备方法安全、环保，收率高，纯度高，低成本，且更适合于工业放大生产，所得[Pyr1]-apelin-13纯度为98％以上。
附图说明
图1表示实施例7的Pyr1-apelin-13的精确分子量图谱。
图2表示实施例7的Pyr1-apelin-13的肽段质谱二级碎裂结果。
图3表示实施例7的Pyr1-apelin-13的质谱谱图二级串联b/y离子匹配信息及得分。
图4表示实施例7的Pyr1-apelin-13的HPLC图谱。
具体实施方式
以下，针对本发明进行详细说明，为了便于说明，本说明书中针对一些技术术语采用缩写方式记载，具体如表1所示。
表1：
[Pyr1]-apelin-13肽链从N端到C端的氨基酸顺序编号序列如下：H-Pyr1-Arg2-Pro3-Arg4-Leu5-Ser6-His7-Lys8-Gly9-Pro10-Met11-Pro12-Phe13-OH。本发明的制备方法中，将13号苯丙氨酸作为起始物氨基酸树脂，按照[Pyr1]-apelin-13肽链的从C端至N端的氨基酸顺序逐一偶联形成。具体方法如下所述。
步骤(1)
将苯丙氨酸树脂作为起始原料，置入反应瓶中进行溶胀处理。该苯丙氨酸树脂为载有苯丙氨酸的氯甲基树脂(2-CTC树脂)，取代度优选为0.6～0.9mmol/g。所述“取代度优选为0.6～0.9mmol/g”是指优选每克氯甲基树脂载有0.6～0.9mmol苯丙氨酸。
步骤(2)
向上述反应瓶中加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc-Pro-OH(12号脯氨酸)、偶联剂和DMF的混合溶液，进行偶联反应，反应完成后进行脱保护，脱去保护基团Fmoc；
通过该步骤得到2肽树脂，即带有脯氨酸的苯丙氨酸树脂。
步骤(3)
作为带有保护基团的原料氨基酸依次使用Fmoc-Met-OH(11号蛋氨酸)、Fmoc-Pro-OH(10号脯氨酸)、Fmoc-Gly-OH(9号甘氨酸)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(8号赖氨酸)、Fmoc-His(Trt)-OH(7号组氨酸)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(6号丝氨酸)、Fmoc-Leu-OH(5号亮氨酸)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4号精氨酸)、Fmoc-Pro-OH(3号脯氨酸)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2号精氨酸)以及Boc-Pyr-OH(1号焦谷氨酸)，依次进行上述步骤(2)，从而通过逐一偶联从上述2肽树脂的N端依次引入11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸。在Boc-Pyr-OH偶联完成后无需脱除保护基团Boc，从而得到带有保护基的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂；
在上述步骤(2)及步骤(3)的偶联过程中使用偶联剂为HOBt/DIC、HOBt/HBTU、HOBt/TBTU、HOBt/DCC混合试剂中的一种，进一步优选为HOBt/DIC，HOBt、DIC和原料氨基酸保持相等摩尔数，且每个原料氨基酸的用量优选为苯丙氨酸树脂摩尔数的1～5倍，更优选3～4倍。每次偶联反应时间优选为60～120分钟。
在步骤(2)及步骤(3)的氨基酸逐一偶联过程中，脱氨基酸Fmoc保护的试剂为DBLK(哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1：4)，每次脱保护所用的试剂用量为每克树脂6～20ml，更优选8～10ml。每次脱保护时间为5～30分钟，更优选10～20分钟。
步骤(4)
将由步骤(3)得到的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂进行裂解反应，除去树脂、侧链保护基以及保护基团Boc，得到[Pyr1]-apelin-13粗肽。
上述裂解试剂为由三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、二硫代苏糖醇(DTT)、甲基苯基硫醚(PhSMe)、水构成的混合试剂，各组分的重量百分含量为TFA：86～96％，TIS：1～5％，DTT：1～5％，PhSMe：0～5％，H2O：0～5％；优选裂解试剂中各组分的重量比为TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝94:2:2:1:1，裂解时间优选2-4小时。
步骤(5)
将由步骤(4)得到的粗肽进行纯化，得到最终产品[Pyr1]-apelin-13。
本发明中纯化可以采用本技术领域的常规纯化方法，如HPLC纯化方法。
通过本发明的方法合成的[Pyr1]-apelin-13粗肽纯度介于70-85％，经HPLC纯化后，[Pyr1]-apelin-13的纯度可达到98％以上。
通过上述本发明的方法，以60g(42.9mmol)苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)为原料，能够获得33.5g的[Pyr1]-apelin-13，相当于0.5mmol苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)能够获得390mg的[Pyr1]-apelin-13，而按现有技术CN1283228A的方法，只能制得28mg产品，由此表明，本发明的制备方法大幅地提高了产品收率。
此外，本发明还具有以下优点：(1)步骤(4)中采用的裂解剂为对环境友好的试剂DTT，替代目前常用方法中毒性及对环境污染影响大的乙二硫醇(EDT)，并且所得粗品纯度，收率都较高；裂解完后析晶溶剂为甲基叔丁基醚替代了现有方法中的乙醚，避免毒性大且易燃的危险化学品乙醚的使用，制备方法安全、环保，纯度高。(2)目前报道的Pyr-apelin-13的制备方法的规模比较小，而本发明的制备方法的合成规模大，更适合于产业化。
以下，通过具体实施例对本发明的制备方法进行说明，其旨在用于说明本发明，并不能解释成是针对本发明的技术方案的限定。
本发明所用试剂如表2所示。
表2
试剂 生产厂家 规格
H-Phe-2-CTC-Resin 吉尔生化 100～200mesh
Fmoc-Pro-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Met-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Gly-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Lys(Boc)-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-His(Trt)-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Ser(tBu)-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Leu-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Arg(Pbf)-OH 吉尔生化 ≥99％
Boc-Pyr-OH 吉尔生化 ≥99％
HOBt 苏州昊帆生物 ≥99％
DIC 苏州昊帆生物 ≥99％
哌啶 国药 AR
三氟乙酸 国药 AR
甲基叔丁基醚 国药 AR
二氯甲烷 国药 AR
实施例1([Pyr1]-apelin-13保护肽树脂制备)
将60g取代度为0.90mmol/g的苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)加入到2L多肽合成反应瓶中，加入DMF 480mL溶胀树脂30分钟，排掉溶剂。取另一个1L反应容器，加入Fmoc-Pro-OH 65g、DMF 480mL搅拌并降温至-5～5℃，加入HOBt 29.2g及DIC 24g，保持温度-5～5℃进行活化反应1小时。将所得的混合液加入到上述反应瓶内，室温搅拌使其与溶胀好的树脂反应1～2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。滤掉反应液，用DMF以480mL/次洗涤三次。加入DBLK 480mL脱保护反应15分钟，滤掉溶剂，并用DMF 480mL/次洗涤6次，得到2肽树脂。
依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、BOC-Pyr-OH，重复上述活化、缩合反应，从而从所得2肽树脂的N端依次引入剩余氨基酸，即11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸，最后一个BOC-Pyr-OH连接完后无需脱保护，树脂用DMF 480mL/次洗涤三次，DCM 480mL/次洗涤三次。后于45℃真空干燥12小时得[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂171g。
实施例2([Pyr1]-apelin-13保护肽树脂制备)
将60g取代度为0.73mmol/g的苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)加入到2L多肽合成反应瓶中，加入DMF 480mL溶胀树脂30分钟，排掉溶剂。取另一个1L反应容器，加入Fmoc-Pro-OH 59.1g、DMF 480ml搅拌并降温至-5～5℃，加入HOBt 23.6g及DIC 22.0g，保持温度-5～5℃活化反应1小时。将所得的混合液加入到上述反应瓶中，室温搅拌使其与溶胀好的树脂反应1～2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。滤掉反应液，用DMF以480mL/次洗涤三次。加入DBLK 480mL脱保护反应15分钟，滤掉溶剂，并用DMF以480mL/次洗涤6次，得到2肽树脂。
依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、BOC-Pyr-OH，重复上述活化、缩合反应，从而从所得2肽树脂的N端依次引入剩余氨基酸，即11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸。最后一个BOC-Pyr-OH连接完后无需脱保护，树脂用DMF 480mL/次洗涤三次，DCM 480mL/次洗涤三次。后于45℃真空干燥12小时得到[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂165g。
实施例3([Pyr1]-apelin-13保护肽树脂制备)
将60g取代度为0.62mmol/g的苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)加入到2L多肽合成反应瓶中，加入DMF 480mL溶胀树脂30分钟，排掉溶剂。取另一个1L反应容器，加入Fmoc-Pro-OH 50.2g、DMF 480mL搅拌并降温至-5～5℃，加入HOBt 20.1g及DIC 18.7g，保持温度-5～5℃活化反应1小时。将所得的混合溶液加入到上述反应瓶中，室温搅拌使其与溶胀好的树脂反应1～2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。滤掉反应液，用DMF以480mL/次洗涤三次。加入DBLK 480mL脱保护反应15分钟，滤掉溶剂，并用DMF以480mL/次洗涤6次，得到2肽树脂。
依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、BOC-Pyr-OH，重复上述活化、缩合反应，从而从所得2肽树脂的N端依次引入剩余氨基酸，即11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸。最后一个BOC-Pyr-OH连接完后无需脱保护，树脂用DMF 480mL/次洗涤三次，DCM 480mL/次洗涤三次。后于45℃真空干燥12小时得到[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂147g。
实施例4([Pyr1]-apelin-13的制备)
在3L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝94:2:2:1:1的混合酸解液1.7L，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例1得到的Pyr1-apelin-13保护肽树脂171g，自然升温至室温并反应3小时。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 170mL洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚6L的10L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚2L/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体83g，纯度83％，经HPLC纯化得到33.5g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.7％，总收率40.4％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)
实施例5([Pyr1]-apelin-13的制备)
在1L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝89:2:3:3:3的混合酸解液300mL，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例2得到的Pyr1-apelin-13保护肽树脂30g，自然升温至室温反应2.5小时。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 60mL洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚900mL的2L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚300mL/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体12.5g，纯度78％，经HPLC纯化得到4.5g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.5％，总收率37.5％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)。
实施例6([Pyr1]-apelin-13的制备)
在1L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝92:3:3:1:1的混合酸解液300mL，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例2得到的Pyr1-apelin-13保护肽树脂30g，自然升温至室温反应2h。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 60mL洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚900mL的2L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚300mL/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体12.1g，纯度76％，经HPLC纯化得到4.3g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.6％，总收率35.8％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)。
实施例7(Pyr1-apelin-13的制备)
在1L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：H2O＝92:3:3:2的混合酸解液300mL，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例2得到的Pyr-apelin-13保护肽树脂30g，自然升温至室温反应3小时。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 60ml洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚900mL的2L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚300mL/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体12.7g，纯度73％，经HPLC纯化得到4.1g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.7％，总收率34.1％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)。
精确分子量测定及序列覆盖率测定：
取实施例7所得样品加水溶解，进样质谱为100ng，仪器为Thermo ScientificTM QExactiveTM HF液质联用质谱，HCD碎裂模式，一级扫描误差为300-2000m/z，二级碎裂能量为45％。序列覆盖采用Mascot搜库，一级质量误差20ppm，二级质量误差为10ppm。精确分子量采用Thermo Xcalibur 2.1软件对质谱谱图去卷积处理，得到精确分子量。
[Pyr1]-apelin-13的精确分子量为1532.8034，实施例7样品[Pyr1]-apelin-13经软件去卷积后得到样品精确分子量结果如图1所示，精确分子量为1532.8026。
[Pyr1]-apelin-13的氨基酸序列为RPRLSHKGPMPE，序列覆盖率采用Mascot搜库，搜库结果为：RPRLSHKGPMPE，结果显示100％覆盖。实施例7的Pyr1-apelin-13的肽段质谱二级碎裂结果如图2所示，质谱谱图二级串联b/y离子匹配信息及得分如图3所示。
通过上述精确分子量测定及序列覆盖率测定结果分析确定实施例7所合成的[Pyr1]-apelin-13具有正确的结构。
通过LC-20A岛津高效液相色谱仪，测定实施例7的Pyr1-apelin-13的纯度，测试条件：色谱柱为C18*250*4.6mm*5um，检测波长为214nm，进样量为20ul(1mg待测样品溶解于1ml水中)，流速为1ml/min，流动相采用乙腈和磷酸二氢钠溶液。测定结果如图4所示。

Claims (7)

1.一种[Pyr1]-apelin-13的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，将苯丙氨酸树脂作为起始原料，置入反应瓶中进行溶胀处理；
步骤(2)，向所述反应瓶中，加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc-Pro-OH、偶联剂和DMF的混合溶液，进行偶联反应，反应完成后脱去保护基团Fmoc；
步骤(3)，作为带有保护基团的原料氨基酸依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH以及Boc-Pyr-OH，依次进行所述步骤(2)，在Boc-Pyr-OH偶联完成后无需脱除保护基团Boc，从而得到带有保护基的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂；
步骤(4)，将由步骤(3)得到的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂进行裂解反应，除去树脂、侧链保护基以及保护基团Boc，得到[Pyr1]-apelin-13粗肽；
步骤(5)，将所得的粗肽进行纯化，得到[Pyr1]-apelin-13。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述偶联剂为由1-羟基苯并三唑与选自N,N’-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯及二环己基碳二亚胺中的任一种构成的试剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述偶联剂为1-羟基苯并三唑与N,N’-二异丙基碳二亚胺。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述苯丙氨酸树脂为载有苯丙氨酸的氯甲基树脂，取代度为0.6～0.9mmol/g。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
在脱保护反应中，用于脱去保护基团Fmoc的脱保护试剂为DBLK，即哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比1：4的混合溶剂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
在裂解反应中，作为裂解剂，使用由三氟乙酸、三异丙基硅烷、二硫代苏糖醇、甲基苯基硫醚以及水构成的混合试剂，且，混合试剂中各组分的重量百分含量为：
三氟乙酸：86～96％，
三异丙基硅烷：1～5％，
二硫代苏糖醇：1～5％，
甲基苯基硫醚：0～5％，以及
水：0～5％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
三氟乙酸：三异丙基硅烷：二硫代苏糖醇：甲基苯基硫醚：水＝94:2:2:1:1。
CN201811530632.3A 2018-12-14 2018-12-14 [Pyr1]-apelin-13的制备方法 Active CN109575117B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811530632.3A CN109575117B (zh) 2018-12-14 2018-12-14 [Pyr1]-apelin-13的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811530632.3A CN109575117B (zh) 2018-12-14 2018-12-14 [Pyr1]-apelin-13的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109575117A true CN109575117A (zh) 2019-04-05
CN109575117B CN109575117B (zh) 2021-09-21

Family

ID=65929590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811530632.3A Active CN109575117B (zh) 2018-12-14 2018-12-14 [Pyr1]-apelin-13的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109575117B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283228A (zh) * 1997-12-24 2001-02-07 武田药品工业株式会社 多肽、其生产方法及应用
CN103951744A (zh) * 2014-03-20 2014-07-30 海南双成药业股份有限公司 一种固相树脂及其制备方法和用途
CN107056927A (zh) * 2017-01-16 2017-08-18 四川吉晟生物医药有限公司 一种利拉鲁肽的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283228A (zh) * 1997-12-24 2001-02-07 武田药品工业株式会社 多肽、其生产方法及应用
CN103951744A (zh) * 2014-03-20 2014-07-30 海南双成药业股份有限公司 一种固相树脂及其制备方法和用途
CN107056927A (zh) * 2017-01-16 2017-08-18 四川吉晟生物医药有限公司 一种利拉鲁肽的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109575117B (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3266792B1 (en) Peptide synthesis method
CN104650219B (zh) 片段缩合制备利拉鲁肽的方法
EP0929567A1 (en) Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
CN107573408B (zh) 一种高纯度亮丙瑞林的合成方法
CA2673229A1 (en) Methods for the synthesis of cyclic peptides
Folkers et al. Design and synthesis of effective antagonists of substance P
WO2021070202A1 (en) A method for preparing glp-1 analogue by solid-phase peptide synthesis
EP3414257B1 (en) Method for preparation of liraglutide using bal linker
CN103980357B (zh) 一种合成胸腺法新的方法
Nilsson et al. Synthesis and purification of amyloidogenic peptides
US20220033440A1 (en) An improved process for the preparation of plecanatide
CN104211801A (zh) 一种制备利西拉来的方法
EP0953577A1 (en) Procedure for obtaining the somatostatin analog, octreotide
Žáková et al. The use of Fmoc‐Lys (Pac)‐OH and penicillin G acylase in the preparation of novel semisynthetic insulin analogs
CN109575117A (zh) [Pyr1]-apelin-13的制备方法
CN103965297A (zh) 一种多肽、其制备方法和应用
NO148332B (no) Fremgangsmaate ved fremstilling av et peptid.
EP3398959B1 (en) Method for preparing lixisenatide
CN102875639A (zh) 一种肽的固相合成方法及其合成的肽
CN104447979B (zh) 一种制备奈西利肽的方法
US20230044268A1 (en) An improved process for preparation of liraglutide
US11419919B1 (en) High-purity adrenocorticotropic hormone, analogue and a large-scale preparation method thereof
CN105273077B (zh) 一种制备普兰林肽的方法
CN114324669B (zh) 一种鲑鱼促性腺激素释放激素类似物中l-精氨酸残留量的柱前手性衍生测定方法
Sabatier Chemical synthesis and characterization of small proteins: example of scorpion toxins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant