CN109575117A - [Pyr1]-apelin-13的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及[Pyr1]‑apelin‑13的制备方法，包括：步骤(1)，将苯丙氨酸树脂置入反应瓶中溶胀处理；步骤(2)，向该反应瓶中加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc‑Pro‑OH、偶联剂和DMF的混合溶液进行偶联反应，之后脱保护脱去保护基团Fmoc；步骤(3)，依次使用Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑His(Trt)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH以及Boc‑Pyr‑OH分别进行步骤(2)，在Boc‑Pyr‑OH偶联完成后不脱除Boc，得到带有侧链保护基的[Pyr1]‑apelin‑13保护肽树脂；步骤(4)，裂解得到[Pyr1]‑apelin‑13粗肽；步骤(5)，纯化得到[Pyr1]‑apelin‑13。该制备方法安全、环保，收率高，纯度高。

Description

[Pyr1]-apelin-13的制备方法
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，涉及一种[Pyr1]-apelin-13的制备方法。
背景技术
Apelin(爱帕琳肽)是Tatemoto等人于1998年首次通过反向药理学方法从牛胃的分泌物中提取并纯化的内源性APJ天然配体，是一种新发现的具有重要生物学作用的心血管活性多肽，与血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)具有31％同源性，属于肾素一血管紧张素系统(reunin-angiotensis system，RAS)新的组分，具有扩张血管、正性肌力、减少抗利尿激素释放、降低血压、调节垂体激素释放、调整生物节律和抑制人类免疫缺陷病毒侵入等多种生物学效应。
Apelin表示具有77个残基的前蛋白，其被加工为apelin肽的生物活性形式，诸如apelin-36(三十六肽)、apelin-17(十七肽)、apelin-16(十六肽)、apelin-13(十三肽)、apelin-12(十二肽)。全长成熟肽也称为“apelin-36”，包含36个氨基酸。Apelin-36具有较强的抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)入侵的能力，而其他亚型则在心血管活动的调节中具有更强的效应。但近来的观点认为apelin-36是一个仅有少许生物学活性的前体，起作用时被水解及翻译后修饰成活性更高的成熟多肽，且主要为焦谷氨酸型Apelin-13，即(Pyr1)apelin-13，其也被称为“Pyr-1-apelin-13”或“[Pyr1]-apelin-13”。
[Pyr1]-apelin-13由13个氨基酸组成，其分子结构如下：
[Pyr1]-apelin-13氨基酸序列为：H-Pyr1-Arg2-Pro3-Arg4-Leu5-Ser6-His7-Lys8-Gly9-Pro10-Met11-Pro12-Phe13-OH
[Pyr1]-apelin-13为13肽化合物，多肽药物的合成方法通常包括液相合成和固相合成，固相合成方法是比较常用的多肽合成方法。现有文献对于[Pyr1]-apelin-13的合成制备方法的报道仅在专利CN1283228A中有简略描述。
专利CN1283228A采用Boc保护的氨基酸进行固相合成，偶联试剂采用NMP-HOBt，裂解过程中使用氟化氢(HF)，然后用乙醚沉淀，所述方法在用Boc保护的氨基酸偶联脱Boc过程中需要用酸，导致树脂肽裂解，并且用到强腐蚀性的剧毒试剂氟化氢(HF)，收率也较低，制备规模只有毫克级。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的[Pyr1]-apelin-13的制备方法，该方法不使用对环境污染影响大的乙二硫醇(EDT)，并且不使用毒性大且易燃的危险化学品乙醚和剧毒试剂氟化氢，制备方法安全、环保，收率高，纯度高，低成本，且更适合于工业放大生产，且所得[Pyr1]-apelin-13的纯度为98.5％以上。
用于解决技术课题的技术手段
本发明的[Pyr1]-apelin-13的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将苯丙氨酸树脂作为起始原料，置入反应瓶中进行溶胀处理；
步骤(2)，向所述反应瓶中加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc-Pro-OH、偶联剂和DMF的混合溶液进行偶联反应，反应完成后进行脱保护，脱去保护基团Fmoc；
步骤(3)，作为带有保护基团的原料氨基酸依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH以及Boc-Pyr-OH，依次进行所述步骤(2)，在Boc-Pyr-OH偶联完成后无需脱除保护基团Boc，从而得到带有侧链保护基的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂；
步骤(4)，将由步骤(3)得到的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂进行裂解脱保护反应，除去树脂、侧链保护基以及保护基团Boc，得到[Pyr1]-apelin-13粗肽；
步骤(5)，将所得的粗肽进行纯化，得到[Pyr1]-apelin-13。
在本发明的方法中，优选所述偶联剂为由1-羟基苯并三唑与选自N,N’-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯及二环己基碳二亚胺中的任一种构成的试剂。更优选所述偶联剂为1-羟基苯并三唑与N,N’-二异丙基碳二亚胺。
在本发明的方法中，优选所述苯丙氨酸树脂为载有苯丙氨酸的氯甲基树脂，取代度为0.6～0.9mmol/g。
在脱保护反应中，用于脱去保护基团Fmoc的脱保护试剂优选为DBLK，即哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比1：4的混合溶剂。
在裂解反应中，作为裂解剂，优选使用由三氟乙酸、三异丙基硅烷、二硫代苏糖醇、甲基苯基硫醚以及水构成的混合试剂，且，混合试剂中各组分的重量百分含量为：三氟乙酸：86～96％，三异丙基硅烷：1～5％，二硫代苏糖醇：1～5％，甲基苯基硫醚：0～5％，以及水：0～5％。更优选三氟乙酸：三异丙基硅烷：二硫代苏糖醇：甲基苯基硫醚：水＝94:2:2:1:1。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明针对传统的[Pyr1]-apelin-13的合成方法进行了改进，不使用对环境污染影响大的乙二硫醇(EDT)，并且不使用毒性大且易燃的危险化学品乙醚以及剧毒试剂氟化氢，制备方法安全、环保，收率高，纯度高，低成本，且更适合于工业放大生产，所得[Pyr1]-apelin-13纯度为98％以上。
附图说明
图1表示实施例7的Pyr1-apelin-13的精确分子量图谱。
图2表示实施例7的Pyr1-apelin-13的肽段质谱二级碎裂结果。
图3表示实施例7的Pyr1-apelin-13的质谱谱图二级串联b/y离子匹配信息及得分。
图4表示实施例7的Pyr1-apelin-13的HPLC图谱。
具体实施方式
以下，针对本发明进行详细说明，为了便于说明，本说明书中针对一些技术术语采用缩写方式记载，具体如表1所示。
表1：
[Pyr1]-apelin-13肽链从N端到C端的氨基酸顺序编号序列如下：H-Pyr1-Arg2-Pro3-Arg4-Leu5-Ser6-His7-Lys8-Gly9-Pro10-Met11-Pro12-Phe13-OH。本发明的制备方法中，将13号苯丙氨酸作为起始物氨基酸树脂，按照[Pyr1]-apelin-13肽链的从C端至N端的氨基酸顺序逐一偶联形成。具体方法如下所述。
步骤(1)
将苯丙氨酸树脂作为起始原料，置入反应瓶中进行溶胀处理。该苯丙氨酸树脂为载有苯丙氨酸的氯甲基树脂(2-CTC树脂)，取代度优选为0.6～0.9mmol/g。所述“取代度优选为0.6～0.9mmol/g”是指优选每克氯甲基树脂载有0.6～0.9mmol苯丙氨酸。
步骤(2)
向上述反应瓶中加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc-Pro-OH(12号脯氨酸)、偶联剂和DMF的混合溶液，进行偶联反应，反应完成后进行脱保护，脱去保护基团Fmoc；
通过该步骤得到2肽树脂，即带有脯氨酸的苯丙氨酸树脂。
步骤(3)
作为带有保护基团的原料氨基酸依次使用Fmoc-Met-OH(11号蛋氨酸)、Fmoc-Pro-OH(10号脯氨酸)、Fmoc-Gly-OH(9号甘氨酸)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(8号赖氨酸)、Fmoc-His(Trt)-OH(7号组氨酸)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(6号丝氨酸)、Fmoc-Leu-OH(5号亮氨酸)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4号精氨酸)、Fmoc-Pro-OH(3号脯氨酸)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2号精氨酸)以及Boc-Pyr-OH(1号焦谷氨酸)，依次进行上述步骤(2)，从而通过逐一偶联从上述2肽树脂的N端依次引入11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸。在Boc-Pyr-OH偶联完成后无需脱除保护基团Boc，从而得到带有保护基的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂；
在上述步骤(2)及步骤(3)的偶联过程中使用偶联剂为HOBt/DIC、HOBt/HBTU、HOBt/TBTU、HOBt/DCC混合试剂中的一种，进一步优选为HOBt/DIC，HOBt、DIC和原料氨基酸保持相等摩尔数，且每个原料氨基酸的用量优选为苯丙氨酸树脂摩尔数的1～5倍，更优选3～4倍。每次偶联反应时间优选为60～120分钟。
在步骤(2)及步骤(3)的氨基酸逐一偶联过程中，脱氨基酸Fmoc保护的试剂为DBLK(哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1：4)，每次脱保护所用的试剂用量为每克树脂6～20ml，更优选8～10ml。每次脱保护时间为5～30分钟，更优选10～20分钟。
步骤(4)
将由步骤(3)得到的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂进行裂解反应，除去树脂、侧链保护基以及保护基团Boc，得到[Pyr1]-apelin-13粗肽。
上述裂解试剂为由三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、二硫代苏糖醇(DTT)、甲基苯基硫醚(PhSMe)、水构成的混合试剂，各组分的重量百分含量为TFA：86～96％，TIS：1～5％，DTT：1～5％，PhSMe：0～5％，H2O：0～5％；优选裂解试剂中各组分的重量比为TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝94:2:2:1:1，裂解时间优选2-4小时。
步骤(5)
将由步骤(4)得到的粗肽进行纯化，得到最终产品[Pyr1]-apelin-13。
本发明中纯化可以采用本技术领域的常规纯化方法，如HPLC纯化方法。
通过本发明的方法合成的[Pyr1]-apelin-13粗肽纯度介于70-85％，经HPLC纯化后，[Pyr1]-apelin-13的纯度可达到98％以上。
通过上述本发明的方法，以60g(42.9mmol)苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)为原料，能够获得33.5g的[Pyr1]-apelin-13，相当于0.5mmol苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)能够获得390mg的[Pyr1]-apelin-13，而按现有技术CN1283228A的方法，只能制得28mg产品，由此表明，本发明的制备方法大幅地提高了产品收率。
此外，本发明还具有以下优点：(1)步骤(4)中采用的裂解剂为对环境友好的试剂DTT，替代目前常用方法中毒性及对环境污染影响大的乙二硫醇(EDT)，并且所得粗品纯度，收率都较高；裂解完后析晶溶剂为甲基叔丁基醚替代了现有方法中的乙醚，避免毒性大且易燃的危险化学品乙醚的使用，制备方法安全、环保，纯度高。(2)目前报道的Pyr-apelin-13的制备方法的规模比较小，而本发明的制备方法的合成规模大，更适合于产业化。
以下，通过具体实施例对本发明的制备方法进行说明，其旨在用于说明本发明，并不能解释成是针对本发明的技术方案的限定。
本发明所用试剂如表2所示。
表2
试剂 生产厂家 规格
H-Phe-2-CTC-Resin 吉尔生化 100～200mesh
Fmoc-Pro-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Met-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Gly-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Lys(Boc)-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-His(Trt)-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Ser(tBu)-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Leu-OH 吉尔生化 ≥99％
Fmoc-Arg(Pbf)-OH 吉尔生化 ≥99％
Boc-Pyr-OH 吉尔生化 ≥99％
HOBt 苏州昊帆生物 ≥99％
DIC 苏州昊帆生物 ≥99％
哌啶 国药 AR
三氟乙酸 国药 AR
甲基叔丁基醚 国药 AR
二氯甲烷 国药 AR
实施例1([Pyr1]-apelin-13保护肽树脂制备)
将60g取代度为0.90mmol/g的苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)加入到2L多肽合成反应瓶中，加入DMF 480mL溶胀树脂30分钟，排掉溶剂。取另一个1L反应容器，加入Fmoc-Pro-OH 65g、DMF 480mL搅拌并降温至-5～5℃，加入HOBt 29.2g及DIC 24g，保持温度-5～5℃进行活化反应1小时。将所得的混合液加入到上述反应瓶内，室温搅拌使其与溶胀好的树脂反应1～2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。滤掉反应液，用DMF以480mL/次洗涤三次。加入DBLK 480mL脱保护反应15分钟，滤掉溶剂，并用DMF 480mL/次洗涤6次，得到2肽树脂。
依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、BOC-Pyr-OH，重复上述活化、缩合反应，从而从所得2肽树脂的N端依次引入剩余氨基酸，即11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸，最后一个BOC-Pyr-OH连接完后无需脱保护，树脂用DMF 480mL/次洗涤三次，DCM 480mL/次洗涤三次。后于45℃真空干燥12小时得[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂171g。
实施例2([Pyr1]-apelin-13保护肽树脂制备)
将60g取代度为0.73mmol/g的苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)加入到2L多肽合成反应瓶中，加入DMF 480mL溶胀树脂30分钟，排掉溶剂。取另一个1L反应容器，加入Fmoc-Pro-OH 59.1g、DMF 480ml搅拌并降温至-5～5℃，加入HOBt 23.6g及DIC 22.0g，保持温度-5～5℃活化反应1小时。将所得的混合液加入到上述反应瓶中，室温搅拌使其与溶胀好的树脂反应1～2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。滤掉反应液，用DMF以480mL/次洗涤三次。加入DBLK 480mL脱保护反应15分钟，滤掉溶剂，并用DMF以480mL/次洗涤6次，得到2肽树脂。
依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、BOC-Pyr-OH，重复上述活化、缩合反应，从而从所得2肽树脂的N端依次引入剩余氨基酸，即11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸。最后一个BOC-Pyr-OH连接完后无需脱保护，树脂用DMF 480mL/次洗涤三次，DCM 480mL/次洗涤三次。后于45℃真空干燥12小时得到[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂165g。
实施例3([Pyr1]-apelin-13保护肽树脂制备)
将60g取代度为0.62mmol/g的苯丙氨酸树脂(H-Phe-2-CTC-resin)加入到2L多肽合成反应瓶中，加入DMF 480mL溶胀树脂30分钟，排掉溶剂。取另一个1L反应容器，加入Fmoc-Pro-OH 50.2g、DMF 480mL搅拌并降温至-5～5℃，加入HOBt 20.1g及DIC 18.7g，保持温度-5～5℃活化反应1小时。将所得的混合溶液加入到上述反应瓶中，室温搅拌使其与溶胀好的树脂反应1～2小时，反应终点以茚三酮法检测为准。滤掉反应液，用DMF以480mL/次洗涤三次。加入DBLK 480mL脱保护反应15分钟，滤掉溶剂，并用DMF以480mL/次洗涤6次，得到2肽树脂。
依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、BOC-Pyr-OH，重复上述活化、缩合反应，从而从所得2肽树脂的N端依次引入剩余氨基酸，即11号蛋氨酸、10号脯氨酸、9号甘氨酸、8号赖氨酸、7号组氨酸、6号丝氨酸、5号亮氨酸、4号精氨酸、3号脯氨酸、2号精氨酸、1号焦谷氨酸。最后一个BOC-Pyr-OH连接完后无需脱保护，树脂用DMF 480mL/次洗涤三次，DCM 480mL/次洗涤三次。后于45℃真空干燥12小时得到[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂147g。
实施例4([Pyr1]-apelin-13的制备)
在3L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝94:2:2:1:1的混合酸解液1.7L，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例1得到的Pyr1-apelin-13保护肽树脂171g，自然升温至室温并反应3小时。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 170mL洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚6L的10L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚2L/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体83g，纯度83％，经HPLC纯化得到33.5g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.7％，总收率40.4％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)
实施例5([Pyr1]-apelin-13的制备)
在1L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝89:2:3:3:3的混合酸解液300mL，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例2得到的Pyr1-apelin-13保护肽树脂30g，自然升温至室温反应2.5小时。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 60mL洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚900mL的2L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚300mL/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体12.5g，纯度78％，经HPLC纯化得到4.5g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.5％，总收率37.5％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)。
实施例6([Pyr1]-apelin-13的制备)
在1L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：PhSMe：H2O＝92:3:3:1:1的混合酸解液300mL，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例2得到的Pyr1-apelin-13保护肽树脂30g，自然升温至室温反应2h。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 60mL洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚900mL的2L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚300mL/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体12.1g，纯度76％，经HPLC纯化得到4.3g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.6％，总收率35.8％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)。
实施例7(Pyr1-apelin-13的制备)
在1L反应瓶中在氮气保护下加入TFA：TIS：DTT：H2O＝92:3:3:2的混合酸解液300mL，搅拌并降温至0～10℃，加入通过实施例2得到的Pyr-apelin-13保护肽树脂30g，自然升温至室温反应3小时。过滤除去裂解下来的树脂后，再用TFA 60ml洗涤一次，合并滤液。将滤液滴加入装有甲基叔丁基醚900mL的2L反应瓶中，滴加过程控温0～10℃，滴完后升至室温搅拌1小时，抽滤并用甲基叔丁基醚300mL/次洗涤两次，所得固体于25℃、真空干燥12小时，得到白色固体12.7g，纯度73％，经HPLC纯化得到4.1g[Pyr1]-apelin-13，纯度98.7％，总收率34.1％(以起始物料苯丙氨酸树脂计)。
精确分子量测定及序列覆盖率测定：
取实施例7所得样品加水溶解，进样质谱为100ng，仪器为Thermo ScientificTM QExactiveTM HF液质联用质谱，HCD碎裂模式，一级扫描误差为300-2000m/z，二级碎裂能量为45％。序列覆盖采用Mascot搜库，一级质量误差20ppm，二级质量误差为10ppm。精确分子量采用Thermo Xcalibur 2.1软件对质谱谱图去卷积处理，得到精确分子量。
[Pyr1]-apelin-13的精确分子量为1532.8034，实施例7样品[Pyr1]-apelin-13经软件去卷积后得到样品精确分子量结果如图1所示，精确分子量为1532.8026。
[Pyr1]-apelin-13的氨基酸序列为RPRLSHKGPMPE，序列覆盖率采用Mascot搜库，搜库结果为：RPRLSHKGPMPE，结果显示100％覆盖。实施例7的Pyr1-apelin-13的肽段质谱二级碎裂结果如图2所示，质谱谱图二级串联b/y离子匹配信息及得分如图3所示。
通过上述精确分子量测定及序列覆盖率测定结果分析确定实施例7所合成的[Pyr1]-apelin-13具有正确的结构。
通过LC-20A岛津高效液相色谱仪，测定实施例7的Pyr1-apelin-13的纯度，测试条件：色谱柱为C18*250*4.6mm*5um，检测波长为214nm，进样量为20ul(1mg待测样品溶解于1ml水中)，流速为1ml/min，流动相采用乙腈和磷酸二氢钠溶液。测定结果如图4所示。

Claims (7)

1.一种[Pyr1]-apelin-13的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，将苯丙氨酸树脂作为起始原料，置入反应瓶中进行溶胀处理；
步骤(2)，向所述反应瓶中，加入包含带有保护基团的原料氨基酸Fmoc-Pro-OH、偶联剂和DMF的混合溶液，进行偶联反应，反应完成后脱去保护基团Fmoc；
步骤(3)，作为带有保护基团的原料氨基酸依次使用Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH以及Boc-Pyr-OH，依次进行所述步骤(2)，在Boc-Pyr-OH偶联完成后无需脱除保护基团Boc，从而得到带有保护基的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂；
步骤(4)，将由步骤(3)得到的[Pyr1]-apelin-13保护肽树脂进行裂解反应，除去树脂、侧链保护基以及保护基团Boc，得到[Pyr1]-apelin-13粗肽；
步骤(5)，将所得的粗肽进行纯化，得到[Pyr1]-apelin-13。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述偶联剂为由1-羟基苯并三唑与选自N,N’-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯及二环己基碳二亚胺中的任一种构成的试剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述偶联剂为1-羟基苯并三唑与N,N’-二异丙基碳二亚胺。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述苯丙氨酸树脂为载有苯丙氨酸的氯甲基树脂，取代度为0.6～0.9mmol/g。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
在脱保护反应中，用于脱去保护基团Fmoc的脱保护试剂为DBLK，即哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比1：4的混合溶剂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
在裂解反应中，作为裂解剂，使用由三氟乙酸、三异丙基硅烷、二硫代苏糖醇、甲基苯基硫醚以及水构成的混合试剂，且，混合试剂中各组分的重量百分含量为：
三氟乙酸：86～96％，
三异丙基硅烷：1～5％，
二硫代苏糖醇：1～5％，
甲基苯基硫醚：0～5％，以及
水：0～5％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
三氟乙酸：三异丙基硅烷：二硫代苏糖醇：甲基苯基硫醚：水＝94:2:2:1:1。
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