CN109563475A - 改善水溶液中组分溶解行为的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改善水溶液中组分溶解度或溶解行为的方法。通过产生缓慢/不良溶解组分与具有负溶解焓的另一种组分的混合颗粒，可正面影响缓慢/不良溶解组分的溶解性质。在不改变化学组成的情况下，溶解度通过制备和加入这种混合颗粒而改善。

Description

改善水溶液中组分溶解行为的方法
本发明涉及改善水溶液中组分溶解度或溶解行为的方法。通过产生缓慢/不良溶解组分与具有负溶解焓的另一种组分的混合颗粒，可正面影响缓慢/不良溶解组分的溶解性质。在不改变化学组成的情况下，溶解度通过制备和加入这种混合颗粒而改善。
发明背景
在制备应容易且充分可溶于水溶液的组分的干燥粉末混合物或其它干燥混合物时，经常面对如下的问题：某些组分不充分溶解，或者只能在与其余组分所需混合时间相比的长时间混合后溶解。关于这些干燥混合物的实例为干燥粉末细胞培养基、营养组合物(例如，泡腾片剂)、用于制备能量饮料的干燥混合物、输注用溶液等。
那些干燥混合物可以为干燥粉末、压实、固体形式或任何类型的片剂的形式。混合物典型地包含数种不同成分，如糖类组分、氨基酸、维生素或维生素前体、盐、缓冲剂组分、辅助因子和/或核酸组分。
这种复杂干燥混合物的一个实例为细胞培养基。
水溶液中的细胞培养基可提供支持和保持细胞生长和/或保持有利于靶向生产某些产品的所需生理学细胞条件的环境。
根据其生长和/或靶向的生理学状态应得到支持的生物体的类型，细胞培养基包括组分(有时多于一百种不同组分)的复杂混合物。
哺乳动物、昆虫或植物细胞的繁殖所需的细胞培养基一般比支持细菌、酵母或真菌的生长的培养基复杂得多。
研发的第一种细胞培养基由不明确的组分组成，如血浆、血清、胚胎提取物或其它不明确的生物提取物或蛋白胨。因此，伴随化学成分明确的培养基的研发，取得重大进步。化学成分明确的培养基通常包括、但并非排他地限于氨基酸、维生素、金属盐、抗氧化剂、螯合剂、生长因子、缓冲剂、激素和本领域的那些专家已知的更多物质。
一些细胞培养基作为无菌水性液体提供。液体细胞培养基的缺点是它们缩短的保存期限以及运输和储存困难。因此，很多细胞培养基目前作为精细研磨干燥粉末混合物提供。制造它们是为了溶于水和/或水溶液和溶于设计的溶解态(经常利用其它补充剂)，用于为细胞提供丰富的营养基础用于生长和/或从相同的所述细胞生产生物药物。
大多数生物药物生产平台基于补料分批细胞培养规程。目标一般是研发高效价的细胞培养方法，以满足日益增长的市场需求和降低制造成本。除了使用高性能重组细胞系外，还需要改善细胞培养基和过程参数，以实现最大的生产潜力。
在补料分批方法中，基础培养基支持初始生长和生产，而补料培养基(feedmedium)防止营养物的耗尽，并维持生产阶段。选择培养基以适应不同生产阶段内的不同代谢需求。过程参数设置——包括补料策略和控制参数——限定适用于细胞生长和蛋白产生的化学和物理环境。
在补料分批方法的优化中，补料培养基的优化是主要方面。
补料培养基大多高度浓缩，以避免生物反应器的稀释。营养物的受控加入直接影响培养物的生长速率。
Invitrogen公司的US 6,383,810 B2公开了制备附聚真核细胞培养基粉末的方法。该方法包括用溶剂湿润干燥粉末细胞培养基，然后使润湿的培养基重新干燥，以得到具有潜在改善的溶解度的干燥附聚细胞培养基。
这种程序的大的缺点是以下事实：所有培养基组分需要与水接触，且它们需要随后加热去除水。这可导致组成变化，因为水含量可能变化。另外，它可能导致培养基组分之间相当多的副反应，或者敏感组分的破裂或改变，且对培养基品质有不可预料的后果。
然而，从干燥粉末制备细胞培养基的限制因素是一些组分如氨基酸的不良溶解度。也见Salazar A, Keusgen M, Hagen J Von. Amino acids in the cultivation ofmammalian cells(哺乳动物细胞培养中的氨基酸). Amino Acids. 2016;48(5):1161-1171. doi:10.1007/s00726-016-2181-8。因此，将有利的是找到一种方式，以改善细胞培养基中此类化合物的溶解度，而不消极影响其它组分，也不改变培养基的组成。这也适用于通过将干燥组分混合物溶于水溶液中而制备的其它干燥混合物，如用于人或动物的营养混合物。
发明简述
已发现，可通过产生混合颗粒改善化合物的溶解度，该混合颗粒包含与溶解焓为负的至少一种组分紧密接近的、溶解度应被改善的组分。可通过如喷雾干燥或共冻干的方法制备那些混合颗粒，然后可与其它组分混合，以产生最终干燥混合物。已发现，在所述混合物溶于水性溶剂时，不良溶解组分的溶解度改善。大概这是由于以下事实：由具有负溶解焓的组分释放的能量可至少部分转移到不良溶解组分，不良溶解组分由于混合颗粒而紧密接近具有负溶解焓的组分。在不改变细胞培养基的化学组成，也不应用其它外部手段如加热、超声或更剧烈的搅拌的情况下，取得这种溶解度改善。已发现，本发明方法尤其适合于通过制备具有负溶解焓的至少一种氨基酸和具有正溶解焓的至少一种氨基酸的混合颗粒，来改善氨基酸的溶解度。
因此，本发明涉及改善具有特定组成的干燥混合物的溶解度的方法，其通过如下进行：
a)确定所述干燥混合物中的一种或多种不良溶解组分
b)制备包含至少一种不良溶解组分和一种具有负溶解焓的组分的混合颗粒，由此所述具有负溶解焓的组分也选自在干燥混合物的特定组成中存在的组分
c)通过使在步骤b)中产生的一种或多种混合颗粒与干燥混合物的其它组分混合，制备所述干燥混合物。
优选在步骤c)中与混合颗粒混合的其它组分以单一组分的颗粒形式存在，而不以通过喷雾干燥、湿制粒、共冻干或涉及溶解和重新干燥所有或大部分组分的其它技术制备的组分混合物形式存在。例外情况是，在应改善多于一种不良溶解组分的溶解度的情况下，存在根据本发明的第二类型混合颗粒。优选大于70%(w/w)的混合物组分以单一组分颗粒的形式存在。
在一个优选的实施方案中，一种或多种不良溶解组分为在25℃包含大于100g/l溶解组分的水溶液中具有小于20g的溶解度的化合物。优选不良溶解组分为具有正溶解焓的组分。
在一个优选的实施方案中，一种或多种具有负溶解焓的组分选自以下组：
- 脯氨酸
- 氯化钙，无水
- 硫酸镁，无水
- 氧化钙，无水
- 氢氧化钠
- 氢氧化钾
或其混合物。
最优选的具有负溶解焓的组分为脯氨酸。
在一个优选的实施方案中，一种或多种不良溶解组分选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。
在另一个优选的实施方案中，在步骤b)中通过喷雾干燥、冻干或湿制粒进行混合颗粒的制备。
在一个最优选的实施方案中，在步骤b)中通过喷雾干燥进行混合颗粒的制备。
很优选在步骤b)中产生的混合颗粒不含大于10%(w/w)的非不良溶解或没有负溶解焓的组分。这意味着优选90%或更多(w/w)的混合颗粒由一种或多种不良溶解组分和一种或多种具有负溶解焓的组分组成。
很优选在步骤b)中产生的混合颗粒只包含氨基酸。
在一个优选的实施方案中，干燥混合物为干燥粉末细胞培养基。
在一个优选的实施方案中，混合颗粒的组成使得由溶解混合颗粒产生的负溶解焓的总量是由溶解在混合颗粒中存在的不良溶解组分产生的正溶解焓的量的双倍或更多。
在一个优选的实施方案中，在步骤b)中制备的混合颗粒包含与一种或多种选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的组分组合的脯氨酸。
本发明还涉及包含一种或多种混合颗粒的干燥混合物，该混合颗粒包含至少一种不良溶于水的组分和至少一种具有负溶解焓的组分。优选混合颗粒只包含一种不良溶于水的组分和一种具有负溶解焓的组分。
在一个优选的实施方案中，干燥混合物为干燥粉末细胞培养基。
在另一个优选的实施方案中，干燥混合物包含混合颗粒，该混合颗粒包含与一种或多种选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的组分组合的脯氨酸。
发明描述
图1显示校正L-脯氨酸初始基线斜率后，相对温度作为时间的函数。数值表示平均数(n=2)。
图2：校正L-亮氨酸初始基线斜率后，相对温度作为时间的函数。数值表示平均数(n=2)。
图3：校正以比率2:1混合的L-脯氨酸和L-亮氨酸粉末的初始基线斜率后，相对温度作为时间的函数。数值表示平均数(n=3)。
图4：校正比率2:1的经喷雾干燥L-脯氨酸和L-亮氨酸粉末的初始基线斜率后，相对温度作为时间的函数。数值表示平均数(n=3)。
关于附图的更多细节可见于实施例3中。
根据本发明的干燥混合物为组分的任何混合物，其包含两种或更多种选自以下的一组或多组的组分：糖类组分、氨基酸、维生素或维生素前体、盐、缓冲剂组分、辅助因子和/或核酸组分。根据本发明的干燥混合物是意欲在水溶液中完全溶解的干燥混合物。水溶液为水或任何水溶液，如缓冲剂。水溶液可包含最高达20%水溶性有机溶剂，如乙醇。但优选溶剂为水或水性缓冲剂，且不含任何有机溶剂。
一般组分的干燥混合物为干燥粉末形式、干燥粉末的任何压实形式或片剂形式。
术语“干燥粉末”可与术语“粉末”互换使用，然而，本文所用“干燥粉末”仅指粒状材料的大体外观，且不旨在意指该材料完全不含复合或附聚溶剂，除非另外指明。
优选干燥混合物的所有组分是干燥的。那意味着，如果它们含水，则仅包含结晶水，而包含不大于 5%、优选不大于 2%、最优选不大于1%重量的未结合或未配位的水分子。
粉末状细胞培养基可以为一般从研磨过程或冻干过程得到的细胞培养基。它也可以为粒状细胞培养基，例如，通过辊压实而干制粒。
根据本发明的干燥混合物可以为意欲制备液体细胞培养基或其它液体组合物(如营养物/维生素饮料、等渗饮料、用于输注的溶液等)的组分的任何混合物，营养混合物的实例可见于US2008/0254119。优选干燥混合物为干燥粉末细胞培养基。
混合颗粒为包含至少一种不良溶解组分和一种具有负溶解焓的组分的颗粒，由此使混合颗粒的所有组分尽可能充分和均匀地混合及在颗粒内分布，以增大不良溶解组分和具有负溶解焓的组分之间的相互作用界面。混合颗粒的大小与干燥混合物其它组分的粒径相当。典型的粒径低于200µm，优选低于100µm。优选粒径在15µm和100µm之间。混合颗粒中组分混合和掺合得越好，则越佳。可通过制备组分混合物颗粒的任何方法来制备混合颗粒。这可通过粉末混合物的干压实，或优选通过湿制粒、喷雾干燥或冻干，尤其优选喷雾干燥。
干压实一般以两个基本步骤进行。
a)提供组分的混合粉末形式的组分混合物
b)在辊压机中压实所述混合粉末。
在步骤a)中提供组分的精细研磨干燥粉末。充分混合所有组分，以便粉末混合物的所有部分具有几乎相同的组成。混合物作为商业干燥粉末细胞培养基应在组成均匀性方面具有相同品质。组成的均匀性越高，所得干燥粒状混合物的品质越佳。适用于产生精细研磨粉末的磨机为例如球磨机、销磨机、喷磨机或旋转叶片筛磨机。粉末的粒径一般低于500µm，优选低于200µm。
辊压机，也称为碾压机，为本领域技术人员已知。一般辊压机包括相互接近以约0.5至3mm、优选1至2mm的短距离定位的两个反向旋转辊。适合的辊压机一般具有10和50cm之间宽度的辊，从而在辊间产生具有10和50cm之间长度的间隙。然而，可根据辊压机的大小改变辊的大小，并因此改变辊间间隙的长度。在一个优选的实施方案中，间隙具有10和15cm之间的长度。
混合粉末材料在反向旋转辊之间引入，并在辊间的间隙中压实。辊间距离及其表面结构对所得粒状颗粒的最终大小和结构有影响。
根据本发明的冻干是通过冷冻该材料然后减小周围压力以使材料中的冻结水和任选其它挥发组分直接从固相升华到气相的冷冻干燥。
本文所用“共冻干的”或“共冻干物”指从在同一容器的溶液中冷干、冷冻干燥、低温干燥或真空干燥多于一种化合物得到的产品。例如，可在同一容器中组合两种溶液，将所得溶液的组合一起冻干，从而使溶液中的组分同时冻干。或者，可在同一液体中溶解两种或更多种化合物，随后一起冻干。此共冻干的所得产品为由固体材料组成的共冻干物，其包括已共冻干的所有不挥发组分的混合物。
如果是通过喷雾干燥产生混合颗粒，则产生要混合的所有组分的浓缩溶液，其以所需比率包含所述组分。将溶液泵送入喷雾干燥器的室，在此使其分散，并用热空气蒸发溶剂。从收集室收集缀合的材料，并可在不进一步处理下使用。
在湿制粒中，通过将制粒液体加到粉末床上形成组分的小粒或混合颗粒，所述粉末床在叶轮(在高剪切制粒机中)、螺杆(在双螺杆制粒机中)或空气(流化床制粒机中)的影响下。在系统中产生的搅动连同组分在配制内的湿润导致初级粉末颗粒聚集，以产生湿小粒。制粒液体包含溶剂，溶剂必须为挥发性以便其可通过干燥去除，并且为非毒性。一般的液体包括单独或组合的水、乙醇和异丙醇。
根据本发明的细胞培养基为保持和/或支持细胞的体外生长和/或支持特定生理学状态的组分的任何混合物。它可以为复合培养基或化学成分明确的培养基。细胞培养基可包含保持和/或支持细胞体外生长必需的所有组分，或仅包含一些组分，因此单独加入另外的组分。根据本发明的细胞培养基的实例为包含保持和/或支持细胞体外生长必需的所有组分的全培养基、培养基补充剂或补料。在一个优选的实施方案中，细胞培养基为全培养基或补料。
一般用根据本发明的细胞培养基保持和/或支持生物反应器中细胞的生长和/或支持特定生理学状态。
哺乳动物细胞培养基为保持和/或支持哺乳动物细胞体外生长的组分的混合物。哺乳动物细胞的实例为人或动物细胞，优选CHO细胞、COS细胞、I VERO细胞、BHK细胞、AK-1细胞、SP2/0细胞、L5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。适合的细胞培养方法为例如补料分批方法或灌流细胞培养方法。
化学成分明确的细胞培养基为不包含任何化学成分不明确物质的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学物质的化学组成是已知的。化学成分明确的培养基不包含任何酵母、动物或植物组织，它们不包含饲养细胞(feed cell)、血清、提取物或消化物或可为培养基贡献化学成分不太明确的蛋白质的其它组分。化学成分不明确或不太明确的化学组分为其化学组成和结构未知、以变化的组成存在或者仅可用巨大实验努力来明确(与蛋白质(如白蛋白或酪蛋白)的化学组成和结构的评估相当)的那些组分。
粉末状细胞培养基为从研磨过程得到的细胞培养基。这意味着粉末状细胞培养基为干燥颗粒状培养基，而不是液体培养基。
要用根据本发明的培养基培养的细胞可以为原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如植物或动物细胞)。细胞可以为正常细胞、无限增殖化细胞、患病细胞、转化细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚细胞，其任何细胞可以为确立或转化的细胞系，或从天然源得到。
一般通过用惰性气体填充相应容器或装置来产生惰性气氛。适合的惰性气体为稀有气体如氩，或优选氮。这些惰性气体为非反应性，并防止发生不合需要的化学反应。根据本发明，产生惰性气氛意味着氧的浓度减小到10%(v/v)绝对值之下，例如，通过引入液氮或氮气。
不同类型的磨机为本领域技术人员已知。
销磨机，也称为离心冲击磨机，将固体磨碎，其中在高速旋转盘上的突出销提供破碎能。销磨机例如由Munson Machinery (美国)、Premium Pulman (印度)、HosokawaAlpine或Sturtevant (美国)销售。
喷磨机用压缩气体加速颗粒，使它们在处理室中相互冲击。喷磨机例如由Sturtevant (美国)、Hosokawa Alpine或PMT (奥地利)销售。
由Fitzpatrick (美国)商品化的菲茨磨机(fitz mill)用具有叶片的转子研磨。
细胞培养基一般包含至少一种或多种糖类组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲剂组分、一种或多种辅助因子和一种或多种核酸组分。
培养基也可包含丙酮酸钠、胰岛素、植物蛋白、脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/或pluronic酸和/或表面活性组分(如化学制备非离子表面活性剂)。适合的非离子表面活性剂的一个实例为以伯羟基为末端的双官能嵌段共聚物表面活性剂，也称为泊洛沙姆，例如以商品名pluronic ®从德国BASF可得到。此类物质为基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物(聚乙二醇(PEG)/聚丙二醇(PPG)嵌段共聚物)。要优选使用的泊洛沙姆，CAS编号9003-11-6，具有通式I
其中x和z优选独立为2至130，y优选为15至67。
市售可得的泊洛沙姆为例如Pluronics®或Lutrole®，例如Pluronic(R)溶液、凝胶或固体，如Pluronic(R) F-127)。或者，可根据在本领域已知的方法从原料制备泊洛沙姆(见例如美国专利号3,579,465和3,740,421)。
特别优选的为Poloxamer 188(有时称为Pluronic F 68)或Kolliphor P 188或Lutrol F 68。
糖类组分为所有单糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)。
根据本发明的氨基酸或氨基酸组分的实例为：蛋白原氨基酸，尤其是必需氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；及非蛋白原氨基酸，如D-氨基酸。另外的实例为脯氨酸和缬氨酸。
维生素的实例为维生素A(视黄醇、视黄醛、各种类视黄醇和四种类胡萝卜素)、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸、烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸、亚叶酸)、维生素B12(氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素E(生育酚、生育三烯酚)和维生素K(叶绿醌、甲萘醌)。也包括维生素前体。
盐的实例为包含无机离子的组分，如碳酸氢根、钙、氯离子、镁、磷酸根、钾和钠或微量元素(如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn)。实例为五水硫酸铜(II)(CuSO4 .5H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2 .2H2O)、氯化钾(KCl)、硫酸铁(II)、无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、六水氯化镁(MgCl2 .6H2O)、七水硫酸锌。
缓冲剂的实例为CO2/HCO3(碳酸盐)、磷酸盐、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。
辅助因子的实例为硫胺素衍生物、生物素、维生素C、NAD/NADP、钴胺素、黄素单核苷酸及衍生物、谷胱甘肽、磷酸血红素核苷酸及衍生物。
根据本发明的核酸组分为：核碱基，如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶；核苷，如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷；及核苷酸，如单磷酸腺苷或二磷酸腺苷或三磷酸腺苷。
对于所有提到的化合物，化合物名也包括任何盐、水合物、二聚物、三聚物或低聚物或对映异构体。例如，葡萄糖也表示一水葡萄糖，或者Hepes (4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸)也表示Hepes钠盐(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐)。
根据本发明的冷冻表示冷却到低于0℃的温度。
本发明的要旨是改善干燥组分混合物的不良溶解组分的溶解度，并因此改善具有特定组成的混合物的总溶解度。优选的混合物为细胞培养基。具有特定组成的粉末状细胞培养基可包含一种或数种在特定溶解条件下不溶于特定量水或需要特殊处理(如高温或长时间)来溶解的组分。改变细胞培养基的总体组成以减小不良溶解组分的量或由另一种组分代替它一般不合乎需要。
已发现，利用本发明的方法，粉末状细胞培养基和其它干燥混合物的溶解度在不改变它们化学组成的情况下可得到改善。
这通过在特定组成中确定一种或多种不良溶解且妨碍干燥粉末混合物易溶的组分进行。
细胞培养基领域的技术人员一般了解细胞培养基一般成分的溶解度，并可确定特定成分清单中的不良溶解组分。
通过检查特定组成的成分清单，并基于溶解度数据确定一种或多种具有最差溶解度的组分，也可进行确定。物质的溶解度一般已知，并可见于公众可利用的数据库或教科书，例如Chemiker-Kalender. 编者 Claudia Synowietz和Klaus Schäfer; 第3版, 第2次再版 1992; 第656页; 柏林、海德尔堡、纽约、东京；Springer 1984；ISBN 978-3-540-12652-2。
通过溶解特定干燥混合物，在不完全溶解的情况下分离不溶解颗粒，并分析它们(例如，通过NMR、质谱、元素分析、色谱法或其组合)，也可实验上进行确定。适合方法的实例为ICP-OES、UPLC(例如，用于氨基酸)、IC。从这一分析，得到关于不溶解颗粒化学组成的信息，并可因此确定不良溶解组分。
根据本发明的不良溶解组分为其在所述混合物组成中的溶解度应在特定溶解条件下改善的任何混合物组分。不良溶解组分经常描述为其中小于10g(尤其小于1g)可在25℃下溶于1升水的物质。本发明适用于此类不良溶解物质，但当然也可用于其中大于10g可在25℃下溶于1升水的物质，只要需要进一步改善它们的溶解度，例如如果它们需要以很大量加入或者如果溶解该物质所需的时间相当长。另外，物质在水中的溶解度可能不同于其在包含数种其它溶解组分的混合物中的溶解度。这对高浓缩溶液如补料培养基尤其正确。在包含大于100g/l溶解组分的溶液中，25℃下在水中具有大于10g/l溶解度的组分的溶解度可能不够，甚至此类组分在那些条件下不良溶解。这正是例如在纯水中具有一般大于10g/l的溶解度的氨基酸如亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的情况。然而，在高浓缩补料培养基中，其溶解度通常不够。因此，根据本发明的不良溶解物质优选为其中小于20g(尤其小于10g)可在25℃下溶于1升包含大于100g/l溶解组分的水溶液(或作为此类溶剂的实例，溶于10倍浓缩的DMEM F12细胞培养基)的物质。在实施例中显示1倍DMEM F12细胞培养基(Sigma Aldrich的产品，商品编号D2906)的组成。一般应在2小时后、优选在45分钟后完成溶解。
不良溶解细胞培养基组分的实例为本领域技术人员已知，或者如上所述对于特定细胞培养基组成确定。它们可依细胞培养基的类型而不同。典型实例为：胱氨酸、柠檬酸铁(水合柠檬酸铁(III))、六水氯化铁(III)和/或酪氨酸。虽然胱氨酸不良溶于水和细胞培养基，但六水氯化铁(III)为充分可溶于水但一般在细胞培养基中显示很差溶解度的组分的实例。
根据本发明的优选不良溶解组分为具有正溶解焓的组分。它们可以为糖类组分、氨基酸、维生素或维生素前体、盐、缓冲剂组分、辅助因子和/或核酸组分。盐的实例为氯化钾和硝酸铵。优选具有正溶解焓的不良溶解组分为氨基酸。实例为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。
溶解焓、溶焓或溶解热为与物质在恒压下在溶剂中产生无限稀释的溶解相关的焓变。
溶解焓最常表达为在恒温下按kJ/mol计的变化。可将此能量视为由三部分组成，在溶质内和在溶剂内的吸热键断裂，和在溶质和溶剂之间吸引力的形成。
化合物在溶解时的能量变化即溶解焓取决于其结构及其溶入的溶剂。此能量的一些也可转移到溶液中的其它分子，称为转移焓，一些损失到周围。已发现，可用此效应来改善不良溶解组分的溶解行为。看来转移焓可在分子水平局部改善不良溶解组分的溶解度，因为能量也在分子水平转移，而无需能量转移到全部混合物(例如，通过加热全部混合物)。
在溶解物质的情况下，组分可基于其能量释放或吸收而分类为放热或吸热。热能和焓通过用公式(1)和(2)计算。由于是在高稀释度下进行测定，可将水的热容用于水溶液。计算用如下实例阐明：
ΔH =反应焓[kJ/mol]
ΔQ =热能变化[kJ]
m = 物质的质量[g]
cp = 水的热容，4.18 [J/kg K]
ΔT = 温度变化[K]
n = 物质的量
实例：甘氨酸加到800g水
m=m(甘氨酸)+m(水)
关于氨基酸溶解焓的更多细节可见于Lou Y, Lin R. Enthalpy of transfer ofamino acids from water to aqueous glucose solutions at 298.15K(在298.15K下氨基酸从水到葡萄糖水溶液的转移焓). 1998；316:145-148, 和Acta T. Enthalpies ofsolution of L-phenylalanine in aqueous solution of amides at 298.15K(在298.15K下L-苯丙氨酸在酰胺水溶液中的溶解焓). 2016;( 2013年1月). doi:10.1016/j.tca.2012.11.004。
已发现，具有负溶解焓的组分到具有正溶解焓的组分的能量转移足以有效地支持不良溶解组分的溶解，只要在溶解期间组分紧密接近。通过产生那些组分的混合颗粒，可达到这种紧密接近。因此，使不良溶解组分与一种或多种具有负溶解焓的组分在将它们加到干燥粉末混合物之前混合，以形成混合颗粒。可使一种或多种不良溶解组分与一种具有负溶解焓的组分混合，或一种不良溶解组分与一种或多种具有负溶解焓的组分混合。优选使一种不良溶解组分与一种具有负溶解焓的组分共冻干。
具有负溶解焓的适合组分如下的所有组分：为非不良溶解组分，且其在组成中的浓度足够高，以便它们以足以与不良溶解组分混合的量存在。实例为：无机盐，如CaCl2、MgSO4或CaO；碱，如氢氧化钠或氢氧化钾；及氨基酸，如脯氨酸。已发现，脯氨酸适合很多应用，尤其用于制备具有不良溶解氨基酸的混合颗粒。如果pH的移动可另外正面影响组分溶解，则优选使用碱氢氧化钠或氢氧化钾。这正是例如用于改善酪氨酸溶解的情况。
优选具有负溶解焓的组分的量，以使负溶解焓的量至少为正溶解焓的量的双倍的量存在于混合颗粒中。
优选混合颗粒只包含一种或多种其溶解度应改善的不良溶解组分和一种或多种由于能量转移而支持不良溶解组分溶解的具有负溶解焓的组分。混合颗粒优选不包含任何或至少不大于10%w/w的不具有负溶解焓也非不良溶解的组分(如氯化钠或葡萄糖)。虽然如葡萄糖或氯化钠的组分容易溶解，但其在混合颗粒中的存在会阻止不良溶解组分和具有负溶解焓的组分的直接接触，并因此阻止能量转移。
显然，为了改善具有特定组成的干燥混合物的溶解度，从干燥混合物的初始组成中也存在的组分选择一种或多种具有负溶解焓的组分，其与不良溶解组分组合以形成混合颗粒。也选择此类组分的量，使得其对应于干燥混合物中存在的初始量。否则，混合物的组成就会改变。因此，如果目的是改善溶解度而不改变干燥混合物的总体组成，本发明的方法只可用于包含一种或多种具有负溶解焓的组分的干燥混合物。否则，就不得不通过加入以前在混合物中未存在的一种或多种具有负溶解焓的组分来改变干燥混合物的组成。一般对于营养组合物和细胞培养基这不是关键问题，因为这类干燥混合物包含足够数目和量的具有负溶解焓的组分。
在例如通过干压实、湿制粒、冻干或喷雾干燥产生混合颗粒后，所得混合固体然后可优选研磨(例如在球磨机中)，以产生均匀大小的颗粒。所得颗粒一般具有低于200µm的粒径。优选粒径低于100µm。有利的粒径在15µm和100µm之间。
然后，可使混合颗粒经分析方法，以测定颗粒中组分的浓度。适合的方法的实例为ICP-OES、UPLC(例如，用于氨基酸)、NMR、IC或LC-MS。
最终混合颗粒然后可储存，或者用于生产干燥混合物，如细胞培养基。
对于后者，使适合量的混合颗粒与细胞培养基的其它组分混合。也可产生两种或更多种类型的混合颗粒，并使两种或更多种类型的混合颗粒与细胞培养基的其它组分混合。组分的混合为生产干燥粉末状细胞培养基领域的技术人员已知。优选充分混合所有组分，以便混合物的所有部分具有几乎相同的组成。组成的均匀性越高，所得培养基关于均匀细胞生长的品质越佳。
随后优选研磨混合物。
可用适合制备粉末状细胞培养基的任何类型磨机进行研磨。典型实例为球磨机、销磨机、菲茨磨机或喷磨机。优选为销磨机、菲茨磨机或喷磨机，销磨机很优选。
本领域技术人员知道如何操作这些磨机。
本发明还涉及包含至少一种混合颗粒的干燥混合物，优选干燥粉末细胞培养基。可通过根据本发明的方法得到这种培养基。
优选干燥混合物包含1至10种不同的混合颗粒。包含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的一种或多种与脯氨酸的混合颗粒尤其优选。最优选只由氨基酸制成的颗粒。
为了使用粉末状干燥混合物，向干燥混合物加入溶剂，优选水(最具体的是蒸馏水和/或去离子水或净化水或注射用水)或水性缓冲剂，并混合组分，直至干燥混合物完全溶于溶剂。
溶剂也可包含盐水、提供1.0-14.0的pH范围的可溶性酸或碱离子、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和醇或其它极性有机溶剂。
在例如细胞培养基的情况下，也可向细胞培养基和溶剂的混合物加入另外的物质，如用于调节pH的缓冲物质、胎牛血清、糖等。然后使所得液体细胞培养基与要生长或保持的细胞接触。
因此，本发明还涉及培养细胞的方法，其通过如下进行：
a)提供细胞培养基，该培养基包含混合颗粒，优选包含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的一种或多种与脯氨酸的混合颗粒，
b)使所述细胞培养基与水或水性缓冲剂混合，
c)使要培养的细胞与步骤 b)的细胞培养基在生物反应器中混合，
d)培养步骤c)的混合物。
生物反应器为可在其中培养细胞的任何容器、器皿、袋或罐。一般在适合的条件(如适合的温度、同渗重摩、通气、搅动等)下进行培育。本领域技术人员了解支持和/或保持细胞生长/培养的适合培育条件。
通过用混合颗粒生产干燥混合物，混合物组分的总量和因此总体混合物组成保持与配方中描绘的相同，但由于不良溶解组分与具有负溶解焓的组分组合，干燥粉末混合物的总溶解度与不用混合颗粒制备的干燥粉末混合物比较显著更高。通过使用本发明的方法，一般不良溶解组分的溶解度可提高至少50%。优选提高至少100%，这表示通过使用混合颗粒，与使用原样的不良溶解物质比较，在相同液体组合物中可溶解至少双倍量的不良溶解组分。
本发明进一步通过以下实施例说明，但不限于此。
以上和以下引用的所有申请、专利和出版物以及2016年7月28日提交的相应欧洲专利申请EP 16181691.3的全部公开内容由此通过引用结合。
实施例
以下实施例代表本发明的实际应用。
DMEM F12细胞培养基(Sigma Aldrich商品编号D2906)的组成，干燥粉末一倍，以[g/L]计组成：
无机盐
氨基酸
L-丙氨酸 0.00445
L-精氨酸 • HCl 0.1475
L-天冬酰胺 • H2O 0.0075
L-天冬氨酸 0.00665
L-胱氨酸 • 2HCl 0.01756
L-半胱氨酸 • HCl • H2O 0.03129
L-谷氨酸 0.00735
L-谷氨酰胺 0.365
甘氨酸 0.01875
L-组氨酸 • HCl • H2O 0.03148
L-异亮氨酸 0.05447
L-亮氨酸 0.05905
L-赖氨酸 • HCl 0.09125
L-蛋氨酸 0.01724
L-苯丙氨酸 0.03548
L-脯氨酸 0.01725
L-丝氨酸 0.02625
L-苏氨酸 0.05345
L-色氨酸 0.00902
L-酪氨酸 • 2Na •2H2O 0.05579
L-缬氨酸 0.05285
维生素
D-生物素 0.0000035
氯化胆碱 0.00898
叶酸 0.00266
肌醇 0.0126
烟酰胺 0.00202
D-泛酸 • ½Ca 0.00224
吡哆醛 • HCl 0.002
吡哆醇 • HCl 0.000031
核黄素 0.000219
硫胺素 • HCl 0.00217
维生素B12 0.00068
其它
D-葡萄糖 3.15
HEPES 3.5745
次黄嘌呤 0.0021
亚油酸 0.000042
腐胺 • 2HCl 0.000081
丙酮酸 • Na 0.055
DL-硫辛酸 0.000105
胸苷 0.000365
追加
NaHCO3 1.2
材料和方法
材料
2. 方法
2.1.1 喷雾干燥，
2.1.1.1 BÜCHI袖珍喷雾干燥器B-290
为了喷雾干燥两种物质的溶液，使用BÜCHI袖珍喷雾干燥器B-290。为了得到喷雾干燥的材料，用压力泵通过双流体喷嘴帽(0.7mm)泵送经加热空气。另外将溶剂(含产品作为溶液或悬浮液)泵送入喷嘴，并在干燥室中通过雾化器喷雾，这由于热压缩空气使溶剂以小微滴分散。在干燥室内，微滴通过经预热空气蒸发。剩余的湿润空气和产品粉末通过旋风分离器离开干燥室，在旋风分离器，产品沉降到收集容器中。为了保证干燥产品，通过过滤过剩物的抽风机抽空潮湿空气和潮湿颗粒。短干燥时间和低干燥温度使得能够干燥热敏感产品17。为了保证小的干燥颗粒，出口温度需要优化到其最低可能值，其仍保证干燥产品，且避免颗粒粘着和团块形成18。
实验设置：
- 袖珍喷雾干燥器设置在40m3/h的Q-Flow。
- 设置130℃的入口温度，这产生82℃的出口温度19。
- 将蠕动泵调节到8mL/分钟泵送速率，具有溶剂的100%恒定抽吸。
- 将喷嘴清洁剂设置到一分钟5次。
2.1.2 共冻干 – 通用程序
变型1：
伴随搅拌使不良溶解组分溶于超纯水(例如，Milli-Q水)，如果必要，在高温下。
也使具有负溶解熔的组分溶于超纯水(例如，Milli-Q水)。
在搅拌下组合两种溶液。
变型2：
使载体组分溶于超纯水(例如，Milli-Q水)。伴随搅拌加入不良溶解组分。搅动混合物，如果必要，也加热，至不良溶解组分溶解。
在两种变型中，需要对要溶解的组分调节组分浓度、溶解次数和温度。本领域技术人员能够这样做。
为了冻干，将根据变型1或2制备的溶液倒入适合的容器(例如，Lyoguards)，并放入冷冻干燥器。根据溶液的组成，在4至12小时内使其冷却到-45℃。使冷凝器冷却到– 90℃。然后施加真空(0.18mbar)，并在–45℃干燥溶液6小时。
然后，在干燥期间，将温度调节到约–30℃持续约24小时，调节到–20℃持续另外24小时，最后调节到约0℃持续另外12小时。在约20℃温度在最小真空(0.003mbar)下进行最后干燥4至12小时。
可根据要干燥溶液的体积调节时间和温度梯度。
2.2溶解焓的测定
2.2.1由TA Instruments的TAM IV微量热计
以0.001K精确度，用TAM IV微量热计检测被试验物质的溶解焓引出的溶液的温度变化。
将氨基酸的不同制剂放入由水性溶剂围绕的安瓿中。在安瓿破裂后，分析温度变化。
实验安排：
- 在环境条件下将250mg各样品填入1mL压碎型安瓿，不经任何预处理。
- 将安瓿用硅树脂塞和蜡封闭，插入溶液量热计的搅拌器，并浸入100mL水中。
- 然后，在安瓿破裂之前，在500rpm下搅拌的同时使系统在25℃下平衡。
- 在破裂之前和之后在250mW功率下用2.5J热脉冲进行校正。
- 为了数据评价，将样品破裂前基线的斜率通过曲线微分设置到0，转换到0并重新积分。
2.3氨基酸的定量分析
2.3.1超高效液相色谱(UPLC)：
用UPLC作为分析技术来鉴定和量化溶液中的氨基酸。氨基酸用衍生化试剂盒衍生化，然后通过液相色谱分离。氨基酸根据其保留时间与标准品比较来鉴定(Zimmer A, MuellerR, Wehsling M, Schnellbaecher A, Hagen J Von. Improvement and simplificationof fed-batch bioprocesses with a highly soluble phosphotyrosine sodium salt(利用高溶解磷酸酪氨酸钠盐改善和简化补料分批生物过程). J Biotechnol. 2014;186:110-118. doi:10.1016/j.jbiotec.2014.06.026.)。
3.1经喷雾干燥的多组分氨基酸
通过量热法研究相邻分子的溶解行为和对溶液能量的疏水性效应，它们对研究此类系统的热力学性质特别重要20。
对于经喷雾干燥的多组分氨基酸，在装配有等温壳的特殊安瓿量热计上进行溶解焓测定。在量热法测定过程中，保持温控系统的稳定性恒定到10-4 K内。所有实验进行三次，并在5%内可再现。
图1和2显示相对温度形式脯氨酸和亮氨酸的溶解。对于L-脯氨酸的溶解焓，观察到温度剧烈提高，随后持续降低(图1)。L-亮氨酸的溶解焓表现出温度的稳定降低(图2)。
以比率2:1混合的L-脯氨酸和L-亮氨酸粉末的溶解焓显示温度剧烈提高，随后稳定降低(图3)。经喷雾干燥的相同氨基酸组合物的温度变化导致小的温度降低，然后沿着基线换向(图4)。
结果总结
1. 在物质溶解时由物质释放或吸收能量。
2. 此能量，也称为溶解焓，可从能量释放物质转移到能量吸收物质，例如，从脯氨酸到亮氨酸。
3. 可通过将物质耦合(例如通过喷雾干燥)增进该现象，。
4. 对于脯氨酸和亮氨酸，发现2:1的比率对于能量转移最有效。
5. 经喷雾干燥的材料的粒径分布不变。因此，在溶解度的改善中可排除粒径的作用。
4. 细胞培养基生产
用以上混合颗粒制备用于中国仓鼠卵巢细胞的化学成分明确的细胞培养基。
通过使用混合颗粒，组分的总量仍保持与配方中描绘的相同。
混合包括混合颗粒的培养基的所有成分，并用配药蜗形轮(dosage snail)和销磨机研磨。在配药蜗形轮中用液氮处理成分。
研磨在以下条件下进行：
温度 – 磨机：10℃
氧水平：低于10%绝对值
Rpm – 磨机：最高达2800 1/分钟
掺合时间：30分钟
配药蜗形轮Rpm：40 1/分钟
所得粉末状细胞培养基适用于培养CHO (中国仓鼠卵巢)细胞。

Claims (15)

1.改善具有特定组成的干燥混合物的溶解度的方法，其通过如下进行：
a)确定所述干燥混合物中的一种或多种不良溶解组分，
b)制备包含至少一种不良溶解组分和一种具有负溶解焓的组分的混合颗粒，
c)通过使在步骤b)中产生的一种或多种混合颗粒与干燥混合物的其它组分混合，制备具有改善的溶解度的所述干燥混合物。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述一种或多种不良溶解组分为在25℃下包含大于100g/l溶解组分的水溶液中具有小于20g/l的溶解度的化合物。
3. 根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述一种或多种具有负溶解焓的组分选自以下组：
- 脯氨酸
- 氯化钙，无水
- 硫酸镁，无水
- 氧化钙，无水
- 氢氧化钠
- 氢氧化钾
或其混合物。
4.根据权利要求1至3中一项或多项的方法，其特征在于，具有负溶解焓的组分为脯氨酸。
5.根据权利要求1至4中一项或多项的方法，其特征在于，所述一种或多种不良溶解组分选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。
6.根据权利要求1至5中一项或多项的方法，其特征在于，在步骤b)中，通过喷雾干燥、冻干或湿制粒进行混合颗粒的制备。
7.根据权利要求1至6中一项或多项的方法，其特征在于，在步骤b)中，通过喷雾干燥进行混合颗粒的制备。
8.根据权利要求1至7中一项或多项的方法，其特征在于，干燥混合物为干燥粉末细胞培养基。
9.根据权利要求1至8中一项或多项的方法，其特征在于，混合颗粒的组成使得负溶解焓的量是不良溶解组分的正溶解焓的量的双倍或更多。
10.根据权利要求1至9中一项或多项的方法，其特征在于，在步骤b)中制备的混合颗粒包含与一种或多种选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的组分组合的脯氨酸。
11.根据权利要求1至10中一项或多项的方法，其特征在于，90%或更多(w/w)的混合颗粒由一种或多种不良溶解组分和一种或多种具有负溶解焓的组分组成。
12.包括一种或多种混合颗粒的干燥混合物，所述混合颗粒包含至少一种不良溶于水的组分和至少一种具有负溶解焓的组分。
13.根据权利要求12的干燥混合物，其特征在于，干燥混合物为干燥粉末细胞培养基。
14.根据权利要求12或13的干燥混合物，其特征在于，干燥混合物包括混合颗粒，所述混合颗粒包含与一种或多种选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的组分组合的脯氨酸。
15.根据权利要求12至14中一项或多项的干燥混合物，其特征在于，90%或更多(w/w)的混合颗粒由一种或多种不良溶解组分和一种或多种具有负溶解焓的组分组成。
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