CN109562203B

CN109562203B - 包含血液的磷质钙水泥组合物

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Publication number: CN109562203B
Application number: CN201780032684.5A
Authority: CN
Inventors: J-M·布勒; O·高泽尔; B·布乔利; P·詹维尔; C·米勒
Original assignee: Graftys SA
Current assignee: Graftys SA
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2017-04-06
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2037-04-06
Also published as: US11338054B2; JP2019513461A; EP3439708B1; WO2017174747A1; US20220323639A1; EP3228334A1; JP7145368B2; US20190134261A1; CA3058931A1; ES2934217T3; US11395862B2; EP3439708A1; US20190365945A1; CN109562203A

Abstract

本发明涉及一种骨水泥糊料，其含有粉末组分和液体组分，所述粉末组分包含平均尺寸大于或等于9μm、优选大于或等于10μm的α‑磷酸三钙(α‑TCP)颗粒，并且所述液体组分包含血液。

Description

包含血液的磷质钙水泥组合物

本发明涉及包含血液的磷质钙(phosphocalcic)水泥组合物。本发明还涉及制备所述组合物的方法以及所述组合物的用途。

合成磷酸钙作为骨替代物的发展现在已经扩展了数十年，其中多孔陶瓷的例子在骨外科中非常有用，因为它们能够在体内被再吸收并被天然骨替代。可注射的磷酸钙水泥(CPC)被认为是下一代产品，因为它们提供更好的主要力学性能，并且由于其可注射特性而在微创手术条件下允许进行植入。因此，自从市场上可获得几个品牌的可注射CPC已有数年，但仍需要显著改进以扩展它们的应用并且使它们适用于特定的临床适应症(例如椎间融合笼的填充，椎体增强)，特别是通过提高它们的疲劳强度和它们的骨引导性能等。

为了改善CPC的力学性能(例如更高的弹性)，一种有吸引力且深入研究的途径是在水泥配制物中引入生物相容且可生物降解的纤维或微粒，包括：例如聚酯如聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共聚-乙醇酸(PLGA)或聚己内酯(PCL)，壳聚糖(Liu,H.等人,ActaBiomaterialia 2006,2,557)，明胶(Bigi,A.等人,Biomaterials 2004,25,2893以及Habraken,W.等人,Journal Of Biomedical Materials Research Part A 2008,87A,643)，胶原蛋白(Miyamoto，Y.等人，Biomaterials 1998,19,707以及Otsuka，M.等人，JBiomed Mater Res B 2006,79B，176)或多肽(Lin，J.P.等人，Journal of BiomedicalMaterials Research Part B-Applied Biomaterials 2006,76B，432)。如果存在生物可降解聚合物对无机基质的良好亲和力，则由于在无机/有机界面处的约束的良好转移，确实可以预期两种组分之间的合作效应。

迄今为止，已知的磷酸钙水泥具有不足的力学性能：它们事实上太脆弱并且具有过低的疲劳强度。

此外，这些水泥具有降低的骨引导潜力，因此限制它们在小体积中的用途。

因此存在对具有改善的力学性能和改善的骨引导潜力的磷质钙水泥的需要。

因此，本发明的目的是提供一种具有令人满意的力学性能的可注射磷质钙水泥。

本发明的另一个目的是提供一种具有改善的力学、生物学和流变性能的可注射磷质钙水泥。

本发明的目的还在于提供一种适用于骨锚固或脊柱融合的可注射的磷质钙水泥。

因此，本发明涉及含有粉末组分和液体组分的骨水泥糊料，所述粉末组分包含平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的α-磷酸三钙(α-TCP)颗粒，所述液体组分包含血液或血液衍生产物。

根据一个有利的实施方案，本发明涉及含有粉末组分和液体组分的骨水泥糊料，所述粉末组分包含平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的α-磷酸三钙(α-TCP)颗粒，所述液体组分包含血液。

根据本发明，“磷酸钙水泥”(或CPC)是一种水泥，其中粉状固相(或粉末组分)由磷酸钙化合物或者钙和/或磷酸盐化合物的混合物制成。

根据本发明，“骨水泥相”是由粉末组分和液体组分混合得到的糊料。

在本发明的上下文中，术语“磷质钙”或“磷酸钙”是指含有钙离子(Ca²⁺)以及正磷酸根(PO₄ ³-)、偏磷酸根或焦磷酸根(P₂O₇ ⁴-)的矿物质，其偶尔含有其它离子如氢氧根离子或质子。

粉末组分

在本申请中，粉末组分包含具有给定平均尺寸的α-磷酸三钙颗粒。

磷酸三钙(TCP)具有式Ca₃(PO₄)₂，并且也称为正磷酸钙、磷酸三钙、三元磷酸钙或骨灰。α-TCP具有式α-Ca₃(PO₄)₂。

根据本发明的α-TCP颗粒的平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm，且更优选大于或等于11μm，甚至最优选大于或等于至12μm。

根据一个实施方案，根据本发明的α-TCP颗粒具有大于10μm的平均尺寸。

在本发明的上下文中，术语“平均尺寸”(或“平均颗粒尺寸”或“平均值颗粒尺寸”)表示通过激光衍射分析测量的所述颗粒的平均等效直径。

根据本发明的骨水泥糊料的粉末组分包含α-TCP，所述α-TCP为颗粒形式，其平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm，如上所定义。

根据一个实施方案，如上定义的α-TCP颗粒的平均尺寸为9μm至100μm，优选10μm至100μm。

根据一种实施方案，粉末组分还包含除α-TCP之外的至少一种磷酸钙化合物。

因此，根据本发明的骨水泥糊料的粉末组分还可包含一种或几种其它磷酸钙化合物，所述化合物不同于α-TCP。因此，粉末组分可以包含如上定义的α-TCP颗粒，与至少一种其他磷酸钙化合物组合。

在α-TCP之外的磷酸钙化合物中，可以列举选自于由下列构成的组中的那些化合物：羟基磷灰石(HA)、无定形磷酸钙(ACP)、无水磷酸一钙(MCPA)、一水合磷酸一钙(MCPM)、二水合磷酸二钙(DCPD)、无水磷酸二钙(DCPA)、沉淀或贫钙的磷灰石(CDA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、磷酸四钙(TTCP)及其混合物。

根据一个实施方案，粉末组分包含如上定义的α-TCP颗粒与几种不同磷酸钙化合物的混合物的组合。

优选地，根据本发明的骨糊料水泥的粉末组分包含：

-平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的α-TCP颗粒，和

-至少一种选自下组的磷酸钙化合物：MCPA、DCPD、CDA及其混合物。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的粉末组分包含至少40重量％、优选至少50重量％、更优选至少60重量％的α-TCP颗粒，所述α-TCP颗粒具有大于或等于9μm、优选大于或等于10μm的平均尺寸，相对于所述粉末组分的总重量计。

根据一个有利实施方案，在根据本发明的骨水泥糊料中，粉末组分包含至少70％、优选至少80重量％的α-TCP颗粒，所述α-TCP颗粒具有大于或等于9μm、优选大于或等于10μm的平均尺寸，相对于所述粉末组分的总重量计。

根据一个实施方案，根据本发明的粉末组分仅由α-TCP颗粒组成，所述α-TCP颗粒具有大于或等于9μm、优选大于或等于10μm的平均尺寸，相对于所述粉末组分的总重量计。在这样的实施方案中，粉末组分包含100重量％的α-TCP颗粒，所述α-TCP颗粒具有大于或等于9μm、优选大于或等于10μm的平均尺寸，相对于所述粉末组分的总重量计。

根据优选的实施方案，根据本发明的粉末组分包含：

-α-TCP颗粒，其平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm，

-MCPM，

-CDA，和

-DPCD。

根据另一实施方案，根据本发明的粉末组分包含：

-α-TCP颗粒，其平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm；

-CDA，和

-DPCA。

优选地，根据本发明的粉末组分包含：

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少70重量％，优选至少75重量％的α-TCP颗粒，所述α-TCP颗粒具有大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的平均尺寸，

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少5重量％的CDA，

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少1重量％的MCPM和DCPD的混合物。

优选地，根据本发明的粉末组分包含：

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少5重量％的CDA，

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少1重量％的MCPM，和

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少1重量％的DCPD。

优选地，根据本发明的粉末组分包含：

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少5重量％的CDA，和

-相对于所述粉末组分的总重量计，至少1重量％的DCPA。

根据一个实施方案，根据本发明的粉末组分包含：

-相对于所述粉末组分的总重量计，70重量％至80重量％的α-TCP颗粒，所述α-TCP颗粒具有大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的平均尺寸，

-相对于所述粉末组分的总重量计，1重量％至15重量％，优选5重量％至10重量％的CDA，

-相对于所述粉末组分的总重量计，1重量％至10重量％，优选1重量％至5重量％的MCPM，

-相对于所述粉末组分的总重量计，1重量％至10重量％，优选1重量％至5重量％的DCPD。

根据一个实施方案，根据本发明的粉末组分包含：

-相对于所述粉末组分的总重量计，1重量％至15重量％，优选5重量％至10重量％的CDA，和

-相对于所述粉末组分的总重量计，1重量％至15重量％，优选5重量％至10重量％的DCPA。

在根据本发明的骨水泥糊料中，粉末组分还可包含至少一种多糖。

多糖是一类碳水化合物，例如淀粉和纤维素，由通过糖苷键连接的许多单糖组成。

纤维素醚以及它们的盐和它们的混合物是用于本发明粉末组分的优选多糖，更优选地选自羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羧甲基纤维素(CMC)。

优选地，按本发明粉末组分的总重量计，纤维素醚的量为0.1重量％至5重量％不等，优选1重量％至3重量％，更优选1重量％至约2重量％。

液体成分

如上所述，根据本发明的骨水泥糊料包括含血液或血液衍生产物的液体组分。

根据有利的实施方案，所述液体组分包含血液，更优选为血液。

在本申请中，术语“血液”是指全血。因此它包括白细胞、红细胞和血小板。

在本申请中，术语“血液衍生产物”是指血浆、血清和先前描述的细胞。

根据本发明，液体组分还可包括下列中的一种或多种：盐水、去离子水、稀磷酸、稀有机酸(乙酸、柠檬酸、琥珀酸)、磷酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠、海藻酸钠、碳酸氢钠、硫酸软骨素钠、Na₂HPO₄水溶液和/或Na₂HPO₄/NaH₂PO₄水溶液。

根据一个实施方案，在根据本发明的骨水泥糊料中，液体组分(L)/粉末组分(P)的比率为0.3至0.7mL/g，且优选为0.4至0.6mL/g，且更优选为0.45或0.55mL/g。

水泥

本发明还涉及由如上定义的骨水泥糊料的固化产生的磷灰石磷酸钙水泥。

在本发明的上下文中，“磷酸钙水泥”(CPC)是一种固体复合材料，该材料包含一种或多种磷酸钙或由一种或多种磷酸钙制成，最终具有额外的钙盐，所述钙盐在包含血液的液体组分存在时固化和硬化。该术语是指固化后获得的硬化材料。可以少量包括其他添加剂以调节水泥的性质，例如固化时间、粘度，减少凝聚或溶胀时间，和/或引起大孔隙，以及向最终硬化产品赋予弹性。

“磷灰石”磷酸钙水泥以具有式Ca_5x(PO₄)_3x,(OH,Cl,F)_x且x≥1的六方晶系结晶。

在本发明的上下文中，水泥的“固化”是指水泥糊料在环境温度下的无干涉自硬化，即取决于环境、室温或体温。

根据本发明的CPC也可称为“CPC/血液复合物”。

根据一个实施方案，本发明的磷灰石磷酸钙水泥还包括用于X射线成像或MRI的造影剂，优选为水溶性造影剂，更优选为用于X射线成像的芳族多碘化合物或用于MRI的含钆的化合物。

根据另一实施方案，本发明的磷灰石磷酸钙水泥还包括治疗剂(例如二膦酸盐或抗生素)或将发挥治疗作用的化合物(例如抗癌趋化因子(chimiokine)或镓)。

本发明还涉及一种可通过包括以下步骤的方法获得的磷灰石磷酸钙水泥：

a)通过混合粉末组分和液体组分制备骨水泥糊料，所述粉末组分包含平均尺寸大于或等于9μm、优选大于或等于10μm的α-TCP颗粒，所述液体组分包含血液或血液衍生产物，所述液体组分优选包含血液，和

b)所述骨水泥糊料的固化。

优选地，根据本发明，固化时间的范围是10分钟至72小时，优选10小时至20小时。特别地，根据本发明的固化时间为约13小时。

根据优选的实施方案，根据本发明的磷灰石磷酸钙水泥是可注射的。

在本发明的上下文中，“可注射水泥”或“适合于注射形式的水泥”是指可被推动通过具有几毫米直径的针的水泥糊料，所述直径优选在1mm和5mm之间，更优选在1mm和3mm之间，最优选在2mm和3mm之间。可注射水泥的特别重要的参数包括：不存在大颗粒、合适的粘度以及适当的体内固化时间(在37℃)。

优选地，根据本发明的磷灰石磷酸盐水泥具有在2MPa和15MPa之间的抗压强度。

在本申请中，“抗压强度”是在失效时水泥样品所承受的最大压缩应力。

根据一个实施方案，根据本发明的磷灰石CPC在硬化后72小时呈现典型的延性材料的抗压强度曲线。特别地，根据本发明的CPC呈现出塑性行为。这意味着当进行力学测试(例如抗压强度测试)时，这种类型的水泥的硬化样品将在破裂之前呈现出变形轮廓。

根据本发明的CPC/血液复合物是有利的，因为血液赋予水泥粘附性、凝聚力和塑性。与没有血液的水泥相比，血液的使用也显著增加了骨引导和再吸收。

根据本发明的CPC有利地是生物可吸收的。

术语“生物可吸收的”是指材料在体内被再吸收的能力。在本发明的上下文中，“完全”再吸收意指没有明显的细胞外片段残留。再吸收过程涉及通过体液、酶或细胞的作用消除原始植入物材料。

例如，再吸收的磷酸钙可以通过成骨细胞作用再沉积为新的骨矿物质，或者通过其它方式在体内再利用或者被排泄。“强烈生物可吸收”意指磷酸钙植入物的主要部分在一到五年之间被再吸收。这种延迟不仅取决于磷酸钙植入物的固有特征，还取决于植入部位、患者年龄、植入物的初期稳定性等。

用途

根据本发明的CPC可以用于牙科和医疗应用，特别涉及骨修复、增强、重建、再生和骨病如骨质疏松症的治疗。

其他医疗应用包括骨缺损的修复、骨折修复以脊柱融合、假体(髋、膝、肩等)手术翻修、骨增强和骨重建。

本发明还涉及如上定义的磷灰石磷酸盐水泥用于填充牙齿或骨缺损的用途。

在牙齿缺损或骨缺损中，可以提及由创伤、手术或病理引起的缺损。特别地，根据本发明的磷灰石磷酸盐水泥可用于治疗骨质疏松症或骨髓病变。

根据本发明的CPC/血液复合物可用于许多应用，尤其是外科应用。

本发明还涉及包含如上定义的磷灰石磷酸盐水泥的植入物。特别地，该植入物可用于修复、恢复或增强骨骼，和/或填充骨缺损或牙齿缺损。

本发明还涉及如上定义的磷灰石磷酸盐水泥用于固定植入物(螺钉)的骨锚固增强的用途。

这种应用的目的是使具有劣质骨的患者的固定植入物周围的骨致密化。对于这种应用，水泥固化，并为螺钉提供机械上更稳定的环境。这种作用方式甚至更有效，因为CPC/血液复合物的塑性(较不脆)允许吸收部分机械应力。

根据本发明的CPC/血液复合物的使用是有利的，因为它避免了微动，优化了固定植入物的稳定性，手术后在短期内恢复承重(机械增强)以及在结合水泥已重建成天然骨之后的较长时期内恢复承重(生物增强)。

对于该应用，植入技术如下：由于其非常高的可注射性，根据本发明的水泥(与全血相关)将渗透并填充固定植入物(螺钉)周围的区域中的小梁骨结构。与全血相关的水泥的流动性(低粘度)允许在该临床应用中进行微创方法和递送。

·在固定植入物之前的放置：将具有全血的水泥注入预制孔中。在螺钉植入时，将CPC/血液复合物推入螺钉周围的小梁结构内，产生更致密的区域；或者

·在固定植入物放置之后的放置，如果螺钉是中空的和有孔的(例如：N-Force，由Innovision提供)。将具有全血的水泥注入螺钉的套管中，并通过螺钉轴的穿孔进入并穿透小梁结构。

本发明还涉及如上定义的磷灰石磷酸盐水泥用于治疗骨髓病变的用途，特别是通过实施“亚软骨成形术”(subchondroplasty)技术。因此，它涉及如上定义的磷灰石磷酸盐水泥，对于其用于治疗骨髓病变的用途。

这种应用的目的是填充由骨髓病变产生的腔，所述腔导致小梁骨体积损失和相关的机械阻力(mechanical resistance)损失。

作用的模式如下：水泥固化，在植入部位提供机械上更稳定的区域，并且在压缩时提供增加的机械阻力。

使用根据本发明的CPC/血液复合物是有利的，因为增加的压缩机械阻力允许消除疼痛(治疗性短期效果)以及防止关节表面塌陷(预防性长期作用)。

对于这种应用，植入技术如下：由于其非常高的可注射性，与全血相关的水泥将渗透并填充该区域中的小梁骨结构。与全血相关的水泥的流动性(低粘度)允许在该临床应用中进行微创方法和递送。

本发明还涉及如上定义的磷灰石磷酸盐水泥用于促进体间笼(intersomaticcages)内的脊柱融合的用途。

对于椎体间(inter-body)脊柱融合的应用，目的是填充椎体间融合笼以产生骨桥从而优化融合。作用模式如下：水泥在适当位置一次固化，并且将再吸收并重塑成天然骨骼，从而允许产生骨桥。

根据本发明的CPC/血液复合物的使用是有利的，因为它允许更长时期的更稳定融合。当与全血相关时，该CPC的特别活跃的成骨特性是最佳骨重建(重建的数量、品质和时间)的关键成功因素。

对于该应用，植入技术如下：与全血相关的水泥的流动性(低粘度)和凝聚性允许在该临床应用中进行微创方法和递送。可以在植入之前将其放入融合笼中，或者在放置笼之后的第二步中：

·如果笼设计不允许在植入后的放置(不存在注射孔)，则在植入融合笼之前放置，或者

·如果存在注射孔(注射孔可以是定位器/操作孔)，则在植入融合笼之后放置。

本发明还涉及一种用于脊柱融合的试剂盒，包括：

-融合笼，优选为PEEK，和

-骨水泥粉末，其包含平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的α-磷酸三钙(α-TCP)颗粒。

然后将该试剂盒与上文定义的液体组分结合使用，用以获得骨水泥糊料和固化后的相应水泥。

本发明还涉及一种用于脊柱融合的试剂盒，包括：

-融合笼，优选为PEEK，和

-包含粉末组分和液体组分的骨水泥糊料，所述粉末组分包含平均尺寸大于或等于9μm，优选大于或等于10μm的α-磷酸三钙(α-TCP)颗粒，并且所述液体组分包含血液或血液衍生产物。

本发明还涉及一种促进体间笼内的脊柱融合的方法，包括以下步骤：

-将融合笼(优选为PEEK)放在两个椎骨体之间，

-将如上定义的骨水泥糊料注入所述笼内。

如上所述进行该方法。

其优于已知方法之处在于，用于放置融合笼的步骤在注射步骤之前进行。事实上迄今为止，还没有在注射水泥之前放置笼的已知方法。已知方法涉及放置填充有自体骨的融合笼。此外，这些现有技术方法具有高的故障率。

将考虑以下附图和实施例进一步说明本发明。

附图

图1：对于(A)QS水泥单独(a)及其含血类似物(b)；(B)HBS水泥单独(c)及其含血类似物(d)，介电常数ε'(左)和介电损耗ε”(右)相对于反应时间的变化。频率：10MHz，温度：37℃。图1A包含比较数据，并且图1B比较了根据本发明的组合物(具有血液)和不含血液的组合物。

图2：对于QS(Δ)(对比组合物)及其含血类似物(对比组合物)(▲)，HBS(□)(对比组合物)及其含血的类似物(■)(根据本发明的组合物)，在20℃下挤出水泥糊料所需的力随时间的变化)。

图3：在72小时的固化时间之后水泥配制物的抗压强度:(右)QS(直线)及其含血类似物(虚线)，(左)HBS(直线)及其含血类似物(虚线)。

图4：来自SEM测量的新形成骨和剩余植入材料的比较定量分析。

图5：对比组合物(a)、根据本发明的组合物(b)和自体移植物(c)的SEM显微照片。

图6：笼体积内的3D定量化(500mm³-μCT分析-分辨率12μm)。

实施例

材料

在该研究中使用的磷灰石磷酸钙水泥(CPC)获自Graftys SA(Aix-en-Provence，法国)。

HBS

HBS是如下的混合物：78重量％的α-磷酸三钙(α-TCP)(Ca₃(PO₄)₂)(平均等效直径：12μm)，5重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)(CaHPO₄,2H₂O)，5重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)(Ca(H₂PO₄)₂,H₂O)，10重量％的CDA(Ca_10-x[]_x(HPO₄)_y(PO₄)_6-y(OH)_2-z[]_z)，2重量％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)(

Colorcon-Dow Chemical，Bougival，法国)。

液相由5重量％的Na₂HPO₄水溶液(液体/粉末比＝0.5mL.g^-1)组成。

Quickset

Quickset是如下的混合物：78重量％的α-TCP(平均等效直径：5μm)，10重量％的无水磷酸二钙(DCPA)(CaHPO₄)，10重量％的CDA，2重量％的HPMC。

液相由0.5重量％的Na₂HPO₄水溶液(液体/粉末比＝0.45mL.g^-1)组成。

通过将8g粉状制剂与其各自的液相混合2分钟以确保分析前所得糊料的均匀性，来制备

HBS和

Quickset的水泥糊料样品。

相同的条件用于制备相应的血液/CPC复合物，区别在于液相完全被新鲜采集的羊血代替。

方法

使用HP 4194 A阻抗/增益相位分析仪(Hewlett-Packard)记录高频阻抗测量值，在0.4和100MHz之间，使用允许在37℃同时执行复数阻抗和吉尔摩针测量的实验装置，如先前报道(Despas,C.；Schnitzler,V.；Janvier,P.；Fayon,F.；Massiot,D.；Bouler,J.M.；Bujoli,B.；Walcarius,A.High-frequency impedance measurement as a relevant toolfor monitoring the apatitic cement setting reaction Acta Biomater 2014,10,940)。

通过计算机完成实验装置，允许自动数据采集和实时计算复数阻抗Z*，由此计算介电常数ε'(与偶极子变化相关)和介电损耗ε”(与自由电荷的移动相关)(Thiebaut,J.M.；Roussy,G.；Chlihi,K.；Bessiere,J.Dielectric study of the activation of blendewith cupric ions Journal Of Electroanalytical Chemistry 1989,262,131)。

初始固化时间(t_i)定义为直到小的吉尔摩针(直径2.12mm，重量113.4g)不能压印样品表面所经过的时间，而最终固化时间(t_f)是当使用大的吉尔摩针(直径1.06mm，重量453.6g)时的相应值。

使用AMETEK LS5质构分析仪随时间进行抗压强度测量和质构分析。以规则的间隔(约每3分钟)随时间测量从注射器挤出水泥糊料样品所需的压缩力(筒的内径8.2mm，出口孔的内径1.7mm)，同时保持挤出速率恒定(0.1mm s^-1)。

HBS和

Quickset CPC的体内植入，对于它们各自的血液复合物

动物和外科手术

所有动物处理和外科手术均根据欧洲共同体关于实验动物的护理和使用的指南(DE 86/609/CEE)进行，并经当地兽医学校伦理委员会批准。

在24只成熟雌性新西兰白兔(3-3.5kg)股骨的远端处双侧植入测试的生物材料分别持续4周和8周。进行膝关节的侧向关节切开术，并在股骨远端产生圆柱形的6×10mm骨临界尺寸缺损。在盐水冲洗后，将骨腔小心地干燥并用测试的磷酸钙水泥填充。对12只兔子用关于其血液复合物的

HBS进行植入，并且对相同数目的兔子用关于其血液复合物的

Quickset进行植入。

二维组织形态学SEM分析和组织学研究

经典地制备植入样品和对照样品用于SEM基组织形态测定术和光学显微术的定性组织学检查[详见Gauthier等人2005,Biomaterials)。使用Movat的五色染色法对每个样品的未脱钙连续7mm切片进行染色。这种骨特定染色非常适合于区分矿物(黄绿色)、骨样组织(红线)和水泥(蓝色)(Verron,E.；Gauthier,O.；Janvier,P.；Pilet,P.；Lesoeur,J.；Bujoli,B.；Guicheux,J.；Bouler,J.M.In vivo bone augmentation in an osteoporoticenvironment using bisphosphonate-loaded calcium deficient apatiteBiomaterials 2010,31,7776)。为了分析更具体的组织成分，进行了苏木精-伊红。用偏光显微镜(

Zeiss，德国)观察样品。

统计分析

用于兔子研究的SEM基组织形态测定术

计算8个实验组(N＝6)中每一组的平均值，并通过方差分析(ANOVA)评估不同组之间和不同处理之间的统计学差异。显著性阈值设定为95％(p＝0.05)。

实施例1：组合物的固化时间

将根据本发明的组合物的固化时间与不含血液的现有技术组合物以及与具有血液和CPC的组合物进行比较，其中α-TCP颗粒具有小于10μm的平均颗粒尺寸。

将血液引入两种可商购的可注射磷灰石水泥(

Quickset[简写为QS]和

HBS[简写为HBS])的组合物中，显示它们的固化时间的显著差别(参见表1)。为此目的，通过添加柠檬酸钠(3.2重量％)稳定的羊血完全替代液相(分别为0.5重量％Na₂HPO₄和5重量％Na₂HPO₄)，同时保持所有其他参数固定。

首先使用吉尔摩针标准测试方法研究在体温下血液对CPC固化反应的可能影响，该方法允许通过测量材料穿透阻力的变化来确定初始(t_i)固化时间和最终(t_f)固化时间。虽然在快速固化配制物(QS)中添加血液时观察到初始固化时间增加4分钟，但是当使用血液作为HBS中的液相时，吉尔摩方法未能确定t_i值，因为由于所得复合材料的弹性质地从而不能观察到“可见的压痕”。

表1.使用吉尔摩针(第一线)或高频阻抗(随后四线)监测所研究的水泥在37℃下的固化反应得到的特征参数，随液相的变化(磷酸盐缓冲液相对于血液)。

[a]水泥硬化在第一个可测量的介电值之前开始(参见材料和方法)

文章Despas,C.；Schnitzler,V.；Janvier,P.；Fayon,F.；Massiot,D.；Bouler,J.M.；Bujoli,B.；Walcarius,A.High-frequency impedance measurement as a relevanttool for monitoring the apatitic cement setting reaction Acta Biomater 2014,10,940报道了基于高频阻抗测量的相关和一般方法的开发，用于原位监测α-磷酸三钙(α-TCP)向贫钙的羟基磷灰石(CDA)转化，这是磷灰石CPC的硬化过程的驱动力。

从复数阻抗数据，可以计算介电常数(ε’，与偶极变化相关)和介电损耗(ε”，与自由电荷的移动相关)。这两种参数的变化据显示与固化过程期间发生的化学反应强烈相关，这与吉尔摩常规标准方法形成对比，该吉尔摩常规标准方法在某些情形中显示出显著的局限，特别是当水泥糊料中存在添加剂时。

因此，记录了QS和HBS的阻抗响应，相比于它们的与血液相结合的类似物，并且在固化反应期间ε’和ε”实验值的演化示于图1中。如前所示，ε’和ε”曲线的急剧变化(↑ε’和↓ε”值)可归于在颗粒表面上α-TCP转变为CDA。

在快速固化配制物的情形中(利用QS的对比数据)，用血液代替液相不会导致介电常数和介电损耗的演化相对于反应时间的显著变化，然而对于含血液的组合物而言CDA沉淀的起始朝向更长时间稍微移动。这与HBS的情况形成鲜明对比，在存在血液作为液相的情况下(对应于根据本发明的组合物)，固化反应被显著延缓(约13小时)。

关于QS的结果如图1A所示，关于HBS的结果如图1B所示。

实施例2：组合物的可注射性

质构分析与探测磷酸钙糊料的可注射性和评价它们在压力下的行为有关(Ginebra,M.P.；Rilliard,A.；Fernandez,E.；Elvira,C.；San Roman,J.；Planell,J.A.Mechanical and rheological improvement of a calcium phosphate cement bythe addition of a polymeric drug J Biomed Mater Res 2001,57,113)。

对于没有血液的两种水泥，挤出力迅速达到平台，然后急剧增加(图2)，这对应于硬化过程的开始。

用血液替代液相导致更易注射的材料，特别是对于根据本发明的基于HBS的组合物，完全符合通过阻抗测量证明的固化特性的变化(如实施例1中所述)。

在所有情况下，水泥糊料挤出所需的力的增加不是由于相分离，因为注射器的全部容量可被注射。

实施例3：组合物的力学性能

将血液引入CPC组合物中不会导致QS配制物的力学性能的显著变化。实际上，对于这些对比组合物，在72小时的固化时间之后的抗压强度在血液存在(21±2MPa)或不存在(25±5MPa)时处于相似的范围内，具有脆性行为(参见图3右侧)。该观察结果与血液对复数阻抗响应的非常有限的影响一致。

相反，对于根据本发明的组合物(HBS配制物)观察到显著变化，因为当与血液结合时，在72小时固化时间之后的抗压强度显著下降(对于本发明组合物而言为6.4±0.1MPa，相比于没有血液的对比组合物的14±2MPa)。

有趣的是，刚度小于HBS，从而导致混合后72小时至336小时样品的更大塑性行为(见图3左侧)。

实施例4：组合物的再吸收性质

定量SEM组织形态测定术

植入后4星期(如上所述)，所有组均显示出相当的新骨形成，并且与其他组相比，仅根据本发明的组合物(HBS/血液)呈现出显著更高的材料降解(p<0.0001)(图4A)。在12星期后，与其他组相比时，根据本发明的组合物(HBS/血液的组合物)经历显著更高的材料降解(p<0.0001)并导致更高的新骨形成(p<0.01)(图4B)。

实施例5：CPC、CPC血液复合物和自体移植物的羊脊柱融合中的体内反应比较

在绵羊中进行体内研究以评估根据本发明的组合物(与不含血液的组合物相比)在植入后3个月促进体间笼内的脊柱融合的能力。使用自体移植物作为正对照物(positivecontrol)。

组合物

·对比CPC是如下成分的混合物：78重量％的α-TCP，10重量％的无水磷酸二钙(DCPA)(CaHPO₄)，10重量％的CDA，2重量％的HPMC。无机粉末颗粒的平均尺寸为6μm。液相由0.5重量％的Na₂HPO₄水溶液组成(液体/粉末比率＝0.45mL.g^-1)。

·本发明的组合物是如下成分的混合物：78重量％的α-磷酸三钙(α-TCP)(Ca₃(PO₄)₂)，5重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)(CaHPO₄,2H₂O)，5重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)(Ca(H₂PO₄)₂，H₂O)，10％重量的CDA(Ca_10-x[]_x(HPO₄)_y(PO₄)_6-y(OH)_2-z[]_z)，2重量％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)(

Colorcon-Dow Chemical，Bougival，法国)。α-TCP的平均尺寸为12μm。液相由通过添加柠檬酸钠(3.2重量％)稳定的新鲜羊血组成(液体/粉末比率＝0.5mL.g^-1)。

·从股骨远端骨骺部位收集自体皮髓质(corticocancellous)骨移植物。

体间笼

在L2/L3和L4/L5羊椎间水平之间的椎间盘切除(dissectomy)后放置聚醚-醚-酮笼

(14×14×6mm)。用咬骨钳将自体移植物压碎，然后装入融合笼中随后将其压紧(impaction)。在压紧之后将根据本发明的组合物和对比组合物注射到笼内。在植入后3个月，通过置于颈静脉中的导管静脉注射20ml戊巴比妥(

VétoquinolS.A.法国)使动物安乐死。然后从周围软组织解剖后收获L1至L5的腰椎段，进行X射线成像并立即置于10％的中性甲醛溶液中。在4℃下将L2/L3和L4/L5椎间试样在pH 7.2的中性甲醛溶液中固定24小时，然后在增加的乙醇浴中从70％脱水至100％，每次持续3天。然后通过使用甲基丙烯酸甲酯进行树脂浸渍。

结果

SEM观察结果(图5)和3D-μCT定量分析(图6)显示：

·本发明组合物与对比组合物的比较：强烈增加的再吸收速率，因此手术后3个月时具有增加的新骨形成；和

·本发明组合物与自体移植物的比较：手术后3个月时具有相当的融合率。

植入12星期之后，与对照物相比，血液复合水泥显示出更好的再吸收率(+22％)。对于两种测试的CPC，新形成的骨的品质非常相似，具有优异的骨/植入物骨接合界面。

实施例6：根据本发明的组合物的固化时间和抗压强度

将根据本发明的组合物的固化时间与不含血液的现有技术组合物和含有血液的组合物进行比较。

GQSb10h是如下成分的混合物：78重量％的α-TCP(颗粒的平均等效直径：9.1μm)，10重量％的无水磷酸二钙(DCPA)(CaHPO₄)，10重量％的CDA和2重量％的HPMC。

液相(液体/粉末比率＝0.45mL.g^-1)由以下组成：

·0.5重量％Na₂HPO₄水溶液，

·或5重量％Na₂HPO₄水溶液，

·或新鲜采集的羊血。

通过如下方式制备

GQSb10h水泥糊料样品：将8g粉状制剂与它们各自的液相混合2分钟以确保在分析之前所得糊料的均匀性。

测量的性能如下：

这里在呈现出>9μm的粉末平均尺寸的QS组合物上观察利用HBS组合物观察的实施例1、2和3中观察到的血液添加效果。

实施例7(对比)：根据本发明的组合物(具有血液作为液体组分)与具有血浆作为液体组分的组合物性质的比较(

HBS相对于

HBS+血浆)

HBS是如下成分的混合物：78重量％的α-磷酸三钙(α-TCP)(Ca₃(PO₄)₂)(颗粒的平均等效直径：12μm)，5重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)(CaHPO₄,2H₂O)，5重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)(Ca(H₂PO₄)₂，H₂O)，10重量％的CDA(Ca_10-x[]_x(HPO₄)_y(PO₄)_6-y(OH)_2-z[]_z)，2重量％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)(

Colorcon-DowChemical，Bougival，法国)。

液相(液体/粉末比率＝0.5mL.g^-1)由以下组成：

·5重量％的Na₂HPO₄水溶液，

·或从新鲜采集的羊血获得的血浆。

在室温(RT)下以1,800g进行血液离心15分钟后获得血浆。

通过如下方式制备

HBS水泥糊料样品：将8g粉状制剂与它们各自的液相混合2分钟，以确保在分析之前所得糊料的均匀性。

测量的性质如下表所示：

用血浆代替HBS液体组分不能在固化时间和抗压强度两方面为骨移植手术提供合适的水泥。

实施例8：包含治疗剂和任选的造影剂的组合物

MIA是如下成分的混合物：78重量％的α-磷酸三钙(α-TCP)(Ca₃(PO₄)₂)(颗粒的平均等效直径：12μM)，5重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)(CaHPO₄，2H₂O)，5重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)(Ca(H₂PO₄)₂，H₂O)，10重量％的CDA(Ca_10-x[]_x(HPO₄)_y(PO₄)_6-y(OH)_2-z[]_z)，部分负载有阿仑膦酸盐(Alendronate)；2重量％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)(

Colorcon-Dow Chemical，Bougival，法国)。固相含有0.56mg阿仑膦酸盐/g水泥。

液相(液体/粉末比率＝0.5mL.g^-1)由以下组成：

·5重量％的Na₂HPO₄水溶液，

·或新鲜采集的羊血，

·或新鲜采集的羊血+Xenetix(168mG碘/mL血液)。

通过如下方式制备

测量的性能如下表所示：

在血液中添加

会增加水泥固化时间并且降低其抗压强度。然而，这两种操作性能仍然与骨移植手术兼容。

Claims

1.一种骨水泥糊料，其含有粉末组分和包含血液的液体组分，

其中相对于所述粉末组分的总重量计，所述粉末组分包含：

-70重量％-80重量％的平均尺寸大于或等于9μm的α-磷酸三钙(α-TCP)颗粒，

-1重量％-10重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)，

-1重量％-10重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)，

-5重量％-15重量％的沉淀或贫钙的磷灰石(CDA)，和

-0.1重量％-5重量％的纤维素醚；和

其中所述液体组分(L)/粉末组分(P)的比率为0.3至0.7mL/g。

2.权利要求1的骨水泥糊料，其中所述液体组分是血液。

3.权利要求1的骨水泥糊料，其中所述粉末组分还包含除α-TCP、CDA、MCPM和DCPD之外的至少一种磷酸钙化合物。

4.权利要求3的骨水泥糊料，其中所述磷酸钙化合物选自羟基磷灰石(HA)、无定形磷酸钙(ACP)、无水磷酸一钙(MCPA)、无水磷酸二钙(DCPA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、磷酸四钙(TTCP)及其混合物。

5.权利要求1的骨水泥糊料，其中所述液体组分(L)/粉末组分(P)的比率为0.4至0.6mL/g。

6.权利要求5的骨水泥糊料，其中所述液体组分(L)/粉末组分(P)的比率为0.45或0.55mL/g。

7.权利要求1的骨水泥糊料，其中所述α-TCP颗粒具有大于或等于10μm的平均尺寸。

8.权利要求1的骨水泥糊料，其中所述纤维素醚选自羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羧甲基纤维素(CMC)。

9.一种磷灰石磷酸钙水泥，其是由权利要求1的骨水泥糊料的固化产生的。

10.权利要求9的磷灰石磷酸钙水泥，还包括用于X射线成像或MRI的造影剂，和/或还包括治疗剂或将发挥治疗作用的化合物。

11.权利要求9的磷灰石磷酸钙水泥，其中所述α-TCP颗粒具有大于或等于10μm的平均尺寸。

12.一种磷灰石磷酸钙水泥，其可通过包括以下步骤的方法获得：

a)通过混合粉末组分和包含血液的液体组分制备骨水泥糊料，

其中相对于所述粉末组分的总重量计，所述粉末组分包含：

-1重量％-10重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)，

-1重量％-10重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)，

-5重量％-15重量％的沉淀或贫钙的磷灰石(CDA)，和

-0.1重量％-5重量％的纤维素醚；和

其中所述液体组分(L)/粉末组分(P)的比率为0.3至0.7mL/g；和

b)骨水泥糊料的固化。

13.根据权利要求9或12的磷灰石磷酸钙水泥在制造用于填充牙齿缺损或骨缺损的药剂中的用途。

14.一种植入物，其包含根据权利要求9或12的磷灰石磷酸钙水泥。

15.根据权利要求9或12的磷灰石磷酸钙水泥在制造用于促进体间笼内的脊柱融合的药剂中的用途。

16.一种用于脊柱融合的试剂盒，包括：

-融合笼，和

-包含粉末组分和包含血液的液体组分的骨水泥糊料，

其中相对于所述粉末组分的总重量计，所述粉末组分包含：

-1重量％-10重量％的一水合磷酸一钙(MCPM)，

-1重量％-10重量％的二水合磷酸二钙(DCPD)，

-5重量％-15重量％的沉淀或贫钙的磷灰石(CDA)，和

-0.1重量％-5重量％的纤维素醚；和

其中所述液体组分(L)/粉末组分(P)的比率为0.3至0.7mL/g。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述α-TCP颗粒具有大于或等于10μm的平均尺寸。