CN109536478A - 纳米介孔材料固定化过氧化酶、其作为催化剂的氧化反应方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纳米介孔材料固定化过氧化酶,其采用将过氧化酶镶嵌于纳米介孔材料中,所述纳米介孔材料的孔径为10nm‑20nm之间,孔容为1.000‑2.000cm2/g。本发明所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶采用将辣根过氧化物酶直接镶嵌于合适孔径的纳米介孔材料中,保持其催化活性,提高其稳定性。而且由于未采用键合方式固定辣根过氧化物酶,所以其酶活很高,可以反复使用。本发明所述纳米介孔材料固定化过氧化酶作为催化剂用于催化胺类化合物的硝化反应和硫脲的氧化反应,通过摸索得出其适合的反应条件,得出反应产率,使其能够早日应用在工业生产方面。
Description
技术领域
本发明涉及过氧化酶的固定化技术,具体地说,涉及一种纳米介孔材料固定化过氧化酶、以及其作为催化剂的氧化反应方法。
背景技术
众所周知,酶在体外的条件下,极易失活,所以导致其工业化生产有一定的困难。在不同条件下,不适宜的反应环境会导致酶失活或者催化效率低下。因此,如果要进一步开拓辣根过氧化物酶的应用水平,需要提高其稳定性。
而采用将酶进行固定化处理解决了大部分难题。酶的固定化方法有很多种,比如吸附法、交联法、包埋法和共价健法等;吸附法由于相互作用很弱,所以会导致固定化物很容易进入反应液中,不能再加以利用,而共价键、交联等化学的方法,易改变酶活,所以很少用于工业反应。因此,现在开始选择将酶用介孔材料进行处理,将酶保护在介孔材料孔道内,介孔材料的孔道为其提供合适的微环境,使得反应底物能够扩散进入孔道内,被酶催化发生反应,反应完成后,未反应的底物和产物又扩散出去,然后简单的清洗离心或过滤后,可以反复使用固定化酶。
传统的苯胺的硝化一般有三步:保护氨基、硝化、水解。其中采用浓硫酸、浓硝酸作为硝化试剂进行硝化,在碱性条件下进行水解。用这种方法进行苯胺的硝化要求的条件苛刻,产物不易分离开来,选择性低,还会污染环境。
目前,工业上生产二氧化硫脲都采用以硫脲和双氧水为反应物,在催化剂的催化下生成二氧化硫脲。由于硫脲和双氧水的反应是一个可逆反应,当加入的双氧水的量不足时,反应不能完全进行,导致硫脲没有完全反应,产率很低,但是当加入的双氧水过量时,可能让二氧化硫脲进一步氧化,同时设备也会被腐蚀,所以反应在控制物料的配比方面要求很严格。在这个反应中,除了控制反应温度、pH值等条件以外,加入的催化剂多为化学催化剂,如碳酸氢铵、丙酮等,添加剂的配比也要严格控制,所以较为麻烦。而且大量的过氧化氢和多种添加剂造成了生产成本的提高,反应后剩余在的母液,而母液重复利用次数有限,故而导致污染环境。
因此,是否可以采用固定化过氧化物酶作为生物催化剂用于氧化反应中,这样在硝化反应中减少双氧水的用量,使反应平衡向右移动,无需加入添加剂就可以使得产率提高,而且固定化酶可以反复使用,使得在工业生产上节约了成本。这样使得工业生产大大简便,同时节约了成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米介孔材料固定化过氧化酶,保持酶的催化活性,稳定性好且可反复使用。
本发明的另一目的是提供上述纳米介孔材料固定化过氧化酶的制备方法。
本发明的另一目的是提供纳米介孔材料固定化过氧化酶在作为催化剂中的应用。
本发明的再一目的是提供纳米介孔材料固定化过氧化酶作为催化剂的氧化反应方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明提供一种纳米介孔材料固定化过氧化酶,采用将过氧化酶镶嵌于纳米介孔材料中。
其中,所述过氧化酶为辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶或葡萄糖氧化酶,其酶活为120-185U/mg。
所述纳米介孔材料的孔径为10nm-20nm之间,孔容为1.000-2.000cm2/g。
所述纳米介孔材料的比表面积为380-420m2/g。
所述纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶活为120-150U/mg。
所述纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶含量:50%-60%(摩尔百分含量)。
所述纳米介孔材料采用如下方法制备而成:
1)先将模版剂用强酸溶解,与扩孔剂在35-40℃反应2-4小时,再加入前驱体反应18-30小时,反应后将中间产物处理成粉末,得粉末状中间产物;
2)然后将粉末状中间产物在80-90℃浓酸条件下反应12-20h,水洗至中性后烘干得到纳米材料最终产物。
所述模版剂为P123(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯)、EG20PG40EG20(聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇)等。
所述扩孔剂为TMB(1,3,5-三甲基苯)、TIPB(1,3,5-三异丙苯)、CCl4(四氯化碳)、异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)等。
所述前驱体为TMOS(四甲氧基硅烷)、TEOS(正硅酸乙酯)、苯基三乙氧基硅烷。
所述模版剂、扩孔剂与TMOS三者的重量比为:8-10:1:15-20,优选为10:1:20。
所述浓酸条件下,HCl或硫酸的浓度为1-2mol·L-1。
其中,步骤1)中反应物处理成粉末采用先进行烘干、分别水、甲醇洗涤、抽滤、再经烘干成粉末。
所述纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶活为120-150U/mg。
所述纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶含量:50%-60%(摩尔百分含量)。
本发明还提供一种纳米介孔材料固定化过氧化酶的制备方法,其包括如下步骤:
先将上述纳米介孔材料与过氧化酶在0-4℃、pH6.2-6.5条件下进行搅拌混合4-6小时,然后经离心分离而成。
本发明所述纳米介孔材料固定化过氧化酶可作为催化剂使用。优选将其用以催化胺类化合物的硝化反应和硫脲的氧化反应。
其中,纳米介孔材料固定化辣根过氧化物酶在用于催化苯胺类化合物的硝化反应方法中,所述纳米介孔材料固定化辣根过氧化物酶,作为催化剂用量为1-2mg可催化120mmol苯胺类化合物反应。
胺类化合物(苯胺、邻甲苯胺或对甲苯胺)、亚硝酸钠与过氧化氢的摩尔用量比为5:60-100:10,优选为1:12:2,PH值为6.2-7。
纳米介孔材料固定化辣根过氧化物酶在用于催化硫脲的氧化反应方法中,所述纳米介孔材料固定化辣根过氧化物酶作为催化剂的用量为1-2mg可催化200mmol硫脲类化合物反应。
硫脲、H2O2的摩尔用量比为1:1-2,优选为1:1.2,PH值为6.2-7。
经验证,本发明所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶采用将辣根过氧化物酶直接镶嵌于合适孔径的纳米介孔材料中,保持其催化活性,提高其稳定性。而且由于未采用键合方式固定辣根过氧化物酶,所以其酶活很高,可以反复使用。
本发明所述纳米介孔材料固定化过氧化酶作为催化剂用于催化胺类化合物的硝化反应和硫脲的氧化反应,通过摸索得出其适合的反应条件,得出反应产率,使其能够早日应用在工业生产方面。
附图说明
图1为辣根过氧化物酶标准曲线;
图2为纳米介孔材料的氮气吸附-脱附等温线;
图3为固定化酶后纳米介孔材料的氮气-吸附-脱附等温线;
图4为苯胺的硝化反应物HPLC谱图;其中峰1:未反应的苯胺,峰2:对硝基苯胺,峰3:邻硝基苯胺;
图5为对甲苯胺的硝化反应HPLC谱图,峰1:未反应的对甲苯胺,峰2:4-甲基-2-硝基苯胺;
图6为邻甲苯胺的硝化反应HPLC谱图;峰1:2-甲基-4-硝基苯胺,峰2:未反应的邻甲苯胺。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1纳米材料的制备:
用天平称取2gP123量取1.6mol·L-1HCl溶液75mL,用盐酸溶解P123后,倒入圆底烧瓶中,放入磁力搅拌子,置于恒温油浴磁力搅拌器内,在35℃下,加入0.2gTMB搅拌3小时。然后加入称取的4g的TMOS,继续在35℃下反应24小时。取出反应物,放入反应釜中,用烘箱在100℃下烘24小时。抽滤后,用水洗3次,再用甲醇洗3次,每次加入水或甲醇后,大约搅拌30分钟左右。将得到的抽滤后的粉末置于培养皿中,用保鲜膜密封,用针头戳上密集的孔,放入通风厨中风干至次日,然后放在60℃烘箱中烘6小时。取出粉末,用研钵研碎,加入硫酸(20mL硫酸、60mL水),放入圆底烧瓶中,在90℃下冷凝回流加热12小时。反应完成后,将反应物用水洗至pH约为7.0,然后再用甲醇洗一次,再将洗后的粉末置于培养皿中,放入通风厨,12小时后在60℃烘箱中烘干6小时,取出,装入15mL离心管后放入真空干燥器中存储。
实施例2辣根过氧化物酶的固定化
称取辣根过氧化物酶5mg(固定化之前酶活为160±5U/mg),称取制备的纳米介孔材料20mg,将酶与材料混合后置入离心管,加入8mL缓冲液,0℃冰浴搅拌6小时。取出离心管3000rpm的转速下离心15分钟。将上清液与沉淀分离后,用缓冲液洗涤沉淀三次直至上清液中无辣根过氧化物酶。
实施例3固定化酶的固定量及酶活的检测
1、固定化酶的固定量检测
用紫外分光光度计测定固定化酶的量:测定从0.05mg·mL-1至0.25mg·mL-1辣根过氧化物酶的标准曲线,然后测上清液的吸光度值。
先配制0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL的辣根过氧化物酶溶液,在402nm处测定吸光值,可得到如图1的标准曲线。
根据标准曲线,标准曲线y=1.784x-0.0127可以计算得上清液中剩余的未固定的酶含量是2.23mg,则辣根过氧化物酶的固定量是2.73mg,固定化酶的量较大,占总酶的量的54.6%,表明当P123与TMB的比例为10:1时,介孔材料的孔径是适合固定辣根过氧化物酶的。
2、辣根过氧化物酶酶活的检测
用紫外分光光度计测固定化酶的酶活(采用沃辛通法):用40mL蒸馏水溶解810mg苯酚,加入25mg4-氨基安替比林,加蒸馏水定容至50mL得到4-氨基安替比林溶液;取1mL过氧化氢,用蒸馏水定容至100mL,再取稀释后的溶液1mL,用配好的磷酸缓冲液稀释到50mL得到过氧化氢溶液。取配好的4-氨基安替比林1.4mL,过氧化氢1.5mL,固定化酶溶液稀释后取0.1mL形成反应体系,在401nm下,测定5分钟内吸光度变化值,采用蒸馏水做对照。
采用沃辛通法测定酶活力,辣根过氧化物酶催化过氧化氢反应,其中4-氨基安替比林作为供氢体,在410nm下检测反应物在5分钟内吸光度的变化值,在25℃时,pH=7.0时,每分钟辣根过氧化物酶分解1umol过氧化氢所需要的酶的量就是1个过氧化物酶活力单位。通过计算,可以得到固定化辣根过氧化物酶的活力是136.8U/mg,与未固定化时的酶的活力相比较可知,酶的活力有一些下降,这可能是由于固定化后影响了酶分子的结构,影响了反应物分子的扩散等原因。反应后回收固定化的辣根过氧化酶经重复使用数次后测定酶活降低很少,仍可催化反应。
实施例4氮气等温吸附脱附分析测定是否被固定在介孔材料中
将制备好的介孔材料和固定化酶后的介孔材料都用氮气吸附脱附进行分析。分析开始前首先在300℃下脱气处理5小时,然后再液氮温度下测定检测样品的吸附脱附等温线,可以采用BET模型得到材料的比表面积,采用BJH模型可以得出材料的孔径分布线。
利用水热合成法,以TMOS为前驱体,采用不同比例的模板剂P123和扩孔剂TMB合成了3种不同孔径的纳米介孔材料(三种分别为1:10,1:1,1:20)。大小可调的孔径是介孔材料最重要的方面,孔径增大,一些生物大分子、金属化合物等可以有选择性的进入孔道,反应物、溶剂分子在孔道中的扩散更加迅速,实现了分子级别的筛选。介孔材料在制备中加入扩孔剂后,孔径可以达到20纳米,可容纳蛋白等,其特殊的窗口连接,高的三维热稳定性,使其在大分子酶固定方面有着很大的应用前景。
由于孔径不同,所以要选择最适孔径的介孔材料来固定化辣根过氧化物酶。根据后面检测得到的酶的固定量可知,其中最适合的是第一组,模板剂P123和扩孔剂TMB的比例为10:1。其余比例由于孔径过大或过小,不能使得酶进入后固定在纳米介孔材料中。其氮气吸附-脱附的表征从图2、3中可以看出,其中图2是纳米介孔材料的氮气吸附-脱附等温线,图3是固定化酶后纳米介孔材料的氮气-吸附-脱附等温线。
借助BET模型和BJH模型,可以计算得到当P123:TMB=10:1时,纳米介孔材料的比表面积为402.903m2/g,孔容为1.084cm2/g,孔径为10.76nm。而固定化辣根过氧化物酶后的介孔材料的各个结构参数相比未固定时,均变小了,则可以得出辣根过氧化物酶已经被固定在介孔材料中的结论。
实施例5
用天平称取1.6g EG20PG40EG20(聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇)量取1mol·L- 1HCl溶液75mL,用盐酸溶解EG20PG40EG20后,倒入圆底烧瓶中,放入磁力搅拌子,置于恒温油浴磁力搅拌器内,在37℃下,加入0.2g TIPB搅拌4小时。然后加入称取的4g的TEOS(正硅酸乙酯),继续在35℃下反应30小时。取出反应物,放入反应釜中,用烘箱在100℃下烘24小时。抽滤后,用水洗3次,再用甲醇洗3次,每次加入水或甲醇后,大约搅拌30分钟左右。将得到的抽滤后的粉末置于培养皿中,用保鲜膜密封,用针头戳上密集的孔,放入通风厨中风干至次日,然后放在60℃烘箱中烘6小时。取出粉末,用研钵研碎,加入硫酸(20mL硫酸、60mL水),放入圆底烧瓶中,在85℃下冷凝回流加热16小时。反应完成后,将反应物用水洗至pH约为7.0,然后再用甲醇洗一次,再将洗后的粉末置于培养皿中,放入通风厨,12小时后在60℃烘箱中烘干6小时,取出,装入15mL离心管后放入真空干燥器中存储。
称取木质素过氧化物酶5mg(固定化之前酶活为130±10U/mg),称取制备的纳米介孔材料20mg,将酶与材料混合后置入离心管,加入8mL缓冲液,4℃冰浴搅拌4小时。取出离心管3000rpm的转速下离心15分钟。将上清液与沉淀分离后,用缓冲液洗涤沉淀三次直至上清液中无木质素过氧化物酶。
经测定,纳米介孔材料的孔径为10.55nm,孔容为1.056cm2/g;比表面积为401.535m2/g。
纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶活为108.3U/mg;酶含量为51%(摩尔百分含量)。
实施例6
用天平称取2gP123量取2mol·L-1HCl溶液75mL,用盐酸溶解P123后,倒入圆底烧瓶中,放入磁力搅拌子,置于恒温油浴磁力搅拌器内,在40℃下,加入0.2g CCl4(四氯化碳)搅拌4小时。然后加入称取的3g的TMOS,继续在40℃下反应18小时。取出反应物,放入反应釜中,用烘箱在100℃下烘24小时。抽滤后,用水洗3次,再用甲醇洗3次,每次加入水或甲醇后,大约搅拌30分钟左右。将得到的抽滤后的粉末置于培养皿中,用保鲜膜密封,用针头戳上密集的孔,放入通风厨中风干至次日,然后放在60℃烘箱中烘6小时。取出粉末,用研钵研碎,加入硫酸(20mL硫酸、60mL水),放入圆底烧瓶中,在80℃下冷凝回流加热20小时。反应完成后,将反应物用水洗至pH约为7.0,然后再用甲醇洗一次,再将洗后的粉末置于培养皿中,放入通风厨,12小时后在60℃烘箱中烘干6小时,取出,装入15mL离心管后放入真空干燥器中存储。
称取葡萄糖氧化酶2mg(固定化之前酶活为160±10U/mg),称取制备的纳米介孔材料20mg,将酶与材料混合后置入离心管,加入8mL缓冲液,0℃冰浴搅拌6小时。取出离心管3000rpm的转速下离心15分钟。将上清液与沉淀分离后,用缓冲液洗涤沉淀三次直至上清液中无葡萄糖氧化酶。
经测定,纳米介孔材料的孔径为10.89nm,孔容为1.234cm2/g;比表面积为410.225m2/g。
纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶活为156U/mg;酶含量为49%(摩尔百分含量)。
实施例7固定化辣根过氧化物酶催化苯胺类化合物的硝化反应
首先,将实施例2获得的固定化辣根过氧化物酶2mg用10mL缓冲溶液稀释混匀,取出3mL装入三口烧瓶中,加入磷酸缓冲液7mL,加入磁力搅拌子,将装置固定好后,抽真空通入氮气制造无氧环境。加入60mmol·L-1的亚硝酸钠10mL,然后滴加10mmol·L-1的过氧化氢10mL,再加入5mmol·L-1的胺类化合物(苯胺、邻甲苯胺、对甲苯胺)10mL启动硝化反应,反应十分钟后结束。
采用高效液相色谱法分析
将苯胺类化合物硝化反应结束后得到的溶液离心,然后用冻干机冻干,再用甲醇溶解产物,得到的甲醇溶解液用高效液相色谱分析其中的成分组成。
用高效液相色谱分析仪分析苯胺类化合物硝化反应的产物的色谱条件是采用C18的柱子,流动相是乙腈和水,流速设为1mL·min-1,采用梯度洗脱,检测波长是254nm。首先用5%的乙腈洗脱5分钟,然后在5到40分钟内,设置梯度洗脱从5%的乙腈上升至100%的乙腈。
如图4-6所示,通过上述分析,可以推论,在辣根过氧化物酶、H2O2、NO2-的存在下(缺少任一条件,都无法发生反应),苯胺类化合物可以发生硝化反应。反应大约在8分钟时停止,为了保证完全反应,一般将时间控制在10分钟左右。反应中加入了磷酸缓冲液,确保辣根过氧化物酶在其最佳的pH环境条件下催化反应,事实证明,在pH为7左右,硝化反应的产物浓度达到最大,在pH高于9或者低于3时,基本上不发生反应,这是因为此时酶已经失活。
过氧化氢的浓度也会影响反应,当过氧化氢浓度增加时,产物也逐渐增多,但是当过氧化氢增加到一定浓度时,硝化反应的产物基本不增加了,为了保证过氧化氢的浓度不影响反应,所以试验中采用的过氧化氢浓度约是苯胺的两倍。亚硝酸盐浓度在60到100mmol/L时,能使反应顺利进行,若亚硝酸盐浓度过大,会引起酶的失活,不利于反应。
实施例8固定化辣根过氧化物酶催化硫脲的氧化反应
在500mL的三口烧瓶中,加入100mL水、15.2g的硫脲,加入pH为6.2的缓冲溶液调节反应体系的pH,加入2mg实施例2获得固定化辣根过氧化物酶(用10ml缓冲液稀释)加入磁力搅拌子,固定好装置,冰水浴下,缓慢加入46mLH2O2后,搅拌反应1.5小时,反应结束后,在碎冰中静置,等待1小时至晶体完全析出。然后快速过滤,收集母液,用乙醇洗涤得到的白色粉末,得到的产物放在烘箱中50℃干燥,得到产物和母液等待分析。
将得到的固体粉末称重,由于红外光谱的特征吸收峰可以识别化合物中的有机官能团,所以利用傅立叶红外光谱分析仪将产物与标准的二氧化硫脲对比分析。
硫脲的氧化反应结束后,可以得到白色的晶体和过滤完晶体后剩余的母液,由于反应体系的pH值控制在6.2左右,虽然辣根过氧化物酶的活性在这个范围比较高,但是二氧化硫脲在pH大于6时,极易分解出亚硫酸,而亚硫酸的还原能力很强,会与双氧水发生反应,导致反应中的副反应增多,出现一些不需要的杂质,使反应产率减小。
由产物和二氧化硫脲的标准品的红外光谱图对照可知,产物的FTIR数据为:3266cm-1,υO-H(-SO2H);3074cm-1,υN-H(-NH2,=NH);1701cm-1,υC=N;1346cm-1,1071cm-1,υC-N;1026cm-1,υS=O。,与标准品一致。因此析出的白色晶体即为纯的二氧化硫脲,称重为10.9g,反应产率为50%。反应产率过小,除了反应过程中转移损失,最主要的原因可能是由于反应环境的pH值不适,需要进一步优化条件来提高反应产率。
虽然已经详细说明了本发明及其优点,但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且,本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解,根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此,所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
Claims (10)
1.一种纳米介孔材料固定化过氧化酶,其特征在于,采用将过氧化酶镶嵌于纳米介孔材料中,所述纳米介孔材料的孔径为10nm-20nm之间,孔容为1.000-2.000cm2/g。
2.根据权利要求1所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶,其特征在于,所述过氧化酶为辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶或葡萄糖氧化酶。
3.根据权利要求1或2所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶,其特征在于,所述纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶活为120-150U/mg。
4.根据权利要求1所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶,其特征在于,所述纳米介孔材料固定化过氧化酶的酶含量为50%-60%。
5.根据权利要求1所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶,其特征在于,所述纳米介孔材料采用如下方法制备而成:
1)先将模版剂用强酸溶解,与扩孔剂在35-40℃反应2-4小时,再加入前驱体反应18-30小时,反应后将中间产物处理成粉末,得粉末状中间产物;
2)然后将粉末状中间产物在80-90℃浓酸条件下反应12-20小时,水洗至中性后烘干得到纳米材料最终产物。
6.根据权利要求1或2所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶,其特征在于,所述模版剂、扩孔剂与前驱体三者的重量比范围为:8-10:1:15-20,其中最佳为10:1:20。
7.权利要求1-6任意一项所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶的制备方法,其特征在于,其包括如下步骤:
先将上述纳米介孔材料与过氧化酶在0-4℃、pH6.2-7条件下进行搅拌混合4-6小时,然后经离心分离而成。
8.权利要求1-6任意一项所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶在用于作为催化剂中的应用。
9.采用权利要求1-6任意一项所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶催化苯胺类化合物的硝化反应方法,其特征在于,所述纳米介孔材料固定化辣根过氧化物酶用量为1-2mg催化120mmol苯胺类反应;所述胺类化合物、亚硝酸钠与过氧化氢的摩尔用量比为5:60-100:10,优选为1:12:2,PH值为6.2-7。
10.采用权利要求1-6任意一项所述的纳米介孔材料固定化过氧化酶催化硫脲的氧化反应方法,其特征在于,所述纳米介孔材料固定化辣根过氧化物酶的用量为1-2mg催化200mmol硫脲类反应;硫脲、H2O2的摩尔用量比为1:1-2,优选为1:1.2,PH值为6.2-7。
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