CN109536434A - 基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞分选技术和生物医学磁传感器技术的交叉领域,具体涉及一种基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法及系统,包括细胞筛选装置,所述细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体,所述腔体中充满了细胞缓冲液;所述筛选方法,包括如下步骤,S1.将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中;S2.对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡,将免疫磁珠吸入上层腔体,目标细胞吸附在细胞筛的下表面;S3.分别冲洗得到包含游离的免疫磁珠的溶液、包含其他细胞的溶液和包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。该方法采用物理的方式实现细胞筛选,能够极大的提高目标细胞的捕获率,并且用于完成本发明方法的装置容易集成传感器,满足大数据时代的信息化需求。
Description
技术领域
本发明属于细胞分选技术和生物医学磁传感器技术的交叉领域,具体涉及一种基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法及系统。
背景技术
免疫磁珠在分子及细胞生物学方面已得到了广泛应用,包括核酸提取、特定蛋白质与细胞的分选和富集等。以基于免疫磁珠的细胞分选为例,该过程共分为四个步骤:(1)用特异性配体或抗体对磁珠进行表面修饰;(2)将经过修饰的磁珠通过抗原—抗体反应或配体—受体结合反应与样品中目标细胞进行结合;(3)通过磁力吸附磁珠—细胞结合体;(4)通过冲洗等手段除去其它细胞。
现有基于免疫磁珠的细胞筛选技术直接通过磁力对磁珠进行吸引,导致其对于与细胞结合的免疫磁珠和未结合的免疫磁珠没有区分能力,在对磁珠进行表面增强拉曼、杂散磁场测量等进一步定性/定量检测时无法除去由未结合的磁珠引起的噪声信号,限制了免疫磁珠的进一步应用。
在实验室研究中,国际顶尖研究单位已通过在磁传感器上表面制备特异性抗体的方式,与目标细胞表面抗原结合,从而将目标细胞成功捕获在磁传感器上方。再通过流体冲洗,就可以实现磁标记细胞的筛选。
但是,现有实验室磁传感器的检测方案中,依靠目标细胞表面抗原和传感器上方抗体的结合来实现目标细胞的捕获,并依靠流体冲刷来除去未结合的磁珠。该方案可以除去其它细胞与未结合的磁珠,但难以保证微量目标细胞被成功捕获。并且,这一方案使用了化学结合的方式,对循环肿瘤细胞等极微量的细胞难以保证成功捕获,这样就会在诊断中引起误诊。另外,这种通过抗体—抗原结合捕获目标细胞的方法需要人工参与,而且必须需要专业的技术人员才能够完成,不利于集成,无法满足大数据时代的信息化需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,该方法采用物理的方式实现细胞筛选,能够极大的提高目标细胞的捕获率,并且用于完成本发明方法的装置容易集成传感器,满足大数据时代的信息化需求。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,包括细胞筛选装置,所述细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体,所述腔体中充满了细胞缓冲液;所述筛选方法,包括如下步骤,
S1.将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中;
S2.对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡,将免疫磁珠吸入上层腔体,目标细胞吸附在细胞筛的下表面;
S3.分别冲洗得到包含游离的免疫磁珠的溶液、包含其他细胞的溶液和包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
进一步地,所述步骤S3的具体操作步骤为:
S31.撤销纵向磁场和横向振荡,对上层腔体进行冲洗,得到包含游离的免疫磁珠的溶液;
S32.施加纵向磁场,对下层腔体进行冲洗,得到包含其他细胞的溶液;
S33.撤销纵向磁场,对下层腔体进行冲洗,得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
进一步地,所述步骤S3的具体操作步骤为:
S31.撤销横向振荡,对下层腔体进行冲洗,得到包含其他细胞的溶液;
S32.撤销纵向磁场,对上层腔体进行冲洗,得到包含游离的免疫磁珠的溶液,对下层腔体进行冲洗,得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
进一步地,所述纵向磁场由永磁体、软磁体或者电磁体产生。
进一步地,所述横向振荡包括横向振荡磁场和/或横向振荡波和/或横向交变水流。
进一步地,所述横向振荡磁场由电磁体产生;所述横向震荡波为横向振荡微波或者横向振荡电磁波。
进一步地,细胞筛选装置的左侧,对应下层腔体设置有进样口;细胞筛选装置的右侧,对应上层腔体和下层腔体分别设置有上层出样口和下层出样口。
进一步地,所述细胞筛的网孔形状为圆形或狭缝型。
进一步地,所述样品输入以及冲洗的操作是通过注射泵或者微流泵来实现的。
本发明的另一个目的在于提供一种基于免疫磁珠标记的细胞筛选系统,其特征在于:包括细胞筛选装置、永磁铁、电磁铁和注射泵,
所述细胞筛选装置包括内部中空的长方体状壳体,壳体内部水平设置一层细胞筛将壳体分割成上层腔体和下层腔体;对应下层腔体,壳体的左侧设置有进样口,右侧设置有下层出样口,对应上层腔体,壳体的右侧设置有;
所述电磁铁包括两个通电线圈,分别设置在细胞筛选装置的左右两侧,永磁铁设置在细胞筛选装置的上侧;
所述注射泵的连接端口分别与下层出样口和下层出样口相连通。
本发明的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,相对于现有技术具有以下有益效果:
(1)本发明使用物理方式实现细胞筛选,通过对磁场梯度、冲洗流速、腔体尺寸的调整,目标细胞的捕获率可达99.9%以上,将大大提高了循环肿瘤细胞等微量细胞的筛选效果。同时,自由免疫磁珠的筛出率可达99%,可实现高信噪比磁性细胞检测;
(2)本发明的方法操作简便,难度小,不需要专业的技术人员参与,而且,用于完成本发明方法的装置容易集成传感器,能够满足大数据时代的信息化需求。
附图说明
图1为细胞筛选装置的一种结构示意图;
图2为步骤S1的操作示意图;
图3为步骤S2的操作示意图;
图4为步骤S3的操作示意图;
图5为步骤S4的操作示意图;
图6为步骤S5的操作示意图;
图7为本发明的筛选系统的一种结构示意图;
图7中:1-细胞筛选装置;11-细胞筛;12-进样口;13-下层出样口;14-上层出样口;2-永磁铁;3-电磁铁;4-注射泵。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图和实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
本发明的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,包括,如图1所示的细胞筛选装置,细胞筛选装置包括内部中空的长方体状壳体,壳体内部水平设置一层细胞筛将壳体分割成上层腔体和下层腔体,腔体内充满了磷酸盐缓冲液PBS。细胞筛选装置的左侧,对应下层腔体设置有进样口;细胞筛选装置的右侧,对应上层腔体和下层腔体分别设置有上层出样口和下层出样口。
在本实施例中,将细胞筛选装置的壳体设置为长方体状,仅为一种优选方式,当然,细胞筛选装置的壳体可是圆柱形、正方体等规则形状,还可以是任何不规则形状,本领域的技术人员可根据需要具体设置。
其中,细胞筛可由硅片制成,也可由聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯等高分子材料制成。对于细胞筛网孔的形状、尺寸和排布无硬性要求,只要网孔的尺寸介于目标细胞的直径与免疫磁珠的直径之间即可,网孔的形状一般为圆形或者是狭缝型,网孔可通过纳米压印或者光刻技术制备而成。在本实施例中,细胞筛选用650微米厚的硅片经光刻技术制备而成。而网孔选用狭缝型,具体采用长为28微米,宽8微米的矩形网孔,网孔间间距为8微米。
其中,免疫磁珠采用四氧化三铁制成的磁珠,直径为20纳米,磁珠外层设置包被,包被的材料可为金、二氧化硅和聚苯乙烯,在本实施例中,磁珠外层由聚苯乙烯包被,表面由被测细胞的特异性抗体修饰。
筛选之前,首先通过抗原-抗体结合标记目标细胞得到包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品。
筛选方法的体步骤如下:
S1.如图2所示,将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中。
S2.如图3所示,对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡,将免疫磁珠吸入上层腔体,目标细胞吸附在细胞筛的下表面。
纵向磁场的作用是通过磁场对免疫磁珠吸引,使得游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞向上运动,纵向磁场一般由永磁体、软磁体或者电磁体产生。横向振荡的作用是使得游离的免疫磁珠轻微晃动,进而使得免疫磁珠在经过细胞筛时,具有高的通过率。横向振荡可以是磁场产生横向振荡磁场,也可以是一种横向振荡波,包括微波、超声波等。在本实施例中,选定纵向磁场由钕铁硼材料制成的永磁铁产生,钕铁硼磁铁具有优异的磁性能,表面剩余磁化强度可达2000oe。横向振荡由电磁铁产生横向振荡磁场提供,电磁铁结构简单,容易控制,并且可通过调整磁力线圈的匝数和缠绕直径来调整磁场的大小,通常振荡频率设置在1-100HZ。在本实施例中,选用100oe,100HZ的振荡梯度磁场即可,用于向磁珠施加横向磁力,提高筛出率。
在进行步骤S2之前,在细胞筛选装置的两侧,分别设置磁力线圈,并通电,在细胞筛选装置上层腔体的一侧放置钕铁硼磁铁。
施加磁场后,游离的免疫磁珠和被免疫磁珠标记的目标细胞在磁场的作用力下,均朝向细胞筛运动,游离的免疫磁珠直径通常小于500nm,远小于细胞筛的网孔尺寸,因此可顺利通过网孔进入到上层腔体,而被免疫磁珠标记的目标细胞直径通常在15μm以上(如肿瘤细胞)大于细胞筛的网孔,因此被细胞筛所阻挡。在本实施例中,细胞筛如果选用圆形设计,那么有一部分细胞筛的网孔就会被目标细胞完全所阻挡,可能有一部分游离的磁珠就会滞留在下层腔体中,而选用矩形网孔则不会出现这个问题,被免疫的磁珠标记的目标细胞虽然由于磁场的作用而吸附在细胞筛上,但是因为形状不同,不会将矩形的网孔完全阻塞,由于免疫磁珠的体积相对于被免疫磁珠标记的目标来说要小得多,因此免疫磁珠能够顺利的通过网孔,提高了磁珠的筛出率。
S31.如图4所示,撤销磁场纵向磁场和横向振荡,对上层腔体进行冲洗,得到包含有游离的免疫磁珠的溶液,对上层腔体进行冲洗,得到包含有游离的免疫磁珠的溶液。
将磁场纵向磁场和横向振荡撤销,游离的免疫磁珠受到的磁场作用力消失,通过对上层腔体冲洗,能够容易得到只包含有游离的免疫磁珠的溶液。
S32.如图5所示,施加纵向磁场,对下层腔体进行冲洗,得到包含有其他细胞的溶液。
施加纵向磁场,由于磁场的吸附作用,以及细胞筛的阻挡作用,被免疫磁珠标记的目标细胞被牢牢的吸附在细胞筛的下侧面,此时选择合适的流速对下层腔体冲洗,即可得到包含有其他细胞的溶液。
S33.如图6所示,撤销纵向磁场,对下层腔体进行冲洗,得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
撤销纵向磁场,被免疫磁珠标记的目标细胞受到的磁场作用力消失,通过对下层腔体冲洗,即可得到只包含有被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
上述样品的输入,以及对上、下层腔体的冲洗,一般是通过泵来实现的,例如,当细胞筛选装置是宏观装置时,可以采用注射泵;当细胞筛选装置是微观装置时,可以采用微流泵。本实施例通过注射泵控制液体样品的流动,从而得到包含不同种类的溶液。
相对于现有技术的化学筛选方式,本发明使用物理方式实现细胞筛选,通过对磁场梯度、冲洗流速、腔体尺寸的调整,目标细胞的捕获率可达99.9%以上,将大大提高了循环肿瘤细胞等微量细胞的筛选效果。同时,自由免疫磁珠的筛出率可达99%,可实现高信噪比磁性细胞检测。
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处在于,本实施例中横向振荡选用横向振荡微波,由微波发生器产生。免疫磁珠在横向微波的作用力下,轻微晃动,免疫磁珠经过细胞筛的速率和通过率都很高。
实施例3
实施例3与实施例1的不同之处在于,本实施例中横向振荡选用横向交变水流。免疫磁珠在横向交变水流的作用力下,轻微晃动,免疫磁珠经过细胞筛的速率和通过率都很高。
实施例4
实施例4与实施1的不同之处在于,在本实施例中,步骤S3具体为:
步骤S31,撤销横向振荡,对下层腔体进行冲洗,得到包含其他细胞的溶液;
步骤S32,撤销纵向磁场,对上层腔体进行冲洗,得到包含游离的免疫磁珠的溶液,对下层腔体进行冲洗,得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
实施例4中的操作步骤更加简便。
实施例5
对应实施例1,本发明提供一种细胞筛选系统,包括细胞筛选装置1、永磁铁2、电磁铁3和注射泵5。
所述细胞筛选装置1包括内部中空的长方体状壳体15,壳体15内部水平设置一层细胞筛11将壳体15分割成上层腔体和下层腔体;对应下层腔体,壳体15的左侧设置有进样口12,右侧设置有下层出样口13,对应上层腔体,壳体15的右侧设置有上层出样口14。在本实施例中,细胞筛11选用650微米厚的硅片经光刻技术制备而成。而网孔选用狭缝型,具体采用长为28微米,宽8微米的矩形网孔,网孔间间距为8微米。
所述电磁铁铁2包括两个通电线圈31,分别设置在细胞筛选装置1的左右两侧,永磁铁2设置在细胞筛选装置1的上侧;所述注射泵4的连接端口分别与下层出样口13和下层出样口14相连通。
应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,包括细胞筛选装置,所述细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体,所述腔体中充满了细胞缓冲液;其特征在于,所述筛选方法,包括如下步骤,
S1.将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中;
S2.对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡,将免疫磁珠吸入上层腔体,目标细胞吸附在细胞筛的下表面;
S3.分别冲洗得到包含游离的免疫磁珠的溶液、包含其他细胞的溶液和包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述步骤S3的具体操作步骤为:
S31.撤销纵向磁场和横向振荡,对上层腔体进行冲洗,得到包含游离的免疫磁珠的溶液;
S32.施加纵向磁场,对下层腔体进行冲洗,得到包含其他细胞的溶液;
S33.撤销纵向磁场,对下层腔体进行冲洗,得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
3.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述步骤S3的具体操作步骤为:
S31.撤销横向振荡,对下层腔体进行冲洗,得到包含其他细胞的溶液;
S32.撤销纵向磁场,对上层腔体进行冲洗,得到包含游离的免疫磁珠的溶液,对下层腔体进行冲洗,得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述纵向磁场由永磁体、软磁体或者电磁体产生。
5.根据权利要求1或2或3所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述横向振荡包括横向振荡磁场和/或横向振荡波和/或横向交变水流。
6.根据权利要求5所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述横向振荡磁场由电磁体产生;所述横向震荡波为横向振荡微波或者横向振荡电磁波。
7.根据权利要求5所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:细胞筛选装置的左侧,对应下层腔体设置有进样口;细胞筛选装置的右侧,对应上层腔体和下层腔体分别设置有上层出样口和下层出样口。
8.根据权利要求7所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述细胞筛的网孔形状为圆形或狭缝型。
9.根据权利要求1或2所述的基于免疫磁珠标记的细胞筛选方法,其特征在于:所述样品输入以及冲洗的操作是通过注射泵或者微流泵来实现的。
10.基于免疫磁珠标记的细胞筛选系统,其特征在于:包括细胞筛选装置(1)、永磁铁(2)、电磁铁(3)和注射泵(4),
所述细胞筛选装置(1)包括内部中空的长方体状壳体(15),壳体(15)内部水平设置一层细胞筛(11)将壳体(15)分割成上层腔体和下层腔体;对应下层腔体,壳体(15)的左侧设置有进样口(12),右侧设置有下层出样口(13),对应上层腔体,壳体(15)的右侧设置有(14);
所述电磁铁(2)包括两个通电线圈(31),分别设置在细胞筛选装置(1)的左右两侧,永磁铁(2)设置在细胞筛选装置(1)的上侧;
所述注射泵(4)的连接端口分别与下层出样口(13)和下层出样口(14)相连通。
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