CN109529039A - 一种载pd1抗体的靶向相变型纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种载pd1抗体的靶向相变型纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物制剂的技术领域，具体公开了一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒及其制备方法和应用，载PD1抗体的靶向相变型纳米粒包括以下组分：PLGA‑PEG‑GRGDS共聚物、Fe3O4纳米粒、PD1抗体和全氟戊烷，所述PLGA‑PEG‑GRGDS共聚物和Fe3O4纳米粒结合后包裹PD1抗体和全氟戊烷；载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法包括以下步骤：1)制备PLGA‑PEG‑GRGDS共聚物；2)采用改进的三步超声乳化及旋转蒸发法制备载PD1抗体的靶向相变型纳米粒。本发明中的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒能够应用在制备抗黑色素瘤药物中，将PD1抗体靶向递送至黑色素瘤组织中，提高PD1抗体在黑色素瘤组织内的浓度，同时联合光热治疗增强黑色素瘤组织中的T细胞抗肿瘤免疫应答，有效提高PD1抗体的治疗疗效。

Description

一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物制剂的技术领域，具体公开了一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
PD1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，以PD1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。在癌症免疫疗法中，免疫检查点抑制剂程序性死亡受体1抗体(PD1抗体)药物，显示出良好的临床疗效，基于大量临床研究结果，美国食品和药物管理局(FDA)批准PD1抗体药物应用于多种肿瘤的治疗，包括晚期黑色素瘤。
尽管PD1抗体药物治疗提高了黑色素瘤患者整体存活率的临床结果令人振奋，但是在转移性黑色素瘤中，PD1抗体药物治疗的客观反应率只有40％，因此，PD1抗体药物的临床疗效仍需进一步提高。在肿瘤组织中增加PD1抗体药物的浓度是提高其治疗疗效的有效方式之一，但是，这样的方式增加了PD1抗体药物的全身给药量，不仅提高了治疗费用，还可能会提高剂量依赖性自身免疫紊乱副反应的发生率，增大患者在治疗过程中的痛苦。此外，有研究发现，通过增强肿瘤组织中的T细胞抗肿瘤免疫应答，能够提高PD1抗体药物的疗效。因此，增加肿瘤组织中PD1抗体药物浓度的同时增强抗肿瘤免疫应答，是提高PD1抗体药物治疗黑色素瘤疗效的重要科学问题。
目前，有一些研究报道，载免疫检查点抑制剂药物的纳米颗粒不仅可以增加肿瘤组织中检查点抑制剂药物的浓度，还可以增强肿瘤组织中的免疫反应。然而，在这些研究中，载免疫检查点抑制剂药物的纳米颗粒只局限于肿瘤局部给药，例如微针贴片或瘤内注射，而不能适用于全身静脉注射，导致这种方法的应用受到限制。因此，有必要研究出一种新的载免疫检查点抑制剂药物的纳米颗粒，既可以在全身静脉注射后将PD1抗体药物有效地递送至肿瘤组织中的同时，又可以增强肿瘤组织中T细胞的抗肿瘤免疫应答。
发明内容
本发明意在提供一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒及其制备方法和应用，以提高PD1抗体在黑色素瘤组织中的浓度，同时增强黑色素瘤组织中T细胞的抗肿瘤免疫应答，提高对黑色素瘤的治疗疗效。
本发明提供的一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒，包括以下组分：PLGA-PEG-GRGDS共聚物、Fe3O4纳米粒、PD1抗体和全氟戊烷，所述PLGA-PEG-GRGDS共聚物和Fe3O4纳米粒结合后包裹PD1抗体和全氟戊烷。
基于本发明中的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒，本发明还提供了载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、制备PLGA-PEG-GRGDS共聚物：将聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-COOH)溶解于二氯甲烷(DCM)中，添加N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)后，在37℃条件下搅拌反应12h，过滤、洗涤、真空干燥得到沉淀物A；将沉淀物A溶解于DCM中，添加三乙醇胺(TEA)和氨基聚乙二醇羧基(NH2-PEG-COOH)，在37℃条件下搅拌反应12h，加水稀释后透析12h，收集下层沉淀冻干得到固体物B；将固体物B溶解于DCM中，添加NHS和DCC，在37℃条件下搅拌反应12h，过滤、洗涤、真空干燥得到沉淀物C；将沉淀物C溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，将多肽(GRGDS)溶解于DMF中，两者混合后添加TEA搅拌反应12h，再加入水稀释后透析12h，冻干得到的白色固体即为PLGA-PEG-GRGDS共聚物；
S2、溶解PLGA-PEG-GRGDS共聚物：将步骤S1中制备的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶解于DCM中；
S3、添加Fe3O4纳米粒：将Fe3O4纳米粒添加至步骤S2中的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶液中；
S4、制备乳化混合液：将PD1抗体与全氟戊烷混合，超声乳化20s，形成乳化混合液，超声功率为50W；
S5、二次乳化：将步骤S4中制备的乳化混合液加入步骤S3中制备的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶液，超声乳化60s，超声功率为50W；
S6、三次乳化：向步骤S5中制备的混合液中添加聚乙烯醇水溶液，超声乳化50s，超声功率为50W；
S7、搅拌离心：将步骤S6中制备的混合液进行磁力搅拌4h后，利用低温离心机离心，去离子水清洗后得到载PD1抗体的靶向相变型纳米粒；
所述步骤S2-S7均在冰浴中进行。
本发明所公开的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒能够应用在制备治疗黑色素瘤的药物中。
进一步，所述步骤S2中，PLGA-PEG-GRGDS共聚物的添加量为25mg，DCM的用量为2mL；所述步骤S3中，Fe3O4纳米粒的添加浓度为25mg/mL，添加量为100μL；所述步骤S4中，PD1抗体的添加浓度为2mg/mL，添加量为200μL，全氟戊烷的添加量为200μL；所述步骤S6中，聚乙烯醇水溶液的添加浓度为4％w/t，添加量为5mL。
进一步，所述步骤S7后，将步骤S7中制备的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒以去离子水稀释，4℃保存。
进一步，所述步骤S7中，低温离心机的转速为8000rpm，离心时间为8min。
本发明的有益效果如下：
相比于现有的肿瘤局部给药治疗技术，本申请中的相变型纳米粒能够进行全身静脉给药，打破肿瘤局部给药的限制，利用PLGA-PEG-GRGDS共聚物和Fe3O4纳米粒作为外壳，将PD1抗体和全氟戊烷包裹在内，通过纳米粒在实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR)及PLGA-PEG-GRGDS共聚物的主动靶向作用下，顺利将整个相变型纳米粒输送至黑色素瘤组织中。同时，利用光热治疗对黑色素瘤组织部位进行照射，相变型纳米粒外壳中的Fe3O4纳米粒作为吸光剂吸收热量，使得相变型纳米粒内部的全氟戊烷由液态转换为气态，破坏相变型纳米粒的外壳，实现定点地在黑色素瘤组织处释放PD1抗体，提高黑色素瘤组织处的PD1抗体浓度。并且，光热治疗以及气态全氟戊烷可以产生直接的细胞毒性，破坏黑色素瘤组织微血管，导致黑色素瘤细胞的死亡或凋亡，招募淋巴细胞进入黑色素瘤组织，协同提高PD1抗体的治疗疗效。不仅如此，Fe3O4纳米粒除了能作为吸光剂来激活液态全氟戊烷，还可以作为一种有效的免疫佐剂激活树突状细胞，进一步激活体内抗肿瘤免疫应答，进一步提高本申请中相变型纳米粒的治疗疗效。
附图说明
图1为GOP@aPD1NPs的扫描电镜图；
图2为GOP@aPD1NPs的透射电镜图；
图3为GOP@aPD1NPs在25℃时的光镜图像；
图4为GOP@aPD1NPs在37℃时的光镜图像；
图5为GOP@aPD1NPs在45℃时的光镜图像；
图6为GOP@aPD1NPs在37℃下有无激光辐照条件下PD1抗体的释放曲线图；
图7为不同浓度GOP@aPD1NPs与B16F10-luc细胞孵育10小时后在有无激光辐照条件下细胞活性变化图；
图8为各组小鼠14天后的血液指标中ALT、AST的检测结果图；
图9为各组小鼠14天后的血液指标中BUM、CR的检测结果图；
图10为各组小鼠14天后的血液指标中CK、LDH-L的检测结果图；
图11为各组小鼠不同时间点肿瘤近红外荧光成像的平均发光效率图；
图12为各组小鼠不同时间点血清中IL-6的水平变化情况图；
图13为各组小鼠不同时间点血清中TNF-α的水平变化情况图；
图14为各组小鼠不同时间点血清中INF-γ的水平变化情况图；
图15为各组小鼠的体重变化图；
图16为各组小鼠的相对肿瘤体积变化图；
图17为各组小鼠的存活率变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施对本发明作进一步详细的说明，但所述实施例仅用于理解本发明而不是限制本发明的范围。
实施例一
本实施例中的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒，包括以下组分：PLGA-PEG-GRGDS共聚物、Fe3O4纳米粒、PD1抗体和全氟戊烷，所述PLGA-PEG-GRGDS共聚物和Fe3O4纳米粒结合后包裹PD1抗体和全氟戊烷。
本实施例中的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法具体包括以下步骤：
S1、制备PLGA-PEG-GRGDS共聚物：称取2g聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-COOH)溶解于20mL二氯甲烷(DCM)中，再分别添加46mg的N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和83mg的N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)，在37℃条件下搅拌反应12h。反应完成后，采用低压抽滤，使用正庚烷溶液洗涤残余在滤纸上的残余物，真空干燥得到白色固体A。
称取1.8g白色固体A溶解于20mLDCM中，再分别添加32μL的的三乙醇胺(TEA)和600mg的氨基聚乙二醇羧基(NH2-PEG-COOH)，在37℃条件下搅拌反应12h。反应完成后，添加3-4倍体积的去离子水稀释后进行透析12h，收集下层沉淀冻干得到固体物B。
称取2g固体物B溶解于20mLDCM中，再分别添加46mg的NHS和83mg的DCC，在37℃条件下搅拌反应12h。反应完成后，采用低压抽滤，使用正庚烷溶液洗涤残余在滤纸上的残余物，真空干燥得到白色固体C。
称取1.5g白色固体C溶解于20mL二甲基甲酰胺(DMF)中，再称取180mg的多肽(GRGDS)溶解于1mLDMF中，两者混合后添加32μL的TEA搅拌反应12h，反应完成后，再添加3-4倍体积的去离子水稀释后进行透析12h，冻干得到的白色固体即为PLGA-PEG-GRGDS共聚物。
S2、溶解PLGA-PEG-GRGDS共聚物：称取步骤S1中制备的PLGA-PEG-GRGDS共聚物25mg，将其溶解于2mLDCM中。
S3、添加Fe3O4纳米粒：量取100μL、浓度为25mg/mL的Fe3O4纳米粒悬浮液，将其添加至步骤S2中的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶液中。
S4、制备乳化混合液：量取200μL、浓度为2mg/mL的PD1抗体溶液与200μL全氟戊烷混合，超声乳化20s，形成乳化混合液，超声功率为50W。
S5、二次乳化：将步骤S4中制备的乳化混合液加入步骤S3中制备的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶液，超声乳化60s，超声功率为50W。
S6、三次乳化：向步骤S5中制备的混合液中添加5mL、浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，超声乳化50s，超声功率为50W。
S7、搅拌离心：将步骤S6中制备的混合液进行磁力搅拌4h后，利用低温离心机离心，离心机的转速为8000rpm，离心时间为8min，离心结束后，使用去离子水清洗后得到载PD1抗体的靶向相变型纳米粒。
S8、保存：将步骤S7中制备的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒以去离子水稀释，4℃保存。
上述步骤S2-S7均在冰浴中进行。
本实施例中所制备的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒(简称为GOP@aPD1NPs，下同)的结构表征如图1和图2所示，图1为GOP@aPD1NPs的扫描电镜图(放大倍数为15000倍)，表明了合成的纳米粒呈球形，大小均匀一致，分散度好；图2为GOP@aPD1NPs的透射电镜图，表明了GOP@aPD1NPs的壳体内含有Fe3O4颗粒。实施例一中成功制备了GOP@aPD1NPs。另外，为了找到GOP@aPD1NPs的相变温度，在热板中连续观察GOP@aPD1NPs。如图3-5所示，在热板中，温度从室温(此室温指25℃)上升至37℃的过程中，GOP@aPD1NPs无明显变化，；当温度上升至45℃时，许多GOP@aPD1NPs蒸发并扩大。这就说明，本实施例中制备的GOP@aPD1NPs在37℃时较为稳定，而在45℃时液气相变扩大破裂释放PD1抗体。
实施例二
为论证实施例一中制备的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，本实施例中，对实施例一中制备的GOP@aPD1NPs进行体外释放实验、细胞实验以及生物体内实验。
1.体外释放实验
为了测量GOP@aPD1NPs的释放曲线，将实施例一中制备的GOP@aPD1NPs配制成5mg/mL浓度悬浮液(PBS溶液配成)，本实施例中，GOP@aPD1NPs悬浮液均由PBS溶液配制而成。取2mL的上述悬浮液作为照射组，对上述悬浮液进行近红外激光照射，激光波长为660nm，功率密度为0.5W/cm2，照射时长为10min。
取2mL的上述悬浮液作为对照组不进行近红外激光照射。
再将照射组和对照组悬浮液置于37℃恒温仪。不同时间点对两组悬浮液进行离心，离心转速为8000rpm，离心时长为3min。取出2mL上清液，通过大鼠IgG ELISA试剂盒测量从GOP@aPD1NPs中释放的PD1抗体的量，利用UV-Vis分光光度计(UV-2550,SHIMADZU,Japan)，在波长为450nm处检测吸光度，对照PD1抗体标准曲线计算上清液中PD1抗体浓度。
结果如下：如图6所示，w/PTT表示照射组的体外释放曲线，w/o PTT表示对照组的体外释放曲线，由图6可以明显看出，照射组中的GOP@aPD1NPs快速释放地PD1抗体，而对照组中的GOP@aPD1NPs释放PD1抗体的速度缓慢。这就说明激光照射是GOP@aPD1NPs突释PD1抗体的触发条件。因此，光热治疗(PTT)可以介导GOP@aPD1NPs的解离，从而可控制地促进PD1抗体从GOP@aPD1NPs中释放，实现PD1抗体的靶向在肿瘤组织中大量释放，有效提高黑色素瘤的治疗疗效，并减少PD1抗体在重要器官的副反应。
2.细胞实验
2.1GOP@aPD1NPs的靶向研究实验
为了测试GOP@aPD1NPs对黑色素瘤细胞的靶向作用，将B16F10-luc细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到6孔板中，B16F10-luc细胞粘附后，将分散在无血清培养基溶液中的GOP@aPD1NPs(100μg/mL)加入一6孔板的各孔中成为实验组，添加量为2mL，将含有非靶向纳米粒(纳米粒壳是未经PEG-GRGDS修饰的PLGA)的无血清培养基溶液(100μg/mL)加入另一6孔板的各孔中成为对照组，添加量为2mL。将6孔板进行温育10h后，使用PBS溶液洗涤细胞三次，然后用4％(质量百分比)多聚甲醛固定，再次使用PBS溶液洗涤细胞三次，并使用DAPI(10μg/mL)染色B16F10-luc细胞核，通过CLSM(Nikon A1，Japan)观察细胞。
观察结果如下：在实验组的B16F10-luc细胞膜周围和B16F10-luc细胞的细胞质中可见许多代表GOP@aPD1NPs的红点，在对照组的B16F10-luc细胞周围观察到的红点较少，证明GOP@aPD1NPs具有对B16F10-luc细胞的靶向作用，GOP@aPD1NPs能够准确靶向B16F10-luc细胞。
2.2GOP@aPD1NPs的细胞毒性研究实验
为了评估GOP@aPD1NPs的细胞毒性，将B16F10-luc细胞以每孔2×103个细胞的密度接种至两96孔板中，将不同浓度的GOP@aPD1NPs悬浮液分别加入96孔板中不同的6孔中，GOP@aPD1NPs悬浮液的浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL，添加量为200μL，将溶剂PBS缓冲液加入96孔板中的6孔中，添加量为200μL，作为对照组。将两96孔板进行温育10h后，分为GOP@aPD1组和GOP@aPD1+PTT组，对GOP@aPD1+PTT组的96孔板进行激光照射，激光波长为660nm，功率密度为0.5W/cm2，照射时长为10min，使用CCK-8试剂盒(Dojindo，Japan)检测B16F10-luc细胞的活力，检测结果如图7所示。
由图7看出，即使在最高浓度为15mg/mL时，GOP@aPD1NPs也没有明显的细胞毒性。然而，激光照射的GOP@aPD1NPs显示出明显的细胞毒性，并且细胞毒性的强弱程度与GOP@aPD1NPs的浓度呈现依赖性关系。例如，对于没有激光照射的5mg/mLGOP@aPD1NPs，细胞存活率为92.89±2.95％，但是激光照射后细胞存活率显着降低至35.24±1.03％。因此，细胞实验证明了GOP@aPD1NPs没有细胞毒性，而经过激光照射后，GOP@aPD1NPs具有了细胞毒性。由此可知，GOP@aPD1NPs不会对体内正常细胞造成伤害，而当GOP@aPD1NPs靶向黑色素瘤细胞后，联合光热治疗，使得GOP@aPD1NPs针对性地对黑色素瘤细胞产生细胞毒性。
3.生物体内实验
3.1GOP@aPD1NPs的体内生物安全性研究实验
为了评估GOP@aPD1NPs的体内生物安全性，将雌性C57B6小鼠随机分为3组，分别为对照组、实验组1和实验组2，每组3只。对照组静脉注射200μL生理盐水，实验组1静脉注射200μL GOP@aPD1NPs悬浮液(5mg/mL)，实验组2静脉注射200μL GOP@aPD1NPs悬浮液(10mg/mL)。正常饲养，每日同一时间称重三组小鼠的重量并记录，观察三组小鼠的行为并记录。正常饲养14天后，分别采集三组小鼠的血样，测试血清生化指标，包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，肌酸激酶(CK)，L-乳酸脱氢酶(LDH-L)，血尿素氮(BUN)和肌酐(CR)。测试结果如图8-10所示。
全身给予GOP@aPD1NPs悬浮液后，各组小鼠均未观察到明显的异常行为。由图8-10可知，血液指标，包括肝功能标记物(ALT，AST)，肾功能标记物(BUN，CR)和心肌酶谱(CK，LDH-L)，在不同组之间显示的变异可忽略不计，表明检测不到GOP@aPD1NPs在相对长的时间内具有毒性，这些结果表明GOP@aPD1NPs在体内是生物相容的，与GOP@aPD1NPs的细胞毒性研究所得出的结论一致。
3.2体内肿瘤模型建立
将C57B6小鼠称重并记录，将B16F10-luc细胞悬浮于无血清培养基溶液中，使得B16F10-luc细胞密度为1×106，通过皮下注射100μL上述B16F10-luc细胞悬浮液至雌性C57B6小鼠的左背部。通过B16F10-luc细胞的生物发光信号监测肿瘤生长，并测量计算肿瘤体积，计算肿瘤体积的公式为：V＝0.5×a×b2，其中V表示肿瘤体积(mm3)，a表示肿瘤的长直径(mm)，b表示短肿瘤直径(mm)。
3.3GOP@aPD1NPs的体内靶向研究实验
为进一步评估GOP@aPD1NPs的体内靶向作用，当肿瘤体积达到80mm3时，将携带B16F10-luc肿瘤的小鼠随机分为A组和B组，A组小鼠静脉注射DIR标记的GOP@aPD1NPs的悬浮液(200μL/kg，5mg/mL)，B组小鼠静脉注射DIR标记的非靶向载PD1抗体纳米粒的悬浮液(200μL/kg，5mg/mL)。
由于DIR是荧光成像(FL)的常用造影剂，因此，可以使用FL来跟踪纳米粒在小鼠体内的递送。如图11所示，A组小鼠的肿瘤组织中积聚的显着荧光信号在6小时达到峰值，比B组高出4.3倍，进一步证实GOP@aPD1NPs靶向黑色素瘤肿瘤组织的能力。
3.4体内细胞因子释放
当肿瘤体积达到80mm3时，将携带B16F10-luc肿瘤的小鼠随机分为对照组，PTT组，GOP@aPD1+PTT组3组，每组3只。对照组不接受任何处理，PTT组接受激光照射(0.1W/cm2，10min)，GOP@aPD1+PTT组静脉注射GOP@aPD1NPs悬浮液(200μL/kg，5mg/mL)，再接受激光照射(0.1W/cm2，10min)。
在第1、3和7天从各组小鼠中分离血清样品，并且通过ELISA试剂盒(R&D Systems)测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)，干扰素γ(IFN-γ)和白介素-6(IL-6)的产生水平。
如图12-14所示，在第3天时，GOP@aPD1+PTT组小鼠的血清样品中，不管是TNF-α、IFN-γ水平，还是IL-6水平，均高于其他两组小鼠，而PTT组小鼠的血清样品中，TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于对照组小鼠。这就表明，单独使用PTT或使用GOP@aPD1+PTT能够在第3天增加IL-6，TNF-α和IFN-γ的分泌，但是基于GOP@aPD1NPs的PTT诱导的分泌物水平明显更高并持续更长时间，引发更强的抗肿瘤免疫反应。
3.5B16F10-luc肿瘤模型中的抗肿瘤活性研究实验
当肿瘤体积达到80mm3时，将携带B16F10-luc肿瘤的小鼠随机分成6组。第1组为对照组，静脉注射200μL生理盐水；第2组为游离PD1抗体组，静脉注射游离PD1抗体(1mg/kg)；第3组为PTT组，接受激光照射(0.1W/cm2，10min)；第4组是游离PD1抗体+PTT组，静脉注射游离PD1抗体(1mg/kg)，再接受激光照射(0.1W/cm2,10min)；第5组是GOP@aPD1组，静脉注射GOP@aPD1NPs悬浮液(200μL/kg，5mg/mL)；第6组为GOP@aPD1+PTT组，静脉注射GOP@aPD1NPs悬浮液(200μL/kg，5mg/mL)，再接受激光照射(0.1W/cm2，10min)。以上所有治疗分别在第0天和第3天进行一次。每两天测量计算各组小鼠的体重和肿瘤体积并记录。第7天处死各组小鼠三只，收集器官使用苏木精和伊红进行染色，同时收集肿瘤组织使用TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)和免疫荧光进行肿瘤的细胞凋亡检测和肿瘤浸润淋巴细胞检测。另在第7天处死各组小鼠三只，收集肿瘤并对肿瘤进行流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞量及亚群。实验结果如下所示。
使用活体荧光成像监测B16F10-luc肿瘤的生物发光，与其他组的小鼠相比，第6组的小鼠的B16F10-luc细胞的生物发光信号显著减少。如图15所示，通过测量小鼠体重来看，各组小鼠的体重变化没有显着差异，表明各组处理对动物安全性无影响。如图16所示，与第1组相比，第2组未显示出抗肿瘤效果，这归因于肿瘤中的PD1抗体药物浓度低和相对低的全身给药剂量。此外，第3组显示出与第1组相似肿瘤生长曲线，因为单独的光热处理不足以均匀地消融B16F10-luc细胞。第5组中，单独GOP@aPD1NPs治疗时，PD1抗体较少释放到肿瘤中，并且没有光热的消融作用，肿瘤生长曲线与第1组无显著差异。然而，第4组显示出了部分抑制肿瘤生长的功能，证实通过将免疫疗法与光热治疗相结合可以提高抗肿瘤效率。治疗疗效最显著的是第6组，对比第4组，第14天的相对肿瘤生长率从47.25％降低至2.31％。此外，如图17所示，第6组显示出更好的存活率：所有小鼠存活超过35天。第4组、第5组、第3组、第2组和第1组的小鼠分别在第17、15、13和12天内死亡。
另外，在第7天进行肿瘤组织的TUNEL测定以进一步评价抗肿瘤效果。TUNEL染色显示，第6组小鼠的肿瘤中出现严重坏死，而在第4组小鼠的肿瘤中仅观察到部分细胞坏死，但是在其他四组的小鼠的肿瘤中没有观察到肿瘤细胞坏死。通过TUNEL测定揭示的肿瘤中的细胞凋亡水平与肿瘤生长曲线有相同的趋势。为了检测基于GOP@aPD1NPsPTT的体内毒性，在第7天进行主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾)的H&E染色，并且在器官上没有显示明显的组织病理学损伤。总之，这些研究结果表明，基于GOP@aPD1NPs的光热疗法可有效抑制黑色素瘤的生长，延长小鼠的存活时间。
综上所述，通过上述制备方法成功制备了多功能GOP@aPD1NPs，用于高效递送PD1抗体至黑色素瘤肿瘤组织，并显著提高了PD1抗体免疫疗法的效果，该疗法在体外和体内实验均得证明。本发明中的GOP@aPD1NPs不仅表现出良好的靶向黑色素瘤aPD1递送能力，而且还显示出光热治疗介导的可控的药物释放能力。本发明证明，基于GOP@aPD1NPs的PTT比PD1抗体免疫疗法更有效地抑制肿瘤生长，并且也首次证明了基于GOP@aPD1NPs的PTT的新型癌症治疗策略，为治疗黑色素瘤提供新的治疗策略。
以上所述的仅是本发明的较佳实施例，本领域的技术人员应当了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒，其特征在于，包括以下组分：PLGA-PEG-GRGDS共聚物、Fe3O4纳米粒、PD1抗体和全氟戊烷，所述PLGA-PEG-GRGDS共聚物和Fe3O4纳米粒结合后包裹PD1抗体和全氟戊烷。
2.一种载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备PLGA-PEG-GRGDS共聚物：将聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-COOH)溶解于二氯甲烷(DCM)中，添加N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)后，在37℃条件下搅拌反应12h，过滤、洗涤、真空干燥得到沉淀物A；将沉淀物A溶解于DCM中，添加三乙醇胺(TEA)和氨基聚乙二醇羧基(NH2-PEG-COOH)，在37℃条件下搅拌反应12h，加水稀释后透析12h，收集下层沉淀冻干得到固体物B；将固体物B溶解于DCM中，添加NHS和DCC，在37℃条件下搅拌反应12h，过滤、洗涤、真空干燥得到沉淀物C；将沉淀物C溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，将多肽(GRGDS)溶解于DMF中，两者混合后添加TEA搅拌反应12h，再加入水稀释后透析12h，冻干得到的白色固体即为PLGA-PEG-GRGDS共聚物；
S2、溶解PLGA-PEG-GRGDS共聚物：将步骤S1中制备的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶解于DCM中；
S3、添加Fe3O4纳米粒：将Fe3O4纳米粒添加至步骤S2中的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶液中；
S4、制备乳化混合液：将PD1抗体与全氟戊烷混合，超声乳化20s，形成乳化混合液，超声功率为50W；
S5、二次乳化：将步骤S4中制备的乳化混合液加入步骤S3中制备的PLGA-PEG-GRGDS共聚物溶液，超声乳化60s，超声功率为50W；
S6、三次乳化：向步骤S5中制备的混合液中添加聚乙烯醇水溶液，超声乳化50s，超声功率为50W；
S7、搅拌离心：将步骤S6中制备的混合液进行磁力搅拌4h后，利用低温离心机离心，去离子水清洗后得到载PD1抗体的靶向相变型纳米粒；
所述步骤S2-S7均在冰浴中进行。
3.根据权利要求2所述的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，PLGA-PEG-GRGDS共聚物的添加量为25mg，DCM的用量为2mL；所述步骤S3中，Fe3O4纳米粒的添加浓度为25mg/mL，添加量为100μL；所述步骤S4中，PD1抗体的添加浓度为2mg/mL，添加量为200μL，全氟戊烷的添加量为200μL；所述步骤S6中，聚乙烯醇水溶液的添加浓度为4％w/t，添加量为5mL。
4.根据权利要求3所述的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S7后，将步骤S7中制备的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒以去离子水稀释，4℃保存。
5.根据权利要求4所述的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，低温离心机的转速为8000rpm，离心时间为8min。
6.如权利要求1所述的载PD1抗体的靶向相变型纳米粒在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。
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